CN104263708A - 一种热稳定性提高的淀粉酶突变体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种热稳定性提高的淀粉酶突变体及其制备方法和应用，属于酶工程领域。本发明利用分子生物学技术进行多轮定点突变获得了热稳定性提高的淀粉酶突变体，所得淀粉酶在60℃的半衰期由对照(突变前)例的3.2min提高到23.9min。利用此策略可以显著提高淀粉酶的热稳定性，为其工业化生产提供了基础。此策略对其它酶的性质改造具有重要的指导意义。

Description

一种热稳定性提高的淀粉酶突变体及其制备方法和应用
本申请是申请号为：201310422992.2，申请日为：2013年9月17日，申请名称为：一种热稳定性提高的淀粉酶突变体及其制备方法和应用的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种热稳定性提高的淀粉酶突变体及其制备方法，属于酶工程领域。
背景技术
α-淀粉酶(EC3.2.1.1)能够水解淀粉分子内部α-1,4-葡萄糖苷键，水解产物为糊精、麦芽寡糖、麦芽糖和葡萄糖，在食品、纺织、医药和饲料等工业领域广泛应用。碱性淀粉酶在强碱性条件下水解淀粉的潜力，使其可以应用于淀粉加工、纺织退浆以及用于自动洗衣机的洗涤剂添加等工业领域。碱性淀粉酶退浆主要应用α-淀粉酶催化淀粉大分子链水解，生成分子质量较小、黏度较低和溶解度较高的低分子化合物，再经水洗即可去除。这种方法可以节省大量时间、降低环境污染，同时将对纺织物本身造成的损坏降至最低程度，因而受到印染工作者的重视。为了满足印染行业连续化生产的要求，需要淀粉酶能够在高温下使用，但是目前大多数淀粉酶在高温下的稳定性较差。
定点突变和定向进化是提高工业用酶热稳定性的两种主要手段。定向进化虽然不需要准确的酶分子结构信息，但是需要建立一种能够从大量的突变株中快速简便的筛选到优势菌株的方法。而定点突变，与定向进化相比，是一种更迅速、直接且节约成本的提高酶热稳定性的方法。本发明基于已得到的碱性淀粉酶在大肠中的表达平台，利用定点突变技术，对碱性淀粉酶进行分子改造，以期得到更适合工业应用的热稳定性提高的碱性淀粉酶。
发明内容
本发明要解决的第一个问题是提供一种热稳定性提高的淀粉酶突变体，其相对亲本淀粉酶具有一个或多个氨基酸发生突变。
所述淀粉酶亲本的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述发生突变的氨基酸位于淀粉酶蛋白结构的外表面(溶剂可接触面积大于100)或内表面(溶剂可接触面积小于5)，所述突变可以增强蛋白表面的静电相互作用或增强蛋白内部疏水相互作用。
所述一个氨基酸发生突变是淀粉酶第66位丝氨酸替换成缬氨酸、第98位赖氨酸替换成精氨酸、第166位天冬酰胺替换成精氨酸、第192位赖氨酸替换成精氨酸、第258位丝氨酸替换成精氨酸、第275位天冬酰胺替换成精氨酸、第317位谷氨酰胺替换成精氨酸、第349位谷氨酰胺替换成缬氨酸或第438位丝氨酸替换为缬氨酸，所得单突变体分别命名为S66V、K98R、N166R、K192R、S258R、N275R、Q317R、Q349V、S438V。
所述多个氨基酸发生突变包括：
(1)第98位赖氨酸替换成精氨酸、第166位天冬酰胺替换成精氨酸、第192位赖氨酸替换成精氨酸、第258位丝氨酸替换成精氨酸、第275位天冬酰胺替换成精氨酸及第317位谷氨酰胺替换成精氨酸，所得6重突变体命名为K98R/N166R/K192R/S258R/N275R/Q317R；
(2)第66位丝氨酸替换成缬氨酸、第349位谷氨酰胺替换成缬氨酸及第438位丝氨酸替换为缬氨酸，所得三重突变体命名为S66V/Q349V/S438V；
(3)将(1)、(2)中所述的9个位点同时进行突变，所得9重突变体命名为S66V/K98R/N166R/K192R/S258R/N275R/Q317R/Q349V/S438V。
本发明还提供一种所述淀粉酶突变体的制备方法，具体步骤如下：
1)根据SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，采用化学全合成的方法全合成基因后克隆到质粒pET-22b(+)中，构建重组质粒pAmyQ；
2)利用Swiss-model软件对源自嗜碱芽孢杆菌淀粉酶(SEQ ID NO.1)进行模拟，获得淀粉酶空间结构，确定在淀粉酶催化结构域内进行氨基酸替换的位点；
