CN104946617A - 一种交联烷基硫酸酯酶聚集体的制备方法 - Google Patents
一种交联烷基硫酸酯酶聚集体的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104946617A CN104946617A CN201510314390.4A CN201510314390A CN104946617A CN 104946617 A CN104946617 A CN 104946617A CN 201510314390 A CN201510314390 A CN 201510314390A CN 104946617 A CN104946617 A CN 104946617A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- preparation
- enzyme
- alkyl
- concentration
- sulfatases
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
本发明提供了一种高活性回收率的交联烷基硫酸酯酶聚集体的制备方法。本发明制备的交联烷基硫酸酯酶聚集体可以达到游离酶活性的81％以上，最适反应温度比游离酶提高了10度，具有更广泛的pH适用性。本发明的优点是工艺设备简单，成本低廉，固定的烷基硫酸酯酶可回收重复使用，节约成本。
Description
技术领域
本发明属于生物工程、生物催化领域，具体涉及交联烷基硫酸酯酶聚集体的制备。
背景技术
SDS(十二烷基磺酸钠)等表面活性剂作为能改变水和其它液体表面张力或两相间界面张力的物质，具有润湿、分散、乳化、增溶、起泡、洗涤、防腐和杀菌等作用，是一系列家用和工业用洗涤剂中的主要成分。由于SDS等表面活性剂随着工业废水和生活污水大量排放到各种水体中，其已造成了严重的环境污染。它们会形成泡沫覆盖水面，消耗水体中的溶解氧，使水质恶化，对水生生物的生存和繁殖及环境造成一定的污染和危害。研究证明低浓度的SDS便可抑制生物体中一些关键酶的活性，并可通过食物链进入人体，造成疾病。此外，SDS还对其它有害物质形成增溶、乳化和分散作用，富集有机污染物，抑制微生物对有机物的降解，增强其对环境的危害等。因此SDS等表明活性剂污染的治理已成为环境保护工程中重要的环节。
传统的物理和化学方法处理污水，成本高，对污染物的去除不够理想，还会引入二次污染。相比而言，生物酶技术处理污水效率高、成本低，环保，并且还可循环使用。烷基硫酸酯酶是硫酸酯酶的一种，能够水解硫酸酯键并释放无机硫酸根和相应的醇类，可有效降解表面活性剂，降低其对环境的污染。例如，Long等从嗜热菌Pseudomonas sp.S9中分离获得一种嗜热型烷基硫酸酯酶sdsAP(专利号CN101942427B，也被称为sdsA)，该酶对SDS有较高的降解活性，并且可以在原核中大量表达，为通过基因工程获得SDS降解酶来治理SDS污染奠定了基础。
但作为降解菌或生物酶本身，其稳定性和降解污染物的效率均受到如水体pH值、温度及水中含有的其它物质等诸多因素的影响，且不能回收重复利用，大大限制了它们的应用和推广。
发明内容
本发明的目的在于克服游离烷基硫酸酯酶在复杂环境中的不稳定性、活性低及不能重复利用等问题，通过将烷基硫酸酯酶制备成交联烷基硫酸酯酶聚集体，实现了对烷基硫酸酯酶的高效固定，从而能够在SDS等表面活性剂的污染治理中得以有效地应用。
根据本发明的一个方面。本发明提供了一种交联烷基硫酸酯酶聚集体的制备方法，包括以下步骤：
(1)在浓度为10-50mg/ml的烷基硫酸酯酶溶液中，加入终浓度为100-300mg/ml的聚乙二醇，进行沉淀分离；
(2)进一步加入终浓度为5-15mM的戊二醛，进行交联反应；和
(3)离心、弃上清，并洗涤至无可溶性蛋白，即得交联烷基硫酸酯酶聚集体。
在本发明中，烷基硫酸酯酶优选来源于嗜热菌Pseudomonas sp.S9的嗜热型烷基硫酸酯酶sdsAP(也被称为sdsA)。
本发明所使用的烷基硫酸酯酶可以通过本领域已知的方法制备得到。例如sdsAP可以通过如下方法制备得到：
将去掉信号肽的sdsAP cDNA克隆到原核表达载体pET-His载体上，并转化表达菌株BL21(DE3)。于LB培养基中培养至OD600约为0.6时，加入终浓度3mM的IPTG 16℃诱导14h。离心收集菌体，加入裂解buffer(50mM pH8.0Tris-HCl，含100mM NaCl)进行超声破碎，离心并收集上清，再进行镍离子亲和层析纯化，并用低浓度例如20mM咪唑洗脱杂蛋白，最后用高浓度例如500mM咪唑洗脱获得纯化的sdsAP蛋白。
在本发明中，聚乙二醇选自聚乙二醇3350、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000及其混合物。
在本发明中，优选烷基硫酸酯酶的浓度为20-40mg/ml，最优选约20mg/ml。优选聚乙二醇的终浓度为150-200mg/ml，最优选约170mg/ml。优选戊二醛的终浓度为8-12mM，最优选约10mM。
