CN103409392B - 一种热稳定的淀粉酶突变体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公布了一种热稳定的淀粉酶突变体及其制备方法，属于遗传工程领域。本发明以嗜碱芽孢杆菌（Bacillus alcalophilus）JN21(CCTCC NO:M2011231)淀粉酶为母本，采用分子生物学技术对嗜碱芽孢杆菌淀粉酶序列进行定点突变，在淀粉酶催化结构域内引入一对或多对二硫键，获得了具有较高热稳定性的淀粉酶突变体。在此改造条件下，嗜碱芽孢杆菌淀粉酶在60℃的半衰期由对照（突变前）例的3.2min提高到22.3min。利用此策略可以显著提高淀粉酶的热稳定性，为其工业化生产提供了基础。此策略对其它酶的性质改造具有重要的指导意义。

Description

一种热稳定的淀粉酶突变体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种热稳定的淀粉酶突变体及其制备方法，具体涉及一种具有较高热稳定性的碱性淀粉酶突变体及其制备方法。
背景技术
淀粉酶能水解淀粉分子内部α-1,4-葡萄糖苷键，水解产物为糊精、麦芽寡糖、麦芽糖和葡萄糖，在食品、纺织、医药和饲料等工业领域广泛应用。碱性淀粉酶在强碱性条件下水解淀粉的潜力，使其可以应用于淀粉加工、纺织退浆以及用于自动洗衣机的洗涤剂添加等工业领域。添加碱性淀粉酶可有效除去餐具和衣物上的淀粉类污垢，提高纺织品印染质量，有着良好的实际应用效果和广阔的市场需求，相关研究也因此受到广泛重视。
碱性淀粉酶退浆主要应用淀粉酶催化淀粉大分子链水解，生成分子质量较小、黏度较低和溶解度较高的低分子化合物，再经水洗即可去除。这种方法催化速度快，对环境污染小，因而受到印染工作者的重视。为了满足印染行业连续化生产的要求，需要淀粉酶能够在高温下使用，但是目前大多数淀粉酶在高温下的稳定性较差。因此基于已得到的碱性淀粉酶在大肠中的表达平台，利用定点突变，对碱性淀粉酶进行分子改造，以期得到酶学性质更适合工业应用的碱性淀粉酶。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种热稳定的淀粉酶突变体，其特征在于，通过定点突变或置换方法在淀粉酶催化结构域内引入一对或多对二硫键，获得具有较高热稳定性的淀粉酶突变体。
所述淀粉酶突变体是以SEQ ID NO.1为出发序列，具有下述1）～3）中的至少一种突变的氨基酸序列：
1）第25位氨基酸由脯氨酸替换成半胱氨酸，第416位氨基酸由甘氨酸替换成半胱氨酸；
2）第106位氨基酸由甘氨酸替换成半胱氨酸，第110位氨基酸由谷氨酰胺替换成半胱氨酸；
1）第426位氨基酸由组氨酸替换成半胱氨酸，第470位氨基酸由甲硫氨酸替换成半胱氨酸。
能表达生产权利要求1-2所述淀粉酶突变体的载体也属于本专利要求保护的范围。
能表达生产权利要求1-2所述淀粉酶突变体的基因工程菌或转基因细胞系也属于本专利要求保护的范围。
本发明还提供一种制备所述淀粉酶突变体的方法，具体步骤如下：
1）根据嗜碱芽孢杆菌淀粉酶序列SEQ ID NO.1所示，采用化学全合成的方法全合成后克隆到质粒pET-22b(+)中，构建重组质粒pAmyQ；
2）通过Swiss-model软件对源自嗜碱芽孢杆菌淀粉酶（SEQ ID NO.1）进行模拟，获得淀粉酶空间结构；
3）利用生物信息学软件对淀粉酶的氨基酸序列以及空间结构进行分析，确定在淀粉酶催化结构域内引入二硫键的位点；
4）设计突变引物，对淀粉酶基因序列进行定点突变，将所述位点的氨基酸进行替换，获得含有突变淀粉酶序列的重组载体；
5）将突变后重组载体转化大肠杆菌BL21，诱导表达，获得淀粉酶突变体。
本发明提供的碱性淀粉酶突变体热稳定性显著提高，在60℃的半衰期由对照（突变前）例的3.2min的提高到22.3min，提高了7倍。相对于采用筛菌或诱变等手段，缩短了酶学性质改造时间。将该碱性淀粉酶突变体应用于纺织、洗涤剂、制革等领域，可以在耐温耐碱环境下高效降解淀粉，具有广阔的应用前景。
具体实施方式
实施例1：淀粉酶热稳定性定点突变分析与方法
通过Swiss-model软件对源自嗜碱芽孢杆菌淀粉酶（SEQ ID NO.1）进行模拟，获得淀粉酶空间结构，利用软件Disulfide by DesignTM预测淀粉酶结构中可能生成的二硫键。在此基础上再利用Swiss-model模拟突变后酶的空间结构，用Discovery Studio软件分析是否形成二硫键，得到能形成二硫键的氨基酸位点。最后利用Discovery Studio软件分析能形成二硫键的氨基酸位点突变对酶分子内部形成氢键、盐桥的影响，同时考虑突变位点与活性中心的距离，最终确定在淀粉酶催化结构域内引入二硫键的位点（Pro25-Gly416,Gly106-Gln110和His426-Met470）。
根据嗜碱芽孢杆菌（Bacillus alcalophilus）淀粉酶序列，采用化学全合成的方法全合成后，克隆到质粒pET-22b(+)中，构建重组质粒pAmyQ。
针对不同位点的定点突变，设计相对应的定点突变引物（表1）。利用定点突变引物及重组质粒pAmyQ，对淀粉酶进行定点突变。采用PCR酶，利用突变引物对重组质粒pAmyQ进行扩增。将扩增后片段利用胶回收试剂盒进行回收纯化。将获得的纯化后片段，采用磷酸化试剂盒对片段两端进行磷酸化。将磷酸化后的片段，利用连接酶进行连接，获得单点突变后的重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌宿主BL21，进行诱导表达，获得单点突变后的重组淀粉酶。以单点突变后获得的重组质粒为模板进行下一轮的突变，最终获得一个或多个位点突变后的重组淀粉酶。
表1淀粉酶突变引物序列
实施例2：淀粉酶热稳定性定点突变分析与方法
DNS法测定碱性淀粉酶酶活：
1）DNS试剂的配制：称取3.25g3,5-二硝基水杨酸溶于少量水中，移入500mL容量瓶，加入2mol/L氢氧化钠溶液162.5mL，再加入22.5g丙三醇，摇匀，定容至500mL，储存于棕色瓶放置在4℃冰箱中待用。
2）葡萄糖标准曲线的制作：配制0.2g/L-1.0g/L不同浓度的葡萄糖溶液。取1mL不同浓度的葡萄糖与同体积的DNS溶液混合，放入沸水浴中，水浴10min。用冷水冷却，定容至10mL，A540测定吸光值。以葡萄糖的浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，制作标准曲线。
3）将1mL2%的可溶性淀粉加入到试管中，加入1.5mL pH9.5的缓冲液，混匀，50℃预热5min，加入0.2mL稀释好的酶液，反应5min。取1mL反应液与同体积的DNS试剂混匀，沸水浴煮沸15min，用冷水冷却，定容至10mL，混匀后，以没有加酶液但加入当量的去离子水的反应体系作为对照，测定A540吸光值。
淀粉酶在60℃的热稳定性测定：
将淀粉酶置于60℃进行孵育，采用3）的方法，定期测定其剩余酶活。绘制剩余酶活的ln值与时间的曲线，根据曲线的斜率得到该温度下的热失活常数k，淀粉酶的半衰期即为ln2与k的比值。
酶活力单位定义：
在pH9.5，50℃条件下，1min降解可溶性淀粉产生1μmol还原物质（以葡萄糖计算）所需要的酶量，为1个酶活单位（U）。
实施例3：淀粉酶在60℃的热稳定性测定分析
通过测定发现，单对二硫键突变体P25C-G416C、G106C-Q110C和H426C-M470C在60℃的半衰期（表2）都有提高，其中G106C-Q110C效果最显著，半衰期提高至原来的3.3倍。在此基础上进行组合突变，获得P25C-G416C/G106C-Q110C、P25C-G416C/H426C-M470C、G106C-Q110C/H426C-M470C和P25C-G416C/G106C-Q110C/H426C-M470C四个突变体，通过测定发现，它们在60℃的半衰期（表3）都有提高，其中能形成三对二硫键的六突变体P25C-G416C/G106C-Q110C/H426C-M470C的效果最显著，半衰期提高至原来的7倍。该淀粉酶在碱性条件下具有较强的热稳定性。
表2单对二硫键重组酶在60℃的热稳定性
表3组合突变重组酶在60℃的热稳定性

