CN112522245A

CN112522245A - 一种腈水合酶氨基酸基序的改造及其应用

Info

Publication number: CN112522245A
Application number: CN202011450235.2A
Authority: CN
Inventors: 周哲敏; 程中一; 马东; 崔文璟; 刘中美; 周丽; 韩来闯; 郭军玲
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-12-09
Filing date: 2020-12-09
Publication date: 2021-03-19

Abstract

本发明提供了一种腈水合酶氨基酸基序的改造及其应用，属于生物工程技术领域。本发明对来源于嗜热假诺卡氏菌腈水合酶做了改造，分别是对野生型对β亚基上的46号位，α亚基上的6、126号位进行了突变，构建得到的突变体比酶活显著提升，可较野生型提升1‑5倍。且底物谱也得到拓宽，对于异丁腈、正戊腈、丙烯腈、烟腈、2‑氰基吡嗪、苯甲腈、肉桂腈和萘甲腈等均有很好的催化作用，并且对相应底物的催化性能也显著提升。使得到的腈水合酶突变体能适用于更多的生产场景，并提高生产效率。

Description

一种腈水合酶氨基酸基序的改造及其应用

技术领域

本发明涉及一种腈水合酶氨基酸基序的改造及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

腈水合酶(Nitrile hydratase，简称NHase，EC 4.2.1.84)，是一类可以催化腈类物质通过水合反应转化为高附加值酰胺类化合物的金属酶，在大宗化学品丙烯酰胺的工业生产上已经被广泛应用。目前，腈水合酶以其绿色环保、反应条件较温和、安全系数高等优势，而逐渐替代传统的化学法，使得酰胺类的生产符合可持续发展和绿色生产理念。

腈水合酶通常由α和β两个亚基构成，研究发现，目前已报道的原核生物来源的腈水合酶大都存在稳定性差、催化活性低、催化底物谱窄的问题。也有很多研究尝试对其进行了改造，来提高其相关的性质。但是目前的催化效率不高、底物谱窄等问题仍然限制着腈水合酶进一步的开发和应用。

发明内容

针对现有的技术难点及存在的问题，本发明通过对来源于嗜热假诺卡氏菌(Pseudonocardiathermophila)的腈水合酶的氨基酸改造，以期能拓宽底物谱并提升催化性能。

本发明提供了一种腈水合酶突变体，所述腈水合酶包含α亚基和β亚基；所述突变体是将腈水合酶亲本的α亚基的第6和/或126位突变，和/或β亚基的第46位突变；所述腈水合酶亲本的α亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，β亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体包括如下(a)-(f)任一：

(a)将β亚基的第46位突变为K，得到突变体M46K；

(b)将α亚基的第6位突变为T，得到突变体L6T；

(c)将α亚基的第126位突变为Y，得到突变体F126Y；

(d)将α亚基的第126位突变为Y，并将β亚基的第46位突变为K；

(e)将α亚基的第6位突变为T，并将β亚基的第46位突变为K；

(f)将α亚基的第6位突变为T、第126位突变为Y，并将β亚基的第46位突变为K。

本发明提供了编码所述突变体的基因。

本发明提供了携带所述基因的重组质粒。

在本发明的一种实施方式中，以pET-24a(+)为表达载体。

本发明提供了表达所述突变体，或含有所述基因的宿主细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞包含原核或真核微生物。

在本发明的一种实施方式中，以E.coli BL21(DE3)为表达宿主。

本发明提供了一种生产酰胺类物质的方法，所述方法是以腈类物质为底物，利用所述突变体催化生成酰胺类物质。

在本发明的一种实施方式中，所述腈类物质包括异丁腈、正戊腈、丙烯腈、烟腈、2-氰基吡嗪、苯甲腈、肉桂腈和萘甲腈。

在本发明的一种实施方式中，所述酰胺类物质包括异丁酰胺、戊酰胺、丙烯酰胺、烟酰胺、吡嗪酰胺、萘甲酰、苯甲酰胺和肉桂酰胺。

本发明还提供了所述突变体，或所述基因，或所述重组质粒，或所述宿主细胞在制备酰胺类物质中的应用。

本发明的有益效果：本发明提供了Pt-NHase突变体，所述突变体相对于野生型，对β亚基上的46号位，α亚基上的6、126号位进行了突变，得到突变体(M46K、L6T及F126Y)及其组合突变体Pt3(M46K-L6T-F126Y)。突变体的比酶活较野生型均有显著的提高，M46K比酶活提高最显著，约为野生型的6倍；突变体L6T和F126Y的酶活则分别是野生型的2和2.5倍。并且突变体的底物谱较野生型拓宽，对于异丁腈、正戊腈、丙烯腈、烟腈、2-氰基吡嗪、苯甲腈、肉桂腈和萘甲腈等均有很好的催化作用，且催化性能较野生型也有显著的提升。

