CN105316300B - 一种高温活性和热稳定性提高的α‑淀粉酶突变体ApkA‑m及其制备方法和应用 - Google Patents

一种高温活性和热稳定性提高的α‑淀粉酶突变体ApkA‑m及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高温活性和热稳定性提高的α‑淀粉酶突变体ApkA‑m及其制备方法和应用。本发明公开了一种高温活性和热稳定性提高的α‑淀粉酶及其编码基因，以来源于极端嗜热古生菌Thermococcus kodakarensis KOD1的α‑淀粉酶ApkA为母本，采用分子生物学技术对ApkA的氨基酸序列进行定点突变，选择的突变位点为K152H和A166C。在此改造条件下，α‑淀粉酶ApkA突变体的最适反应温度由对照(突变前)的90℃提高到100℃；于110℃绝对酶活由对照(突变前)的566.03U/mg提高至4463.67U/mg，提高了7.89倍；于100℃半衰期由对照(突变前)的7.5min延长至80min，提高了10.67倍。

Description

一种高温活性和热稳定性提高的α-淀粉酶突变体ApkA-m及其 制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种α-淀粉酶的突变体及其制备方法，特别是利用蛋白质工程的定点突变方法来提高α-淀粉酶的高温活性和热稳定性的技术，属于基因工程和酶工程领域。
背景技术
淀粉是α-D-葡萄糖苷通过α-1,4糖苷键和α-1,6糖苷键连接而成的高分子量聚合物，是除纤维素之外的数量分布最广的多糖之一。淀粉作为一种基本原材料，广泛应用于食品工业、医药、造纸、纺织、饲料等领域，并且淀粉是发酵、制糖等工业中最重要的原料之一。α-淀粉酶是一类作用于淀粉分子，从其分子内部随机切断α-1,4糖苷键，生成葡萄糖、还原糖、极限糊精和含四个以上葡萄糖残基的低聚糖的水解酶。α-淀粉酶常被应用于淀粉液化工艺，将淀粉水解成低分子量的糊精，以制造各种糖浆，是最重要的工业酶制剂之一，占全球工业用酶份额的30％。
目前淀粉液化工艺仍存在较多的不足，例如110℃液化条件下，玉米、小麦等蛋白质含量较高的粗原料的液化效果不够理想；目前工业上广泛使用的耐高温α-淀粉酶BLA的耐热性与淀粉液化工艺的要求存在一定的差距。为了简化淀粉液化工艺流程，提高粗原料的液化效果，国内外学者主要是通过以下两种途径以求获得更适用于淀粉液化工艺的α-淀粉酶：(1)寻找新的热稳定性较好的α-淀粉酶；(2)对现有的α-淀粉酶进行有关提高酶分子耐热性的分子改造。来源于极端嗜热微生物的α-淀粉酶具有反应温度高、液化速度快、热稳定性好以及对Ca2+依赖性小等特点而成为国内外研究的热点。针对极端嗜热α-淀粉酶的开发应用研究和高温适应性机制研究，不仅可以为淀粉液化工艺提供具有优良性质的α-淀粉酶，也将为其他α-淀粉酶的改造提供新的理论依据和设计思路。
极端嗜热α-淀粉酶ApkA是由极端嗜热古生菌Thermococcus kodakarensis KOD1所产生的胞外α-淀粉酶(Tachibana Y,Leclere M M,Fujiwara S,et al.Cloning andexpression of the α-amylase gene from the hyperthermophilic archaeonPyrococcus sp.KOD1,and characterization of the enzyme[J].Journal ofFermentation and Bioengineering,1996,82(3):224-232.)。该酶的最适反应温度为90℃，于100℃保持80％的酶活性，于110℃保持20％的酶活性。其最适反应pH为5～6.5，于pH4.5保持40％的酶活性。该酶在未补加Ca2+的条件下于90℃保温1h后保持90％的剩余活性。ApkA具有优良的高温活性和热稳定性，并且耐酸性强，综合性质优于其他α-淀粉酶，在淀粉液化工艺中具有较大的应用潜力。但是ApkA的性质仍与淀粉液化工艺的需求存在一定的差距，例如其于110℃的酶活力相对较弱，于100℃保温10min后迅速丧失酶活力。为了满足淀粉液化工艺的要求，需要进一步提高ApkA的高温活性和热稳定性。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种高温活性和热稳定性提高的α-淀粉酶突变体ApkA-m，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明还提供一种编码上述的α-淀粉酶突变体ApkA-m的基因；所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明还提供一种能表达生产上述α-淀粉酶突变体ApkA-m的载体。
本发明还提供一种能表达生产上述α-淀粉酶突变体ApkA-m的基因工程菌。
