PL237601B1 - Nowe szczepy bakteryjne, nowe białka, konstrukt kwasu nukleinowego, wektor, komórka gospodarz, sposób wytwarzania szczepów bakteryjnych i nowych białek, kompozycja, ich zastosowanie oraz sposób bioremediacji środowiska - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Dziedzina techniki

Przedmiotem wynalazku są nowe szczepy bakteryjne Pseudomonas jessenii AP3_16 B/00139 oraz Pseudomonas laurylosulfatovorans AP3_22, które dzięki wytwarzanym przez nie enzymom, szczególnie występującym w tych szczepach alkilosulfatazom, posiadają wyjątkowe zdolności do przeżycia w obecności wysokich stężeń środków powierzchniowo czynnych, takich jak detergenty anionowe, jak również zdolność do ich rozkładu. Przedmiotem wynalazku jest więc sposób oczyszczania środowiska, zanieczyszczonego estrami siarkowymi, w tym środkami powierzchniowo czynnymi obejmującymi związki zawierające wiązanie estrowe estrów siarkowych, przy zastosowaniu mikroorganizmu wyrażającego alkilosulfatazę lub izolowanej alkilosulfatazy bakteryjnej, w którym do oczyszczanego środowiska wprowadzany jest wymieniony mikroorganizm, jego lizat lub izolowany z mikroorganizmu enzym o aktywności alkilosulfatazy. Wynalazek dotyczy również nowych szczepów bakteryjnych Pseudomonas jessenii AP3_16 B/00139 oraz Pseudomonas laurylosulfatovorans

AP3_22, które są stosowane w tym sposobie i z których pochodzą nowe białka o aktywności alkilosulfatazy jak również kompozycji je obejmujących. Wynalazek dotyczy ponadto nowego wyizolowanego białka kodującego alkilosulfatazę, konstruktu kwasu nukleinowego kodującego takie białko, wektora ekspresyjnego zdolnego do ekspresji takiego konstruktu kwasu nukleinowego jak i komórki gospodarza zawierającej konstrukt kwasu nukleinowego lub wektor w którym to gospodarzu możliwe jest wyrażanie takiego białka. Wynalazek dostarcza również sposobu wytwarzania nowych szczepów bakteryjnych zdolnych do rozkładu estrów siarkowych jak i nowych szczepów bakteryjnych otrzymanych takim sposbem. Przedmiot wynalazku również dotyczy sposobu wytwarzania białka alkilosulfatazy jak i kompozycji je obejmującej. Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie nowych szczepów bakteryjnych Pseudomonas jessenii AP3_16 B/00139 oraz Pseudomonas laurylosulfatovorans

AP3_22 i/lub lizatu takiego szczepu, białka alkilosulfatazy, kompozycji zawierającej takie białko lub nowy szczep jak i ich mieszanian do rozkładania estrów siarkowych. Nowe szczepy bakteryjne jak i nowe białka alkilosulfatazy pozwalają na efektywne prowadzenie sposobu bioremediacji środowiska skażonego ksenobiotykami. Nowe szczepy bakteryjne jak i praparaty oczyszczonych białek mogą stanowić wartościowe źródło pozwalające na tworzenie narzędzi biotechnologicznych do zastosowań w bioremediacji środków powierzchniowo czynnych, korzystnie surfaktantów i detergentów lub biotransformacji w procesach przemysłowych.

Stan Techniki

Surfaktanty to amfifilowe substancje chemiczne posiadające w swojej budowie chemicznej część hydrofilową i hydrofobową. Taka budowa chemiczna pozwala im akumulować się na granicy fazy wodnej i powietrznej, lub na granicy fazy wodnej i olejowej, przez co zmniejszają napięcie powierzchniowe, czyli są środkami powierzchniowo czynnymi. W zależności od ładunku cząsteczki chemicznej surfaktantu dzieli się je na środki anionowe, niejonowe, kationowe oraz amfoteryczne (Im et al., 2008). Niska cena oraz korzystne właściwości sprawiają, że surfaktanty anionowe są niezwykle często wykorzystywane w szerokiej gamie produktów takich jak: kosmetyki, preparaty farmaceutyczne, środki czystości dla domu i przemysłu a także w rolnictwie jako dodatki poprawiające właściwości użytkowe środków ochrony roślin.

Intensywne stosowanie środków powierzchniowo czynnych w produktach gospodarstwa domowego oraz w rolnictwie powoduje akumulację tych substancji w środowisku wodnym i w glebie, wywierając niejednokrotnie efekt toksyczny dla żyjących tam organizmów. Surfaktanty anionowe takie jak detergenty np. laurylosiarczan sodowy (SDS, dodecylosiarczan sodu) są znane ze swoich bakteriostatycznych i bakteriobójczych właściwości, ale wiadomo również, iż mają negatywny wpływ na życie takich organizmów jak sinice asymilujące azot, algi, skorupiaki czy ryby (Lechuga et al., 2016; Sandbacka et al., 2000). Amfoteryczny charakter surfaktantów anionowych leży u podstaw ich zdolności do bioakumulacji w organizmach żywych jak i toksyczności. Ujemnie naładowana część kwasowa (grupa siarczanowa w przypadku laurylosiarczanu sodu) wiąże się z komponentami wewnątrzkomórkowymi na zasadach oddziaływań elektrostatycznych, natomiast długołańcuchowy alkohol wiąże się z białkami na zasadach oddziaływań hydrofobowych (Cserhati et al., 2002).

Problem gromadzenia się dużych ilości detergentów w środowisku jest doskonale widoczny na przykładzie oczyszczalni ścieków, w których procesy fizykochemiczne i biologiczne są zaburzone i spowolnione przez nadmiar środków powierzchniowo czynnych spływających wraz ze ściekami. Na poziomie fizykochemicznym obniżone napięcie powierzchniowe powoduje nadmierne pienienie ście

PL 237 601 B1 ków, stabilizację ich koloidalnego charakteru a w konsekwencji zaburzenie procesu wytrącania osadu. Na poziomie biologicznym, detergenty wywierają wieloraki negatywny wpływ na bioróżnorodność konsorcjum mikroorganizmów biorących udział w biodegradacji zanieczyszczeń obecnych w ściekach. Wśród poznanych mechanizmów negatywnego wpływu należy wymienić: (I) absorpcję detergentu na powierzchni osadu czynnego, powodującą lizę komórek bakteryjnych; (II) oddziaływanie detergentu z białkami w komórkach bakterii prowadzące do zmian konformacji białek i zaburzeń ich funkcji; (III) wiązanie detergentów do enzymów zwłaszcza w obszarze centrów aktywnych lub miejsc wiązania substratów, co zaburza przebieg reakcji chemicznych katalizowanych przez te enzymy (Ivankovic i Hrenović, 2010). Substancje powierzchniowo czynne zaburzając funkcjonowanie enzymów wpływają na metabolizm całych grup mikroorganizmów, zmieniając tym samym profil degradacji związków chemicznych (np. węglowodanów) w oczyszczanych ściekach (Eerlingen et al., 1994). W końcu, zbyt wysokie stężenie środków powierzchniowo czynnych zmniejsza bioróżnorodność konsorcjów mikroorganizmów bytujących w osadnikach oczyszczalni ścieków, wpływając na spadek aktywności metabolicznej tych konsorcjów, co negatywnie wpływa na cały proces oczyszczania wody, który staje się mniej wydajny oraz bardziej kosztowny (Zangeneh et al., 2014).

Pomimo znanej toksyczności detergentów, w literaturze specjalistycznej często spotyka się propozycje ich wykorzystania do bioremediacji wód lub gleb skażonych różnego rodzaju węglowodorami (np. ropa naftowa i jej pochodne, odczynniki chemiczne, pestycydy etc.). W tym przypadku wykorzystuje się środki powierzchniowo czynne do zwiększenia rozpuszczalności węglowodorów w wodzie, a tym samym zwiększenia ich biodostępności dla mikroorganizmów. W tym kontekście najczęściej proponowanym detergentem jest laurylosiarczan sodu, który wykazuje dużą skuteczność w procesach bioremediacji skażonej gleby (Yu et al., 2007; Zhou and Zhu, 2008; Moldes et al., 2013). Jednakże by bioremediacja ksenobiotyków stymulowana dodatkiem laurylosiarczanu sodu była efektywna, postulowane jest równoległe zastosowanie kilku grup mikroorganizmów o różnych właściwościach biochemicznych. W pierwszej kolejności proponuje się zastosowanie mikroorganizmów zdolnych do degradacji ksenobiotyku stanowiącego skażenie ale odpornych na działanie wysokich stężeń detergentu. W drugiej kolejności stosowane mają być mikroorganizmy efektywnie usuwające środki powierzchniowo czynne z oczyszczonego z ksenobiotyku środowiska.

W kontekście tego drugiego etapu w literaturze naukowej można znaleźć szereg publikacji opisujących izolację szczepów bakteryjnych mających zdolność do degradacji środków powierzchniowo czynnych w tym laurylosiarczanu sodu. Do grona opisanych mikroorganizmów rozkładających SDS należą szczepy z rodzaju Pseudomonas (Chaturvedi i Kumar, 2011a; John et al., 2015; Klebensberger et al., 2006; Yeldho et al., 2011), Kliebsiella oxytoca (Masdor et al., 2015; Shukor et al., 2009), Enterobacter sp. szczep NENI-13 (Rahman et al. 2016), aż w końcu konsorcjum składające się ze szczepów Acinetobacter calcoaceticus oraz Acinetobacter calcoaceticus (Abboud et al., 2007). Jednakże w wyżej wymienionych przykładach, mikroorganizmy wyizolowano ze środowisk silnie skażonych wyłącznie środkami powierzchniowo czynnymi, w których nie występowało równoległe skażenie innymi ksenobiotykami.

Środki powierzchniowo czynne takie jak detergenty są także szeroko stosowanymi dodatkami do preparatów z pestycydami pozwalającymi dostosować właściwości finalnego produktu do potrzeb końcowego użytkownika.

Enzymy hydrolizujące estry siarkowe, w szczególności detergenty anionowe

Proces degradacji anionowych środków powierzchniowo czynnych lub estrów kwasu siarkowego z alkoholami alkilowymi lub aromatycznymi został dość dobrze scharakteryzowany na poziomie biochemicznym. Enzymy biorące udział w hydrolizie wiązania estrowego estrów siarkowych (prowadzącej zwykle do powstania odpowiedniego alkoholu i nieorganicznego siarczanu) nazywane są sulfatazami (EC 3.1.6.-). Ta heterogenna grupa enzymów może być podzielona na co najmniej trzy oddzielne klasy, w zależności od mechanizmu przeprowadzanej reakcji (Kertesz, 1999). Pierwsza klasa grupuje arylosulfatazy, białka zawierające konserwowany motyw C/S-X-P-X-A-X4-T-G, identyfikowane głównie w organizmach eukariotycznych (Hagelueken et al., 2006). Chociaż nazwa klasy sugeruje, że enzymy te są specyficzne wobec substratów aromatycznych, wiele z nich może również katalizować reakcje dla siarkowych pochodnych węglowodanów alifatycznych (Toesch et al., 2014). Typowym przedstawicielem bakteryjnych arylosulfataz jest AtsA z Pseudomonas aueruginosa (Boltes et al., 2001). Druga grupa sulfataz to zależne od żelaza (II) dioksygenazy, które poprzez wbudowanie tlenu w cząsteczkę substratu, katalizują reakcje utleniania estru siarkowego do odpowiedniego aldehydu i nieorganicznego siarczanu. Przedstawicielem tej grupy sulfataz jest AtsK z Pseudomonas putida

PL 237 601 B1 (Muller et al., 2004). Trzecia klasa sulfataz łączy enzymy posiadające domenę metalo-3-laktamazy na N-końcu białka oraz domenę SCP-2, zaangażowaną w wiązanie steroli, na C-końcu białka. W chwili obecnej grupę tę reprezentują cztery sulfatazy o różnej specyficzności substratowej: SdsA z aktywnością enzymatyczną wobec anionowych środków powierzchniowo czynnych takich jak laurylosiarczan sodu (Davison et al., 1992), SdsAP i SdsA1 z aktywnością wobec pochodnych pierwszorzędowych, w tym laurylosiarczanu sodu (Hagelueken et al., 2006; Long et al., 2011; Schober et al., 2011) oraz PisA1 wykazujący aktywność wobec pochodnych drugorzędowych (Schober et al., 2011). Enzymy z tej grupy różnią się mechanizmem działania, mogą katalizować rozerwanie wiązania S-O bądź C-O, co powoduje, w wypadku asymetrycznego substratu, powstanie alkoholu o odpowiednio zachowanej lub zmienionej konfiguracji. Pierwsze badania nad właściwościami białek SdsA1 i PisA1 wykazały, że obydwa enzymy katalizują rozerwanie wiązania C-O.

Szczegółowy opis wynalazku

W świetle opisanego stanu techniki celem niniejszego wynalazku jest przezwyciężenie niedogodności związanych z trudnościami usunięcia detergentów anionowych ze środowiska przykładowo z gleby, wody, roztworu, korzystnie ścieku, instalacji przemysłowej. Wynalazek ma również na celu dostarczenie narzędzi dla prowadzenia katalizy reakcji chemicznych mających na celu hydrolizę pochodnych alkilo- i/lub arylo sulfonowych.

Celem wynalazku jest więc dostarczenie nowych szczepów bakteryjnych lub/i konstruktów w celu wytworzenia ulepszonych szczepów zdolnych do katalizowania hydrolizy estrów siarkowych np. środków powierzchniowo czynnych, które ponadto korzystnie charakteryzują się zwiększoną opornością na wysokie stężenia środków powierzchniowo czynnych w środowisku a także innych ksenobiotyków np. pestycydów czy węglowodorów. Celem wynalazku jest również dostarczenie nowych alkilosulfataz, których wytwarzanie w formie aktywnej, pozwalającej na hydrolizę wiązania estrowego estrów siarkowych np. w postaci środków powierzchniowo czynnych, jest możliwe w heterologicznych systemach ekspresyjnych, w szczególności w komórkach bakterii Escherichia coli. Kolejnym celem wynalazku jest dostarczenie preparatów alkilosulfataz, które wykazują właściwości pozwalające na hydrolizę wybranych estrów siarkowych, np. środków powierzchniowo czynnych.

Mikroorganizmy ujawnione w niniejszym zgłoszeniu patentowym wyizolowane zostały z torfu (pochodzącego ze strefy korzeniowej) pobranego z hydrofitowej oczyszczalni ścieków, funkcjonującej przy zakładzie konfekcjonującym pestycydy. Taka strategia pozwoliła na wyizolowanie mikroorganizmów zdolnych zarówno do degradacji środków powierzchniowo czynnych, jak i wykazujących oporność na wysokie stężenia innych ksenobiotyków jak pestycydy. Co więcej badania pozwoliły stwierdzić w wyizolowanych szczepach mikroorganizmów obecność enzymów o właściwościach alkilosulfataz, gdyż enzymy te wykazują zdolność do rozkładu laurylosiarczanu sodu do reszty kwasu siarkowego oraz długołańcuchowego alkoholu. Enzymy o aktywności sulfataz wyizolowane ze szczepów bakteryjnych ujawnionych w niniejszym zgłoszeniu patentowym zostały scharakteryzowane pod kątem składu aminokwasowego jak i właściwości biochemicznych. Analizy te pokazały, że białka te należy zaliczyć do trzeciej klasy sulfataz.

Twórcy wynalazku zidentyfikowali i scharakteryzowali 36 szczepów bakteryjnych z rodzaju Pseudomonas spp., które wykazują zdolność do rozkładu detergentu - laurylosiarczanu sodu, przy czym wykazują one znaczne różnice w zdolności wykorzystania tego środka powierzchniowo czynnego jako jedynego źródła węgla. Źródłem mikroorganizmów była hydrofitowa oczyszczalnia ścieków funkcjonująca przy zakładzie konfekcjonującym pestycydy. Wyizolowane szczepy bakteryjne wykazują podobieństwo taksonomiczne do subgrupy Pseduomonas jessenii. W testach biochemicznych wykazały one najlepsze zdolności degradacji SDS, gdyż w czasie krótszym niż 24 godziny są w stanie rozłożyć od 80% do 100% laurylosiarczanu sodu obecnego w hodowli w początkowym stężeniu 1 g/l. Szczepy te różnią się pod względem tempa rozkładu SDS, oporności na jego wysokie stężenie (od 2,5 g/l do 10 g/l a nawet wyższe), jak również w teście płytkowym w zdolności do chemotaksji w kierunku laurylosiarczanu sodu. Analiza zymograficzna białek cytoplazmatycznych obecnych w pięciu szczepach najlepiej degradujących SDS wykazała obecność białek o aktywności alkilosulfataz. Dla dwóch białek kodowanych w genomach tych szczepów udało się potwierdzić zdolność do rozkładu laurylosiarczanu sodu a następnie udało się nadprodukować i oczyścić te białka w celu szczegółowej charakterystyki.

Wyniki wskazują, że wyizolowane mikroorganizmy oraz praperaty oczyszczonych białek mogą stanowić wartościowe źródło pozwalające na tworzenie narzędzi biotechnologicznych do zastosowań w bioremediacji środków powierzchniowo czynnych lub biotransformacji w procesach przemysłowych.

PL 237 601 B1

Przedmiotem wynalazku jest szczep Pseudomonas jessenii AP3_16 zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM) Instytutu Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN pod numerem B/00139.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest szczep Pseudomonas laurylosulfatovorans AP3_22 zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM) Instytutu Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN pod numerem B/00140.