附图说明

图1为纯酶的SDS-PAGE电泳图，M：蛋白Marker，1:pET24a，2：WT，3：M46K，4：L6T，5：F126Y，6：M46K-L6T，7：M46K-F26Y，8：M46K-L6T-F126Y。

图2为Pt NHase野生酶WT与突变体M46K、L6T、F126Y、M46K-L6T、M46K-F26Y及M46K-L6T-F126Y的对于烟腈催化的比酶活。

图3为Pt NHase野生酶WT与突变体M46K、L6T、F126Y、M46K-L6T、M46K-F26Y及M46K-L6T-F126Y对于8种不同腈类底物的催化活性。

图4为Pt NHase野生酶WT与突变体M46K、L6T、F126Y、M46K-L6T、M46K-F26Y及M46K-L6T-F126Y对于烟腈催化的耐受性。

具体实施方式

腈水合酶的酶活力(U)：单位酶活力定义为25℃下，每分钟催化烟腈生成1μmol烟酰胺所需要的酶量。

腈水合酶的比酶活(U/mg)：每毫克腈水合酶所具有的酶活力。

LB培养基：胰蛋白胨10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，NaCl 10.0g/L，卡那霉素终浓度50μg/mL。

2×YT培养基：胰蛋白胨16.0g/L，酵母提取物10.0g/L，NaCl 5.0g/L，卡那霉素终浓度50μg/mL。

采用亲和层析的方法纯化野生型WT及其6个突变体，纯化柱为GE公司的StrepTrapHP 1mL柱。在10000rpm条件下离心3min收集菌体细胞，用20mL结合缓冲液(20mM Na2HPO4·12H2O，280mM NaCl，6mM KCl，pH 7.4)重悬，于冰水混合物中超声破碎。破碎液在4℃、12000rpm条件下离心30min，取上清液过0.22μm有机滤膜。纯化柱在用结合缓冲液平衡后，进行上样，然后用结合缓冲液洗去杂蛋白，目的蛋白用100％的洗脱缓冲液(20mMNa2HPO4·12H2O，280mM NaCl，6mM KCl，2.5mM d-Desthiobiotin，pH 7.4)洗脱并收集。蛋白浓度使用Bradford蛋白浓度检测试剂盒进行定量。

实施例1：PtNHase的各突变体的构建

根据Pt NHase的野生型质粒pET24a(+)-Pt WT(该质粒记载于Cheng et al.,Computational Design of Nitrile Hydratase from PseudonocardiathermophilaJCM3095 for Improved Thermostability,2020)，采用全质粒PCR的方法构建了突变体质粒pET24a(+)-M46K，L6T，F126Y及其组合突变体M46K-L6T、M46K-F26Y和M46K-L6T-F126Y。首先以质粒pET24a(+)-Pt WT为模板，突变序列设计在引物上，通过PCR扩增出碱基序列发生突变的DNA片段，所用引物序列如表1所示，扩增体系如表2所示，PCR扩增反应条件为95℃预变性3min，98℃变性15s，55℃退火30s，72℃延伸1min 45s，72℃延伸5min，共30个循环。将PCR产物用DpnI消化酶消化2-3h，转化E.coli DH5α，在LB平板培养后、挑取单克隆由天霖生物科技(无锡)有限公司进行测序验证，得到阳性转化子。

表1引物序列

表2 PCR扩增体系

实施例2：Pt NHase的野生型及突变体的催化效率

将Pt NHase的野生型WT及重构质粒pET24a(+)-M46K，pET24a(+)-L6T，pET24a(+)-F126Y及其组合突变体pET24a(+)-M46K-L6T、pET24a(+)-M46K-F26Y和pET24a(+)-M46K-L6T-F126Y分别转化至E.coli BL21(DE3)，挑取单菌落至5mL LB培养基，37℃、200rpm条件下培养7-8h。将种子液按1％(v/v)转接至100mL 2×YT培养基，37℃、200rpm条件下培养至OD600至0.6-0.8，加入终浓度为0.4mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)以及0.1g/L的CoCl₂·6H₂O，改变培养温度为24℃，诱导表达12-16h。

