CN114350645B - 一种新基因型腈水合酶及其重组表达 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新基因型腈水合酶及其重组表达，属于生物工程技术领域。所述腈水合酶来源于RoseomonasStagni，基因全长1014bp，编码336个氨基酸，并将其成功构建于大肠杆菌重组表达体系中。得到的目的蛋白以3‑氰基嘧啶为催化底物，可证明其是一种新型的腈水合酶，对烟腈有催化活力。并且将所述腈水合酶第250位精氨酸突变为丙氨酸后酶活提高了3.61倍，更加适于酰胺类物质在工业领域的生产。

Description

一种新基因型腈水合酶及其重组表达

技术领域

本发明涉及一种新基因型腈水合酶及其重组表达，属于生物工程技术领域。

背景技术

腈水合酶(Nitrile hydratase，简称NHase，EC 4.2.1.84)，是一类可以催化腈类物质通过水合反应转化为高附加值酰胺类化合物的金属酶，在大宗化学品丙烯酰胺的工业生产上已经被广泛应用。目前，腈水合酶以其绿色环保、反应条件较温和、安全系数高等优势，而逐渐替代传统的化学法，使得酰胺类的生产符合可持续发展和绿色生产理念。

绝大多数腈水合酶是由两个α和两个β亚基组成的四聚体结构。有一类蛋白能够帮助腈水合酶摄取特定的金属离子，这一类蛋白被称为腈水合酶的调控蛋白。大部分腈水合酶的基因结构顺序为β亚基-α亚基-调控蛋白。但是此次挖掘到的新基因型腈水合酶没有β亚基，只有α亚基和调控蛋白。并且两者融合在一起，形成了一种αp14k基因型的腈水合酶。目前发现的腈水合酶的成熟机制主要是“亚基交换机制”。与常规的腈水合酶不同，αp14k型腈水合酶的成熟机制显然不能通过目前已有的研究得到解答。它是如何进行翻译后修饰的？它是如何摄取co²⁺的。因此新基因型腈水合酶的发现和研究，对于深入认识调控蛋白和理解腈水合酶的成熟机制具有重要意义。

发明内容

针对现有的技术难点及存在的问题，本发明提供了一种来源于玫瑰假单胞菌Roseomonas Stagni的腈水合酶的氨基酸基序及其突变体以及它们在底物催化生产上的应用。

本发明的第一个目的是提供腈水合酶突变体，所述突变体是在来源于RoseomonasStagni的腈水合酶第250位发生取代。

在一种实施方式中，所述来源于Roseomonas Stagni的腈水合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，并将其第250位取代为丙氨酸。

本发明的第二个目的是提供编码所述突变体的基因。

本发明的第三个目的是提供含有所述基因的表达载体。

在一种实施方式中，所述表达载体包括pET-24a(+)。

本发明的第四个目的是提供表达所述突变体、或含有所述基因的宿主细胞。

在一种实施方式中，所述宿主细胞包括E.coli BL21(DE3)。

本发明的第五个目的是提供一种制备酰胺类物质的方法，所述腈类物质为底物，所述突变体或氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的腈水合酶催化生成酰胺类物质。

在一种实施方式中，所述腈类物质包括异丁腈、正戊腈、丙烯腈、烟腈、2-氰基吡嗪、苯甲腈、肉桂腈和萘甲腈。

在一种实施方式中，所述酰胺类物质包括异丁酰胺、戊酰胺、丙烯酰胺、烟酰胺、吡嗪酰胺、萘甲酰、苯甲酰胺和肉桂酰胺。

本发明的第五个目的是提供所述突变体、或所述基因、或所述表达载体、或所述宿主细胞、或氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的腈水合酶在生产酰胺类物质中的应用。

在一种实施方式中，所述酰胺类物质包括但不限于异丁腈、正戊腈、丙烯腈、烟腈、2-氰基吡嗪、苯甲腈、肉桂腈和萘甲腈。

本发明的有益效果：本发明提供了一段RS-αp14k的氨基酸基序，在宿主中表达后，通过纯化得到纯酶。该腈水合酶在pH 7.4条件下催化烟腈形成烟酰胺，最高比活可达8.3U/mg。每个腈水合酶可以结合4.7个CO²⁺，经DSC扫描后发现该腈水合酶的Tm值为55.5℃。证明了在没有β亚基存在的条件下，RS-αp14k型腈水合酶依然能结合CO²⁺并催化烟腈生成烟酰胺。进一步地，将第250位突变为丙氨酸后，比酶活达到了30.01U/mg，相较于野生型提高了3.61倍。这对于进一步深入认识腈水合酶的生物催化机理和对其进行改造具有重要意义。