在本发明中，烷基硫酸酯酶溶液的pH值优选为7.0-9.0，更优选为7.5-8.5，最优选约8.0，溶剂可以使用本领域常用的缓冲液，例如但不限于Tris-HCl缓冲液和PBS缓冲液等。缓冲液中优选加入能够维持蛋白稳定的试剂，包括但不限于NaCl和/或甘油等，其中，NaCl的浓度优选为100-500mM，甘油的浓度优选为50-100mg/ml。洗涤用裂解缓冲液，优选用含有约50-150mM的NaCl，约20-100mM的pH约7.0-9.0的Tris-HCl裂解缓冲液，更优选用含有约100mM NaCl的约50mM的pH约8.0的Tris-HCl裂解缓冲液。
本发明的制备方法优选在4-16℃下进行操作。沉淀分离的时间优选为10-60min，更优选20-40min，最优选约30min。交联反应的时间优选为1-4h，更优选1.5-3h，最优选约2h。离心转数和时间要能充分沉淀交联烷基硫酸酯酶聚集体，例如离心转数优选为4000-18000rpm，更优选8000-14000rpm，最优选12000rpm；离心时间优选为5-30min，更优选10-15min，最优选约10min。沉淀和交联优选在pH为7.0-9.0，更优选在pH为7.5-8.5，最优选在pH约为8.0的条件下进行。本发明的交联烷基硫酸酯酶聚集体可进一步干燥成粉末保存。
根据本发明的另一个方面，本发明进一步涉及根据本发明的制备方法制备得到的交联烷基硫酸酯酶聚集体。
本发明的有益效果在于：设备简易，操作简单，成本低廉；沉淀过程中的沉淀效率和酶活保留率高，均达93％以上，交联效率几乎为100％；固定化烷基硫酸酯酶的酶活回收率高，大于81％；温度和pH适用性都明显提高，不仅最适温度提高了10℃，且温度在10-100℃、pH为4-10的范围内都能适用；同时很好的保留了酶对底物的亲合力，且可回收重复使用；极大地提高了烷基硫酸酯酶的稳定性，耐储存。
附图说明
图1经镍离子亲和层析纯化的sdsAP的SDS-PAGE检测：1,Marker；2和3,经镍离子亲和层析纯化的sdsAP蛋白。
图2SDS溶液滴定Stain-all染色液标准曲线。
图3sdsAP-CLAs在不同温度条件下的活性分析。
图4sdsAP-CLAs在不同pH条件下的活性分析。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面结合实施例和附图对本发明做进一步的描述。
实施例1烷基硫酸酯酶sdsAP的制备和活性测定
(1)烷基硫酸酯酶sdsAP的诱导表达及纯化
将去掉信号肽的sdsAP cDNA(氨基酸42-674)克隆到原核表达载体pET-His载体上，并转化表达菌株BL21(DE3)。于LB培养基中培养至OD600约为0.6时，加入终浓度3mM的IPTG进行诱导表达，16℃诱导14h。离心收集菌体，加入裂解buffer(50mM pH8.0Tris-HCl，含100mM NaCl)进行超声破碎，离心并收集上清，进行镍离子亲和层析纯化，并用20mM咪唑洗脱杂蛋白，最后用500mM咪唑洗脱获得纯化的sdsAP烷基硫酸酯酶，参见图1。
(2)烷基硫酸酯酶sdsAP的活性测定
配置Stain-all储存液：溶解1mg Stain-all粉末于1ml异丙醇与水的混合溶液中(体积比1:1)，避光4℃保存(可保存1个月)。
配制Stains-all工作液：将1ml Stain-all储存液与1ml甲酰胺混合后加入到18ml去离子水中(室温避光可以放置3天)。
制作标准曲线：用25mM的Tris-HCl buffer(pH 8.0)配制成1g/L的SDS溶液。取1μl SDS溶液加入到980μl Stains-all工作液中，并用水补充至1ml，用移液枪混匀，在UV 438nm处测定吸光值，每次增加1μl SDS溶液，并记录吸光值一次，最后做成标准曲线，并计算公式，参见图2。
活性测定：配置1％的SDS溶液，440μl裂解buffer+50μl 0.1％SDS+10μl 0.15mg/ml sdsAP酶，70℃反应5min，取20μl反应液加入到980μlStains-all工作液中，在UV 438nm处测定吸光值，并设对照，按照标准曲线所得公式计算sdsAP酶的酶活，为20μmol.min-1.mg-1。酶活单位定义为每分钟降解1μmol SDS所需要的酶量。
实施例2交联烷基硫酸酯酶sdsAP聚集体(sdsAP-CLAs)的制备和活性测定
取200μl浓度分别为20mg/ml，30mg/ml和40mg/ml的sdsAP酶溶液置于6个1.5ml的eppedorf管中，其中，溶剂为pH为8.0的Tris-HCl缓冲液，其中含有浓度为300mM的NaCl和浓度为50mg/ml的甘油。每个浓度两组，一组中分别加入终浓度为150mg/ml、170mg/ml和200mg/ml的PEG4000，另一组中分别加入终浓度为150mg/ml、170mg/ml和200mg/ml的PEG6000，均于4℃沉淀分离30min，期间每隔几分钟颠倒一次。