Claims (7)

1.一种热稳定的淀粉酶突变体，其特征在于，在淀粉酶催化结构域内引入一对或多对二硫键，获得了具有较高热稳定性的淀粉酶突变体；其特征在于以SEQ ID NO.1所示序列为出发序列，具有下述1)～3)中的至少一种突变的氨基酸序列：
1)第25位氨基酸由脯氨酸替换成半胱氨酸，第416位氨基酸由甘氨酸替换成半胱氨酸；
2)第106位氨基酸由甘氨酸替换成半胱氨酸，第110位氨基酸由谷氨酰胺替换成半胱氨酸；
3)第426位氨基酸由组氨酸替换成半胱氨酸，第470位氨基酸由甲硫氨酸替换成半胱氨酸。
2.能表达生产权利要求1所述淀粉酶突变体的转基因细胞系。
3.能表达生产权利要求1所述淀粉酶突变体的载体。
4.能表达生产权利要求1所述淀粉酶突变体的基因工程菌。
5.权利要求1所述淀粉酶突变体的制备方法，其特征在于，以嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalcalophilus)为出发菌株，通过定点突变或置换方法在淀粉酶催化结构域内引入一对或多对二硫键，获得了具有较高热稳定性的淀粉酶突变体。
6.权利要求5所述方法，其特征在于，具体步骤如下：
1)根据嗜碱芽孢杆菌淀粉酶序列SEQ ID NO.1所示，采用化学全合成的方法全合成后克隆到质粒pET-22b(+)中，构建重组质粒pAmyQ；
2)通过Swiss-model软件对源自嗜碱芽孢杆菌的序列为SEQ ID NO.1所示的淀粉酶进行模拟，获得淀粉酶空间结构；
3)利用生物信息学软件对淀粉酶的氨基酸序列以及空间结构进行分析，确定在淀粉酶催化结构域内引入二硫键的位点；
4)设计突变引物，对淀粉酶基因序列进行定点突变，将所述位点的氨基酸进行替换，获得含有突变淀粉酶序列的重组载体；
5)将突变后重组载体转化大肠杆菌BL21，诱导表达，获得淀粉酶突变体。
7.权利要求1所述淀粉酶突变体在纺织、洗涤剂、制革、造纸、食品领域的应用。
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