纯化野生型WT及其6个突变体，采用SDS-PAGE检测目的蛋白的纯化质量，检测如图1所示，可见野生型及其突变体所表达的蛋白在纯化后蛋白条带单一，纯化质量高。

用10mM KPB(磷酸缓冲盐，pH 7.4)溶液将WT及其突变体纯酶的浓度稀释至0.5mg/mL，取10μL至1.5mL离心管中，置于25℃金属浴上。向离心管中加入490μL底物(200mM烟腈溶液)，充分涡旋混匀，25℃下反应10min，然后加入500μL纯乙腈溶液进行终止。将反应液用纯乙腈溶液稀释适当倍数，过0.22μm滤膜。

液相检测方法：流动相组成为乙腈：水＝1：2(v/v)，流速为0.6mL/min，检测波长为215nm，柱温为40℃，测定反应体系中产物烟酰胺的生成量。

WT及突变体的比酶活计算结果如图2所示，野生酶WT的比酶活为70.78±2.33U/mg，突变体M46K、L6T及F126Y的比酶活分别为418.72±16.44U/mg、143.95±5.20U/mg、176.78±0.49U/mg，它们的组合突变体M46K-L6T、M46K-F126Y及Pt3(M46K-L6T-F126Y)的比酶活分别为433.51±2.45U/mg、760±23.3U/mg、679.89±18.04U/mg。

即当上述三个氨基酸残基发生突变时，腈水合酶的比酶活均有不同程度地提高，进行组合后酶活有更大程度地提升，说明上述3个氨基酸残基可能在两个亚基的关键结构域，对于腈水合酶的催化活性具有重要作用。

实施例3：Pt NHase的野生型及突变体M46K的底物谱

培养诱导及反应体系同实施例2。基于上述的纯酶进行不同底物催化反应，其中异丁腈、丙烯腈、肉桂腈和苯甲腈催化反应用的浓度为0.05mg/mL，戊腈、烟腈和2-氰基吡嗪催化反应用的浓度为0.5mg/mL，萘甲腈催化反应用的浓度为0.01mg/mL。

液相检测方法：流动相组成为乙腈：水＝1：2(v/v)；流速：除肉桂酰胺和苯甲酰胺为1mL/min外，异丁酰胺、戊酰胺、丙烯酰胺、烟酰胺、吡嗪酰胺和萘甲酰胺均为0.6mL/min；检测波长：异丁酰胺和戊酰胺为202nm，丙烯酰胺、烟酰胺、苯甲酰胺和萘甲酰胺为215nm，吡嗪酰胺和肉桂酰胺为261nm；柱温为40℃，测定反应体系中产物酰胺的生成量。

WT及突变体M46K的比酶活计算结果如图3所示，对于异丁腈、正戊腈、丙烯腈、烟腈、2-氰基吡嗪、苯甲腈、肉桂腈和萘甲腈等8种腈类底物催化，野生酶WT的比酶活分别为699.90±75.87U/mg、39.74±4.48U/mg、1692.88±9.15U/mg、70.78±2.33U/mg、62.99±0.00U/mg、63.69±0.35U/mg、15.63±0.76U/mg、19.92±0.21U/mg，突变体M46K的比酶活分别为3362.52±0.00U/mg、169.79±6.99U/mg、1602.99±8.23U/mg、418.72±16.44U/mg、512.59±0.00U/mg、667.72±9.33U/mg、280.28±5.01U/mg、132.48±2.15U/mg。其中，除丙烯腈比酶活几乎没有变化之外，M46K催化异丁腈、正戊腈的比酶活分别是WT的4.8倍、4.27倍；其催化烟腈、2-氰基吡嗪、苯甲腈、肉桂腈和萘甲腈的比酶活分别是WT的5.9、8.13、10.48、17.9和6.65倍。