每管取一半反应液，离心后取上清按照实施例1中相同的方法检测酶活，并在去掉上清的沉淀中加入含有100mM NaCl的50mM pH8.0 Tris-HCl裂解缓冲液再溶解沉淀，并按照实施例1中相同的方法检测酶活。分别计算沉淀效率和酶活保留率，其中：沉淀后总酶活与沉淀前总酶活的比值为沉淀效率，沉淀再溶解后总酶活与沉淀后总酶活的比值为酶活保留率，其中，沉淀后总酶活为沉淀前总酶活性减去上清残留总酶活。结果表明，分别加入终浓度为15％、17％和20％的PEG4000组的沉淀效率分别为97.1％、97.5和98.0％，酶活保留率分别为95.0％、96.5％和98.5％；分别加入终浓度为15％、17％和20％的PEG6000组的沉淀效率分别为97.5％、98.2％和98.5％，酶活保留率分别为96.0％、96.5％和99.0％。由此可见，各组沉淀效率均在97％以上，活性保留率均在95％以上。
在每组的另一半反应液中分别进一步加入终浓度为8mM、10mM和12mM的戊二醛，于4℃交联反应2h，期间每隔几分钟振荡一次。
12000rpm离心10min后，弃上清，用含有100mM NaCl的50mM pH8.0Tris-HCl裂解缓冲液洗涤数次，至洗涤液中检测不到sdsAP酶活性，即得交联烷基硫酸酯酶聚集体，可进一步干燥成粉末备用。
将交联烷基硫酸酯酶聚集体用含有100mM NaCl的50mM pH8.0Tris-HCl裂解缓冲液重新悬浮，按照实施例1中相同的方法检测酶活并计算酶活回收率。酶活回收率为交联烷基硫酸酯酶聚集体的总酶活和用于制备交联烷基硫酸酯酶聚集体的sdsAP酶总酶活之比。结果表明，戊二醛终浓度分别为8mM、10mM和12mM的PEG4000组的酶活回收率分别为87.0％、91.1％和85.5％，戊二醛终浓度分别为8mM、10mM和12mM的PEG6000组的酶活回收率分别为86.0％、88.3％和85.0％，均大于85％。
实施例3交联烷基硫酸酯酶sdsAP聚集体(sdsAP-CLAs)的制备和活性测定
取200μl浓度分别为10mg/ml和50mg/ml的sdsAP酶溶液置于4个1.5ml的eppedorf管中，其中，溶剂为pH为7.4的PBS缓冲液，其中含有浓度为100mM的NaCl和浓度为50mg/ml的甘油。每个浓度两组，一组中分别加入终浓度为100mg/ml和300mg/ml的PEG3350，另一组中分别加入终浓度为100mg/ml和300mg/ml的PEG8000，均于16℃沉淀分离20min，期间每隔几分钟颠倒一次。
每管取一半反应液按照实施例2中相同的方法测定沉淀效率和酶活保留率。结果表明，分别加入终浓度为10％和30％的PEG3350组的沉淀效率分别为93.0％和98.0％，酶活保留率分别为95.1％和97.5％；分别加入终浓度为10％和30％的PEG8000组的沉淀效率分别为94.5％和99.5％，酶活保留率分别为93.0％和95.5％。由此可见，沉淀效率均在93％以上，活性保留率也均在93％以上。
在每组的另一半反应液中分别进一步加入终浓度为5mM和15mM的戊二醛，于16℃交联反应3h，期间每隔几分钟振荡一次。
8000rpm离心15min后，弃上清，用含有100mM NaCl的50mM pH8.0Tris-HCl裂解缓冲液洗涤数次，至洗涤液中检测不到sdsAP酶活性，即得交联烷基硫酸酯酶聚集体，可进一步干燥成粉末备用。
将交联烷基硫酸酯酶聚集体用含有100mM NaCl的50mM pH8.0Tris-HCl裂解缓冲液重新悬浮，按照实施例2中相同的方法计算酶活回收率。结果表明，戊二醛终浓度分别为5mM和15mM的PEG3350组的酶活回收率分别为85.5％和82.3％，戊二醛终浓度分别为5mM和15mM的PEG8000组的酶活回收率分别为82.8％和81.5％，均大于81％。
实施例4对比实施例
取200μl浓度为20mg/ml的sdsAP酶溶液置于9个1.5ml的eppedorf管中，其中，溶剂为pH为8.0的Tris-HCl缓冲液，其中含有浓度为100mM的NaCl和浓度为50mg/ml的甘油。分别加入终浓度为300mg/ml、400mg/ml和500mg/ml的硫酸铵、500mg/ml的乙醇、甲醇、异丙醇、叔丁醇、丙酮和乙腈，均于4℃沉淀分离30min，期间每隔几分钟颠倒一次。
每管取一半反应液按照实施例2中相同的方法测定沉淀效率和酶活保留率，结果表明沉淀效率虽然也都大于90％，但是酶活保留率均低于80％。
在每管的另一半反应液中进一步加入终浓度为10mM的戊二醛，于4℃交联反应2h，期间每隔几分钟振荡一次。
12000rpm离心10min后，弃上清，用含有100mM NaCl的50mM pH8.0Tris-HCl裂解缓冲液洗涤数次，至洗涤液中检测不到sdsAP酶活性，即得交联烷基硫酸酯酶聚集体。
将交联烷基硫酸酯酶聚集体用含有100mM NaCl的50mM pH8.0Tris-HCl裂解缓冲液重新悬浮，按照实施例2中相同的方法计算酶活回收率。结果表明，酶活回收率分别为66％、64％、63％、60％、58％、55％、52％、50％和49％。
实施例5对实施例2所得交联烷基硫酸酯酶聚集体的性质进行分析。
最佳活性温度分析：分别在10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃和100℃温度下同时测定实施例2中sdsAP酶浓度为20mg/ml、加入终浓度为170mg/ml的PEG4000和10mM戊二醛组得到的交联烷基硫酸酯酶聚集体和实施例1中得到的游离的烷基硫酸酯酶的活性，并制作折线图。结果显示交联烷基硫酸酯酶聚集体的最适反应温度为80℃，比游离的烷基硫酸酯酶的最适反应温度70℃提高了10℃，且其在10-100℃的范围内的酶活均在60％以上。