Zdeponowane szczepy bakteryjne według wynalazku wykazują ekspresję alkilosulfataz o sekwenjci aminokwasowej SEKW NR ID: 1 i 2 (odpowiednio dla Pseudomonas laurylosulfatovorans AP3_22 i Pseudomonas jessenii AP3_16). Alkilosulfatazy wyrażane przez wymienione szczepy wykazują wysokie podobieństwo sekwencji (ok. 93%) i zapewniają wydajną degradację estrów siarkowych, w szczególności środków powierzchniowo czynnych obejmujących związki zawierające wiązanie estrowe estrów siarkowych, w szczególności laurylosiarczanu sodu. Ponadto, Twórcy niniejszego wynalazku stwierdzili, że alkilosulfatazę o sekwencji obejmującej SEKW NR ID: 1 lub 2 można wprowadzać do innych gatunków bakterii, nadając im tym samym zdolność do wydajnej degradacji takich środków powierzchniowo czynnych. Enzymy te wykazują również zdolność hydrolizy wiązania estrowego estrów siarkowych, w tym środków powierzchniowo czynnych obejmujących takie wiązanie, takich jak laurylosiarczan sodu, w szerokim spektrum pH i temperatury. Ponadto, Twórcy stwierdzili, że oba wymienione szczepy Pseudomonas wykazują oporność na działanie ksenobiotyków i mogą być stosowane do remediacji środowisk zanieczyszczonych nie tylko środkami powierzchniowo czynnymi ale i ksenobiotykami, na przykład pestycydami czy węglowodorami.

Dlatego też, przedmiotem wynalazku jest również sposób oczyszczania środowiska, zwłaszcza gleby, wody, roztworu, instalacji przemysłowej, zanieczyszczonego estrami siarkowymi, w tym środkami powierzchniowo czynnymi obejmującymi związki zawierające wiązanie estrowe estrów siarkowych, przy zastosowaniu mikroorganizmu wyrażającego alkilosulfatazę i/lub izolowanej alkilosulfatazy bakteryjnej, charakteryzujący się tym, że alkilosulfataza pochodzi z szczepu Pseudomonas jak określonego w zastrz. 1 albo 2, oraz alkilosulfataza obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEKW NR ID: 1 lub 2, i/lub alkilosulfataza jest kodowana przez sekwencję nukleotydową obejmującą SEKW NR ID: 3 lub 4, przy czym do oczyszczanego środowiska wprowadzany jest wymieniony mikroorganizm, jego lizat lub izolowany z mikroorganizmu enzym o aktywności alkilosulfatazy.

W korzystnym przykładzie wykonania sposobu oczyszczania środowiska zanieczyszczonego estrami siarkowymi, estrem siarkowym jest laurylosiarczan sodu.

Korzystnie, oczyszczanie środowiska zanieczyszczonego estrami siarkowymi, w tym środkami powierzchniowo czynnymi obejmującymi związki zawierające wiązanie estrowe estrów siarkowych, jest elementem procesu bioremediacji środowiska skażonego ksenobiotykami, korzystnie węglowodorami, przy czym mikroorganizmem wytwarzającym alkilosulfatazę są szczepy określane powyżej.

Korzystnie, mikroorganizmem wprowadzanym do oczyszczanego środowiska jest szczep Pseudomonas jessenii AP3_16 określony powyżej lub szczep Pseudomonas laurylosulfatovorans AP3_22 określony powyżej lub ich mieszanina.

Przedmiotem wynalazku jest także białko o sekwencji aminokwasowej przedstawionej na SEKW NR ID: 1 lub 2, korzystnie kodowane przez sekwencję nukleotydową obejmującą SEKW NR ID: 3 lub 4, mające aktywność alkilosulfatazy.

Przedmiotem wynalazku jest także konstrukt kwasu nukleinowego kodujący białko według wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest także wektor ekspresyjny obejmujący konstrukt według wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest także komórka gospodarz obejmująca konstrukt według wynalazku lub wektor według wynalazku.

W korzystnym przykładzie wykonania, komórka gospodarz to jednokomórkowy organizm mezofilny, korzystnie E. coli, korzystniej szczep E. coli BL21.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania szczepów bakteryjnych zdolnych do rozkładu estrów siarkowych, w tym środków powierzchniowo czynnych obejmujących związki zawierające wiązanie estrowe estrów siarkowych w środowisku, obejmujący wprowadzanie do komórki bakterii konstruktu według wynalazku lub wektora według wynalazku, przy czym konstrukt lub wektor mogą być wprowadzane metodami inżynierii genetycznej lub z wykorzystaniem naturalnych procesów horyzontalnego transferu genów, korzystnie bezpośrednio w środowisku.

PL 237 601 B1

Przedmiotem wynalazku jest także szczep bakteryjny wyrażający alkilosulfatazę i zdolny do rozkładu estrów siarkowych otrzymany sposobem wytwarzania szczepów bakteryjnych zdolnych do rozkładu estrów siarkowych, w tym środków powierzchniowo czynnych obejmujących związki zawierające wiązanie estrowe estrów siarkowych według wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania białka alkilosulfatazy, znamienny tym, że obejmuje etap hodowli komórki gospodarza w warunkach umożliwiających ekspresję białek, przy czym komórka gospodarz wykazuje ekspresję białka według wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja do rozkładu estrów siarkowych w środowisku, w tym środków powierzchniowo czynnych obejmujących związki zawierające wiązanie estrowe estrów siarkowych obejmująca białko według wynalazku lub otrzymane sposobem według wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja do rozkładu estrów siarkowych w środowisku, w tym środków powierzchniowo czynnych obejmujących związki zawierające wiązanie estrowe estrów siarkowych obejmującą szczep bakteryjny Pseudomonas jessenii AP3_16 jak określono powyżej i/lub Pseudomonas laurylosulfatovorans AP3_22 jak określono powyżej i/lub szczep bakteryjny otrzymany sposobem wytwarzania szczepów bakteryjnych zdolnych do rozkładu estrów siarkowych według wynalazku i/lub komórkę obejmująca konstrukt według wynalazku i/lub wektor według wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie szczepu Pseudomonas jessenii AP3_16 lub Pseudomonas laurylosulfatovorans AP3_22 lub szczepu bakteryjnego otrzymanego sposobem wytwarzania szczepów bakteryjnych zdolnych do rozkładu estrów siarkowych według wynalazku; lub lizatu wymienionego szczepu lub białka według wynalazku; lub kompozycji według wynalazku obejmującej białko według wynalazku lub otrzymane sposobem według wynalazku; i/lub kompozycji obejmującej szczep bakteryjny Pseudomonas jessenii AP3_16 i/lub Pseudomonas laurylosulfatovorans AP3_22 i/lub szczep bakteryjny otrzymany sposobem wytwarza nia szczepów bakteryjnych zdolnych do rozkładu estrów siarkowych według wynalazku i/lub komórkę obejmującą konstrukt według wynalazku lub wektor według wynalazku; do rozkładania estrów siarkowych, w tym środków powierzchniowo czynnych obejmujących związki zawierające wiązanie estrowe estrów siarkowych w środowisku, w szczególności glebie, wodzie, roztworze, instalacji przemysłowej.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób bioremediacji środowiska skażonego ksenobiotykami, obejmujący:

a) etap wprowadzania środków powierzchniowo czynnych obejmujących związki zawierające wiązanie estrowe estrów siarkowych dla zwiększenia rozpuszczalności węglowodorów w wodzie, a tym samym zwiększenia ich biodostępności dla mikroorganizmów,

b) etap wprowadzania mikroorganizmów zdolnych do degradacji ksenobiotyku stanowiącego skażenie ale odpornych na działanie wysokich stężeń środków powierzchniowo czynnych, oraz

c) etap wprowadzania nowego szczepu Pseudomonasjessenii AP3_16 lub Pseudomonas laurylosulfatovorans AP3_22 lub szczepu bakteryjnego otrzymanego sposobem wytwarzania szczepów bakteryjnych zdolnych do rozkładu estrów siarkowych według wynalazku, lizatu wymienionego szczepu, białka według wynalazku lub kompozycji obejmującej białka według wynalazku i/lub kompozycji obejmującej szczepy według wynalazku lub ich kombinacji w celu usunięcia środków powierzchniowo czynnych z oczyszczanej wody lub gleby.

Niniejszy wynalazek obejmuje swoim zakresem nowe szczepy Pseudomonas jessenii AP3_16 zdeponowany w dniu 30 sierpnia 2017 r w Polskiej Kole kcji Mikroorganizmów (PCM) Instytutu Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN pod numerem B/00139 i Pseudomonas laurylosulfatovorans AP3_22 zdeponowany w dniu 30 sierpnia 2017 r w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM) Instytutu Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN pod numerem B/00140 oraz ich funkcjonalne pochodne.

Przez termin wariant nowego szczepu lub szczepu wytworzonego sposo bem według wynalazku lub przez termin funkcjonalna pochodna takiego szczepu należy rozumieć szczep mutanta lub szczep otrzymany przez hodowlę zdeponowanego szczepu lub szczepu wytworzonego sposobem według wynalazku jako materiału wyjściowego, który obejmuj e fragment kwasu nukleinowego kodujący przynajmniej jedną z alkilosulfataz przedstawionych w SEKW NR ID: 1-2, w szczególności fragment kwasu nukleinowego obejmujący SEK ID NR: 3 lub 4, i który to szczep jest zdolny do hydrolizy wiązania estrowego estrów siarkowych, w szczególności środków powierzchniowo czynnych.

PL 237 601 B1

Twórcy wynalazku stwierdzili, że szczepy należące do grupy Pseudomonas jessenii, korzystnie: Pseudomonas jessenii AP3_16 oraz Pseudomonas laurylosulfatovorans AP3_22 są w stanie żyć w silnie skażonym środowisku, a ponadto posiadają zdolność do rozkładu środków powierzchniowo czynnych, korzystnie laurosiarczanu sodu w tempie nawet 80% z początkowego stężenia 1 g/l w ciągu 8 godzin, a ponadto są w stanie tolerować bardzo wysokie stężenia tego związku w środowisku sięgające 25 g/l.

Twórcy wynalazku na podstawie podobieństwa sekwencji zidentyfikowali w genomach wyizolowanych szczepów Pseudomonas sp., zdolnych do hydrolizy wiązania estrowego estrów siarkowych, geny kodujące sulfatazy. Dwadzieścia jeden fragmentów genomu zawierających zidentyfikowane geny wraz z obszarami promotorowymi wprowadzili do wektorów utrzymujących się w szczepach E. coli Top10, które przetestowano pod względem nabycia zdolności do degradacji SDS. Nieoczekiwanie, dwa z uzyskanych kontruktów nadawały komórkom biorcy zdolność do degradacji laurylosiarczanu sodu.

Takie szczepy lub ich lizaty lub izolowane z nich białka są przydatne w bioremediacji w tym do zastosowania w procesie bioaugmentacji środowisk skażonych środkami powierzchniowo czynnymi. Konstrukty, np. plazmidy niosące geny nadające szczepom zdolność do hydrolizy wiązania estrowego estrów siarkowych, w tym środków powoerzchniowo czynnych, takich jak laurylosiarczan sodu mogą służyć do wytwarzania innych szczepów zdolnych do tego procesu lub do usprawnienia szczepów już posiadających taką właściwość.

Poprzez „bioremediację” należy rozumieć przekształcenie szkodliwych substancji obecnych w środowisku do mniej toksycznych lub całkowicie bezpiecznych metabolitów, za pomocą drobnoustrojów lub wyższych organizmów.

Zgodnie z wynalazkiem „bioaugmentacja” oznacza wprowadzenie do środowiska naturalnego lub zdegradowanego wyselekcjonowanych szczepów bądź zestawu mikroorganizmów w celu zwiększenia wydajności i możliwości przebiegu danego procesu.

W przypadku gdy nie ma możliwości bezpośredniego skonstruowania szczepów rozkładających środki powierzchniowo czynne na bazie mikloflory autochtonicznej, można wprowadzić plazmid do środowiska za pomocą metod bioaugmentacji. Do tego celu wykorzystywany jest szczep zawierający konstrukt lub wektor niosący dowolną sekwencję nukleotydową z SEKW NR ID: 3-4 lub ich pochodne do środowiska skażonego środkami powierzchniowo czynnymi i w wyniku naturalnych procesów horyzontalnego transferu genów, np. koniugacji zawierający dowolną sekwencję nukleotydową z SEKW NR ID: 3-4 wektor lub konstrukt według wynalazku jest przekazywany do komórek mikroorganizmów autochtonicznych.

Twórcy opracowali sposób konstrukcji szczepów zdolnych do hydrolizy wiązania estrowego estrów siarkowych, w szczególności środków powierzchniowo czynnych, również na bazie szczepów autochtonicznych wyizolowanych ze środowiska naturalnego, bez ograniczeń geograficznych, korzystnie ze środowiska skażonego środkami powierzchniowo czynnymi lub węglowodorami czy pestycydami do których mobilizacji i usunięcia planuje się użycie środków powierzchniowo czynnych.

Dzięki niniejszemu rozwiązaniu możliwe jest więc usuwanie środków powierzchniowo czynnych obejmujących wiązanie estrowe poprzez hydrolizę wiązania estrowego estrów siarkowych. Przykładowo, etap hydrolizy wiązania S-O prowadzony jest przez nowy szczep Pseudomonas jessenii AP3_16, Pseudomonas laurylosulfatovorans AP3_22, nowy szczep bakteryjny zdolny do hydrolizy wiązania estrowego estrów siarkowych wytworzony sposobem według wynalazku, lub kompozycję zawierającą szczepy zdolne do hydrolizy wiązania estrowego estrów siarkowych lub ich kombinację.

W jednym z aspektów, rozwiązanie dotyczy konstruktu kwasu nukleinowego lub wektora obejmującego dowolną sekwencję nukleotydową z SEKW NR ID: 3-4 lub jego funkcjonalnej pochodnej. Taki wektor może być zastosowany jako plazmid lub jako fragment sekwencji wbudowany w genom bakteryjny do konstrukcji szczepów zdolnych do hydrolizy estrów alkoholi alifatycznych i aromatycznych, w szczególności środków powierzchniowo czynnych.

Do usuwania zanieczyszczeń środkami powierzchniowo czynnymi wykorzystywać można szczep bakteryjny obejmujący konstrukt lub wektor, np. plazmid, który zawiera dowolną sekwencję nukleotydową z SEKW NR ID: 3-4 lub jej funkcjonalną pochodną albo szczep bakteryjny zawierający taką dowolną sekwencję nukleotydową wybraną z SEKW NR ID: 3-4 lub jej funkcjonalną pochodną wbudowaną w genom bakteryjny szczepu wyjściowego. Szczepy zawierające dowolną sekwencję nukleotydową z SEKW NR ID: 3-4 lub jej funkcjonalną pochodną będą zdolne do hydrolizy estrów alkoholi alifatycznych i aromatycznych.

PL 237 601 B1

Termin „alkilosulfataza” dotyczy białka - enzymu - należącego do grupy sulfataz biorącego udział w hydrolizie wiązania estrowego estrów siarkowych (prowadzącej zwykle do powstania odpowiedniego alkoholu i nieorganicznego siarczanu). Jako substrat należy rozumieć dowolny związek organiczny zawierający wiązania C-O lub S-O.

Twórcy stwierdzili, że możliwe jest wykorzystanie alkilosulfataz, takich jak CD 175_09595 (SEKW NR ID: 2) bądź B0D71_15760 (SEKW NR ID: 1) w procesach hydrolizy wiązania estrowego estrów siarkowych. W szczególności korzystne jest wykorzystanie tych białek w procesach hydrolizy wiązania estrowego estrów siarkowych w roztworach zawierających jony K+ jak i Mg²⁺ działające aktywująco na sulfatazy. Alkilosulfatazy różnią się jednak wrażliwością na obecność Na⁺, Mn²⁺ oraz 10 mM Ca²⁺. Enzym B0D71_15760 (SEKW NR ID: 1) jest aktywowany przez Na⁺ w stężeniu 10 mM, jednak wyższa zawartość tych jonów (100 mM) nie ma znaczącego wpływu na aktywność tej alkilosulfatazy. Z kolei aktywność CD175_09595 (SEKW NR ID: 2) jest hamowana wyższym stężeniem Na⁺, podczas gdy nisze stężenie jonów sodu nie ma wpływu na aktywność enzymu. Jony manganu Mn²⁺ nie mają wpływu na aktywność CD175_09595 (SEKW NR ID: 2), chociaż wykazują one pozytywny wpływ na aktywność B0D71_15760 (SEKW NR ID: 1), podobnie jak Ca²⁺ w niższym testowanym (10 mM) stężeniu.

Zastosowanie alkilosulfatazy, takiej jak CD175_09595 (SEKW NR ID: 2) bądź B0D71_15760 (SEKW NR ID: 1) w procesach hydrolizy wiązania estrowego estrów siarkowych może być realizowane w środowisku, którego pH mieści się korzystnie w zakresie 6,0-9,0 pH z optimum w pH 8,0 oraz w szerokim zakresie temperatur (30-90°C). CD175_09595 (SEKW NR ID: 2) wykazuje optimum temperaturowe w 60°C, natomiast B0D71_15760 (SEKW NR ID: 1) w 70°C stopniach.

Twórcy stwierdzili, że możliwe jest zastosowanie na przykład alkilosulfatazy B0D71_15760 (SEKW NR ID: 1) w procesach hydrolizy wiązania estrowego estrów siarkowych nawet podczas godzinnej inkubacji w optymalnej temperaturze 60°C.

Możliwe jest także stosowanie postaci immobilizowanych alkilosulfatazy, korzystnie za pomocą absorbcji na powierzchni nośnika lub w matrycy nośnika zarówno o charakterze nieorganicznym (np. szkło, krzemionka, tlenki metali) jak i organicznym (np. białka, polisacharydy, polimery syntetyczne). Alkilosulfatazy mogą być immobilizowane również na przykład przez sieciowanie przestrzenne oraz zamykanie wewnątrz membran półprzepuszczalnych.

Krótki opis figur rysunku

Dla lepszego zrozumienia wynalazku, został on zilustrowany w przykładach wykonania oraz na załączonych figurach rysunku, na których:

Fig. 1. Przedstawia identyfikację szczepów bakterii potencjalnie rozkładających SDS. Zdjęcia przedstawiają porównanie wzrostu izolatów bakteryjnych hodowanych na zestalonym agarem 10x rozcieńczonym podłożu LB (A) lub na podłożu minimalnym z 0,1% SDS (B). Różnice w średnicy przejaśnień obserwowanych wokół koloni na podłożu zawierającym SDS jako jedyne źródło węgla obrazują różną zdolność poszczególnych kolonni do rozkładu tego detergentu.

