CN102311934A - 一种产碱性淀粉酶的嗜碱芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株产碱性淀粉酶的嗜碱芽孢杆菌JN21（BacillusalcalophilusJN21），保藏编号CCTCC NO：M2011229。该菌株生产的碱性淀粉酶具有较高的耐碱性，适用的pH值范围较宽，可以在碱性条件下，高效降解淀粉。该菌株生产的碱性淀粉酶主要用于纺织退浆、洗涤剂添加剂、食品、医药等领域。

Description

一种产碱性淀粉酶的嗜碱芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一株产碱性淀粉酶的嗜碱芽孢杆菌及其应用。

背景技术

α-淀粉酶（EC 3.2.1.1）是一种降解淀粉的重要的工业用酶，主要应用在食品、纺织、医药、洗涤剂等领域。碱性淀粉酶最适反应pH应高于8.0，碱性淀粉酶可用于纺织品退浆、洗涤剂添加剂以及以淀粉作粘结剂的粘度调节剂等。Horikoshi在1971年首先报道了产自嗜碱菌A-40-2的碱性淀粉酶。2007年Saxena等人筛选到一株可以产碱性淀粉酶的菌株。2010年Pancha等人筛选出一株产耐温淀粉酶菌株。四川大学卢涛等人从西藏当雄八宿温泉土壤中筛选出一株分泌高温淀粉酶的高产突变菌株，为地衣芽孢杆菌，该菌生长的地理环境独特，其高温特性良好，经改造得到了一种pH活性域较宽、热稳定性较高的淀粉酶。目前，国内的前处理酶制剂市场基本被丹麦诺维信公司和美国杰能科公司所垄断。诺维信公司介绍了一种碱性淀粉酶，有较宽的pH及温度范围。目前国内外工业化的碱性淀粉酶几乎没有，因此筛选产碱性淀粉酶的优良菌株非常有必要。

发明内容

本发明提供了一种嗜碱芽孢杆菌JN21（Bacillusalcalophilus JN21），已于2011年7月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2011229，地址：中国武汉、武汉大学；其16SrDNA序列如核苷酸序列表中SEQ ID NO:1所示，以其16SrDNA全序列为基础的系统发育树如说明书附图2所示。

本发明还提供了一种碱性淀粉酶，来源于嗜碱芽孢杆菌JN21，CCTCC NO：M 2011229，其最适反应pH为10.5。

所述产碱性淀粉酶的嗜碱芽孢杆菌是从碱性土壤中筛选，其保藏条件如下：从生长良好的平板上接取3环嗜碱芽孢杆菌到摇瓶培养基中，30℃摇床（200 rpm）培养36 h，取0.65 mL移入含有0.3 mL无菌甘油的甘油管中，放入-70℃超低温冰箱保存。

所述固态平板培养基为：1.0% 玉米淀粉，0.5% 酵母粉，1.5% 蛋白胨，0.5% NaCl，0.05% KH₂PO₄，2% 琼脂粉，灭菌后，用Na₂CO₃ 调pH 9.5-10.5。

所述液体发酵培养基为：1.5% 可溶性淀粉，1.0% 酵母粉，1.0% 蛋白胨，0.5% NaCl，0.05% KH₂PO₄，灭菌后，用Na₂CO₃ 调pH 9.5-10.5。

所述嗜碱芽孢杆菌的培养条件为：将已保藏甘油管的嗜碱芽孢杆菌接入液体发酵培养基，30℃，200 rpm，摇床培养36 h。

将产碱性淀粉酶的嗜碱芽孢杆菌发酵后的发酵液，10000 rpm 离心10 min，在pH 10.0条件下，采用DNS法测定离心后发酵上清液的碱性淀粉酶酶的酶活。在碱性条件下，酶活明显。在不同碱性pH值下，测定碱性淀粉酶的最适反应pH，碱性淀粉酶的最适反应pH为10.5，在碱性环境下，可以高效降解淀粉。

本发明自碱性土壤中筛选出一株产碱性淀粉酶的嗜碱芽孢杆菌JN21（Bacillusalcalophilus JN21），该菌株可生产耐强碱的碱性淀粉酶，该碱性淀粉酶可以在强碱的环境下高效降解淀粉。将菌株生产的碱性淀粉酶应用于纺织退浆、洗涤剂添加、医药、食品等领域，可以在碱性环境下高效降解淀粉，达到所需的目的。