最佳活性pH分析：分别在pH4、pH5、pH6、pH7、pH8、pH9和pH10条件下同时测定实施例2中sdsAP酶浓度为20mg/ml、加入终浓度为170mg/ml的PEG4000和10mM戊二醛组得到的交联烷基硫酸酯酶聚集体和实施例1中得到的游离的烷基硫酸酯酶的活性，并制作折线图。结果显示交联烷基硫酸酯酶聚集体具有更为广泛的pH适用范围，其在pH4-10的范围内的酶活均在60％以上，最适pH为7.0。所选pH buffer如下：acetic acid buffer(pH 4.0–5.0)，sodium phosphate buffer(pH6.0–7.0)，Tris–HCl buffer(pH 8.0and 9.0)和glycine–NaOH buffer(pH 10.0)。
实施例6对实施例2所得交联烷基硫酸酯酶聚集体的底物亲合力进行测定
配置5种不同浓度的SDS缓冲液(含pH8.0Tris-HCl，100mM NaCl和一定浓度的SDS)，SDS的终浓度分别为0.2mg/ml，0.15mg/ml，0.1mg/ml，0.07mg/ml和0.04mg/ml，每种浓度设置两份。分别加入25μg的游离酶和固定化酶，在70度条件下进行孵育，每隔30S测定一次A438读数。利用实施例1中的公式计算剩余的SDS含量，再用初始SDS含量减去剩余SDS含量即得一定时间内被酶所降解的SDS量。以时间为横坐标，SDS被降解量为纵坐标做图，所得斜率即为酶的反应速度。再利用反应速度和对应的底物浓度进行双倒数作图法来获得酶的Km值。
结果表明游离sdsAP的Km值大约为240μM，固定化酶的Km值大约为200μM，两者Km值十分接近，表明固定化并没有破坏酶对底物的亲合力。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆属本发明的涵盖范围。
Claims (10)
1.一种交联烷基硫酸酯酶聚集体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在浓度为10-50mg/ml的烷基硫酸酯酶溶液中，加入终浓度为100-300mg/ml的聚乙二醇，进行沉淀分离；
(2)进一步加入终浓度为5-15mM的戊二醛，进行交联反应；和
(3)离心、弃上清，并洗涤至无可溶性蛋白，即得交联烷基硫酸酯酶聚集体。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，烷基硫酸酯酶为来源于嗜热菌Pseudomonas sp.S9的嗜热型烷基硫酸酯酶sdsAP。
3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，聚乙二醇选自聚乙二醇3350、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000及其混合物。
4.如权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其特征在于，烷基硫酸酯酶的浓度为20-40mg/ml，优选约20mg/ml。
5.如权利要求1-4中任一项所述的制备方法，其特征在于，聚乙二醇的终浓度为150-200mg/ml，优选约170mg/ml。
6.如权利要求1-5中任一项所述的制备方法，其特征在于，戊二醛的终浓度为8-12mM，优选约10mM。
7.如权利要求1-6中任一项所述的制备方法，其特征在于，烷基硫酸酯酶溶液pH值为7.0-9.0，优选7.5-8.5，更优选约8.0，溶剂为Tris-HCl缓冲液或PBS缓冲液，其中含有浓度为100-500mM的NaCl和/或浓度为50-100mg/ml的甘油。
8.如权利要求1-7中任一项所述的制备方法，其特征在于，洗涤用裂解缓冲液，优选用含有50-150mM NaCl的约20-100mM的pH约7.0-9.0的Tris-HCl裂解缓冲液，更优选用含有约100mM NaCl的约50mM的pH约8.0的Tris-HCl裂解缓冲液。
9.如权利要求1-8中任一项所述的制备方法，其特征在于，在4-16℃下进行操作；沉淀分离的时间为10-60min，优选20-40min，更优选约30min；交联反应的时间为1-4h，优选1.5-3h，更优选约2h；离心转数为4000-18000rpm，优选8000-14000rpm，更优选12000rpm；离心时间为5-30min，优选10-15min，更优选约10min；沉淀和交联在pH为7.0-9.0，优选在pH为7.5-8.5，更优选pH约为8.0的条件下进行。