即当46号位点的甲硫氨酸突变为赖氨酸时，除丙烯腈外，腈水合酶对于其他不同腈类底物的比酶活均有不同程度地提高，尤其是对于较大位阻底物分子的活性提升更为显著。

实施例4：PtNHase的野生型及突变体的耐受性

将OD₆₀₀为10的发酵菌液WT及其突变体分别置于烟腈浓度为0.8mol·L^-1以及烟酰胺浓度为1.6mol·L^-1的体系(200μL菌液+800μL烟腈/烟酰胺)中，对照组体系添加等量的10mM KPB，25℃处理30min。于6000rpm离心10min弃上清，再用10mM KPB进行重悬，反复2-3次，然后用200μL KPB进行重悬，吸取10μL全细胞至1.5mL离心管进行催化反应，其中未经处理的对照组和实验组分别添加490μL 200mM烟腈，25℃金属浴反应10min，然后加入500μL纯乙腈溶液进行终止。将反应液用纯乙腈溶液稀释适当倍数，过0.22μm滤膜。液相检测方法同实施例1，通过分析烟腈和烟酰胺处理后发酵菌液的残余酶活来检测底物/产物耐受性。未经任何处理的细胞相对酶活定义为100％。

与野生型腈水合酶相比，L6T在烟酰胺中的耐受性提高了41.73％，F126Y在烟腈中的耐受性提高了85.08％，M46K-F126Y突变体对于烟酰胺耐受性几乎不变的情况下，对于烟腈耐受性提高了52.68％；而Pt3对于烟腈耐受性几乎不变的情况下，对于烟酰胺耐受性提高了10.36％％。

表3突变体的在不同溶液中的剩余酶活(％)

	WT	M46K	L6T	F126Y	M46K-L6T	M46K-F126Y	M46K-L6T-F126Y
								KPB	100	100	100	100	100	100	100
烟腈	7.84	4.93	8.58	14.51	7.25	11.94	6.32
								烟酰胺	52.05	41.56	73.77	47.59	45.30	51.38	57.44

