CN103045624A - 一种耐高温高碱木聚糖酶及其基因、工程菌和制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种耐高温高碱木聚糖酶及其基因、工程菌和制备方法，其技术方案是利用易错PCR和定点突变技术对来源于坎皮纳斯类芽孢杆菌的木聚糖酶基因XynG1-1进行耐高温和高碱的定向分子改造，得到耐高温高碱的木聚糖酶突变基因XynG1-1B43CC16，并利用巨大芽孢杆菌表达系统，分泌表达耐高温高碱木聚糖酶的方法。本发明解决了现有木聚糖酶耐高温与耐碱性无法同时兼顾，造成其在造纸工业中应用受限的问题，满足了木聚糖酶在高温和高碱性环境下进行生物制浆和生物漂白的要求，可提高纸浆白度和得率，减少造纸工业中化学试剂的用量，降低环境污染，促进造纸工业的清洁生产。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及基因的随机突变和定点突变技术，尤其是一种耐高温高碱木聚糖酶及其基因、工程菌和制备方法。
背景技术
木聚糖酶(1，4-β-D-xylanase;EC3.2.1.8)是一种重要的工业用酶，在造纸工业、食品、能源、饲料以及环境等领域中显示了广阔的应用前景。特别是在纸浆生物漂白中的巨大应用潜力早已引起各界同行的高度关注。通过木聚糖酶对纸浆的预处理，不仅可以提高纸浆的白度，降低打浆的能耗，改善浆料的强度性能，而且，可以减少后继工序漂剂的用量，降低废液的毒性，减轻环境污染。但到目前为止，工业上用于纸浆漂白的木聚糖酶大多是中性偏酸的，最适反应温度大多在50～60℃左右，最适作用pH在5.0～7.0左右，而纸浆蒸煮完毕时，温度为95～100℃，pH值为10～12，这就要求在加酶之前先将纸浆的pH和温度调到适合木聚糖酶作用的范围，从而使工艺流程复杂化并造成生产成本增加。随着木聚糖酶分子生物学研究的不断深入，应用基因工程以及蛋白质工程手段对现有木聚糖酶进行定向的分子改造有望解决这一问题。
酶分子的定向进化是基于模拟体内蛋白分子的自然进化机制，通过体外随机突变和基因重组等方法构建随机突变文库，结合有益基因的定向筛选方案，从而可在相对较短时间内得到工业或市场所需要的性质优良的突变酶，该方法适用于空间结构和催化机制研究得并不清楚的蛋白的分子改造，在蛋白质工程中属于蛋白质的非理性设计。易错PCR是蛋白质分子定向进化的常用技术，通过对PCR体系中dNTP比例及Mg2+浓度的改变，并添加相应浓度的Mn2+，从而提高PCR过程中的错配率，以达到随机突变的效果。然而，就像自然进化是一个长期而复杂的积累过程一样，单纯通过一次易错PCR往往很难得到理想的结果，因此，通过多轮连续的易错PCR和合理的定向筛选方可得到有益突变的积累，有利于优良突变酶的获得。定点突变是改造及优化基因的最常用和最便捷的基因工程手段，它是在对蛋白分子结构和功能进行详尽的分析之后，从而有针对性的设计突变位点，达到迅速、高效的提高目的蛋白的性状及表征的目的，是一种理性的分子改造方案。而酶分子的定向改造是一个复杂而艰巨的任务，应用单一的改造技术很难达到预期目标，通常需要应用多种技术相结合的方法达到预期的改造目的。
目前已有上百种来自于细菌和真菌的木聚糖酶基因得到了克隆和表达，研究细菌木聚糖酶基因的外源表达与调控的原核表达系统应用最多的是大肠杆菌表达系统，随着研究的发展，芽孢杆菌表达系统具有非致病性、分泌蛋白能力强和发酵基础良好等特性，逐步成为目前分泌表达外源蛋白较为理想的原核表达系统，但国内外对芽孢杆菌表达系统研究较多的是枯草芽孢杆菌表达系统，其他芽孢杆菌表达系统的报道却很少。巨大芽孢杆菌表达系统作为一种极具潜力的分泌型外源基因表达系统，具有表达率高、遗传稳定、产物可分泌、发酵工艺成熟等优点，近年来在工业以及学术研究领域得到了广泛的应用。
国内外对木聚糖酶的研究已进入分子生物学阶段，Hirohito等从碱性菌株Bacillus sp.41M-1中克隆得到碱性木聚糖酶基因XynJ，通过在该酶的活性中心引进精氨酸突变，构建二硫桥，成功使其最适作用pH从8.5上升到9.5，这也是目前所研究的木聚糖酶的最适pH的最高水平，但其最适作用温度为65℃，仍属中温木聚糖酶，其在造纸高温环境中的应用仍受到一定的局限。而目前研究的最适作用温度最高的是一种来自于硫化叶菌属Sulfolobus solfataricus Oa的木聚糖酶，其最适作用温度为95℃，但其最适作用pH为3.5，不适合在造纸工业的碱性环境中应用。在国内，木聚糖酶的最适作用温度最高为85℃，而其最适作用pH为6.5，是2009年新疆大学的Wei Zhang等将嗜热网团菌的木聚糖酶基因xynB在Bacillus subtilis中表达的木聚糖酶；2008年，上海交通大学的Q.Wang等应用DNA shuffling和定点突变等技术对褐色嗜热单孢菌木聚糖酶进行定向改造，其最适作用pH 9.0为国内最高水平，而其最适作用温度为60℃。