10.如权利要求1-9中任一项所述的制备方法制备得到的交联烷基硫酸酯酶聚集体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510314390.4A CN104946617A (zh) | 2015-06-10 | 2015-06-10 | 一种交联烷基硫酸酯酶聚集体的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510314390.4A CN104946617A (zh) | 2015-06-10 | 2015-06-10 | 一种交联烷基硫酸酯酶聚集体的制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104946617A true CN104946617A (zh) | 2015-09-30 |
Family
ID=54161682
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510314390.4A Pending CN104946617A (zh) | 2015-06-10 | 2015-06-10 | 一种交联烷基硫酸酯酶聚集体的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104946617A (zh) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101942427A (zh) * | 2010-09-07 | 2011-01-12 | 国家海洋局第三海洋研究所 | 一种烷基型硫酸酯酶及其制备方法 |
| CN104630248A (zh) * | 2015-02-16 | 2015-05-20 | 集美大学 | 芳香基硫酸酯酶基因、编码蛋白及其固定化的方法和应用 |
-
2015
- 2015-06-10 CN CN201510314390.4A patent/CN104946617A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101942427A (zh) * | 2010-09-07 | 2011-01-12 | 国家海洋局第三海洋研究所 | 一种烷基型硫酸酯酶及其制备方法 |
| CN104630248A (zh) * | 2015-02-16 | 2015-05-20 | 集美大学 | 芳香基硫酸酯酶基因、编码蛋白及其固定化的方法和应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| FERNANDO LO´PEZ-GALLEGO ET AL.: "Co-aggregation of Enzymes and Polyethyleneimine: A Simple Method To Prepare Stable and Immobilized Derivatives of Glutaryl Acylase", 《BIOMACROMOLECULES》 * |
| 陈颖 等: "交联海藻糖合酶聚集体的制备及其性质", 《食品科学》 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2524393A1 (en) | Solid phase cell lysis and capture platform | |
| Elorza et al. | Dimorphism in Candida albicans: contribution of mannoproteins to the architecture of yeast and mycelial cell walls | |
| Pfeffer et al. | Peptidoglycan O acetylation and autolysin profile of Enterococcus faecalis in the viable but nonculturable state | |
| Chiou et al. | Immobilization of Candida rugosa lipase on chitosan with activation of the hydroxyl groups | |
| Sagt et al. | Introduction of an N-glycosylation site increases secretion of heterologous proteins in yeasts | |
| Schooling et al. | Membrane vesicles: an overlooked component of the matrices of biofilms | |
| Bee et al. | Trace levels of the CHO host cell protease cathepsin D caused particle formation in a monoclonal antibody product | |
| Schooling et al. | Interactions of DNA with biofilm-derived membrane vesicles | |