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种腈水合酶氨基酸基序的改造及其应用

<130> BAA201486A

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 205

<212> PRT

<213> Pseudonocardia thermophila

<400> 1

Met Thr Glu Asn Ile Leu Arg Lys Ser Asp Glu Glu Ile Gln Lys Glu

1 5 10 15

Ile Thr Ala Arg Val Lys Ala Leu Glu Ser Met Leu Ile Glu Gln Gly

20 25 30

Ile Leu Thr Thr Ser Met Ile Asp Arg Met Ala Glu Ile Tyr Glu Asn

35 40 45

Glu Val Gly Pro His Leu Gly Ala Lys Val Val Val Lys Ala Trp Thr

50 55 60

Asp Pro Glu Phe Lys Lys Arg Leu Leu Ala Asp Gly Thr Glu Ala Cys

65 70 75 80

Lys Glu Leu Gly Ile Gly Gly Leu Gln Gly Glu Asp Met Met Trp Val

85 90 95

Glu Asn Thr Asp Glu Val His His Val Val Val Cys Thr Leu Cys Ser

100 105 110

Cys Tyr Pro Trp Pro Val Leu Gly Leu Pro Pro Asn Trp Phe Lys Glu

115 120 125

Pro Gln Tyr Arg Ser Arg Val Val Arg Glu Pro Arg Gln Leu Leu Lys

130 135 140

Glu Glu Phe Gly Phe Glu Val Pro Pro Ser Lys Glu Ile Lys Val Trp

145 150 155 160

Asp Ser Ser Ser Glu Met Arg Phe Val Val Leu Pro Gln Arg Pro Ala

165 170 175

Gly Thr Asp Gly Trp Ser Glu Glu Glu Leu Ala Thr Leu Val Thr Arg

180 185 190

Glu Ser Met Ile Gly Val Glu Pro Ala Lys Ala Val Ala

195 200 205

<210> 2

<211> 233

<212> PRT

<213> Pseudonocardia thermophila

<400> 2

Met Asn Gly Val Tyr Asp Val Gly Gly Thr Asp Gly Leu Gly Pro Ile

1 5 10 15

Asn Arg Pro Ala Asp Glu Pro Val Phe Arg Ala Glu Trp Glu Lys Val

20 25 30

Ala Phe Ala Met Phe Pro Ala Thr Phe Arg Ala Gly Phe Met Gly Leu

35 40 45

Asp Glu Phe Arg Phe Gly Ile Glu Gln Met Asn Pro Ala Glu Tyr Leu

50 55 60

Glu Ser Pro Tyr Tyr Trp His Trp Ile Arg Thr Tyr Ile His His Gly

65 70 75 80

Val Arg Thr Gly Lys Ile Asp Leu Glu Glu Leu Glu Arg Arg Thr Gln

85 90 95

Tyr Tyr Arg Glu Asn Pro Asp Ala Pro Leu Pro Glu His Glu Gln Lys

100 105 110

Pro Glu Leu Ile Glu Phe Val Asn Gln Ala Val Tyr Gly Gly Leu Pro

115 120 125

Ala Ser Arg Glu Val Asp Arg Pro Pro Lys Phe Lys Glu Gly Asp Val

130 135 140

Val Arg Phe Ser Thr Ala Ser Pro Lys Gly His Ala Arg Arg Ala Arg

145 150 155 160

Tyr Val Arg Gly Lys Thr Gly Thr Val Val Lys His His Gly Ala Tyr

165 170 175

Ile Tyr Pro Asp Thr Ala Gly Asn Gly Leu Gly Glu Cys Pro Glu His

180 185 190

Leu Tyr Thr Val Arg Phe Thr Ala Gln Glu Leu Trp Gly Pro Glu Gly

195 200 205

Asp Pro Asn Ser Ser Val Tyr Tyr Asp Cys Trp Glu Pro Tyr Ile Glu

210 215 220

Leu Val Asp Thr Lys Ala Ala Ala Ala

225 230

<210> 3

<211> 144

<212> PRT

<213> Pseudonocardia thermophila

<400> 3

Met Ser Ala Glu Ala Lys Val Arg Leu Lys His Cys Pro Thr Ala Glu

1 5 10 15

Asp Arg Ala Ala Ala Asp Ala Leu Leu Ala Gln Leu Pro Gly Gly Asp

20 25 30

Arg Ala Leu Asp Arg Gly Phe Asp Glu Pro Trp Gln Leu Arg Ala Phe

35 40 45

Ala Leu Ala Val Ala Ala Cys Arg Ala Gly Arg Phe Glu Trp Lys Gln

50 55 60

Leu Gln Gln Ala Leu Ile Ser Ser Ile Gly Glu Trp Glu Arg Thr His

65 70 75 80

Asp Leu Asp Asp Pro Ser Trp Ser Tyr Tyr Glu His Phe Val Ala Ala

85 90 95

Leu Glu Ser Val Leu Gly Glu Glu Gly Ile Val Glu Pro Glu Ala Leu

100 105 110

Asp Glu Arg Thr Ala Glu Val Leu Ala Asn Pro Pro Asn Lys Asp His

115 120 125

His Gly Pro His Leu Glu Pro Val Ala Val His Pro Ala Val Arg Ser

130 135 140

Claims

1.一种腈水合酶突变体，其特征在于，所述腈水合酶由α亚基、β亚基和调控蛋白组成；所述突变体是将腈水合酶亲本的α亚基的第6和/或126位突变，和/或β亚基的第46位突变；所述腈水合酶亲本的α亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，β亚基的氨基酸序列如SEQID NO.2所示，调控蛋白的氨基酸算序列如SEQ ID NO.3所示。

2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体包括如下(a)-(f)任一：

(a)将β亚基的第46位突变为赖氨酸；

(b)将α亚基的第6位突变为苏氨酸；

(c)将α亚基的第126位突变为酪氨酸，

(d)将α亚基的第126位突变为酪氨酸，并将β亚基的第46位突变为赖氨酸；

(e)将α亚基的第6位突变为苏氨酸，并将β亚基的第46位突变为赖氨酸；

(f)将α亚基的第6位突变为苏氨酸、第126位突变为酪氨酸，并将β亚基的第46位突变为赖氨酸。

3.编码权利要求1或2所述突变体的基因。

4.携带权利要求3所述基因的重组质粒。

5.表达权利要求1或2所述突变体，或含有权利要求3所述基因的宿主细胞。

6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含原核或真核微生物。

7.一种生产酰胺类物质的方法，其特征在于，以腈类物质为底物，利用权利要求1或2所述突变体催化生成酰胺类物质。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述腈类物质包括异丁腈、正戊腈、丙烯腈、烟腈、2-氰基吡嗪、苯甲腈、肉桂腈和萘甲腈。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述酰胺类物质包括异丁酰胺、戊酰胺、丙烯酰胺、烟酰胺、吡嗪酰胺、萘甲酰、苯甲酰胺和肉桂酰胺。

10.权利要求1或2所述突变体，或权利要求3所述基因，或权利要求4所述重组质粒，或权利要求5或6所述宿主细胞在制备酰胺类物质中的应用。