附图说明

图1为硫铵沉淀后的SDS-PAGE电泳图；M：蛋白Marker，1：20％硫酸铵沉淀，2：30％硫酸铵沉淀，3：40％硫酸铵沉淀，4：50％硫酸铵沉淀，5：60％硫酸铵沉淀，6：70％硫酸铵沉淀，7：80％硫酸铵沉淀。

图2为纯酶的SDS-PAGE电泳图，M：蛋白Marker，1：RS-αp14k野生型纯酶2:R250A突变体纯酶

图3为RS-αp14k野生型的DSC曲线图。

图4为RS-αp14k野生酶WT与突变体R250A对于烟腈催化的比酶活。

具体实施方式

实施例1：基因的获得和表达体系的构建

从基因库中将RS-αp14k基因序列调出，根据大肠杆菌密码子偏好性对密码子进行优化(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，最终将优化的序列送至苏州金唯智进行基因合成，选择的表达载体是pET-24a(+)，选择的基因插入位置为NdeⅠ和EcoRⅠ两个酶切位点，菌株选择E.coli DH5α，构建RS-αp14k基因保藏菌株E.coli DH5α/pET-24a(+)-RS-αp14k，测序验证，验证正确的即为阳性转化子，从阳性转化子中提取出质粒pET-24a(+)-RS-αp14k

实施例2：重组蛋白的纯化

1)诱导培养

将重组质粒pET-24a(+)-RS-αp14k转化E.coli BL21(DE3)，挑取单菌落至5mL LB培养基(胰蛋白胨10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，NaCl 10.0g/L，卡那霉素终浓度50μg/mL)，37℃、200rpm条件下培养7-8h。将种子液按1％(v/v)转接至500mL 2×YT培养基(胰蛋白胨16.0g/L，酵母提取物10.0g/L，NaCl 5.0g/L，卡那霉素终浓度50μg/mL)，37℃、200rpm条件下培养至OD₆₀₀至0.6-0.8，加入终浓度为0.4mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)以及0.1g/L的CoCl₂·6H₂O，改变培养温度为25℃，诱导表达12-16h。

2)硫酸铵沉淀初步纯化目的蛋白

在12000rpm条件下离心3min收集菌体细胞，用100mL磷酸钾缓冲液(1mM DTT，pH＝7.4)重悬于冰水混合物中超声破碎。破碎液在4℃、12000rpm条件下离心30min取上清液。

本发明中的RS-αp14k型腈水合酶未添加纯化标签，先通过硫酸铵沉淀法进行粗提纯。首次实验时应进行不同饱和度硫酸铵的分级沉淀，确定沉淀目的蛋白所需的硫酸铵饱和度范围。将离心所得上清液用缓冲液定容至100mL，置于冰水混合物中。查硫酸铵溶液饱和度计算表(0℃)，边搅拌边缓慢加入11.4g研磨均匀的硫酸铵粉末，使其饱和度达到20％。加完硫酸铵后，用稀氨水调节酶液pH至7.4，继续搅拌30min，然后在4℃、12000r·min-1条件下离心20min。取100mL离心所得上清液，加入5.9g硫酸铵，使其饱和度达到30％，之后重复上述操作，再取100mL第二次和第三次离心所得上清液，分别加入6.2g、6.4g、6.6g、6.9g、7.2g硫酸铵，使其饱和度达到40％、50％、60％、70％、80％。用适量缓冲液重悬每次离心所得沉淀，通过SDS-PAGE进行检测，确定能够富集目的蛋白的硫酸铵饱和度范围。将含目的蛋白的沉淀用10mL缓冲液重悬后，于1L缓冲液中透析12h，每4h更换一次透析缓冲液，去除样品中高浓度的盐分。透析后的样品用0.22μm水系微孔滤膜过滤后备用。

3)阴离子交换层析

初步提纯后，再通过离子交换法进一步纯化。由于RS-αp14k的等电点在5附近，在pH＝7.4的缓冲液条件下带有负电荷，因此选择阴离子交换层析，层析柱为强阴离子交换柱Resource Q。纯化柱用结合缓冲液平衡后，进行上样，然后用结合缓冲液洗去杂蛋白。设置线性洗脱方法(0～100％ B，20CV)，用阴离子交换层析洗脱缓冲液进行目的蛋白的洗脱。收集各洗脱峰对应的样品。蛋白浓度使用Bradford蛋白浓度检测试剂盒进行定量。采用SDS-PAGE检测目的蛋白的纯化质量，检测如图2所示，可见RS-αp14k纯化后蛋白条带单一，纯化质量高。