附图说明

图1：采用含有玉米淀粉的固体培养基平板筛选产碱性淀粉酶的嗜碱芽孢杆菌;

图2：嗜碱芽孢杆菌（Alkaliphilic bacillus sp.）JN21的系统发育树;

图3：嗜碱芽孢杆菌产生的碱性淀粉酶的最适反应Ph;

图4：嗜碱芽孢杆菌产生的碱性淀粉酶的最适稳定pH。

具体实施方式

实施例1：产碱性淀粉酶的嗜碱芽孢杆菌筛选方法

取采取的一定量碱性土壤，放入装有100 mL无菌水及玻璃珠的250mL三角瓶中，振荡，稀释不同浓度梯度，将不同浓度梯度稀释好的样品分别涂布到含有玉米淀粉的pH值为10.0的固体培养基平板上，30℃培养36 h。反复进行平板划线分离，重复三次得到纯化的单菌落，供下一步鉴定用。

鉴定主要通过：1）菌落特征观察：在含有玉米淀粉的固体培养基平板上，用肉眼直接观察，在菌落周围有淀粉降解透明圈的菌株（见附图1所示）。2）个体形态观察：用光学显微镜染色观察，挑起有芽孢的菌株。将满足鉴定条件的菌株挑出甘油管保藏。

以3%接种量取-70℃甘油管保藏液接种于发酵培养基中，30℃，200rpm 摇瓶培养。取30℃摇床培养的36 h的发酵液，10000 rpm，4℃离心10 min。离心结束后，取上清液，采用DNS法，在碱性条件下测定碱性淀粉酶的酶活。

通过利用DNS法对碱性淀粉酶进行测定，筛选出一株具有较强耐碱能力且在碱性环境下可高效降解淀粉的菌株, 所产碱性淀粉酶酶活为509.3 U/mL，通过16SrDNA鉴定，序列分析（见核苷酸序列表中SEQ ID NO:1所示）可知该菌株为嗜碱芽孢杆菌，已于2011年7月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2011229，地址：中国武汉、武汉大学；分类学命名：嗜碱芽孢杆菌JN21（Bacillusalcalophilus JN21）。

实施例2：嗜碱芽孢杆菌产碱性淀粉酶最适反应pH的测定

DNS法测定碱性淀粉酶酶活

1）DNS试剂的配置：称取2.5 g 3,5-二硝基水杨酸溶于少量水中，加入0.5 g苯酚，再溶解0.075 g亚硫酸钠、2.5 g氢氧化钠、50 g酒石酸钾钠，将其转入500 mL 容量瓶中摇匀定容，储存于棕色瓶放置在4℃冰箱中待用。

2）麦芽糖标准曲线的制作：配制0.2 g/L - 1.0 g/L不同浓度的麦芽糖溶液。取1 mL 不同浓度的麦芽糖与同体积的DNS溶液混合，放入沸水浴中，水浴10 min。用冷水冷却，定容至10 mL，A₅₄₀测定吸光值。以麦芽糖的浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，制作标准曲线。

3）将2 mL 1%的可溶性淀粉加入到试管中，加入1 mL的缓冲液，混匀，55℃预热5 min，加入0.4 mL稀释好的酶液，反应5 min。取1 ml 反应液与同体积的DNS试剂混匀，沸水浴煮沸10 min，用冷水冷却，定容至10 ml，混匀后，以没有加酶液但加入当量的去离子水的反应体系作为对照，测定A₅₄₀吸光值。

碱性淀粉酶最适反应pH值的测定

    采用甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，配制不同pH的缓冲液（8.0，8.5，9.0，9.5，10.0，10.5，11.0），将缓冲液与可溶性淀粉混匀，采用3）的方法测定碱性淀粉酶最适反应pH（见图3）。该碱性淀粉酶的最适反应pH为10.5，在碱性环境下可以高效降解淀粉，为碱性淀粉酶。

 