Fig. 2. Przedstawia ocenę tempa wzrostu oraz zdolności do rozkładu detergentu SDS przez wyizolowane szczepy bakteryjne. (A) Korelacja tempa wzrostu (mierzonego wzrostem OD) oraz zdolności do rozkładu SDSu (mierzonego spadkiem stężenia substratu [%]) po 24 godz. inkubacji. Korelację wyznaczoną dla 36 wstępnie wyizolowanych szczepów bakteryjnych zaznaczono linią przerywaną; (B) Pomiar tempa spadku stężenia SDS w hodowlach pięciu najbardziej wydajnych szczepów bakteryjnych; (C) Pomiar tempa wzrostu pięciu najbardziej wydajnych szczepów bakteryjnych w hodowlach płynnych zawierających 0,1% SDS jako jedyne źródło węgla. Poszczególne wartości na wykresach są wartościami średnimi uzyskanymi z trzech powtórzeń wraz z odchyleniami standardowymi.

Fig. 3. Przedstawia analizę filogenetyczną wyselekcjonowanych izolatów bakteryjnych w oparciu o sekwencję 16s rRNA. Analizę wykonano metodą największej wiarygodności (ang. Maximum Likelihood). Badane izolaty oznaczono na drzewie czarnymi trójkątami.

Fig. 4. Przedstawia wpływ stężenia SDS w środowisku na tempo wzrostu wyselekcjonowanych szczepów bakterii przedstawiony jako gęstość optyczna hodowli bakterii po 24 godz. inkubacji. Wartości przedstaione na wykresach są wartościami średnimi uzyskanymi z trzech powtórzeń wraz z odchyleniami standardowymi. Linia przerywana oznacza wartość wyjściowego OD600 dla każdego z badanych szczepów.

PL 237 601 B1

Fig. 5. Przedstawia ocenę chemotaksji izolatów bakteryjnych w kierunku SDSu będącego jedynym źródłem węgla. Po 8 godzinnej inkubacji w temperaturze 30°C wzrost bakterii obserwowany był na szalce w formie pierścieni wokół centralnie nakroplonego źródła węgla. Kolejne rzędy zdjęć przedstawiają obraz chemotaksji dla: (I) glukozy, (II) SDSu i kontrolnych płytek bez źródła węgla.

Fig. 6. Przedstawia analizę obecności enzymów o aktywności alkilosulfataz w lizatach bakteryjnych pięciu szczepów rozdzielonych w 8% natywnym żelu poliakryloamidowym. Szczepy hodowano na pożywce minimalnej w obecność glukozy (MM+glucose) lub SDSu (MM+SDS) jako jedynych źródeł węgla. Obecność prążków nierozpuszczalnego alkoholu laurylowego świadczących o obecności białek zdolnych do rozkładu SDS identyfikowano po 30 min. lub 4 godz. inkubacji.

Fig. 7. Przedstawia porównanie zdolności rozkładu SDS przez szczep E. coli oraz nowoutworzone szczepy niosące plazmidy kodujące potencjalne alkilosulfatazy zidentyfikowane w genomach szczepów AP3_16 oraz AP3_22. Hodowle prowadzono na podłożu LB uzupełnionym 0,1% SDS.

Fig. 8. Przedstawia wpływ pH (A) oraz temperatury (B) na aktywność homogennych preparatów białek. Aktywność preparatów białkowych badano w przedziale pH 4-10 (A) lub w przedziale temperatury 4-90°C poprzez oznaczenie zmian stężenia SDS w roztworach z użyciem odczynnika Stains-all. Kwadratami zaznaczono wartości uzyskane dla białka CD175_09595 a trójkątami dla białka B0D71_15760. Stężene detergentu mierzono po 24 godz. z użyciem odczynnika Stains-all.

Sposoby wykonania wynalazku

Poniższe przykłady zostały umieszczone jedynie w celu zilustrowania wynalazku oraz wyjaśnienia poszczególnych jego aspektów, a nie w celu jego ograniczenia i nie powinny być utożsamiane z całym jego zakresem, który zdefiniowano w załączonych zastrzeżeniach.

W poniższych przykładach, jeśli nie wskazano inaczej stosowano standardowe materiały i metody opisane w Sambrook J. I Russel D. W. 2001 Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, lub postępowano zgodnie z zaleceniami producentów określonych materiałów i metod.

P r z y k ł a d y

P r z y k ł a d 1 - Selekcja i identyfikacja bakterii zdolnych do degradacji anionowych środków powierzchniowo czynnych g próbki torfu pobranej z hydrofitowej oczyszczalni ścieków, przechowywanej w plastikowej torbie w temperaturze 8°C była umieszczona w sterylnym kubku blendera, zalana 100 mL roztworu 0,9% NaCI, po czym zhomogenizowana w trzech cyklach 1 minutowych homogenizacji z maksymalnymi obrotami przedzielonych schładzaniem kubka blendera w wodzie z lodem przez 1 minutę. Po 5 minutach sedymentacji osadu, frakcja płynna była zbierana do świeżej, sterylnej zlewki, a pozostała frakcja stała zawieszana była w świeżej porcji 100 mL roztworu 0,9% NaCI. Procedurę taką powtórzono łącznie trzykrotnie. Połączone frakcje płynne żwirowano 5000 g przez 10 minut w temperaturze 4°C, po czym zebrano osad zawierający resztki mineralne oraz bakterie glebowe. Przygotowano kilka rozcieńczeń osadu, które posłużyły do wysiania bakterii na szalki petriego zawierające podłoże stałe w postaci ekstraktu glebowego. Szalki inkubowano 7 dni w temperaturze 23°C, po czym kolonie bakteryjne o unikalnej morfologii były przenoszone do bankowania na płytce 96 dołkowej. Kolonie bankowano w 100 ąl płynnego ekstraktu glebowego z dodatkiem 15% glicerolu, a następnie przechowywano w temp -80°C. W ten sposób wyizolowano i zabezpieczono 238 środowiskowych szczepów bakteryjnych.

Wyizolowane mikroorganizmy testowano pod kątem zdolności do degradacji laurylosiarczanu sodu, poprzez wysiewanie na zestalone podłoże bazowe (na litr: 3,5 g KH2PO4; 1,5 g K2HPO4; 0,25 g (NH4)2SO4; 0,5 g NaCI; 0,14 g MgSO4; 0,15 g MgCh6H2O) (Shahbazi et al., 2013), suplementowane detergentem w stężeniu 2 g/l. Zastosowanie w tym przypadku podłoże bazowe chrakteryzuje się wytrąceniem detergentu w postaci jednolitej zwiesiny, co ułatwiało obserwację przejaśnienia powstającego wokół rosnącej kolonii bakteryjnej. Mikroorganizmy wykazujące przejaśnienie obserwowane wokół kolonii bakteryjnej inkubowanej przez 3-4 dni w temperaturze 30°C uznawane były za zdolne do rozkładu SDS (Fig. 1). W ten sposób zidentyfikowano 36 izolatów wykazujących charakterystyczne przejaśnienie dookoła kolonii. Ponadto poprzez kilkukrotny posiew redukcyjny na podłoża stałe została sprawdzona czystość i uzyskana homogenność izolatów.

PL 237 601 B1

P r z y k ł a d 2 - Oznaczenie zdolności wyizolowanych szczepów do degradacji anionowych środków powierzchniowo czynnych

Zdolność rozkładania laurylosiarczanu sodu przez 36 szczepów mikroorganizmów przejawiających zdolność do tworzenia przejaśnienia na podłożach stałych była kwantyfikowana przy pomocy metod kolorymetrycznych.

Wyselekcjonowane szczepy były hodowane przez noc w 0,1 X LB (10 x rozcieńczone podłoże LB) bez dodatku detergentu, z wytrząsaniem 140 rpm. Nocną hodowlę zwirowywano, przemywano podłożem minimalnym (na litr: 0,5 g Na₂HPO4; 0,5 g KH2PO4; 0,25 g (NH4)2SO4) nie zawierającym żadnego źródła węgla a po przemyciu wykorzystywano do zainokulowania do OD600 = 0,05-0,15 płynnego podłoża minimalnego z dodatkiem 0,1% SDS (1 g/L), jako jedynego źródła węgla. Stężenie detergentu mierzono kolorymetrycznie w momencie inokulowania hodowli (godzina 0) oraz po 2, 4, 6, 8 i 24 godzinach od momentu rozpoczęcia eksperymentu. Użyte w tym eksperymencie podłoże minimalne jest optymalne od pomiarów kolorymetrycznych ze względu na brak precypitacji detergentu.

Stężenie laurylosiarczanu sodu mierzono w płytkach 96 dołkowych z wykorzystaniem odczynnika Sains-AII (Sigma_Aldrich) jak opisano wcześniej (Rusconi et al., 2001) z niewielkimi modyfikacjami. Koncentrat odczynnika Stains-AII w stężeniu 1 mg/mL przygotowywano w roztworze izopropanokwoda (50:50). Stężenie robocze odczynnika Stains-AII uzyskiwano przez rozcieńczenie 1 ml koncentratu w 18 ml wody z dodatkiem 1 ml formamidu. Próbki pohodowlane pobrane w odpowiednim czasie zwirowywano a klarowny supernatant pozbawiony bakterii rozcieńczano 10 razy w wodzie. W dołku płytki 96 dołkowej umieszczano 8 pL rozcieńczonej próbki, do której dodawano 100 pL wody oraz 100 pL roboczego roztworu Stains-AII. Absorbancję powstałego roztworu mierzono po 10 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej przy długości fali 438 nm. Pomiary stężenia detergentu w poszczególnych punktach czasowych mierzone były w tryplikacie dla danego szczepu bakteryjnego. Wyniki pomiarów kolorymetrycznych potwierdzane były dodatkowo, z użyciem ilościowej spektrometrii masowej.

Dwa z pośród 36 szczepów bakteryjnych nie zaadoptowały się do warunków hodowli płynnej, co objawiało się minimalnym wzrostem gęstości optycznej hodowli oraz brakiem rozkładu detergentu po 24 godzinach inkubacji. W przypadku pozostałych 34 szczepów zaobserwowano spadek początkowego stężenia detergentu mieszczący się od 6,4% do 99,2% (Fig. 2A). Przeanalizowane w ten sposób szczepy zostały podzielone na cztery grupy pod kątem ich zdolności do degradacji laurylosiarczanu sodu:

• Szczepy niedegradujące - 2 izolaty, które nie adaptowały się do warunków hodowli, • Szczepy wolno degradujące - 14 izolatów, które w ciągu 24 godzin rozłożyły mniej niż

30% początkowej ilości detergentu, • Szczepy ze średnią zdolnością do degradacji - 15 izolatów, które w ciągu 24 godzin rozłożyły od 31% do 70% początkowej ilości detergentu.

• Szczepy szybko degradujące - 5 izolatów, które w ciągu 24 godzin rozłożyły ponad 71% początkowej ilości detergentu.

Do ostatniej, najbardziej obiecującej grupy mikroorganizmów należy szczep oznaczony jako AP3_22, który rozłożył około 50% i 81% początkowej ilości laurylosiarczanu sodu w odpowiednio 6 i 8 godzin (Fig. 2B). W ciągu 24 godzin eksperymentu z pomiarem kolorymetrycznym szczepy szybko degradujące detergent rozłożyły 74.1% - AP3_10; 84.6% - AP3_16; 85.1% - AP3_19, 79.4% - AP3_20 oraz 99.2% - AP3_22 detergentu z początkowego jego stężenia równego 1 g/L. Ten eksperyment pokazał również silnie dodatnią korelację pomiędzy stopniem rozkładu detergentu a wzrostem gęstości optycznej hodowli bakteryjnej (współczynnik korelacji r = 0.86) (Fig. 2A). Szczepy AP3_16 i AP3_22 posiadają bardzo zbliżony profil wzrostu (Fig. 2C), jednakże w zaczny sposób różnią się tempem degradacji SDS (Fig. 2B).

P r z y k ł a d 3 - Identyfikacja taksonomiczna hodowalnych szczepów degradujących anionowe środki powierzchniowo czynne, w tym pięciu najbardziej wydajnych szczepów.

Przeprowadzono analizę taksonomiczną wyizolowanch 36 szczepów w oparciu o sekwencjonowanie metodą Sangera amplikonów genu 16S rRNA zawierających region V3V4 (około 1500 par zasad).

Mała podjednostka (16S) genu rRNA była namnażana przy pomocy kolonijnego PCR z użyciem następujących starterów: 27F (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG) SEK ID NR: 7 oraz 1492R (GGTTACCTTGTTACGACTT) SEK ID NR: 8 (Lane, 1991). Po przygotowaniu matrycy DNA danego szczepu reakcję PCR prowadzono w objętości 50 pL używając polimerazy High-Fidelity DNA Polymerase (Thermo) z dodatkiem buforu HF. Reakcję PCR prowadzono w następujący sposób :

PL 237 601 B1 jeden cykl 99°C przez 5 min; 10 cykli 99°C przez 30 s, 60°C przez 30 s i 72°C przez 45 s; oraz 20 cykli 99°C przez 30 s, 50°C przez 30 i 72°C przez 45 s, ostateczna elongacja 72°C przez 5 min. Produkty reakcji PCR - fragmenty genu 16S rRNA (o długości około 1500 par zasad) oczyszczano z użyciem zestawu AMPureXP w proporcji 0.8:1, po czym wklonowywano do wektora pCR™ Blunt ll-TOPO® (ThermoFisher) zgodnie z protokołem producenta i transformowano bakterie Escherichia coli (Sambrook and Russell, 2001). Plazmidy izolowano przy pomocy zestawu do minilizy Plasmid Mini kit (A&A Biotechnology) a wstawka zawierająca fragment genu 16S rRNA była następnie sekwewncjonowana metodą sangera z użyciem starterów M13 Forward (GTAAAACGACGGCCAG) SEK ID NR: 9 oraz M13 Reverse (CAGGAAACAGCTATGAC) SEK ID NR: 10 (ThermoFisher). Sekwencje nukleotydowe genów 16S rRNA porównywano do bazy danych EzBioCloud (Yoon et al., 2017). Ogólna anliza filogenetyczna wykazała, że wybranych 36 szczepów bakteryjnych należy do rodzaju Pseudomonas.

Sekwencja 16S rRNA dla Pseudomonas jessenii AP3_16 zdeponowanego pod nr B/00139 przedstawiona jest jako SEK ID NR: 5 natomiast dla Pseudomonas laurylosulfatovorans AP3_22 zdeponowanego pod nr B/00140 jako SEK ID NR: 6.

Z użyciem programu ClustalW (Larkin et al., 2007) zbudowano drzewo filogenetyczne dla pięciu najlepiej degradujących szczepów oraz dla 27 szczepów referencyjnych, których sekwencje nukleotydowe pozyskano z bazy danych NCBI. Ten sam program wykorzytano do analiz typu “Multiple sequence alignment” w celu zidentyfikowania fragmentów genów o maksymalnej identyczności. Drzewo maksymalnego prawdopodobieństwa skonstruowano z użyciem programu MEGA 6.0 (Tamura et al., 2013) z metodą szacowania wewnętrznego wsparcia drzewa (pseudopróbkowania - ang. bootstrap) dla 1000 powtórzeń według modelu Tamura-Nei zastosowanego w ustawieniach wyjściowych.

Dokładna analiza dopasowania sekwencji amplikonów 16S rRNA (ang. Sequence alignment) pięciu szczepów najlepiej degradujących wykazała, że szczepy te są do siebie podobne pod wględem taksonomicznym ale nie są identyczne (Fig. 3). Porównanie tych sekwencji do bazy danych EzBioCloud wykazało, że szczepy oznaczone jako AP3_10, AP3_16, AP3_20 i AP3_22 wykazały najwyższy stopień podobieństwa do szczepu referencyjnego Pseudomonas jessenii CIP 105274 (odpowiednio 99,79%, 99,24%, 99,86%, 99,79%). Natomiast szczep oznaczony jako AP3_19 wykazał największe podobieństwo do szczepu referencyjnego Pseudomonas mohnii Ipa-2 (99,45%). Analiza drzewa filogenetycznego (Fig. 3) wskazuje, że wyizolowne szczepy bakteryjne najlepiej degradujące laurylosiarczan sodu należą do tego samego kładu, przy czym szczepy AP3_10, AP3_16 oraz AP3_22 klastrują się ze szczepami referencyjnymi P. jessenii CIP 1052274, P. reinekei CCUG 53116, P. koreensis LMG 21318 oraz P. moraviensis DSM 16007. Natomias izolaty AP3_16 i AP3_19 klastrują się do grupy szczepów referencyjnych tworzonych przez wyżej wymieniony kład wzbogacony o P. moorei CCUG 53114 i P. vancouverensis DSM 17555. Powyższe analizy taksonomiczne wskazują, że wyizolowane mikroorganizmy pod względem taksonomicznym należą do rodziny Pseudomonas, przy czym pięć najlepiej degradujących izolatów przynależy do subgrupy Pseudomonas jessenii.

P r z y k ł a d 4 - Wyznaczanie optymalnych warunków wzrostu dla nowych szczepów bakterii, oraz maksymalnego tolerowanego stężenia środków powierzchniowo czynnych

Wyselekcjonowane szczepy bakteryjne zaszczepiano na noc do płynnego podłoża LB, następnie nocne hodowle były zwirowywane, przemywane dwukrotnie podłożem minimalnym bez żadnego źródła węgla. Tak przygotowanymi bakteriami zaszczepiano podłoże minimalne do uzyskania początkowej gęstości optycznej hodowli OD6oo = 0,15. Podłoże minimalne suplementowano dodatkowo rosnącym stężeniem detergentu 0,5-50 g/L jako jedynym źródłem węgla. Tak przygotowane tryplikaty każdego ze szczepów hodowano w głębokich płytkach 48 dołkowych, a gęstość optyczną hodowli (OD600) odczytywano po 24 godzinach inkubacji. Analiza statystyczna uzyskanych wyników prowadzona była w środowisku R (wersja 3.5.0) i obejmowała analizę Kruskal-Wallis’a oraz analizę post-hok Dunn’a, przy poziomie istotności ustawionym na 0,05.