本发明还提供一种上述的α-淀粉酶突变体ApkA-m的制备方法，以氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的α-淀粉酶ApkA为出发序列，将第152位赖氨酸替换为组氨酸、第166位丙氨酸替换为半胱氨酸。
上述的制备方法，具体步骤如下：
1)根据Thermococcus kodakarensis KOD1的α-淀粉酶ApkA的基因序列，其基因序列如SEQ ID NO：4所示，采用化学全合成的方法合成优化的基因后，将其克隆到质粒pET-28a(+)中，构建重组质粒；
2)利用SWISS-MODEL软件对α-淀粉酶ApkA进行模拟，获得α-淀粉酶ApkA的三级结构；
3)通过BLASTP搜索比对，找出与α-淀粉酶ApkA在氨基酸序列上高度相似的蛋白质；采用ClustalW2程序对这些蛋白质进行序列比对；通过对α-淀粉酶ApkA的氨基酸序列和空间结构进行分析，确定要突变的氨基酸位点，分别为第152位赖氨酸和第166位丙氨酸；
4)设计突变引物，对α-淀粉酶ApkA的氨基酸序列进行定点突变，将所述位点的氨基酸进行替换，获得含有α-淀粉酶突变体基因序列的重组载体；
5)将含有α-淀粉酶突变体基因序列的重组载体转化大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL，诱导表达，获得α-淀粉酶突变体ApkA-m。
上述α-淀粉酶突变体ApkA-m在纺织、洗涤剂、制革、造纸、医药、食品领域的应用。
本发明通过对ApkA的氨基酸序列和模拟的三维结构进行分析，选择待突变的氨基酸位点，采用定点突变技术得到了一个高温活性和热稳定性提高的α-淀粉酶突变体ApkA-m。
与现有技术相比，本发明的优点如下：本发明提供的α-淀粉酶突变体ApkA-m的高温活性和热稳定性显著提高；α-淀粉酶ApkA突变体的最适反应温度由对照(突变前)的90℃提高到100℃；于110℃绝对酶活由对照(突变前)的566.03U/mg提高至4463.67U/mg，提高了7.89倍；于100℃半衰期由对照(突变前)的7.5min延长至80min，提高了10.67倍。本发明的优化改良α-淀粉酶突变体ApkA-m更适用于淀粉液化工艺，在纺织、洗涤剂、制革、造纸、医药、食品等领域具有广泛的应用前景。
附图说明
图1α-淀粉酶ApkA和α-淀粉酶突变体ApkA-m纯化样品的SDS-PAGE检测图；
图2α-淀粉酶ApkA和α-淀粉酶突变体ApkA-m的最适反应温度；
图3α-淀粉酶ApkA和α-淀粉酶突变体ApkA-m在100℃的热稳定性。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明一种高温活性和热稳定性提高的α-淀粉酶突变体ApkA-m及其制备方法和应用作进一步的详细说明。
实验条件：
1、菌株与载体
大肠杆菌DH5α(购自TaKaRa)，大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL(购自Stratagene)，大肠杆菌表达载体pET-28a(+)(购自Novagen公司)。
2、酶类及其他生化试剂
KOD DNA聚合酶及KOD-Plus-neo DNA聚合酶购自Toyobo公司，DNA限制性内切酶、T4DNA连接酶、DNA Marker、低分子量蛋白质Marker购自Fermentase公司，DNA胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒E.Z.N.A.购自Omega Bio-tek公司，Chelating SepharoseTM FastFlow购自GE Healthcare公司，Bradford法蛋白浓度测定试剂盒购自上海生工生物工程股份有限公司，其它化学试剂均为国产或进口分析纯。
3、培养基
大肠杆菌的培养采用LB培养基(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH 7.0)。筛选培养基采用含50μg/mL卡那霉素的LB培养基。
本发明中所用到的分子克隆技术和蛋白质检测技术均为本领域中的常规技术。在以下实施例中未作详细介绍的技术，均按照如下实验手册中的相关部分来进行。Green MR,Sambrook J.Molecular cloning:a laboratory manual[M].New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press,2012。
α-淀粉酶ApkA基因合成、表达载体构建及突变体构建
(1)突变位点分析与方法
利用SWISS-MODEL软件对α-淀粉酶ApkA进行模拟，获得α-淀粉酶ApkA的三级结构；通过BLASTP搜索比对，找出与ApkA在氨基酸序列上高度相似的蛋白质；采用ClustalW2程序对这些蛋白质进行序列比对；通过对α-淀粉酶ApkA的氨基酸序列和空间结构进行分析，确定要突变的氨基酸位点，分别为第152位赖氨酸和第166位丙氨酸；α-淀粉酶ApkA的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