实施例3：酶学性质的测定

1)酶活测定

腈水合酶的酶活力(U)：单位酶活力定义为25℃下，每分钟催化烟腈生成1μmol烟酰胺所需要的酶量。

腈水合酶的比酶活(U/mg)：每毫克腈水合酶所具有的酶活力。

用10mM KPB(pH 7.4)溶液将RS-αp14k纯酶的浓度稀释至1mg/mL，取10μL至1.5mL离心管中，置于25℃金属浴上。向离心管中加入490μL底物(200mM烟腈溶液)，充分涡旋混匀，25℃下反应10min，然后加入500μL纯乙腈溶液进行终止，过0.22μm滤膜。

液相检测方法：流动相组成为乙腈：水＝1：2(v/v)，流速为0.6mL/min，检测波长为215nm，柱温为40℃，测定反应体系中产物烟酰胺的生成量。RS-αp14k型腈水合酶的比酶活计算结果8.6±0.7U/mg。

2)热稳定性测定

采用差示扫描量热法(DSC)检测RS-αp14k腈水合酶的热稳定性。即在程序控制温度下，测量输入给样品与参比物的功率差和温度关系，以热流率(dh/dt)为纵坐标、以温度(T)为横坐标，得到dH/dt-t(T)曲线。曲线离开基线的位移即代表样品吸热或放热的速率(mJ·s^-1)，而曲线中峰或谷包围的面积即代表热量的变化。因而差示扫描量热法可以直接测量样品在发生物理或化学变化时的热效应。本实验设置扫描温度范围为30-80℃。DSC曲线如图4所示，检测结果为RS-αp14k型腈水合酶的Tm值为55.5℃。

3)co²⁺含量测定

采用国标GB5009.286-2016中的第一法电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)测定蛋白样品中CO²⁺的含量。Co²⁺含量的计算结果为每个RS-αp14k蛋白结合0.47±0.05个Co²⁺。

实施例4：突变体的构建

根据RS-αp14k的野生型质粒pET24a(+)-RS-αp14k.，采用全质粒PCR的方法构建了突变体质粒pET24a(+)-R250A。首先以质粒pET24a(+)-RS-αp14k为模板，突变序列设计在引物上，通过PCR扩增出碱基序列发生突变的DNA片段，所用引物序列如表1所示，扩增体系如表2所示，PCR扩增反应条件为95℃预变性3min，98℃变性15s，55℃退火30s，72℃延伸1min30s，72℃延伸5min，共30个循环。将PCR产物用DpnI消化酶消化2-3h，转化E.coli DH5α，在LB平板培养后、挑取单克隆由金唯智生物科技(苏州)有限公司进行测序验证，得到阳性转化子。

表1引物序列

表2PCR扩增体系

实施例5：RS NHase的野生型及突变体的催化效率

将RS-αp14k的野生型WT及重构质粒pET24a(+)-R250A分别转化至E.coli BL21(DE3)，挑取单菌落至5mL LB培养基，37℃、200rpm条件下培养7-8h。将种子液按1％(v/v)转接至100mL2×YT培养基，37℃、200rpm条件下培养至OD₆₀₀至0.6-0.8，加入终浓度为0.4mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)以及0.1g/L的CoCl₂·6H₂O，改变培养温度为24℃，诱导表达12-16h。

纯化及酶活检测方法同实施例2和3所述。

WT及突变体的比酶活计算结果如图4所示，野生酶WT的比酶活为8.3±0.7U/mg，突变R250A的比酶活分别为30.01±0.8U/mg

即当上述氨基酸残基发生突变时，腈水合酶的比酶活提高，说明上述250位氨基酸残基可能在腈水合酶的关键结构域，对于腈水合酶的催化活性具有重要作用。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种新基因型腈水合酶及其重组表达

<130> BAA211478A

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1011

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgcatgatc tgccgccgac ccatccgccg catgacgcgg gcgggcgata tgatggcccg 60