| EP1354036B1 (en) | Compositions, methods, and kits for isolating nucleic acids using surfactants and proteases | |
| Fournand et al. | Acyl transfer activity of an amidase from Rhodococcus sp. strain R312: formation of a wide range of hydroxamic acids | |
| Martin et al. | Identification and characterization of a halotolerant, cold-active marine endo-β-1, 4-glucanase by using functional metagenomics of seaweed-associated microbiota | |
| Heffron et al. | In vitro studies of peptidoglycan binding and hydrolysis by the Bacillus anthracis germination-specific lytic enzyme SleB | |
| Jenkins et al. | Use of a sentinel system for field measurements of Cryptosporidium parvum oocyst inactivation in soil and animal waste | |
| ES2744630T3 (es) | Hemocultivo del mismo día con microscopia digital | |
| WO2006026248A1 (en) | Compositions and methods employing zwitterionic detergent combinations | |
| CN103458694A (zh) | 用于治理微生物诱导的腐蚀和环境损害及用于改进废水处理工艺的方法和组合物 | |
| Kadurugamuwa et al. | S-layered Aneurinibacillus and Bacillus spp. are susceptible to the lytic action of Pseudomonas aeruginosa membrane vesicles | |
| Butkus et al. | Influence of surface characteristics on the stability of Cryptosporidium parvum oocysts | |
| Nasri et al. | Digestive alkaline proteases from Zosterisessor ophiocephalus, Raja clavata, and Scorpaena scrofa: characteristics and application in chitin extraction | |
| Lazo et al. | α-Galactosidase (melibiase) from Saccharomyces carlsbergensis: Structural and kinetic properties | |
| Dai et al. | The algicidal fungus Trametes versicolor F21a eliminating blue algae via genes encoding degradation enzymes and metabolic pathways revealed by transcriptomic analysis | |
| CN1120370C (zh) | 一种测定样品中存在的内毒素类似物的方法及其试剂盒 | |
| Efremenko et al. | Addition of polybrene improves stability of organophosphate hydrolase immobilized in poly (vinyl alcohol) cryogel carrier | |
| Yu et al. | Noncovalent immobilization of cellulases using the reversibly soluble polymers for biopolishing of cotton fabric | |
| Kanugula et al. | Immobilization of organophosphate hydrolase on biocompatible gelatin pads and its use in removal of organophosphate compounds and nerve agents |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20150930 |