3)设计突变引物，通过PCR对淀粉酶基因序列进行定点突变，获得含有突变淀粉酶序列的重组载体；
4)将突变后重组载体转化大肠杆菌BL21，诱导表达，离心收集发酵上清，获得淀粉酶突变体。
本发明提供的碱性淀粉酶单突变体或多重突变体热稳定性均显著提高，其中，9个位点同时突变的突变体在60℃的半衰期由对照(突变前)的3.2min的提高到23.9min。相对于采用筛菌或诱变等手段，缩短了酶学性质改造时间。将该碱性淀粉酶突变体应用于纺织、洗涤剂、制革等领域，可以在耐温耐碱环境下高效降解淀粉，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1：pAmyQ的质粒图谱。
图2：淀粉酶3D空间结构。
具体实施方式
实施例1淀粉酶突变位点的确定及突变体的获得
通过Swiss-model软件对源自嗜碱芽孢杆菌的淀粉酶(SEQ ID NO.1)进行模拟，以获得的淀粉酶空间结构模型为基础，利用Macrodox软件计算出酶蛋白分子内所有氨基酸的溶剂可接触面积。一方面，选取位于蛋白表面的(溶剂可接触面积大于100)赖氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸，将它们替换成精氨酸，增强蛋白表面的静电相互作用，同时分析相应位点的氨基酸突变对酶分子内部形成氢键、盐桥的影响，确定进行以下位置处的氨基酸替换：Lys 98Arg、Asn 166Arg、Lys 192Arg、Ser 258Arg、Asn 275Arg和Gln 317Arg。另一方面，选取位于蛋白内部的(溶剂可接触面积小于5)天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸，将它们替换成缬氨酸，增强蛋白内部疏水相互作用；同时分析相应位点的氨基酸突变对酶分子内部疏水相互作用的影响，确定进行以下位置处的氨基酸替换：Ser 66Val、Gln 349Val和Ser 438Val。基于以上分析，最终确定在如下位置处进行氨基酸替换：Ser 66Val、Lys 98Arg、Asn 166Arg、Lys 192Arg、Ser 258Arg、Asn 275Arg、Gln 317Arg、Gln 349Val和Ser 438Val。
根据SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，采用化学全合成的方法全合成相应基因后，克隆到质粒pET-22b(+)中，构建重组质粒pAmyQ。
针对不同位点的定点突变，设计相对应的定点突变引物(表1)。以重组质粒pAmyQ为模版，利用定点突变引物对淀粉酶进行定点突变。采用PCR酶，利用突变引物对重组质粒pAmyQ进行扩增。将扩增后片段利用胶回收试剂盒进行回收纯化。将获得的纯化后片段，采用磷酸化试剂盒对片段两端进行磷酸化。将磷酸化后的片段，利用连接酶进行连接，获得单点突变后的重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌宿主BL21，进行诱导表达，获得单点突变后的重组淀粉酶。以单点突变后获得的重组质粒为模板进行下一轮的突变，最终获得多个位点突变后的重组淀粉酶。
表1淀粉酶突变引物序列
实施例2淀粉酶热稳定性定点突变分析与方法
DNS法测定碱性淀粉酶酶活：
1)DNS试剂的配制：称取3.25g 3,5-二硝基水杨酸溶于少量水中，移入500mL容量瓶，加入2mol/L氢氧化钠溶液162.5mL，再加入22.5g丙三醇，摇匀，定容至500mL，储存于棕色瓶放置在4℃冰箱中待用。
2)葡萄糖标准曲线的制作：配制0.2g/L-1.0g/L不同浓度的葡萄糖溶液。取1mL不同浓度的葡萄糖与同体积的DNS溶液混合，放入沸水浴中，水浴10min。用冷水冷却，定容至10mL，A540测定吸光值。以葡萄糖的浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，制作标准曲线。
3)将1mL2％的可溶性淀粉加入到试管中，加入1.5mL pH9.5的缓冲液，混匀，50℃预热5min，加入0.2mL稀释好的酶液，反应5min。取1mL反应液与同体积的DNS试剂混匀，沸水浴煮沸15min，用冷水冷却，定容至10mL，混匀后，以没有加酶液但加入当量的去离子水的反应体系作为对照，测定A540吸光值。
淀粉酶在60℃的热稳定性测定：
将淀粉酶置于60℃进行孵育，采用3)的方法，定期测定其剩余酶活。绘制剩余酶活的ln值与时间的曲线，根据曲线的斜率得到该温度下的热失活常数k，淀粉酶的半衰期即为ln2与k的比值。