Wzrost gęstości optycznej hodowli szczepu bakterii powyżej wyjściowej gęstości optycznej OD600 = 0,15 był interpretowany jako wynik dodatni testu pokazujący, że w danych warunkach stężenia detergentu bakterie są zdolne do jego wykorzystania jako źródła węgla, co pozwalało na wzrost i podział komórek (Fig. 4). Wszystkie szczepy bakterii szybko degradujących laurylosiarczan sodu osiągnęły najwyższą gęstość optyczną hodowli (OD600 = 0,55-0,75) w obecności 1 g/L detergentu. To może świadczyć, że to stężenie detergentu było optymalne pod kątem zapewnienia wystarczającej ilości źródła węgla, przy minimalnym efekcie toksycznym. Pierwsze objawy toksyczności zaobserwowane były przy stężeniu 2,5 g/L laurylosiarczanu sodu, gdzie OD600 wszystkich pięciu szczepów szybko

PL 237 601 B1 degradujących było podobne lub niższe niż w przypadku hodowli prowadzonej w obecności 0,5 g/L detergentu. Stężenie 5 g/L detergentu miało istotny toksyczny wpływ na szczep AP3_10, gdyż po 24 godzinach hodowli gęstość optyczna tego szczepu nie uległa zmianie w porównaniu do wartości początkowej (p-value = 0,76), podczas gdy dla pozostałych czterech szczepów ODeoo istotnie wzrosło i wynosiło od 0,22 do 0,4 (p-value < 0,05). W obecności detergentu na poziomie 10 g/L jedynie szczep AP3_16 zachował zdolność do wzrostu (p-value = 0,02). Zachowanie tego szczepu w wyższych stężeniach laurylosiarczanu sodu było również niezwykle interesujące, gdyż w obecności tak wysokich stężeń detergentu jak 20 g/L i 25 g/L gęstość optyczna hodowli tego szczepu wynosiła 0,12, co jest wynikiem statystycznie nieistotnym w porównaniu do wyjściowego OD600 = 0,15 (p-value = 0,45). Takie zachowanie szczepu AP3_16 sugeruje, że w tak wysokich stężeniach detergentu zachowuje on zdolność przeżycia.

P r z y k ł a d 5 - Chemotaksja wyizolowanych szczepów bakteryjnych w kierunku źródła laurylosiarczanu sodu

Odpowiedź chemotaktyczną pięciu wyselekcjonowanych szczepów bakteryjnych zbadano w teście płytkowym z wykorzystaniem glukozy jako kontroli pozytywnej. Nocną hodowlę szczepów AP3_10, AP3_16, AP3_19, AP3_20, oraz AP3_22 w pożywce LB użyto do zainokulowania 50 mL świeżej pożywki LB (1:50, v/v). Po 2 godzinach inkubacji w temperaturze 30°C komórki zebrano przez żwirowanie 8000 rpm, 15 minut, przemyto dwukrotnie roztworem 0,9% NaCI, zawieszono do końcowej gęstości optycznej OD600 = 0,1 w pożywce minimalnej o temperaturze ok. 40°C z dodatkiem 0,45% bacto-agar, po czym wylewano na płytki petriego o średnicy 30 mm. Po zestaleniu podłoża z zawiesiną bakterii na środek szalki nakraplano pięć mikrolitrów 20% roztworu SDS lub 20% roztworu glukozy. Efekt chemotaksji mikroorganizmów w kierunku nakroplonego centralnie źródła węgla obserowano jako koncentryczne pierścienie (Fig. 5) po 8 godz. inkubacji w temperaturze 30°C. W kontroli pozytywnej wszystkie pięć szczepów wykazało migrację do środka szalki gdzie nakroplono glukozę. W przypadku szalek z nakroplonym roztworem SDS wzrost bakterii uzyskał formę koncentrycznych pierścieni, świadczących że dany szczep rósł w obszarze optymalnego stężenia detergentu.

P r z y k ł a d 6 - Morfologiczna, fizjologiczna i biochemiczna analiza szczepów bakteryjnych mających największą zdolność do rozkładania anionowych środków powierzchniowo czynnych

Barwienie Grama przeprowadzono metodą standardową. Morfologię komórek analizowano za pomocą mikroskopii świetlnej i mikroskopii elektronowej transmisyjnej po nocnej hodowli w pożywce LB w temperaturze 30°C. Barwienie wici bakteryjnych przeprowadzono techniką na mokro przy użyciu barwnika Ryu (Heimbrook i wsp., 1989). Tolerancję szczepów na temperaturę, pH i zasolenie analizowano poprzez monitorowanie zmian gęstości optycznej (OD600) pożywek w hodowlach (w porównaniu do kontroli niezaszczepianej). Hodowle nocne rozcieńczono w świeżej pożywce LB stosownie do wymagań testów: pH 7 dla oznaczenia temperatury (4°C, 8°C, 15°C, 23°C, 30°C, 37°C, 42°C); pH 3,0-11,0 do analizy tolerancji pH lub uzupełnione NaCI do końcowych stężeń: 0%, 0,5%, 1,0% -9,0% (z przyrostem o 1%) w celu analizy tolerancji na zasolenie. Początkowa gęstość optyczna przy 600 nm (OD600) wynosiła 0,05 w każdym teście. Hodowle inkubowano z wytrząsaniem w 30°C z wyjątkiem testów temperaturowych. Aktywność katalazy określono w teście z dodatkiem roztworu nadtlenku wodoru o stężeniu 3% (objętościowo). Aktywność oksydazy testowano stosując krążki zawierające oksolan N, N-dimetylo-p-fenylenodiaminy i α-naftol (Sigma-Aldrich). Pozostałe właściwości biochemiczne i aktywność enzymów określono stosując płytkę GEN III Biolog i paski API 20NE zgodnie z instrukcjami producentów. Degradację laurylosiarczanu sodu testowano w minimalnym podłożu z 0,1% SDS jako jedynym źródłem węgla i mierzono za pomocą testu kolorymetrycznego, jak opisano w Przykładzie 2. Wytwarzanie pigmentu fluorescencyjnego badano na podłożu King B (King i wsp., 1954). Jako szczepów odniesienia użyto szczepów typowych dla najbardziej spokrewnionych gatunków: Pseudomonas jessenii DSM 17150^T(=CIP 105274T), Pseudomonas baetica DSM 26532T (=390a^T, =LMG 25716T), Pseudomonas reinekei DSM 18361T (=MT-1^T), Pseudomonas vancouverensis DSM 17555T oraz Pseudomonas umsongensis DSM 16611T zakupionych w kolekcji DSMZ.

Na podstawie cech morfologicznych, fizjologicznych i biochemicznych szczepy: Pseudomonas laurylsulfatovorans AP3_22 zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM) Instytutu Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN pod numerem B/00140 i Pseudomonas jessenii AP3_16 zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM) Instytutu Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN pod numerem B/00139 zostały zaliczone do rodzaju Pseudomonas. Oba szczepy tworzyły okrągłe kolonie o gładkich kształtach i zabarwieniu beżowym (AP3_22) lub mlecznym (AP3_16). Szczepy

PL237 601 Β1 są pałeczkami Gram-ujemnymi o wielkości średnio: 0,6 μm szerokości i 1,9 μm długości, poruszającymi się za pomocą pojedyńczej wici. Komórki wytwarzają pigment fluorescencyjny na podłożu King B. Wzrost obserwowany jest w 0-6% NaCI (optymalny 0-2%), 5-10 pH (optymalny pH 7) i w temperaturze 8-42°C (optymalnie 30°C). Szczepy wykazują pozytywny wynik w testach na aktywność katalazy i oksydazy, a negatywny dla ureazy, dehydrolazy argininy i β-galaktozydazy. W przeciwieństwie do szczepu AP3_16, szczep AP3_22 podobnie jak P. jessenii DSM17150 i P. umsongensis DSM 16611, ma zdolność do redukcji azotanów. Szczepy nie hydrolizują eskuliny oraz żelatyny a także nie fermentują glukozy. Szczepy asymilują: L-arabinozę, glukonian potasu, kwas dekanowy, kwas jabłkowy, cytrynian trisodowy i kwas fenylooctowy, ale nie asymilują kwasu adypinowego. Pełne informacje dotyczące cech fenotypowych uzyskanych w testach Biolog GENUI i API20 NE zostały wymienione w Tabeli 1 poniżej. Podstawowymi cechami odróżniającymi szczepy AP3_16 i AP3_22 od pokrewnych gatunków Pseudomonas były następujące: wykorzystanie dodecylosiarczanu sodu (SDS) jako jedynego źródła węgla oraz zdolność utleniania sacharozy, kwasu α-keto-masłowego i kwasu acetylooctowego. Zawartość G + C w DNA szczepu AP3_22 wynosi 59,6 mol% a szczepu AP3_16 wynosi 60,1 mol%, kiedy wartości dla szczepów kontrolnych wynoszą: P. jessenii DSM 171501 - 59,7; P. baetica DSM 265321 - 58,8; P. reinekei DSM 18361T - 59,2 i P. umsongensis DSM 16611T-59,7.

Tabela 1

Fizjologiczna i biochemiczna charakterystyka szczepów P. jessenii AP3_16 i P. \aurylsulfatovorans AP3_22 w porównaniu do innych blisko spokrewnionych szczepów typowych gatunków należących do rodzaju Pseudomonas. Szczepy testowano z użyciem płytek Biolog GEN III oraz pasków API20 NE. Kolumny: 1 - P. jessenii AP3_16 (zdeponowany jako B/00139); 2 - P. \aurylsulfatovorans AP3_22 (zdeponowany jako B/00140); 3 - P. jessenii CIP 105724^T; 4 - P. vancouverensis DSM 17555^T; 5 - P. umsongensis DSM 16611^T; 6 - P. reinekei DSM 18361^T; 7 - P. baetica DSM26532^T. +, wynik pozytywny; -, wynik negatywny.

Źródło węgla	1	2	3	4	5	6	7
Dekstryna	+	-	-	-	-	-	-
D-Maltoza	-	-	-	-	-	-	-

PL 237 601 Β1

Źródło węgla	1	2	3	4	5	6	7
D-Trehaloza	-	-	-	-	-	-	-
D-Celobioza	-	-	-	-	-	-	-
Gentiobioza	-	-	-	-	-	-	-
S^chsrozs	+	+	-	-	-	-	-
D-turanoza	-	-	-	-	-	-	-
Stachylozae	-	-	-	-	-	-	-
D-rafinoza	-	-	-	-	-	-	-
A-D-laktoza	-	-	-	-	-	-	-
D-melibioza	-	-	-	-	-	-	-
B-metylo-D-glukozyd	-	-	-	-	-	-	-
D-Salicyna	-	-	-	-	-	-	-
N-acetylo-D-glukozoamina	+	+	4-	4-	-	-	4-
N-acetylo-B-D-mannozamina	-	-	-	-	-	-	-
N-acetylo-D-Galaktozamina	-	-	-	-	-	-	-
Kwas N-acetylouraminowy	-	-	-	-	-	-	-
A-D-glukoza	4-	4-	4-	4-	+	4·	4-
D-mannoza	+	4-	4-	4-	+	+	4-
D-fruktoza	+	4-	4-	4-	+	4-	4-
D-galaktoza	+	4-	4-	-	+	4-	4-
3-methylo glukoza	-	-	-	-	-	-	-
D-fukoza	+	-	-	4-	-	4-	4-
L-fukoza	+	-	-	4-	-	4-	-
L-ramnoza	-	-	-	-	-	-	-
Inozyna	-	-	-	4-	-	4-	4-
D-sorbitol	-	-	-	-	-	-	-
D-mannitol	+	-	4-	4-	-	4-	4-
D-arabitol	+	-	4-	4-	-	4-	4-
Mio-inozytol	-	-	-	-	-	-	-
Glicerol		4“	+	+	+	4-	+
D-glukozo-6PO4	-	-	-	-	-	-	-
D-fruktozo-6-PO4	+	-	-	-	-	4-	4-
Kwas D-asparaginowy	-	-	4-	-	-	4-	-
D-seryna	+	4-	4-	4-	-	4-	4-
Żelatyna	-	-	-	-	-	-	-
Glicylo-L-prolina	-	-	4-	-		4-	-

PL237 601 Β1

Źródło węgla	1	2	3	4	5	6	7
L-alanina	+	+	+	+	+	+	+
L-arginia	+	+	4-	4-	4-	4-	4-
Kwas L-asparaginowy	+	+	4-	4-	4-	4-	4-
Kwas L-glutaminowy	+	4-	4*	4-	4-	4-	4-
L-histydyna	+	+	4-	4-	4-	4-	4-
Kwas L-piroglutaminowy	+	+	4-	-	4-	4-	4-
L-seryna	+	+	4-	4-	4-	4-	4-
Pektyna	+	+	+	-	+	-	+
Kwas D-galakturonowy	+	+	-	-	4-	4-
Lakton kwasu L-galakturonowego	+	+	-	-	4-	4-	-
Kwas D-glukonowy	+	+	4-	4-	4-	4-	4-
Kwas D-glukuronowy	+	+	-	-	4-	-	-
Glukuronamid	+	+	-	4-	4-	-	-
Kwas D-galaktarowy	+	+	4-	4-	4-	4-	-
Kwas chinowy	+	+	4-	-	4-	4-	4-
Kwas D-glukarowy	+	+	4-	-	4-	4-	4-
Kwas p-hydroxyfenylooctowy	-	-	4-	-	-	-	-
Pirogronian metylu	+	+	4-	4-	4-	4-	4-
Ester metylowy kwasu D-mlekowego	-	-	-	-	-	-	-
Kwas L-mlekowy	+	+	4-	4-	4-	4-	4-
Kwas cytrynowy	+	+	4-	4-	4-	4-	4-
Kwas a -keto-g łuta rowy	+	+	4-	4-	4-	4-	4-
Kwas D-jabłkowy	+	+	4-	4-	4-	-	-
Kwas L-jabłkowy	+	+	4-	4-	4-	4-	4-
Kwas bromo-bursztynowy	+	+	4-	4-	4-	-	4-
Tween 40	+	+	4-	-	4-	-	4-
Kwas y-aminobutylowy	+	+	4-	4-	4-	4-	4-
Kwas a-hydroxy-butylowy	4-	4-	4-	4’	4-	4-	4-
Kwas β -hydroxy-D,L-butylowy	+	4-	4-	4-	4-	4-	4-
Kwas a -keto-butylowy	+	4-	-	-	-	-	-
Kwas acetylooctowy	+	4-	-	-	-	-	-
Kwas propionowy	+	4-	4-	4-	4-	4-	4-
Kwas octowy	+	4-	4-	4-	4-	4-	4-
Kwas mrówkowy	+	+	+	+	+	+	-
Pozostałe testy dla płytek Biolog Gen III	1	2	3	4	5	6	7

PL 237 601 Β1

Źródło węgla	1	2	3	4	5	6	7
pH 6	+	+	+	+	+	+	+
pH 5	+	+	+	4-	4-	4-	4-
1% NaCI	+	+	+	4-	4-	+	4-
4% NaCI	+	+	-	4-	4-	+	4-
8% NaCI	-	-	-	-	4-	+	4-
1% mleczan sodu	+	+	+	4-	4-	4-	4-
Kwas fusydowy	+	+	+	+	4-	+	+
D-Seryna	+	+	+	+	+	+	+
Troleandomycyna	+	+	4-	4-	4-	4-	4-
Ryfamycyna Sv	+	+	+	4-	4-	+	4-
Minocyklina	-	-	-	-	-	+	4-
Linkomycyna	+	+	+	4-	4-	-i-	4-
Chlorowodorek guanidyny	+	+	+	4-	4-	+	4-
Nia proof 4		4-		+	4-	+	4-
Wankomycyna	+	+	+	4-	4-	4-	4-
Fiolet tetrazoliowy	+	4-	+	+	+	+	+
Błękit tetrazoliowy	+	+	+	4-	4-	+	4-
Kwas nalidynowy	+	+	4-	4-	4-	+	4-
Chlorek litu	+	+	4-	4-	4-	+	4-
Telluryn potasu	+	+	+	4-	4-	+	4-
Aztreonam	+	4-	+	4-	4-	4-	4-
Maślan sodu	4-	-	-	-	-	+	-
Bromian sodu	+	4-	-	4-	4-	4-	4-
API20 NE	1	2	3	4	5	6	7
Redukcja azotynów	-	+	4-	4-	4-	-	-
Wytwarzanie indolu (tryptofan)	-	-	-	-	-	-	-
Fermentacja glukazy	-	-	-	-	-	-	-
Dehydrolaza argininy	-	-	-	-	4-	-	+
Ureaza	-	-	-	-	-	-	-
Hydroliza eskuliny	-	-	-	-	-	-	-
Hydroliza żelatyny	-	-	-	-	-	-	4-
β-Galaktozydaza	-	-	-	-	-	-	-
Asymilacja:
Glukoza	+	+	4-	4-	4-	+	4-
Arabinoza	-	+	4-	-	4-		4-

PL237 601 Β1

Źródło węgla	1	2	3	4	5	6	7
Mannoza	+	+	+	-	+	-	+
Mannitol	+	-	+	+	-	+	+
N-acetylo-glukozamina	+	+	+	+	-	-	+
Maltoza	-	-	-	-	-	-	-
Glukonian potasu	+	+	+	+	+	+	+
Kwas dekanowy	+	4-	+	+	+	+	4-
Kwas adypinowy	-	-	-		-		-
Jabłczan	+	4-		+	4	+	4*
Cytrynian trisodowy	+	+	+	+	+	+	+
Kwas fenylooctowy	+	+	+	+	+	+	-

Przykład 7 - Wstępna identyfikacja białek enzymatycznych produkowanych przez szczepy bakteryjne odpowiedzialne za rozkład anionowych środków powierzchniowo czynnych

7.1. Przygotowanie surowych ekstraktów komórkowych

Nocna hodowla bakterii szczepów AP3_10, AP3_16, AP3_19, AP3_20, and AP3_22 prowadzona była w podłożu LB, po czym komórki zwirowywano i zawieszano w płynnym podłożu minimalnym z dodatkiem laurylosiarczanu sodu lub glukozy w stężeniu 1 g/L tak by uzyskać gęstość optyczną OD6oo = 0,15. Tak przygotowane hodowle inkubowano przez 20 godzin w temperaturze 30°C z wytrząsaniem 140 rpm. Następnie, komórki zwirowywano 10 000 g przez 15 minut w temperaturze pokojowej, a osad komórek zawieszano w buforze do lizy o składzie: 50 mM HEPES, pH 7,5, 300 mM NaCI, 20 mM imidazol, 50 μΜ PMSF, 10 mM β-merkaptoetanol, 0,1% Tween 20, 10% glicerol oraz lizozym. Dodatkowo dezintegrację komórek bakteryjnych prowadzono przez sonikację (Diagenode sonication system) w kąpieli wodnej o temperaturze 4°C przy następujących parametrach urządzenia: 30 cykli przy nastawie High power (300 W), gdzie jeden cykl składał się z 30 sekund sonikacji i 30 sekund przerwy. Resztki komórek usuwano przez wirowanie 14 000 g przez 30 minut w temperaturze 4°C, a uzyskany surowy ekstrakt komórkowy przechowywano zamrożony w temperaturze -20°C.