实施例3：嗜碱芽孢杆菌产碱性淀粉酶最适稳定pH的测定

采用甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，配置不同梯度pH 缓冲液（7.0， 7.5， 8.0， 8.5， 9.0， 9.5， 10.0， 10.5， 11.0）。分别将相同浓度酶液（500 U/mL）与不同pH的缓冲液在试管中混合，在25℃水浴锅内保温24 h，分别在不同pH下采用实施例2中3）测定碱性淀粉酶的方法，测定残糖酶活的量。以酶活初始值为基础，将所有酶活除以初始值，乘以100%，得到碱性淀粉酶酶活力随着不同pH的变化，活力残留的情况。结果显示，在pH值为7.5-10.5的范围内，碱性淀粉酶稳定（见图4），充分说明该淀粉酶为耐碱性淀粉酶。

可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

序列表

序列表

<110>  江南大学

 

<120>  一种产碱性淀粉酶的嗜碱芽孢杆菌及其应用

 

<160>  1

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  1363

<212>  DNA

<213> BacillusalcalophilusJN21

 

<400>  1

ttagcggcgg acgggtgagt aacacgtggg caacctgccc ttgagactgg gataacttcg        60

 

ggaaaccgga gctaataccg gataatataa ggaacctcct ggttccttat tgaaagatgg       120

 

tttcggctat cacttaagga tgggcccgcg gcgcattagc tagttggtga ggtaacggct       180

 

caccaaggcg acgatgcgta gccgacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac       240

 

acggcccaaa ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccacaatgga cgaaagtctg       300

 

atggagcaac gccgcgtgag tgatgaaggc cttcgggtcg taaagctctg ttgttaggga       360

 

agaacaagtg cgagagtaac tgctcgcacc ttgacggtac ctaaccataa agccacggct       420

 

aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttatccgg aattattggg       480

 

cgtaaagcgc gcgcaggtgg tttcttaagt ctgatgtgaa agcccacggc tcaaccgtgg       540

 

agggtcattg gaaactgggg aacttgagtg cagaagagga aagtggaatt ccaagtgtag       600

 

cggtgaaatg cgtagagatt tggaggaaca ccagtggcga aggcgacttt ctggtctgta       660

 

actgacactg aggcgcgaaa gcgtggggag caaacaggat tagataccct ggtagtccac       720

 

gccgtaaacg atgagtgata agtgttagag ggtttccgcc ctttagtgct gcagctaacg       780

 

cattaagcac tccgcctggg gagtacggtc gcaagactga aactcaaagg aattgacggg       840

 

ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aatttgaagc aacgcgaaga accttaccag       900

 

gtcttgacat cctatgacaa ccctagagat agggctttcc ccttcggggg acagagtgac       960

 

aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga      1020

 

gcgcaaccct tgattttagt tgccagcatt cagttgggca ctctaaggtg actgccggtg      1080

 

acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga cctgggctac      1140

 

acacgtgcta caatggacgg tacaaagggc agcaaaaccg cgaggtcgag ccaatcccat      1200

 

aaaaccgttc tcagttcgga ttgcaggctg caactcgcct gcatgaagcc ggaatcgcta      1260

 

gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt      1320

 

cacaccacga gagtttgtaa cacccgaagt cggtggggta acc                               1363

Claims (7)

1.一种嗜碱芽孢杆菌，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO: M 2011229。

2.根据权利要求2所述的嗜碱芽孢杆菌，其特征在于，该菌生产的淀粉酶在pH为8.0-11.0的条件下使用。

3.权利要求1所述嗜碱芽孢杆菌生产的淀粉酶。

4.根据权利要求3所述的淀粉酶，其特征在于，该酶的最适反应pH为10.5，在pH为8.0-11.0的条件下使用。

5.权利要求1所述的嗜碱芽孢杆菌用于生产淀粉酶。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，发酵培养基为：1.5% 可溶性淀粉，1.0% 酵母粉，1.0% 蛋白胨，0.5% NaCl，0.05% KH₂PO₄，灭菌后，用Na₂CO₃ 调pH 9.5-10.5。

7.根据权利要求3所述的淀粉酶在纺织退浆、洗涤剂、化工、食品领域的应用。

Images