酶活力单位定义：在pH9.5，50℃条件下，1min降解可溶性淀粉产生1μmol还原物质(以葡萄糖计算)所需要的酶量，为1个酶活单位(U)。
实施例3淀粉酶在60℃的热稳定性测定分析
通过测定发现，单突变体S66V、K98R、N166R、K192R、S258R、N275R、Q317R、Q349V和S438V在60℃的半衰期(表2)都有提高，其中Q317R效果最显著，半衰期提高至原来的1.8倍。在此基础上进行复合突变，将增强静电作用的6个单突变体进行复合获得一个六突变体K98R/N166R/K192R/S258R/N275R/Q317R，同时将增强疏水作用的3个单突变体进行复合获得一个三突变体S66V/Q349V/S438V。最后，将所有9个氨基酸替换全部引入到淀粉酶催化结构域内获得一个九突变体S66V/K98R/N166R/K192R/S258R/N275R/Q317R/Q349V/S438V。通过测定发现，它们在60℃的半衰期(表3)都有提高，其中具有9个氨基酸替换的突变体的效果最显著，半衰期提高至原来的7.5倍。该淀粉酶在碱性条件下具有较强的热稳定性。
表2单点突变重组酶在60℃的热稳定性
表3复合突变重组酶在60℃的热稳定性
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (8)

1.一种热稳定性提高的淀粉酶突变体，其特征在于，相对于具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的淀粉酶，有一个或者多个氨基酸突变成缬氨酸。
2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述发生突变的氨基酸位于淀粉酶蛋白结构的内表面。
3.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述发生突变的氨基酸是以下氨基酸中的一个或者多个：第66位丝氨酸、第349位谷氨酰胺或第438位丝氨酸。
4.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述1个氨基酸突变是淀粉酶第66位丝氨酸替换成缬氨酸、第349位谷氨酰胺替换成缬氨酸或第438位丝氨酸替换为缬氨酸，所得单突变体分别命名为S66V、Q349V、S438V。
5.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述多个氨基酸突变是第66位丝氨酸替换成缬氨酸、第349位谷氨酰胺替换成缬氨酸及第438位丝氨酸替换为缬氨酸，所得三重突变体命名为S66V/Q349V/S438V。
6.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，同时还有多个氨基酸突变成精氨酸；所述氨基酸突变是以下9个位点的氨基酸同时发生突变：第66位丝氨酸替换成缬氨酸、第98位赖氨酸替换成精氨酸、第166位天冬酰胺替换成精氨酸、第192位赖氨酸替换成精氨酸、第258位丝氨酸替换成精氨酸、第275位天冬酰胺替换成精氨酸、第317位谷氨酰胺替换成精氨酸、第349位谷氨酰胺替换成缬氨酸和第438位丝氨酸替换为缬氨酸，所得9重突变体命名为S66V/K98R/N166R/K192R/S258R/N275R/Q317R/Q349V/S438V。
7.一种权利要求1-6所述任一淀粉酶突变体的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
1)根据SEQ ID NO.1所示氨基酸序列，采用化学全合成的方法全合成基因后克隆到质粒pET-22b(+)中，构建重组质粒pAmyQ；
2)利用Swiss-model软件对氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的酶的结构进行模拟，获得淀粉酶空间结构，确定在淀粉酶催化结构域内进行氨基酸替换的位点；
3)设计突变引物，通过PCR对淀粉酶基因序列进行定点突变，获得含有突变淀粉酶序列的重组载体；
4)将突变后重组载体转化大肠杆菌BL21，诱导表达，离心收集发酵上清，获得淀粉酶突变体。
8.权利要求1-6所述任一淀粉酶突变体在纺织、洗涤剂、制革、造纸、医药、食品领域的应用。
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