7.2. Badanie obecności enzymów o aktywności alkilosulfataz - Zymografia w niedenaturującym żelu poliakrylamidowym.

W tym celu surowe ekstrakty uzyskane z każdego ze szczepów szybko degradujących laurylosiarczan sodu rozdzielano w 8% niedenaturującym żelu poliakrylamidowym nakładając próbki w ilości 60 μg totalnego białka w surowym ekstrakcie. Elektroforezę prowadzono w 0,378 M buforze Trisglicynowym (pH 8,3) przy stałym napięciu zasilacza 100 V, w temperaturze 4°C.

Żel odpłukiwano w ultra czystej wodzie destylowanej (MiliQ), a następnie inkubowano w roztworze wywołującym (20 mM SDS rozpuszczonym w 0,1 M Tris-CI, pH 7,5) o tempraturze 30°C. Obecność enzymów o aktywności alkilosulfataz widoczna była na żelu, jako białe prążki nierozpuszczalnego alkoholu laurylowego.

Szczepy bakteryjne oznaczone numerami AP3_10, AP3_20, and AP3_22, wykazały obecność tylko jednego prążka po wywołaniu reakcji zymograficznej, co sugeruje obecność w ich cytoplazmie tylko jednego białka o aktywności alkilosulfatazy (Fig. 6). Podczas gdy analiza zymograficzna szczepów AP3_16 oraz AP3_19, które pod względem filogenetycznym różnią się od siebie, wykazała obecność dwóch prążków mogących sugerować obecności dwóch enzymów lub dwóch izoform białka o aktywności alkilosulfatazy.

Przykład 8 - Sekwencjonowanie genomów wyizolowanych szczepów bakteryjnych mających największą zdolność do rozkładania anionowych środków powierzchniowo czynnych, oraz identyfikacja w sekwencjach genetycznych potencjalnych białek enzymatycznych, mających zdolność rozkładu anionowych środków powierzchniowo czynnych

8.1. Izolacja genomowego DNA, przygotowanie bibliotek do sekwencjonowania i sekwencjonowanie

PL 237 601 B1

Genomowy DNA szczepów AP3_22 i AP3_16 został wyizolowany według wcześniej opisanego protokołu (Furmanczyk et al., 2017) z wykorzystaniem delikatnej lizy enzymatycznej przy użyciu lizozymu, achromopeptydazy i proteinazy K, a następnie oczyszczony poprzez ekstrakcję mieszaniną fenokchloroform i wytrącony przy użyciu etanolu. Uzyskany w ten sposób DNA został wykorzystany do przygotowania dwóch typów bibliotek w technologii Illumina, dla każdego ze szczepów: biblioteki typu pair-end ze średnią wielkością wstawki ok. 500 pz (powstałej przy użyciu zestawu „KAPA HTP Library Preparation Kit for Illumina platforms” firmy KAPA) oraz biblioteki typu mate-pair o średniej wielkości wstawki równej 8 000 pz (powstałej przy użyciu zestawu „Nextera® Mate Pair Sample Prep”). Poprawność wykonanych bibliotek sprawdzono z zastosowaniem zestawu „2100 Bioanalyzer (Agilent) HighSensitivity DNA Assay”, a ilość otrzymanych bibliotek zweryfikowano stosując technikę qPCR i zestaw „KAPA Library Quantification Kit for the Illumina”. Do sekwencjonowania wysoko przepustowego wykorzystano sekwenator MiSeq wraz z dedykowanymi zestawami odczynników (MiSeq Reagent Kit v3, 600 cycles) i zadaną długością odczytu 2x 300 pz.

8.2. Składanie genomów szczepów AP3_22 i AP316, ich adnotacja oraz identyfikacja potencjalnych genów zaangażowanych w pierwszy etap rozkładu SDS

Odczyty uzyskane z sekwencjonowania po odpowiednim przefiltrowaniu (Furmanczyk et al., 2017) posłużyły do odtworzenia sekwencji genomów badanych szczepów. Do składania wykorzystano program SPAdes 3.9.0 (Bankevich et al., 2012). Otrzymane sekwencje nukleotydowe o wielkości większej niż 1000 pz zadnotowano przy użyciu NCBI PGAP (Tatusova et al., 2016). Wśród otwartych ramek odczytu, na podstawie podobieństwa sekwencji (m.in. poprzez użycie takich narzędzi jak BLAST) zidentyfikowano potencjalne sulfatazy mogące brać udział w degradacji SDSu. W genomie szczepu AP3_22 zidentyfikowano sześć takich genów, a w genomie drugiego szczepu - AP3_16 - piętnaście pełnej długości genów.

P r z y k ł a d 9 - Klonowanie zidentyfikowanych białek enzymatycznych do wektorów ekspresyjnych. Wykazanie aktywności białek enzymatycznych (z natywnym promotorem) w innym gospodarzu niż bakteria środowiskowa

9.1. Klonowanie genów potencjalnych sulfataz i weryfikacja ich funkcjonalności w E. coli

Zaprojektowano startery (Tabela 2 poniżej) umożliwiające namnożenie obszarów zawierających potencjalne sulfatazy (sześć z genomu szczepu AP3_22 i piętnaście z genomu szczepu AP3_16) zaangażowane w dekompozycję SDS-u, wraz z ich potencjalnymi obszarami promotorowymi. Fragmenty genomu zostały namnożone w reakcji PCR. W skład mieszaniny PCR (50 gl) wchodziły: matryca (genomowy DNA każdego ze szczepów (100 ng/gl) - 1 gl); mieszanina dNTPów (0,2 mM każdy); para starterów (0,2 gM każdy), polimeraza Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (0,02 U/gl, Thermo) wraz z dołączonym buforem HF (1x). Program użyty do namnażania pożądanych fragmentów składał się z etapów: wstępnej denaturacji (99°C przez 5 minut), 35 cykli: denaturacji (99°C przez 30 sekund), przyłączania starterów (56°C przez 30 s), elongacji (72°C przez 30-90 sekund (szczegóły w Tabeli 2 poniżej)); oraz końcowej elongacji (72°C przez 5 minut). Produkty amplifikacji oczyszczano z użyciem AMPureXP (w stosunku 0,8 x produktu PCR: 1,0 x AMPureXP), a następnie wklonowano do plazmidu pCR™Blunt ll-TOPO® (Invitrogen), i wprowadzono metodą transformacji do E. coli TOP10. Po potwierdzeniu wklonowania odpowiednich sekwencji poprzez sekwencjonowanie poszczególnych insertów przystąpiono do przeprowadzenia wstępnego testu zdolności uzyskanych szczepów do degradacji SDSu. Hodowle prowadzono w podłożu LB uzupełnionym SDSem (0,1%) i kanamycyną. Hodowle nocne badanych szczepów rozcieńczano 1:50 (v/v). Pomiaru stężenia detergentu dokonano po 24 godz. hodowli (37°C, 140 rpm) z zastosowaniem metody kolorymetrycznej opartej na odczynniku Stains-all.

PL237 601 Β1

Tabela 2

Sekwencje starterów użytych do namnażania metodą PCR genów kodujących białka o potencjalnej aktywności sulfatazowej.

Nazwa startera	Sekwencja	SEK ID NR	Nazwwa produktu PCR	Przewidywana wielkość Produktu (nt)	Czas anilingu	Opis
AP3_16SUL_1F	ACGCCTGTTTAATCGTGTCC	11	CD175JM430	2010	1 min 05 sek	Klonowanie ze szczepu AP3_16 białek natywnych o aktywności sulfatazy
AP3_16SUL_1R	GCGCTGAAATGATGTGATCC	12
AP3_16SUL_2F	TGACAGACAGTCGCAGATCG	13	CD175_07120	1867	1 min 05 sek
AP3_16SUL_2R	CAAGCCAGCTCCTACAGTTG	14
AP3_16SUL_3F	AGTCGGGCCATGTCTTGCTC	15	CD175_08470	1846	1 min 05 sek
AP3_16SUL_3R	GGCCTGCCACCACAAAGTAG	16
AP3J6SUL 4F	GCGGTGCTGCATATCTGACG	17	CD175_08875	1815	1 min 05 sek
AP3_16SUL_4R	ATTCAGGCGGCCTCGATACG	18
AP3_16SUL_5F	ATTCGACCGGCGCATTTAGC	10	CD175_09340	1895	1 min 05 sek
AP3J6SUL_5R	TGCAGATCGGGCAAGTGTTC	20
AP3_16SUL_6F	TCAAGGGTGGCTGGAAATAC	21	CD175„14500	2724	1 min 30 sek
AP3_16SUL_6R	TGAGGGTCAAGGCAAATACG	22
AP3_16SUL_7F	CAGCAGCACTGCGAGAAGAC	23	CD175_14675	2008	1 min 05 sek
AP3_16SUL_7R	TTCGGCCGTTATCGAGGAGG	24
AP3_16SUL_8F	GTAAACGCCTCTGTGGTTTC	25	CD175_14710	1850	1 min 05 sek
AP3_16SUL_8R	TGGATTCGGCTGTTACTTGG	26
AP3_16SUL_10F	GGCGGATCAAACAAGTGGTC	27	CD175.27360	796	30 sek
AP3_16SUL_10R	GTAGCGGATGCGTTCAAGTG	28
AP3_16SUL_11F	TGGACGCTCGACCCTTATTC	29	CD175_30210	1820	1 min 05 sek
AP3_16SUL_11R	CTACAGAGGATCGCGTACAC	30
AP3_16SUL_12F	GTTCGGCGTCATCTCATAAC	31	CD175_04445	2272	1 min 30 sek
AP3_16SUL_12R	TATTCAGGGTCGCGAAGTAG	32
AP3_16SUL_13F	GCAGCATTCGCCGACTAGAC	33	CD175-30230	2008	1 min 05 sek
AP3_16SUL_13R	CCGGGCAAGGACAAGGAATC	34
AP3_16SUL_14F	GGCGATCAGGTGCAGCAAAG	35	CD175 09595	2321	1 min 30 sek
AP3_16SUL_14R	CCCGCATCATCGTTGACCTC	36
AP3J6SUL_15F	TCCACGGTATAGCCTTTGAG	37	CD175_13190	2235	1 min 30 sek
AP3_16SUL„15R	TTAACGTTCGCCGACTTGAC	38
AP3_16SUL_16F	AAGC GGCAGACCAAATCCTC	39	CD175_22425	1902	1 min 05 sek
AP3_16SUL_16R	TGCGGAAGGTTCGGATGAAG	40
AP3_22SUL_1F	CGCCCTTGACCGTTATTCCC	41	B0D71_00255	1853	1 min 05 sek	Klonowanie ze szczepu AP3_22 białek natywnych o aktywności sulfatazy
AP3_22SUL_1R	TGGCCGGATATCGGTTCCTC	42
AP3.22SJL2F	GCCCTTGGCATGTTCTGGTATC	43	B0D71_03695	1912	1 min 05 sek
AP3_22SUL_2R	TTTGCGGGTGCCTTGAGTAG	44
AP3.22SUL3F	ACAGTCGCAGATCGGTCGTCTC	45	B0D71_04065	1852	1 min 05 sek
AP3_22SUL_3R	ATAGGGCCGAAACGGTCCCAAG	46
AP3_22SUL_4F	TTTGCCACTGCCTGACTC	47	B0D71.15760	2421	1 min 30 sek
AP3_22SUL_4R	GGCGGCATCACATTCAAC	48
AP3_22SUL_5F	ATTCGGCTGACTACTTGG	49	B0D71-16010	1850	1 min 05 sek
AP3_22SUL_5R	CCCGGTAATGAAGACTGAG	50
AP3_22SUL_6F	GGCGGATCAAACAAGTGGTC	51	B0D71_22840	1859	1 min 05 sek
AP3_22SUL_6R	CGCATCACATCGGTCATTGTAG	52

Podsumowanie eksperymentu zaprezentowano na Fig. 7 i w Tabeli 3 poniżej. Dzięki klonowaniu fragmentów genomów kodujących potencjalne sulfatazy otrzymano dwa zmodyfikowane szczepy

PL 237 601 Β1

E. coli niosące plazmid pCR z białkiem CD175_09595 bądź B0D71_15760 zdolne do całkowitej degradacji SDS-u w warunkach testowanych w eksperymencie.

Tabela 3

Wyniki analizy zdolności degradacji SDS przez komórki E. coli transformowane plazmidami niosącymi białka o potencjalnej aktywności sulfatazowej zidentyfikowane w genomach szczepów AP3_16 (B/00139) oraz AP3_22 (B/00140).

Kod numeryczny białka	% SDS	odchylenie standardowe	Automatyczna adnotacja białka
CD175_04430	103,09	5,43	sulfataza ary Iowa
CD175_07120	97,2	4,88	sulfataza ary Iowa
CD175_08470	101,1	0,85	sulfataza ary Iowa
CD175_08875	97,23	2,38	sulfataza ary Iowa
CD175 09340	95,77	2,59	sulfataza ary Iowa
CD175_14500	117,94	9,88	sulfataza ary Iowa
CD17514675	100,94	1,22	sulfataza ary Iowa
CD175_14710	120,09	3,58	sulfataza ary Iowa
CD17527360	97,63	0,84	sulfataza ary Iowa
CD175_30210	100,62	2,79	sulfataza ary Iowa
CD175_04445	99,85	3,78	Białko hipotetyczne
CD17530230	103,16	5,05	Sulfataza alkilowa
CD175_09595	0,35	1,69	Sulfataza alkilowa/arylowa
CD17513190	106,49	11,05	sulfataza
CD17522425	111,23	10,86	sulfataza
B0D71_00255	102,87	3,45	sulfataza ary Iowa
B0D71_03695	101,66	4,23	sulfataza ary Iowa
B0D7104065	99,68	3,8	sulfataza ary Iowa
B0D71_15760	-1,27	1,06	Sulfataza alkilowa/arylowa
B0D7116010	107,59	1,64	sulfataza ary Iowa
B0D71_22840	105,69	1,15	sulfataza ary Iowa
E.coii -
kontrola negatywna	105,93	1,95

Przykład 10 - Nadprodukcja, oczyszczanie i charakterystyka nowych białek enzymatycznych mających zdolność do degradacji anionowych środków powierzchniowo czynnych

10.1. Klonowanie genów kodujących alkilosulfatazy w wektorze pET

Geny kodujące alkilosulfatazy zidentyfikowane w przykładzie 9 zostały namnożone z wykorzystaniem następujących par starterów: A16S14FT (GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGATGCCTCGTTTCACCTTGAG) (SEK ID NR: 53) i A16S14RT (GGTGACCCTGAAAATACAAATTCTCCTCGAGCGGGGTAACGATATTGAACT) (SEK ID NR: 54) dla białka CD175_09595 oraz A22S04FT (GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGATGCCTCGTTTCACCTTGAGCCCTCG)

PL 237 601 B1 (SEK ID NR: 55) i A22S04RT (GGTGACCCTGAAAATACAAATTCTCCTCGAGAGGCGTGACGATATTGAACTGCG) (SEK ID NR: 56) dla białka B0D71_15760. W skład mieszaniny PCR (50 μl) wchodziły: matryca (genomowy DNA każdego ze szczepów (100 ng/μl) - 1 μl); mieszanina dNTPów (0,2 mM każdy); para starterów (0,2 μM każdy), polimeraza Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (0,02 U/μl, Thermo) wraz z dołączonym buforem HF (1x). Program użyty do namnażania żądanych fragmentów składał się z etapów: wstępnej denaturacji (99°C przez 5 minut), 10 cykli: denaturacji (99°C przez 30 sekund), przyłączania starterów (56°C przez 30 s), elongacji (72°C przez 65 sekund); a następnie 20 cykli: denaturacji (99°C przez 30 sekund), przyłączania starterów (62°C przez 30 s), elongacji (72°C przez 65 sekund); oraz końcowej elongacji (72°C przez 5 minut). Produkty amplifikacji oczyszczano z użyciem AMPureXP (w stosunku 0,8 x produktu PCR: 1,0 x AMPureXP) według zaleceń producenta, a następnie klonowano, stosując protokół „sequence- and ligation-independent cloning” (Jeong, 2012), do wektora pET28 umożliwiającego otrzymanie białka rekombinowanego ze znacznikiem histydynowym (6xHis) na C-końcu białka (z możliwością odcięcia znacznika za pomocą proteazy TEV). W tym celu wektor trawiono enzymami restrykcyjnymi Ncol i Xhol (enzymy FastDigest, Thermo), a następnie oczyszczano poprzez izolację z żelu agarozowego po rozdziale elektroforetycznym. Wektor (100 ng) mieszano z odpowiednią wstawką w stosunku molowym 1:4 i inkubowano z dodatkiem polimerazy T4 DNA (0,15 U/μl, New England Biolabs) w 1x buforze NEBuffer2 (New England Biolabs) z dodatkiem BSA (0,1 mg/ml) przez 2,5 minuty w temperaturze pokojowej. Reakcje zatrzymywano poprzez 10 minutową inkubację na lodzie. Następnie mieszaninę transformowano do E. coli MH1. Spośród wyrosłych transformantów selekcjonowano niosące właściwą wstawkę (poprzez trawienie restrykcyjne a następnie sekwencjonowanie insertów). Właściwy konstrukt wprowadzano metodą transformacji do szczepu E. coli BL21.