(2)基因优化合成
为了利于重组蛋白质的纯化，在不改变其氨基酸序列的前提下，在α-淀粉酶ApkA基因序列的3’端(终止密码子之前)添加编码六个组氨酸残基的碱基序列。将改造设计好的基因序列送上海博益生物科技有限公司进行全基因合成。
(3)表达载体的构建
根据合成基因的序列设计PCR引物，上游引物P1含有Nco I内切酶酶切位点，下游引物P2含有EcoR I内切酶酶切位点；引物序列如下：上游引物P1：5’-CATGCCATGGGCGCAAAGTATTCCGAACTCGAAG-3’；下游引物P2：5’-CCGGAATTCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTCC-3’，其中下划线部分为限制性内切酶的切割位点。
以合成基因为模板，以P1、P2为引物，进行PCR扩增；PCR扩增条件为：98℃ 5min；98℃ 20sec，60℃ 20sec，74℃ 2min，30个循环；74℃，10min；扩增产物经Nco I和EcoR I双酶切，连接至载体pET-28a(+)，构建重组载体pET-28a(+)-ApkA。
(4)突变体的构建
采用TransGen公司的Fast Mutagenesis System对α-淀粉酶ApkA基因进行定点突变，包含突变位点的重叠引物(表1)按照该产品说明书的要求进行设计，PCR等相关操作按照该产品说明书进行。
具体操作如下：
以pET-28a(+)-ApkA为模板，采用引物K152H-F和K152H-R，进行PCR扩增得到包含载体序列和基因序列的线性片段；PCR扩增条件为：94℃ 5min；94℃ 30sec，55℃ 20sec，68℃ 4min，35个循环；68℃，10min；扩增产物经Dpn I酶处理后，转化大肠杆菌DH5α，卡那霉素抗性平板筛选转化子，经测序鉴定是否为突变基因ApkAK152H；在此基础上，以pET-28a(+)-ApkAK152H为模板，采用引物A166C-F和A166C-R，进行PCR扩增，重复以上实验步骤，获得重组载体pET-28a(+)-ApkAK152H/A166C。
表1 突变引物
注：下划线部分为突变位点。
α-淀粉酶ApkA及其突变体ApkA-m在大肠杆菌中的表达和纯化
上述两种表达载体pET-28a(+)-ApkA及pET-28a(+)-ApkAK152H/A166C通过热击转化大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL，分别获得含有原基因和突变体基因的重组菌株。
取含有重组质粒的大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL菌株和含有pET-28a(+)的大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL菌株(作为对照)，分别接种于含有50μg/mL卡那霉素的5mL LB液体培养基中，37℃快速振荡培养过夜。将过夜培养物以1％接种量转接至含有50μg/mL卡那霉素的50mL LB液体培养基中，37℃快速振荡培养至菌液OD600nm达到0.4左右。加入IPTG至其终浓度为0.25mM，继续于16℃培养20h，12000r/min离心5min收集菌体沉淀。
采用50mM MES，pH 6.5缓冲液重悬并洗涤菌体沉淀，再加入适量50mM MES，pH 6.5缓冲液重悬菌体沉淀，置于冰上用超声波破碎细胞。超声波细胞破碎仪的参数设置如下：超声波功率为25％，超声波破碎时间为3sec，间歇6sec。超声波处理菌体细胞至菌体悬液变为均一的溶液，采用SDS-PAGE检测重组蛋白质的表达情况。
将目的蛋白质所位于的细胞可溶成分于85℃保温10min，12000r/min离心30min，去除沉淀，收集上清。然后采用Ni2+亲和层析柱对上清中目的蛋白质进行纯化，用250mM咪唑洗脱缓冲液洗脱，即得到纯化后的重组α-淀粉酶ApkA和ApkA-m。利用SDS-PAGE检测重组α-淀粉酶的纯度，并采用Bradford法测定重组α-淀粉酶的浓度。SDS-PAGE检测结果表明，α-淀粉酶ApkA及其突变体ApkA-m均在大肠杆菌中成功表达，并且经Ni2+亲和层析可以获得纯度达90％以上的重组α-淀粉酶。
α-淀粉酶酶活力测定方法
α-淀粉酶酶活力测定采用DNS法。具体方法如下：将10μL酶液与490μL含1％(W/V)可溶性淀粉的50mM MES，pH 6.5缓冲液混合，于90℃反应30min后，迅速放入冰水浴中终止反应，然后采用DNS法测定反应体系中还原糖量。
DNS试剂的配制：
称取6.5g 3,5-二硝基水杨酸溶于少量水中，加入2mol/L氢氧化钠溶液262mL，50℃水浴溶解后，再加入185g酒石酸钾钠及5g苯酚和5g无水亚硫酸钠，冷却后定容至1L，储存至棕色瓶中，放置于4℃冰箱待用。
葡萄糖标准曲线的制作：