gtggaacgcg aagaacatga agcggcgcat tgggaacgcg aagcggatgc gattcgcatg 120

ctgctggcgg atggccgccg ccgcctgttt accaccgatg aaagccgccg cgtgcaagaa 180

cagctggatg atgcgaccta ttgggcgatg ccgtattatg aacgctggat tctggcgttt 240

agcagcctgc tgctggaaaa aggcaccctg accattgcgg cgctggaagc ggaagaagcg 300

cgcctgcgcg cggaaggcct ggatcgcgtg gaagatgaag cggcgggcca tcatcatggc 360

catgatcatg atcatgatca tgatcatgat catgatcatg atgatgatca tccgtatcaa 420

gcggatcatg acgcgggcga aaccgtgctg agcccgctgc gcctgcgcgg catggcggtg 480

cgcaacctga ttgtggcgaa aggcgtgctg accccggaag aaattcgcgc ggaaattgag 540

cgcatggatg cacgctcacc tcatgatggc gcggcggtgg tcgcacgtgc gtgggtggac 600

gcggactttg ccgcccgctt agcagcggat gcgccggcgg cggtgaaaga actgggcctg 660

gatgcggcgg gcaccaaact ggcggcgctg tttaacaccg cggatcgcca tcatctggtg 720

gtgtgcaccc tgtgcagctg ctatccgcgc accattattg gcagaccgcc tgcgtggtat 780

aaaagccgcg cgtaccgcgc tcgcgcggta cgcgacccgc gcggcattct gcgcgaattt 840

ggcacagaac tgccgccggg caccgaactg cgcgtgcatg atagcaacgc ggaactgcga 900

tatctggtga taccggcgcg cccggcgggc acagaaggct gggaagaaac ccgcctggcg 960

accctggtga cccgcgatag catgattggc gtgaccaccg cgcgcgcgcc g 1011

<210> 2

<211> 337

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met His Asp Leu Pro Pro Thr His Pro Pro His Asp Ala Gly Gly Arg

1 5 10 15

Tyr Asp Gly Pro Val Glu Arg Glu Glu His Glu Ala Ala His Trp Glu

20 25 30

Arg Glu Ala Asp Ala Ile Arg Met Leu Leu Ala Asp Gly Arg Arg Arg

35 40 45

Leu Phe Thr Thr Asp Glu Ser Arg Arg Val Gln Glu Gln Leu Asp Asp

50 55 60

Ala Thr Tyr Trp Ala Met Pro Tyr Tyr Glu Arg Trp Ile Leu Ala Phe

65 70 75 80

Ser Ser Leu Leu Leu Glu Lys Gly Thr Leu Thr Ile Ala Ala Leu Glu

85 90 95

Ala Glu Glu Ala Arg Leu Arg Ala Glu Gly Leu Asp Arg Val Glu Asp

100 105 110

Glu Ala Ala Gly His His His Gly His Asp His Asp His Asp His Asp

115 120 125

His Asp His Asp His Asp Asp Asp His Pro Tyr Gln Ala Asp His Asp

130 135 140

Ala Gly Glu Thr Val Leu Ser Pro Leu Arg Leu Arg Gly Met Ala Val

145 150 155 160

Arg Asn Leu Ile Val Ala Lys Gly Val Leu Thr Pro Glu Glu Ile Arg

165 170 175

Ala Glu Ile Glu Arg Met Asp Ala Arg Ser Pro His Asp Gly Ala Ala

180 185 190

Val Val Ala Arg Ala Trp Val Asp Ala Asp Phe Ala Ala Arg Leu Ala

195 200 205

Ala Asp Ala Pro Ala Ala Val Lys Glu Leu Gly Leu Asp Ala Ala Gly

210 215 220

Thr Lys Leu Ala Ala Leu Phe Asn Thr Ala Asp Arg His His Leu Val

225 230 235 240

Val Cys Thr Leu Cys Ser Cys Tyr Pro Arg Thr Ile Ile Gly Arg Pro

245 250 255

Pro Ala Trp Tyr Lys Ser Arg Ala Tyr Arg Ala Arg Ala Val Arg Asp

260 265 270

Pro Arg Gly Ile Leu Arg Glu Phe Gly Thr Glu Leu Pro Pro Gly Thr

275 280 285

Glu Leu Arg Val His Asp Ser Asn Ala Glu Leu Arg Tyr Leu Val Ile

290 295 300

Pro Ala Arg Pro Ala Gly Thr Glu Gly Trp Glu Glu Thr Arg Leu Ala

305 310 315 320

Thr Leu Val Thr Arg Asp Ser Met Ile Gly Val Thr Thr Ala Arg Ala

325 330 335

Pro

Claims (6)

1. 腈水合酶突变体，其特征在于，所述突变体是在来源于Roseomonas Stagni的腈水合酶第250位取代为丙氨酸；所述来源于Roseomonas Stagni的腈水合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.编码权利要求1所述突变体的基因。

3.含有权利要求2所述基因的表达载体。

4.表达权利要求1所述突变体或含有权利要求2所述基因的宿主细胞。

5.一种制备酰胺类物质的方法，其特征在于，腈类物质为底物，利用权利要求1所述突变体催化生成酰胺类物质；所述腈类物质为烟腈，所述酰胺类物质为烟酰胺。

6.权利要求1所述突变体，或权利要求2所述基因，或权利要求3所述表达载体，或权利要求4所述宿主细胞在生产烟酰胺中的应用。