10.2. Nadprodukcja i oczyszczanie wybranych białek enzymatycznych o aktywności alkilosulfataz

Nocne hodowle szczepów E. coli BL21 (DE3) niosące plazmidy pET ze sklonowanymi genami kodującymi białka B0D71_15760 bądź CD175_09595, rozcieńczono (1:50,v:v) w świeżej porcji podłoża LB z dodatkiem kanamycyny. Po 2 godzinnej inkubacji hodowli (37°C, 150 rpm) przeniesiono je do 18°C i zaindukowano IPTG do końcowego stężenia 0,5 mM. Hodowle prowadzono przez 24 godz. w 18°C z wytrząsaniem (150 rpm). Następnie hodowle żwirowano (8000 rpm, 20 minut, RT), a osady bakteryjne zawieszono w buforze lizującym (50 mM HEPES, pH 7,5, 300 mM NaCI, 20 mM imidazol, 50 μM PMSF, 10 mM β-merkaptoetanol, 0,1% Tween 20, 10% glicerol z dodatkiem lizozymu) i poddano sonikacji z użyciem sonikatora Diagenode w schłodzonej łaźni wodnej (4°C), stosując moc 300 W w 30 cyklach (30 s impuls i 30 s przerwa), a następnie wirowano w 4°C przez 20 minut (14000 x g). Białka rekombinowane oczyszczano z zastosowaniem zestawu „Protino 96 Ni-IDA”. Supernatanty uzyskane po wirowaniu nanoszono na aktywowane kolumny. Złoże płukano 50 objętościami buforu płuczącego I (50 mM HEPES pH7,5, 300 mM NaCI, 10 mM MgCI), a następnie 25 objętościami buforu płuczącego II (50 mM HEPES pH7,5, 300 mM NaCI). Związane białka eluowano trzema frakcjami (300 μl każda) buforu elucyjnego (50 mM HEPES, 300 mM NaCI, 250 mM imidazol pH 7,5). Frakcje elucyjne zawierające oczyszczone białko dializowano przez noc wobec buforu dializacyjnego (50 mM HEPES, 300 mM NaCI, 10% glicerol, 10 mM β-merkaptoetanol, pH 7,5). Stężenie białka oznaczano z użyciem odczynnika „Bio-Rad Protein Colorimetric Assay” wobec krzywej wzorcowej BSA.

10.3. Określenia właściwości przykładowych alkilosulfataz

Test aktywności alkilosulfataz

Aktywność każdego z wstępnie oczyszczonych białek B0D71_15760 oraz CD175_09595 badano metodą kolorymetryczną z wykorzystaniem odczynnika Stains-all. 2 μl preparatu enzymatycznego (150 μg/mL) dodawano do 100 μl buforu (50 mM Tris-HCI) z dodatkiem 0,01% SDS-u. Mieszaninę inkubowano przez 5 minut w 37°C. Reakcję zatrzymywano poprzez przeniesienie mieszaniny do 100°C i 10 minutową inkubację. Oznaczania zawartości SDS w mieszaninie reakcyjnej dokonywano za pomocą metody kolorymetrycznej w płytce 96-dołkowej, wobec równolegle przygotowywanej krzywej wzorcowej. Do 8 μl mieszaniny poreakcyjnej dodawano 100 μl wody i 100 μl roboczego roztworu Stains-all (0,05 mg/ml Stains-all w mieszaninie formamid:izopropanol:woda (2:1:37)). Po 10 minutach inkubacji dokonywano pomiaru absorbancji przy 438 nm. W przypadku obu preparatów białek zaobserwowano aktywność degradacji SDS.

PL 237 601 B1

Wpływ temperatury i pH na aktywność przykładowych białek

Wpływ temperatury na aktywność alkilosulfataz B0D71_15760 oraz CD175_09595 badano poprzez testowanie aktywności przykładowych enzymów w różnych temperaturach (4-90°C) w 50 mM buforze Tris-HCI z dodatkiem 0,01% SDS. Wpływ pH na aktywność alkilosulfataz badano poprzez testowanie aktywności przykładowych enzymów w różnych warunkach pH (4,0-10,0) w następujących 50 mM buforach: buforze cytrynianowym (pH 4-5), buforze cytrynianowo- fosforanowym (pH 6), buforze Tris-HCI (pH 7-8) oraz buforze glicynowym (pH 9-10). Relatywną aktywność enzymatyczną definiowano wobec maksymalnej aktywności osiąganej w optymalnych warunkach spośród testowanych wariantów.

Termostabilność alkilosulfataz

Termostabilność badanych białek B0D71_15760 i CD175_09595 określano poprzez oznaczanie aktywności enzymatycznej preparatów poddanych wpływowi wysokiej temperatury, poprzez godzinną inkubację w temperaturze: 60°C bądź 70°C. Relatywną aktywność enzymatyczną definiowano wobec aktywności preparatu enzymatycznego niepoddawanego preinkubacji w podwyższonej temperaturze.

Wpływ wybranych substancji na aktywność sulfataz

Zbadano wpływ wybranych jonów (Ca²⁺, Cu²⁺, Mg²⁺, Mn²⁺, Na⁺, K⁺) w formie soli chlorkowych oraz EDTA na aktywność alkilosulfataz B0D71_15760 i CD175_09595. Określone stężenia (10 mM bądź 100 mM) powyższych odczynników dodawano do mieszaniny reakcyjnej, a następnie określano aktywność enzymatyczną poszczególnych preparatów białkowych. Relatywną aktywność enzymatyczną definiowano wobec aktywności osiąganych przez dany enzym w warunkach bez obecności dodatkowych substancji.

Właściwości przykładowych alkilosulfataz

Obydwa enzymy B0D71_15760 i CD175_09595 wykazują aktywność w podobnym zakresie pH (6.0-9.0 pH) z optimum w pH 8.0 (Fig. 8A). Odznaczają się również zachowaniem aktywności w szerokim zakresie temperatur (30-90°C). CD175_09595 wykazuje optimum temperaturowe w 60°C, natomiast B0D71_15760 w 70°C stopniach (Fig. 8B). Wpływ wybranych dodatków na aktywność sulfataz został podsumowany w Tabeli 4 poniżej. Wyniki pokazują, że zarówno K⁺ jak i Mg²⁺ (w obydwu testowanych stężeniach) działają aktywująco na obydwa badane enzymy. Zarówno aktywność B0D71_15760 jak i CD175_09595 jest hamowana przez Cu²⁺, EDTA oraz Ca²⁺ (w wyższym 100 mM stężeniu). Badane alkilosulfatazy różnią się jednak wrażliwością na obecność Na+, Mn2+ oraz 10 mM Ca²⁺. Enzym B0D71_15760 jest aktywowany przez Na⁺ w stężeniu 10 mM, jednak wyższa zawartość tych jonów (100 mM) nie ma znaczącego wpływu na aktywność tej alkilosulfatazy. Z kolei aktywność CD175_09595 jest hamowana wyższym stężeniem Na⁺, podczas gdy niższe stężenie jonów sodu nie ma wpływu na aktywność tego enzymu. Jony manganu Mn²⁺ nie mają wpływu na aktywność CD175_09595, chociaż wykazują one pozytywny wpływ na aktywność B0D71_15760, podobnie jak Ca²⁺ w niższym testowanym (10 mM) stężeniu.

Przeprowadzone badania termostabilności dowodzą, że białko B0D71_15760 zachowuje swoją aktywność po godzinnej inkubacji w temperaturze 60°C, ale nie 70°C. Alkilosulfataza CD175_09595 jest wrażliwa na inkubację w obydwu testowanych temperaturach. Obydwa enzymy są inaktywowane poprzez 10-minutową inkubację w 100°C (Tabela 4).

PL237 601 Β1

Tabela 4

Wyniki analizy wpływu na aktywność enzymów CD175_09595 i B0D71_15760 takich czynników jak jony metali, chelator jonów metali oraz inkubacja w wysokich temperaturach.

Czynnik	Stężenie (mM)	B0D71. Aktywność relatywna (%)	.15760 Odchylenie standardowe	CD175_09595
Aktywność relatywna (%)	Odchylenie standardowe
Ca	10	134.1	9.9	107.6	7.9
Ca	100	65.8	16.6	10.6	8.3
Na	10	132.1	6.5	103.7	5.6
Na	100	108.9	7.3	89.0	4.5
K	10	157.4	6.2	125.1	1.5
K	100	197.4	13.8	132.0	11.5
Mg	10	181.1	8.3	124.4	8.3
Mg	100	158.1	2.1	126.0	4.0
Cu	10	61.0	25.4	48.0	10.0
Mn	10	182.6	14.4	109.4	7.3
EDTA	10	32.4	4.8	33.0	3.7
		B0D71.	.15760	CD175_09595
		Aktywność		Aktywność
Preinkubaca	Odchylenie	Odchylenie
		relatywna		relatywna
		standardowe	standardowe
		(%)		(%)
60°C, 1h	79.5	15.7	-7.7	8.5
70°C, 1h	-0.2	15.7	3.8	2.9
100°C, 10 min	0.0	4.7	8.5	9.4

Referencie:

Abboud, Μ. M., Khleifat, K. M., Batarseh, M., Tarawneh, K. A., Al-mustafa, A., and Al-madadhah, M. (2007). Different optimization conditions required for enhancing the biodegradation of linear alkylbenzosulfonate and sodium dodecyl sulfate surfactants by novel consortium of Acinetobacter calcoaceticus and Pantoea agglomerans. Enzyme Microb. Technol. 41,432-439. doi:10.1016/j.enzmictec.2007.03.011.

Bankevich, A., Nurk, S., Antipov, D., Gurevich, A. A., Dvorkin, M., Kulikov, A. S., et al. (2012). SPAdes: A new genome assembly algorithm an its applications to single-cell sequencing. J. Comput. Biol. 19, 455-477. doi:10.1089/cmb.2012.0021.

Boltes, I., Czapińska, H., Kahnert, A., von Bulów, R., Dierks, T., Schmidt, B., et al. (2001). 1.3 A Structure of Arylsulfatase from Pseudomonas aeruginosa Establishes the Catalytic Mechanism of Sulfate Ester Cleavage in the Sulfatase Family. Structure 9, 483-491.

Chaturvedi, V., and Kumar, A. Diversity of culturable sodium dodecyl sulfate (SDS) degrading bacteria isolated from detergent contaminated ponds situated in Varanasi city, India. Int. Biodeterior. Biodegrad. 65, 961-971. doi: 10.1016/j.ibiod.2011.07.005.

PL 237 601 B1

Cserhati, T., Forgacs, E., and Oros, G. (2002). Biological activity and environmental impact of anionie surfactants. Environ. Int. 28, 337-348.

Davison, J., Brunei, F., Phanopoulos, A., Prozzi, D., and Terpstra, P. (1992). Cloning and sequencing of the Pseudomonas genes determining sodium dodecyl sulfate degradation. Gene 114, 19-24.

Eerlingen, R. C., Cillen, G., Delcour, J. A. (1994). Enzyme-Resistant Starch. IV. Effect of Endogenous Lipids and Added Sodium Dodecyl Sulfate on Formation of Resistant Starch. Cereal Chem. 71, 170-177.

Furmanczyk, E., Kaminski, M., Dziembowski, A., Lipinski, L., and Sobczak, A. (2017). Draft Genome Sequence of the Type Strain Pseudomonas jessenii DSM 17150. Genome Announc. 5.

Hagelueken, G., Adams, T. M., Wiehlmann, L., Widow, U., Kolmar, H., Tummler, B., et al. (2006). The crystal structure of SdsA1, an alkylsulfatase from Pseudomonas aeruginosa, defines a third class of sulfatases. 103, 7631-7636.

Heimbrook, M. E., Wang, W. E. N. L. A. N. L., and Campbell, G. (1989). Staining bacterial flagella easily. J. Clin. Microbiol. 27, 2612-2615.

Im, S. H., Jeong, Y. H., and Ryoo, J. J. (2008). Simultaneous analysis of anionic, amphoteric, nonionic and cationic surfactant mixtures in shampoo and hair conditioner by RP-HPLC/ELSD and LC/MS. Anal. Chim. Acta 619, 129-136. doi:10.1016/j.aca.2008.03.058.

Ivanković, T., i Hrenović, J. (2010). Surfactants in the environment. Arh Hig Rada Toksikol 61, 95-110. doi:10.2478/10004-1254-61-2010-1943

Jeong, J., Yim, H., Ryu, J., Lee, H. S., Lee, J., Seen, D., et al. (2012). One-step sequence- and ligation-independent cloning (SLIC): Rapid and versatile cloning method for functional genomics studies. Appl. Envir. Microbiol. 78, 5440-5443. doi: 10.1128/AEM.00844-12.

John, E. M., Sharrel, J., Asok, A. K., and M.S, J. (2015). Pseudomonas plecoglossicida S5, a novel nonpathogenic isolate for sodium dodecyl sulfate degradation. Env. Chem Lett 13, 117-123. doi: 10.1007/s10311-015-0493-7.

Kertesz, M. A. (1999). Riding the sulfur cycle - metabolism of sulfonates and sulfate esters in Gram-negative bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 24, 135-175.

King, E., Raney, M., and Ward, D. (1954). Two simple media for the demonstration of pyocianin and fluorescin. J. Lab. Clin. Med. 44, 301-307.

Klebensberger, J., Rui, O., Fritz, EvaSchink, B., and Bodo, P. (2006). Cell aggregation of Pseudomonas aeruginosa strain PAO1 as an energy-dependent stress response during growth with sodium dodecyl sulfate. Arch Microbiol, 417-427. doi: 10.1007/s00203-006-0111-y.

Lane, D. J. (1991). “16S/23S rRNA sequencing,” in Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics, eds. E. Stackebrandt and M. GoodFellow, 115-175.

Larkin, M. A., Blackshields, G., Brown, N. P., Chenna, R., Mcgettigan, P. A., McWilliam, H., et al. (2007). Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics 23, 2947-2948.

doi:10.1093/bioinformatics/btm404

Lechuga, M., Fernandez-serrano, M., Jurado, E., and Rios, F. (2016). Ecotoxicology and Environmental Safety Acute toxicity of anionic and non-ionic surfactants to aquatic organisms. Ecotoxicol. Environ. Saf. 125, 1-8. doi:10.1016/j.ecoenv.2015.11.027.

Long, M., Ruan, L., and Li, F. (2011). Heterologous expression and characterization of a recombinant thermostable alkylsulfatase (sdsAP). Extremophiles 15, 293-301.

doi:10.1007/s00792-011-0357-4.

Masdor, N., Shukor, M. shukri A., Khan, A., Halmi, M. I. E. Bin, Abdullah, siti R. S., Shamaan, N. Ar., et al. (2015). Isolation and characterization of a molybdenum-reducing and SDS- degrading Klebsiella oxytoca strain Aft-7 and its bioremediation application in the environment. Biodiversitas 16, 238-246. doi:10.13057/biodiv/d160219

Moldes, A. B., Paradelo, R., Vecino, X., Cruz, J. M., Gudina, E., Rodrigues, L., et al. (2013). Partial characterization of biosurfactant from lactobacillus pentosus and comparison with sodium dodecyl sulphate for the bioremediation of hydrocarbon contaminated soil. Biomed Res. Int. 2013. doi:10.1155/2013/961842.

Muller, I., Kahnert, A., Pape, T., Sheldrick, G. M., Meyer-Klaucke, W., Dierks, T., et al. (2004). Crystal Structure of the Alkylsulfatase AtsK: Insights into the Catalytic Mechanism of the

PL 237 601 B1

Fe (II) R-Ketoglutarate-Dependent Dioxygenase Superfamily. Biochemistry, 3075-3088. doi: 10.1021/bi035752v.

Rahman, M., Rusnam, M., Gusmanizar, N., Masdor, N.., Lee, C. H., Shukor, M. S., et al. (2016). MOLYBDATE-REDUCING AND SDS-DEGRADING Enterobacter sp. STRAIN NENI-13. Nov. Biotechnol. Chim. 15, 166-181. doi:10.1515/nbec-2016-0017.

Sambrook, J., and Russell, R. (2001). Molecular cloning: A laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Sandbacka, M., Christianson, I., and Isomaa, B. (2000). The acute toxicity of surfactants on fish cells, Daphnia magna and fish-A comparative study. Toxicol. Vitr. 14, 61-68. doi: 10.1016/S0887-2333(99)00083-1

Schober, M., Gadler, P., Knaus, T., Kayer, H., Birner-gr, R., Gully, C., et al. (2011). A Stereoselective Inverting sek - Alkylsulfatase for the Deracemization of sek - Alcohols. Org. Lett. 13, 16-19. doi: 10.1021/ol201635y.

Shahbazi, R., Kasra-kermanshahi, R., Gharavi, S., Nejad, Z. M.-, and Borzooee, F. (2013). Screening of SDS-degrading bacteria from car wash wastewater and study of the alkylsulfatase enzyme activity. 5, 153-158.

Shukor, M. Y., Husin, W. S. W., Rahman, M. F. A., Shamaan, N. A., and Syed, M. A. (2009). Isolation and characterization of an SDS-degrading Klebsiella oxytoca. 30, 129-134.

Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A., and Kumar, S. (2013). MEGA6: Molecular evolutionary genetics analysis version 6.0. Mol. Biol. Evol. 30, 2725-2729.

doi:10.1093/molbev/mst197.