配制0～0.6mol/L不同浓度的葡萄糖溶液。取10μL不同浓度的葡萄糖溶液与490μLDNS溶液混合，于100℃沸水浴中煮沸10min。迅速至于冰水浴中冷却，稀释5倍后，测定样品的OD540nm。以葡萄糖浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，制作标准曲线。
酶活力单位(U)定义：在一定反应条件下，每分钟催化产生1μmol还原糖(以葡萄糖计)的酶量为一个酶活力单位(U)。
α-淀粉酶ApkA及其突变体ApkA-m的部分性质分析
(1)α-淀粉酶ApkA及其突变体ApkA-m的最适反应温度
以1％可溶性淀粉为底物，分别于40℃～120℃下测定α-淀粉酶ApkA和突变体ApkA-m的绝对酶活，并以绝对酶活对时间作图，获得温度对这两种重组α-淀粉酶的酶活力影响的曲线，确定其最适反应温度。其结果表明，ApkA的最适反应温度为90℃，在此温度下的绝对酶活力为2946.75U/mg；突变体ApkA-m的最适反应温度为100℃，在此温度下的绝对酶活力为5201.08U/mg。并且突变体ApkA-m于110℃绝对酶活由对照(ApkA)的566.03U/mg提高至4463.67U/mg，提高了7.89倍。由此可见，突变体ApkA-m的最适反应温度和高温活性得到了明显的提高。
(2)α-淀粉酶ApkA及其突变体ApkA-m的热稳定性
将酶液于100℃保温，分时间梯度取出部分样品测定酶活力，计算相对酶活。将未处理的酶液的酶活力定义为100％，并以相对酶活的百分比对时间作图，评价酶的热稳定性。测定结果如图3所示，突变体ApkA-m于100℃半衰期由对照(突变前)的7.5min延长至80min，提高了10.67倍。以上稳定性试验结果表明，α-淀粉酶突变体ApkA-m具有更强的热稳定性，更适用于淀粉液化工艺。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围的内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求所界定的保护范围为准。

Claims (8)

1.一种高温活性和热稳定性提高的α-淀粉酶突变体ApkA-m，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种编码权利要求1所述的α-淀粉酶突变体ApkA-m的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
4.一种能表达生产权利要求1所述α-淀粉酶突变体ApkA-m的载体。
5.一种能表达生产权利要求1所述α-淀粉酶突变体ApkA-m的基因工程菌。
6.根据权利要求1所述的α-淀粉酶突变体ApkA-m的制备方法，其特征在于，以氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的α-淀粉酶ApkA为出发序列，将第152位赖氨酸替换为组氨酸、第166位丙氨酸替换为半胱氨酸。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
1)根据Thermococcus kodakarensis KOD1的α-淀粉酶ApkA的基因序列，其基因序列如SEQ ID NO：4所示，采用化学全合成的方法合成优化的基因后，将其克隆到质粒pET-28a(+)中，构建重组质粒；
2)利用SWISS-MODEL软件对α-淀粉酶ApkA进行模拟，获得α-淀粉酶ApkA的三级结构；
3)通过BLASTP搜索比对，找出与α-淀粉酶ApkA在氨基酸序列上高度相似的蛋白质；采用ClustalW2程序对这些蛋白质进行序列比对；通过对α-淀粉酶ApkA的氨基酸序列和空间结构进行分析，确定要突变的氨基酸位点，分别为第152位赖氨酸和第166位丙氨酸；
4)设计突变引物，对α-淀粉酶ApkA的氨基酸序列进行定点突变，将所述位点的氨基酸进行替换，获得含有α-淀粉酶突变体基因序列的重组载体；
5)将含有α-淀粉酶突变体基因序列的重组载体转化大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL，诱导表达，获得α-淀粉酶突变体ApkA-m。
8.根据权利要求1所述α-淀粉酶突变体ApkA-m在纺织、洗涤剂、制革、造纸、食品领域的应用。
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CN107201350A (zh) * 2017-03-23 2017-09-26 中国农业科学院饲料研究所 一种高比活且具有较强降解生淀粉能力的淀粉酶突变体制备方法及其应用
CN107201350B (zh) * 2017-03-23 2020-05-22 中国农业科学院饲料研究所 一种高比活且具有较强降解生淀粉能力的淀粉酶突变体制备方法及其应用

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