Tatusova, T., Dicuccio, M., Badretdin, A., Chetvernin, V., Nawrocki, P., Zaslavsky, L., et al. (2016). NCBI prokaryotic genome annotation pipeline. 44, 6614-6624.

doi:10.1093/nar/gkw569.

Toesch, M., Schober, M., and Faber, K. (2014). Microbial alkyl- and aryl-sulfatases: Mechanism, occurrence, screening and stereoselectivities. Appl. Microbiol. Biotechnol. 98, 1485-1496. doi: 10.1007/S00253-013-5438-0.

Yeldho, D., Rebelio, S., and Jisha, M. S. (2011). Plasmid-Mediated Biodegradation of the Anionic Surfactant Sodium Dodecyl Sulphate, by Pseudomonas aeruginosa S7. Bull Env. Contam Toxicol 86, 110-113. doi:10.1007/s00128-010-0162-2.

Yoon, S., Ha, S., Kwon, S., Lim, J., Kim, Y., Seo, H., et al. (2017). Introducing EzBioCloud: a taxonomically united database of 16S rRNA gene sequences and whole-genome assemblies. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 67, 1613-1617. doi:10.1099/ijsem.0.001755.

Yu, H., Zhu, L., and Zhou, W. (2007). Enhanced desorption and biodegradation of phenanthrene in soil-water systems with the presence of anionic-nonionic mixed surfactants. J. Hazard. Mater. 142, 354-361. doi:10.1016/j.jhazmat.2006.08.028.

Zangeneh, H., Zinatizadeh, A. A. L., and Feizy, M. (2014). A comparative study on the performance of different advanced oxidation processes (UV / O 3 / H 2 O 2) treating linear alkyl benzene (LAB) production plant’ s wastewater. J. Ind. Eng. Chem. 20, 1453-1461. doi:10.1016/j.jiec.2013.07.031.

Zhou, W., and Zhu, L. (2008). Enhanced soil flushing of phenanthrene by anionic-nonionic mixed surfactant. Water Res. 42, 101-108. doi:10.1016/j.watres.2007.07.021.

Wykaz istotnych sekwencji:

SEK ID NR: 1SEK ID NR: 2SEK ID NR: 3SEK ID NR: 4SEK ID NR: 5SEK ID NR: 6przedstawia sekwencję aminokwasową alkilosulftazy B0D71_15760 uzyskaną ze szczepu AP3_22 przedstawia sekwencję aminokwasową alkilosulftazy CD175_09595 uzyskaną ze szczepu AP3_16 przedstawia sekwencję nukleotydową genu kodującego alkilosulftazę

B0D71_15760 uzyskaną ze szczepu AP3_22 przedstawia sekwencję nukleotydową genu kodującego alkilosulftazę

CD175_09595 uzyskaną ze szczepu AP3_16 przedstawia sekwencję 16S rRNA dla Pseudomonas jessenii AP3_16 zdeponowanego pod nr E3/00139 przedstawia sekwencję 16S rRNA dla Pseudomonas laurylosulfatovorans AP3_22 zdeponowanego pod nr E3/00140

PL 237 601 Β1

Wersja elektroniczna listy sekwencji złożona z niniejszym zgłoszeniem zawiera odniesienie do wszystkich sekwencji od SEK ID NR: 1 do SEK ID NR: 56 (wskazanych w treści opisu). Poniższa lista sekwencji zawiera jedynie odniesienia do sekwencji istotnych.

LISTA SEKWENCJI:

<110> IBB <120> Sposób oczyszczania środowiska zanieczyszczonego estrami siarkowymi, nowe szczepy bakteryjne.....

<130>

PK/5037/AGR

<160> <170> <210> <211> <212> <213> <400>

6 Patentln version 1 657 PRT Pseudomonas spp. 1

3.5 (B/00140)

Met 1

Pro

Arg

Phe

Thr 5

Leu

Ser

Pro

Arg

Gly 10

Leu

Leu

Ala

Cys

Leu 15

Ile

Thr

Ala

Cys

Leu 20

Al a

Gin

Ser

Val

Val 25

Ala

Ala

Asp

Ala

Pro 30

Val

Ala

Ala

Ser

Ser 35

Gin

Thr

Thr

Ala

Ser 40

Asn

Ala

Ala

Val

Leu 45

Gin

Gin

Leu

Pro

Phe 50

Thr

Asp

Arg

Thr

Asp 55

Phe

Glu

Ser

Val

Ser 60

Lys

Gly

Leu

Ile

Ala 65

Pro

Phe

Lys

Gly

Gin 70

Val

Lys

Asp

Ala

Ser 75

Gly

Lys

Val

Ile

Trp 80

Asp

Ile

Gin

Ala

Tyr 85

Asp

Phe

Leu

Ala

Lys 90

Asp

Lys

Ala

Pro

Asp 95

Ser

Ile

Asn

Pro

Ser 100

Leu

Trp

Arg

Leu

Ala 105

Gin

Leu

Asn

Ala

His 110

Ala

Gly

Leu

Phe

Glu 115

Val

Ser

Pro

Arg

Leu 120

Tyr

Gin

Val

Arg

Gly 125

Phe

Asp

Leu

Ala

Asn 130

Met

Thr

Ile

Ile

Glu 135

Gly

Asp

Asp

Gly

Leu 140

Ile

Ile

Ile

Asp

Pro 145

Leu

Thr

Val

Ala

Glu 150

Thr

Ala

Lys

Ala

Ala 155

Leu

Asp

Leu

Tyr

Tyr 160

Gin

Asn

Arg

Pro

His 165

Lys

Pro

Val

Val

Ala 170

Val

Ile

Tyr

Ser

His 175

Thr

His

Val

Asp

His 180

Phe

Gly

Gly

Val

Arg 185

Gly

Val

Ile

Asp

Glu 190

Ala

Asp

Val

Lys

Ala 195

Gly

Lys

Val

Lys

Val 200

Phe

Ala

Pro

Ala

Gly 205

Phe

Met

Glu

His

Val 210

Met

Ser

Glu

Asn

Val 215

Tyr

Ala

Gly

Thr

Ala 220

Met

Ser

Arg

Arg

Ala 225

Gin

Tyr

Gin

Phe

Gly 23 0

Ser

Leu

Leu

Pro

Arg 235

Gly

Asp

His

Gly

Gin 240

Val

Asp

Ala

Gly

Leu 245

Gly

Lys

Ser

Ser

Pro 250

Asn

Gly

Gly

Thr

Val 255

Thr

Leu

Ile

Pro

Pro 260

Thr

Asp

Leu

Ile

Asp 265

Lys

Glu

Leu

Glu

Thr 270

Arg

Thr

Ile

Ala

Gly 275

Leu

Glu

Val

Glu

Phe 280

Gin

Leu

Thr

Pro

Gly 285

Thr

Glu

Ala

Pro

Ala 290

Glu

Met

Asn

Leu

Tyr 295

Leu

Pro

Gin

Leu

Arg 300

Ala

Leu

Cys

Met

Ala 305

G1U

Asn

Ala

Thr

Gin 310

Met

Met

His

Asn

Ile 315

Leu

Thr

Pro

Arg

Gly 320

Ala

Gin

Val

Arg

Asp 325

Ala

Lys

Ala

Trp

Ala 330

Glu

Tyr

Leu

Asp

Ser 335

Ser

Leu

Ala

Arg

Tyr 340

Gly

Asn

Lys

Ser

Asp 345

Val

Leu

Phe

Ala

Gin 350

His

Asn

Trp

Pro

Thr 355

Trp

Gly

Gly

Glu

Arg 360

Ile

Arg

Thr

Phe

Leu 365

Ala

Asp

Gin

Arg

Asp 370

Met

Tyr

Ala

Phe

Leu 375

Asn

Asp

Arg

Thr

Leu 330

His

Leu

Leu

Asn

Gin 385

Gly

Leu

Thr

Pro

Leu 390

Glu

Ile

Ala

Asp

Ser 395

Ile

Lys

Lys

Leu

Pro 400

PL237 601 Β1

Gly Asn Leu Asp

Ser Phe Asn Thr 420

Gly Asn Pro Ala 435

Arg Thr Val Glu 450

Arg Gly Ala Ile 465

Asn Gin Val Leu

Gin Ala Glu Ala

500

Trp Arg Asn Met 515

Pro Pro His Ser

530

Ser Pro Glu Met 545

Lys Ala Val Gly

Asn Lys Asp Phe 580

Thr Gly Leu Asn 595

Thr Leu Glu Gin

610

His Lys Gly Leu 625

Leu Met Ser Ser

Pro

Gin Lys 405

Arg Ala

Asn Leu

Ala Met

Thr Gin

470 Phe Ala 485 Leu Glu

Tyr Leu

Gly Ser

Phe Ehe

550 His Asp 565

Asn Leu

Pro Gin

Ile Ser

Ile Lys 630

Leu Asp 645

Trp	Tyr	Thr	Arg 410	Gly	Tyr	Tyr	Gly	Ser 415	Leu
Val	Tyr	Gin 425	Arg	Tyr	Met	Gly	Phe 430	Tyr	Asp
Asn	Pro 440	Leu	Pro	Pro	Val	Glu 445	Thr	Ala	Arg
Gly 455	Gly	Glu	Ala	Ala	Val 460	Leu	Glu	Lys	Met
Gly	Asp	Tyr	Arg	Trp 475	Ala	Ala	Gin	Leu	Gly 480
Asn	Pro	Asp	Asn 490	Gly	Asp	Ala	Arg	Lys 495	Thr
Gin	Leu	Gly 505	Tyr	Gin	Ser	Glu	Asn 510	Ala	Thr
Thr	Gly 520	Ala	Met	Glu	Leu	Arg 525	Thr	Gly	Val
Ser 535	Val	Ser	Val	Asp	Met 540	Val	Arg	Ala	Met
Asp	Tyr	Leu	Ala	Val 555	Arg	Leu	Asp	Ser	Glu 560
Leu	Thr	Leu	Asn 570	Trp	Thr	Phe	Glu	Asp 575	Gin
Thr	Leu	Arg 585	Asn	Gly	Val	Leu	Thr 590	His	Arg
Ala	Asp 600	Ala	Gly	Val	Ser	Met 605	Ser	Lys	Ala
Leu 615	Lys	Gin	Leu	Asp	Phe 620	Pro	Thr	Ala	Ile
Leu	Gin	Gly	Asn	Gly 635	Lys	Lys	Leu	Gly	Glu 64 0
Thr	Phe	Ser	Pro 650	Gin	Phe	Asn	Ile	Val 655	Thr

<210> 2 <211> 657 <212> PRT <213> Pseudomonas spp. (B/00139) <400> 2

Met Pro Arg Phe Thr Leu Ser Pro 15

Thr Ala Cys Leu Ala Gin Ala Val 20

Ala Ser Pro Gin Thr Thr Ala Ser 3540

Pro Phe Thr Asp Arg Thr Asp Tyr 5055

Ala Pro Phe Lys Gly Gin Val Lys 6570

Asp Ile Gin Ala Tyr Asp Phe Leu 35

Val Asn Pro Ser Leu Trp Arg Leu 100

Leu Phe Glu Val Ser Pro Arg Leu 115120

Ala Asn Met Thr Ile Ile Glu Gly 130135

Pro Leu Thr Met Ala Glu Thr Ala

145150

Gin Asn Arg Pro His Lys Pro Val 165

His Val Asp His Phe Gly Gly Val

Gly Leu Leu Ala Cys Leu Ile 1015

Ala Ala Asp Ala Pro Val Ala 30

Ala Ala Val Leu Lys Gin Leu 45

Ser Val Thr Lys Gly Leu Ile 60

Ala Ala Gly Lys Val Ile Trp 75 80

Lys Asp Gin Ala Pro Glu Ser 90 95

Gin Leu Ser Ala His Ala Gly 110

Gin Val Arg Gly Leu Asp Leu 125

Asp Gly Leu Ile Ile Ile Asp 140

Ala Ala Leu Asp Leu Tyr Tyr 155 160

Ala Val Ile Tyr Ser His Thr 170 175

Arg Gly Val Ile Asp Glu Ala Asp

Arg

Val 25 Asn

Glu

Asp

Ala

Ala 105 Tyr

Asp

Lys

Val

PL 237 601 Β1

Val Lys

His Val

210 Ala Gin 225 Val Asp

Leu Ile

Ile Ala

Pro Ala

290 Ala Glu 305 Ala Gin

Leu Ala

Trp Pro

Arg Asp

370 Gin Gly 385 Gly Ser

Ser Phe

Gly Asn

Tyr Thr

450 Arg Ala 4 65 Asn Gin

Gin Ala

Trp Arg

Pro Pro

530

Ser Pro 545

Lys Ala

Asn Lys

Ala Gly

Thr Leu

610 Gin Lys 625

Leu Met

Pro

180 Ala Gly 195

Met Ser

Phe Gin

Ala Gly

Pro Pro

260 Gly Leu 275 Glu Met

Asn Ala

Val Arg

Arg Tyr 34 0

Thr Trp 355

Met Tyr

Leu Thr

Leu Asp

Asn Thr

420 Pro Ala 435

Val Glu

Ala Met

Leu Leu

Glu Ala

500

Asn Met 515

His Ala

Gin Met

Ala Gly

Asp Phe

580 Leu Asn 595 Glu Gin

Gly Leu

Thr Ser

Lys Val

Glu Asn

Phe Gly 230

Leu Gly 245

Thr Asp

Glu Val

Asn Leu

Thr Gin 310 Asp Ala 325

Gly Asp

Gly Gly

Ala Phe

Pro Leu 390 Gin Lys 405

Arg Ala

Asn Leu

Ala Met

Thr Lys 470

Phe Ala 485 Leu Glu

Tyr Leu

Gly Thr

Phe Phe

550 His Asp 565 Asn Leu

Ala Gin

Ile Ser

Ile Lys 630

Leu Asp 645

Lys Val 200

Val Tyr 215

Ser Leu

Lys Ser

Leu Ile

Glu Phe 280

Tyr Leu 295 Met Met

Lys Ala

Lys Ser

Glu Arg 360

Leu Asn 375

Glu Ile

Trp Tyr

Val Tyr

Asn Pro 440

Gly Gly 455

Gly Glu

Asn Pro

Gin Met

Thr Gly 520

Ser Val 535 Asp Phe

Leu Thr

Thr Leu

Ala Asp 600

Leu Lys 615

Leu Gin

Thr Phe

185 Phe Ala

Ala Gly

Leu Pro

Thr Pro

250 Asp Lys 265 Gin Leu

Pro Gin

His Asn

Trp Ala

330 Asp Val 345 Ile Arg

Asp Arg

Ala Asp

Thr Arg 410

Gin Arg 425

Leu Pro

Glu Ala

Tyr Arg

Asp Asn

490 Gly Tyr 505 Ala Met

Ser Val

Leu Ala

Leu Asn

570

Arg Asn 585

Ala Gly

Gin Leu

Gly Asn

Ala Pro 650

Pro Ala

Asn Ala 220 Arg Gly 235 Ser Gly

Glu Leu

Thr Pro

Leu Arg 300

Ile Leu 315

Glu Tyr

Leu Phe

Thr Phe

Thr Leu 380

Ser Ile 395

Gly Tyr

Tyr Met

Pro Val

Ala Val

460 Trp Ala 475

Gly Asp

Gin Ser

Glu Leu

Asp Met 540

Val Arg 555

Trp Thr

Gly Val

Val Thr

Asp Ile

620 Gly Lys 635 Gin Phe

190 Gly Phe 205

Met Ser

Glu Lys

Gly Thr

Glu Thr

270 Gly Thr 285 Ala Leu

Thr Pro

Leu Asp

Ala Gin

350 Leu Ala 365 His Leu

Lys Lys

Tyr Gly

Gly Phe

430 Glu Thr 445 Leu Glu

Ala Gin

Ala Arg

Glu Asn

510 Arg Asn 525 Val Arg

Leu Asp

Phe Glu

Leu Thr

590 Met Ser 605

Pro Thr

Lys Leu

Asn Ile

Met Glu

Arg Arg

Gly Gin

240

Val Thr 255 Arg Thr

Glu Ala

Cys Met

Arg Gly 320

Gly Ser 335

His Asn

Asp Gin

Leu Asn

Leu Pro 400

Ser Leu 415

Tyr Asp

Ala Lys

Lys Met

Leu Gly

480 Lys Ala 495 Ala Thr

Gly Val

Ala Met

Ser Glu

560 Asp Leu 575 His Arg

Lys Ala

Ala Ile

Gly Glu

640

Val Thr 655 <210> 3

PL237 601 Β1 <211> 1974 <212> DNA <213> Pseudomonas spp. (Β/00140) <400> 3 atgcctcgtt gcgcaatcgg aacgccgccg aagggtttga gatatccagg ctgtggcgcc tatcaggtgc atcatcatcg cagaaccgcc ttcggcggcg ttcgctcccg atgagccgcc gtegatgccg accgacctga cagctgaccc gccttgtgca gcgcaagtgc ggcaacaaga atccgcacct cacctgctga ggcaacctgg cgcgcggtgt ctgccacccg ctggagaaaa aatcaagtac ctggagcaac gccatggaac gtgcgggcga aaggccgtgg aacctgaccc gccggcgtga ccgacggcga ttgatgagea tcaccttgag tagtcgccgc tgctgcaaca tcgcgccgtt cctacgattt tggcccagct geggettega acccgctgac cgcacaaacc tgcgcggcgt ccggcttcat gcgcgcaata gcctgggcaa tcgacaagga cgggcaccga tggcggaaaa gtgatgccaa gcgacgtgtt tcctcgccga accagggcct accagaagtg ateagegeta tggaaacagc tgcgtggggc tgttcgccaa tgggttatca tgcgcaccgg tgagcccgga gccatgacct ttcgcaatgg gcatgagcaa tccacaaagg gcctcgatac ccctcgtggg cgatgcaccg actgcccttc caagggccag cctcgccaaa caacgcccat cctggcgaac agtggccgaa ggtggtggcg gategaegag ggaacacgtg ccagttcggc aagctcgccc actggaaacc ggcaccggcg cgccacgcaa ggcctgggcg gttcgcccag ccaacgggac gacgccactg gtacacccgt catgggtttc ccggcgcacg gatcacccag ccccgacaac aagcgaaaac cgtgccgccg gatgttette gaccctgaac cgtgctgacc ggcaaccctg cctgatcaag cttttcgccg ctgctcgctt gtcgcggcca accgaccgca gtcaaggacg gacaaggccc geeggattgt atgaccatca accgccaagg gtgatctaca gccgacgtca atgagegaga agcctgctgc aatggcggca cgcaccatcg gaaatgaacc atgatgcaca gagtacctgg cacaactggc atgtacgcct gaaatcgccg ggctactacg tatgaeggea gtcgaggcca ggtgactacc ggegatgege gccacctggc cactctggca gactacctgg tggaccttcg caccgcaccg gageagatea ttgcaaggca cagttcaata gcctgatcac gctcgcagac ccgactttga cctcgggcaa eggattegat tcgaagtcag tcgaaggcga ccgcactgga gccacaccca aggccggcaa acgtctacgc cccgtggcga ccgtcaccct ccggcctcga tgtacctgcc acatcctcac acagcagcct cgacctgggg tcctcaatga actcgatcaa getegetgag acccggccaa tgggcggtga gctgggcggc gcaaaaccca gcaacatgta gttcggtgtc cggttcgcct aggaccagaa ggctcaatcc gcctcaagca atggcaagaa tcgtcacgcc cgcctgcctg cacggcgagt atcggtctcc ggtcatctgg caacccgagc cccgcggttg tgacgggctg cctgtactac cgtcgaccac ggtcaaggtg cggcaccgcc tcatggccag gatcccgccc ggtggaattc gcaactgcgt ccctcgcggt ggcgcgttac cggcgaacgc ccgcaccttg gaaactgccc tttcaacacc cctcaatccg agcggcggtg gcaactgggc ggccgaggcc cctgaccggt ggtggacatg ggacagtgaa caaggacttc ccaggcggat actggacttc gcttggggag ttga

120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960

1020 1080

1140 1200 1260 1320

1380 1440 1500 1560

1620 1680 1740 1800 '18 60

1920 1974 <210> 4 <211> 1971 <212> DNA <213> Pseudomonas spp. (B/00139) <400> 4 atgcctcgtt gcgcaagcgg aacgccgccg aagggcttga gatatccagg ctctggcgcc tatcaggtgc atcatcatcg cagaaccgac ttcggtggcg ttcgcccccg atgagccgcc gtcgatgccg accgacctga cagttgaccc geettatgea gcgcaagtgc ggcgacaaga atccgcacct cacctgctga tcaccttgag tggtcgccgc tcctgaagca tcgcgccctt cctatgactt tggcccaact gcggcctgga acccgttgac cgcacaaacc tgcgcggggt ccgggttcat gtgegeagtt gcctgggcaa tcgacaaaga cgggcaccga tggcggaaaa gggacgccaa gcgacgtact tcctcgccga accagggcct ccctcgtggg cgatgcaccg actgcccttc caaaggccag cctcgccaaa cagcgcccat cctggcgaac catggccgaa ggtggtggcg catcgacgaa ggaacacgtg ccagttcggc gagcacgccg actggagacc ggcgcccgcg cgccacgcaa ggcctgggcc gttcgcgcag ccagcgcgac gacgccgctg ctgctcgctt gtcgcggcca accgaccgca gtcaaggacg gaccaggccc gccggtctgt atgaccatca accgccaagg gtgatctaca gccgacgtca atgagegaga agcctgctgc ageggeggea cgcaccatcg gaaatgaacc atgatgcaca gagtacctgg cacaactggc atgtacgcct gaaatcgccg gcctgatcac tgcctgcctg 60 gcccgcaaac cacggccagt 120 ccgactacga gtcggtcacc 180 ccgcgggcaa ggtcatctgg 240 cggagtcggt caacccgagc 300 tcgaagtcag ccctcggctg 360 tcgaaggcga cgacgggctg 420 cagcactgga cctgtactac 480 gccacaccca cgtcgaccac 540 aggccggcaa ggtcaaagtg 600 acgtctacgc tggcaacgcc 660 cccgtggcga aaaaggccag 720 ccgtcaccct gatcccgccc 780 ccggcctcga ggtggaattc 840 tgtacctgcc gcaattgcgt 900 acatcctcac cccgcgcggc 960 acggcagcct ggcgcgatac 1020 cgacctgggg cggcgaacgc 1080 tcctcaatga ccgcaccctg 1140 actcgatcaa gaaactgccc 1200

PL 237 601 Β1 ggcagcctgg cgtgcggtgt ctgccacctg ctggagaaaa aatcaattgc ctggagcaga gccatggaac gtgcgggcga aaggccgcag aacctgaccc gccggcgtga cccacggcga ttgatgacca accagaagtg atcagcgtta tggaaacggc tgcgcgcggc tgttcgccaa tgggctatca tgcgcaacgg tgagcccgca gccatgacct tgcgcaacgg ccatgagcaa tccagaaagg gcctcgatac gtacacccgc catgggtttc gaagtacacg gatgaccaag cccggacaac aagtgaaaac cgtaccgccc gatgttcttc gaccctgaac cgtgctgacc ggccaccctg cctgatcaag gtttgcgccg ggctactacg tatgacggca gtcgaggcca ggtgagtacc ggcgatgcgc gccacctggc catgcgggca gacttcctgg tggaccttcg caccgcgccg gaacagatca ttgcaaggca cagttcaata gctcgctgag acccggccaa tgggtggcga gctgggccgc gcaaagctca gcaacatgta cttcggtgtc ccgtgcgtct aggacctgaa gcctcaacgc gcctcaagca atggcaagaa tcgttacccc cttcaacacc cctcaatccg agcggcggta gcaactgggc ggctgaggcg cctgaccggc ggtggacatg ggacagcgaa caaggacttc ccaggcggat actggatatc gctcggggag g

1260

1320

1380

1440

1500

1560

1620

1680

1740

1800

1860

1920

1971 <210> 5 <211> 1532 < 212> DNA < 213> Pseudomonas spp. (B/00139) < 400> 5 tgaagagttt agcggatgac tctgcctggt ggagaaagca gttggtgagg tcacactgga acaatgggcg aagcacttta acagaataag ttaatcggaa ccccgggctc gtggaatttc gcgaccacct gataccctgg tagtggcgca tcaaatgaat gcgaagaacc cgggaacatt taagtcccgt taaggagact cttacggcct ggtggagcta tgaagtcgga ttgtacacac ttcgggagga cgtaggggaa gatcatggct aggagcttgc agtgggggac ggggaccttc taatggctca actgagacac aaagcctgat agttgggagg caccggctaa ttactgggcg aacctgggaa ctgtgtagcg ggactgatac tagtccacgc gctaacgcat tgacgggggc ttaccaggcc gagacaggtg aacgagcgca gccggtgaca gggctacaca atcccacaaa atcgctagta cgcccgtcac cggttaccac cctgcggctg cagattgaac tcctgaattc aacgtttcga gggccttgcg ccaaggcgac ggtccagact ccagccatgc aagggcatta ctctgtgcca taaagcgcgc ctgcattcaa gtgaaatgcg tgacactgag cgtaaacgat taagttgacc ccgcacaagc ttgacatcca ctgcatggct acccttgtcc aaccggagga cgtgctacaa accgatcgta atcgcgaatc accatgggag ggtgtgattc gatcacctcc gctggcggca agcggcggac aaggaacgct ctatcagatg gatccgtaac cctacgggag cgcgtgtgtg acctaatacg gcagccgcgg gtaggtggtt aactgacgag tagatatagg gtgcgaaagc gtcaactagc gcctggggag ggtggagcat atgaactttc gtcgtcagct ttagttacca aggtggggat tggtcggtac gtccggatcg agaatgtcgc tgggttgcac atgactgggg tt ggcctaacac gggtgagtaa aataccgcat agcctaggtc tggtctgaga gcagcagtgg aagaaggtct ttagtgtttt taatacagag cgttaagttg ctagagtatg aaggaacacc gtggggagca cgttgggagc tacggccgca gtggtttaat cagagatgga cgtgtcgtga gcacgttatg gacgtcaagt agagggttgc cagtctgcaa ggtgaatacg cagaagtagc tgaagtcgta atgcaagtcg tgcctaggaa acgtcctacg ggattagcta ggatgatcag ggaatattgg tcggattgta gacgttaccg ggtgcaagcg gatgtgaaag gtagagggtg agtggcgaag aacaggatta cttgagctct aggttaaaac tcgaagcaac ttggtgcctt gatgttgggt gtgggcactc catcatggcc caagccgcga ctcgactgcg ttcccgggcc tagtctaacc acaaggtagc

0 180 240

300

360

420 480

540 600

660 72 0

780

840

900

960

1020 1080

1140

1200

1260

1320

1380

1440 1500 1532

1533 DNA

Pseudomonas 6 <210>

<211>

<212> <213>

<400>

ctgaagagtt gagcggatga atctgcctgg gggagaaagc agttggtgag gtcacactgg gacaatgggc aaagcacttt gacagaataa gttaatcgga gccccgggct ggtggaattt spp.

tgatcatggc caggagcttg tagtggggga aggggacctt gtaatggctc aactgagaca gaaagcctga aagttgggag gcaccggcta attactgggc caacctggga cctgtgtagc (B/00140) tcagattgaa ctcctgaatt caacgtttcg cgggccttgc accaaggcga cggtccagac tccagccatg gaagggcagt actctgtgcc gtaaagcgcg actgcattca ggtgaaatgc cgctggcggc cagcggcgga aaaggaacgc gctatcagat cgatccgtaa tcctacggga ccgcgtgtgt aaattaatac agcagccgcg cgtaggtggt aaactgacaa gtagatatag aggcctaaca catgcaagtc 60 cgggtgagta atgcctagga 120 taataccgca tacgtcctac 180 gagcctaggt cggattagct 240 ctggtctgag aggatgatca 300 ggcagcagtg gggaatattg 360 gaagaaggtc ttcggattgt 420 tttgctgttt tgacgttacc 480 gtaatacaga gggtgcaagc 540 ttgttaagtt ggatgtgaaa 600 gctagagtat ggtagagggt 660 gaaggaacac cagtggcgaa 720

PL237 601 Β1

ggcgaccacc	tggactgata	ctgacactga	ggtgcgaaag	cgtggggagc	aaacaggatt	7B0
agataccctg	gtagtccacg	ccgtaaacga	tgtcaactag	ccgttgggag	ccttgagctc	840
ttagtggcgc	agctaacgca	ttaagttgac	cgcctgggga	gtacggccgc	aaggttaaaa	900
ctcaaatgaa	ttgacggggg	cccgcacaag	cggtggagca	tgtggtttaa	ttcgaagcaa	960
cgcgaagaac	cttaccaggc	cttgacatcc	aatgaacttt	ccagagatgg	attggtgcct	1020
tcgggaacat	tgagacaggt	gctgcatggc	tgtcgtcagc	tcgtgtcgtg	agatgttggg	1080
ttaagtcccg	taacgagcgc	aacccttgtc	cttagttacc	agcacgtcat	ggtgggcact	1140
ctaaggagac	tgccggtgac	aaaccggagg	aaggtgggga	tgacgtcaag	tcatcatggc	1200
ccttacggcc	tgggctacac	acgtgctaca	atggtcggta	cagagggttg	ccaagccgcg	1260
aggtggagct	aatcccataa	aaccgatcgt	agtccggatc	gcagtctgca	actcgactgc	1320
gtgaagtcgg	aatcgctagt	aatcgcgaat	cagaatgtcg	cggtgaatac	gttcccgggc	1380
cttgtacaca	ccgcccgtca	caccatggga	gtgggttgca	ccagaagtag	ctagtctaac	1440
cttcgggagg	acggttacca	cggtgtgatt	catgactggg	gtgaagtcgr	aacaaggtag	1500
ccgtagggga	acctgcggct	ggatcacctc	ctt			1533

Zastrzeżenia patentowe

Claims (18)

1. Szczep Pseudomonas jessenii AP3_16 zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM) Instytutu Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN pod numerem B/00139.

2. Szczep Pseudomonas laurylosulfatovorans AP3_22 zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM) Instytutu Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN pod numerem B/00140.

3. Sposób oczyszczania środowiska, zwłaszcza gleby, wody, roztworu, instalacji przemysłowej, zanieczyszczonego estrami siarkowymi, w tym środkami powierzchniowo czynnymi obejmującymi związki zawierające wiązanie estrowe estrów siarkowych, przy zastosowaniu mikroorganizmu wyrażającego alkilosulfatazę i/lub izolowanej alkilosulfatazy bakteryjnej, znamienny tym, że alkilosulfataza pochodzi z szczepu Pseudomonas jak określonego w zastrz. 1 albo 2, oraz alkilosulfataza obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEKW NR ID: 1 lub 2, i/lub alkilosulfataza jest kodowana przez sekwencję nukleotydową obejmującą SEKW NR ID: 3 lub 4, przy czym do oczyszczanego środowiska wprowadzany jest wymieniony mikroorganizm, jego lizat lub izolowany z mikroorganizmu enzym o aktywności alkilosulfatazy.

4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że estrem siarkowym jest laurylosiarczan sodu.

5. Sposób według zastrz. 3-4, znamienny tym, że oczyszczanie środowiska zanieczyszczonego estrami siarkowymi, w tym środkami powierzchniowo czynnymi obejmującymi związki zawierające wiązanie estrowe estrów siarkowych, jest elementem procesu bioremediacji środowiska skażonego ksenobiotykami, korzystnie węglowodorami, przy czym mikroorganizmem wytwarzającym alkilosulfatazę jest szczep określony w zastrz. 1-2.

6. Sposób według zastrz. 2-5, znamienny tym, że mikroorganizmem wprowadzanym do oczyszczanego środowiska jest szczep Pseudomonas jessenii AP3_16 jako określony w zastrz. 1 lub szczep Pseudomonas laurylosulfatovorans AP3_22 jako określony w zastrz. 2 lub ich mieszanina.

7. Białko o sekwencji aminokwasowej przedstawionej na SEKW NR ID: 1 lub 2, korzystnie kodowane przez sekwencję nukleotydową obejmującą SEKW NR ID: 3 lub 4, mające aktywność alkilosulfatazy.

8. Konstrukt kwasu nukleinowego kodujący białko określone w zastrz. 7.

9. Wektor ekspresyjny obejmujący konstrukt jak określony w zastrz. 8.

10. Komórka gospodarz obejmująca konstrukt jak określony w zastrz. 8 lub wektor określony w zastrz. 9.

11. Komórka gospodarz według zastrz. 10, znamienna tym, że jest to jednokomórkowy organizm mezofilny, korzystnie E. coli, korzystniej szczep E. coli BL21.

12. Sposób wytwarzania szczepów bakteryjnych zdolnych do rozkładu estrów siarkowych, w tym środków powierzchniowo czynnych obejmujących związki zawierające wiązanie estrowe es

PL 237 601 B1 trów siarkowych, w środowisku, znamienny tym, że obejmuje etap, w którym wprowadza się do komórki bakterii konstrukt określony w zastrz. 8 i/lub wektor określony w zastrz. 9, przy czym konstrukt i/lub wektor mogą być wprowadzane metodami inżynierii genetycznej lub z wykorzystaniem naturalnych procesów horyzontalnego transferu genów, korzystnie bezpośrednio w środowisku.

13. Szczep bakteryjny wyrażający alkilosulfatazę i zdolny do rozkładu estrów siarkowych, otrzymany sposobem określonym w zastrz. 12.

14. Sposób wytwarzania białka alkilosulfatazy, znamienny tym, że obejmuje etap hodowli komórki gospodarza w warunkach umożliwiających ekspresję białek, przy czym komórka gospodarz wykazuje ekspresję białka jak określono w zastrz. 7.

15. Kompozycja do rozkładu estrów siarkowych w środowisku, w tym środków powierzchniowo czynnych obejmujących związki zawierające wiązanie estrowe estrów siarkowych, obejmująca białko określone w zastrz. 7 lub otrzymane sposobem określonym w zastrz. 14.

16. Kompozycja do rozkładu estrów siarkowych w środowisku, w tym środków powierzchniowo czynnych obejmujących związki zawierające wiązanie estrowe estrów siarkowych, obejmująca szczep bakteryjny jak określony w zastrz. 1-2 i/lub 13 i/lub komórkę gospodarza jak określoną w zastrz. 10-11.

17. Zastosowanie szczepu określonego w dowolnym z zastrzeżeń 1-2, lub 13, lub lizatu wymienionego szczepu lub białka określonego w zastrz. 7 lub kompozycji określonej w zastrz. 15-16 do rozkładania estrów siarkowych, w tym środków powierzchniowo czynnych obejmujących związki zawierające wiązanie estrowe estrów siarkowych w środowisku, korzystnie w glebie, wodzie, roztworze, instalacji przemysłowej.

18. Sposób bioremediacji środowiska skażonego ksenobiotykami, znamienny tym, że obejmuje:

a) etap wprowadzania środków powierzchniowo czynnych obejmujących związki zawierające wiązanie estrowe estrów siarkowych dla zwiększenia rozpuszczalności węglowodorów w wodzie, a tym samym zwiększenia ich biodostępności dla mikroorganizmów,

b) etap wprowadzania mikroorganizmów zdolnych do degradacji ksenobiotyku stanowiącego skażenie ale odpornych na działanie wysokich stężeń środków powierzchniowo czynnych, oraz

c) etap wprowadzania nowego szczepu określonego w zastrz. 1 lub 2 lub 13, lizatu wymienionego szczepu, białka określonego w zastrz. 7 lub kompozycji określonej w zastrz. 15-16 lub ich kombinacji w celu usunięcia środków powierzchniowo czynnych z oczyszczanej wody lub gleby.