可见，目前开发的木聚糖酶难以兼顾耐高温、耐高碱性及高活力的特性，不能适应造纸工业高温高碱性的极端应用环境的要求。因此，为促进造纸工业的清洁生产，亟待开发一种在高温、高pH值条件下具有高活力的耐高温高碱木聚糖酶。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种耐高温高碱木聚糖酶及其基因、工程菌和制备方法，本发明制备获得的该耐高温高碱木聚糖酶，其最适作用温度70℃，最适作用pH为9.0，并且在高温和高碱的条件下较稳定，90℃保温2h，残余酶活为38.2%，而原始酶XynG1-1的酶活则完全丧失；在pH11.0条件下保存3h，残余酶活为44%，比原始酶XynG1-1提高了57%。
本发明实现目的的技术方案如下：
一种耐高温高碱木聚糖酶基因，其基因序列为序列13。
一种耐高温高碱木聚糖酶基因的构建方法，应用两轮连续易错PCR方法对坎皮纳斯类芽孢杆菌木聚糖酶基因XynG1-1进行随机突变和耐碱性的定向筛选，得到耐碱性木聚糖酶突变基因XynG1-1B43，其突变位点为：Val90Arg和Pro172His；所述坎皮纳斯类芽孢杆菌木聚糖基因XynG1-1为序列11，耐碱性木聚糖酶突变基因XynG1-1B43为序列12，应用定点突变的方法对序列12的耐碱性木聚糖酶突变基因XynG1-1B43进行耐高温的定向分子改造，得到耐高温高碱木聚糖酶的突变基因XynG1-1B43CC16，其突变位点为：Asp16Tyr、Thr84Cys和Thr182Cys。
一种高产耐高温高碱木聚糖酶的工程菌，含耐高温高碱木聚糖酶基因。
而且，所述工程菌的宿主细胞为Bacillus megaterium MS941。
而且，所述工程菌中的表达载体为大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒pSTREPHIS1525。
一种耐高温高碱木聚糖酶，具有基因序列为序列13所述的基因编码的蛋白序列。
而且，由上述述的工程菌发酵得到。
而且，所述的木聚糖酶的最适作用温度为70℃，最适作用pH为9.0。
一种耐高温高碱木聚糖酶的制备方法，其特征在于：步骤如下：
⑴对坎皮纳斯类芽孢杆菌木聚糖酶基因(XynG1-1)进行随机突变和耐碱性的定向筛选，得到耐碱性木聚糖酶突变基因(XynG1-1B43)，其突变位点为：Val90Arg和Pro172His；所述坎皮纳斯类芽孢杆菌木聚糖酶基因(XynG1-1)见序列11；
⑵对耐碱性木聚糖酶突变基因(XynG1-1B43)进行定点突变，突变位点为：Asp16Tyr、Thr84Cys和Thr182Cys，得到耐高温高碱木聚糖酶基因(XynG1-1B43CC16)，所述耐碱性木聚糖酶突变基因(XynG1-1B43)见序列12；
⑶将上述耐高温高碱木聚糖酶基因与表达载体连接，构建获得携带有耐高温高碱木聚糖酶基因的重组载体；
⑷将重组载体转化入宿主菌株中，构建获得重组菌株；
⑸重组菌株分泌表达，发酵制备耐高温高碱木聚糖酶。
本发明的优点和积极效果如下：
1、本发明利用易错PCR和定点突变技术，对坎皮纳斯类芽孢杆菌木聚糖酶基因进行定向改造，获得耐高温高碱木聚糖酶基因XynG1-1B43CC16(V90R/P172H/T84C-T182C/D16Y)，并通过分泌型表达载体，转化巨大芽孢杆菌，使耐高温高碱木聚糖酶得以分泌表达，制备获得的耐高温高碱木聚糖酶的最适作用温度为70℃，最适作用pH为9.0，并且在高温和高碱的条件下较稳定，90℃保温2h，残余酶活为38.2%，而原始酶XynG1-1的酶活则完全丧失；在pH11.0条件下保存3h，残余酶活为44%，比原始酶XynG1-1提高了57%。
2、本发明制备的耐高温高碱木聚糖酶适用于造纸工业的生物制浆与漂白，不仅可以提高纸浆白度和得率，还可以减少后继工序化学漂剂的用量，降低废液的毒性，减轻环境污染，降低漂白成本，即可带来显著的社会效益、经济效益和环境效益。
附图说明
图1为本发明易错PCR随机突变文库的构建示意图；
图2为本发明纯化后原始酶XynG1-1、耐碱性突变酶XynG1-1B43及其耐高温高碱突变酶XynG1-1B43CC16的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图，其中，1为XynG1-1纯化后蛋白；2为XynG1-1B43纯化后蛋白；3为XynG1-1B43CC16纯化后蛋白；M为蛋白Marker；
图3为本发明纯化后XynG1-1及XynG1-1B43CC16的最适作用温度(3-1)和在90℃、pH9保温2h条件下热稳定性(3-2)的测定曲线图；纯化后XynG1-1及XynG1-1B43CC16的最适作用pH（3-3）和在70℃、pH11保温3h条件下pH稳定性（3-4）的测定曲线图。
图4为本发明重组质粒构建流程图；
图5为本发明重组木聚糖酶的SDS-PAGE及酶谱分析图，其中，M：蛋白Marker；1：B.megaterium MS941(pSTREPHIS1525)的胞内蛋白；2：B.megateriumMS941(pSH-XynG1-1B43CC16)的胞内蛋白；3：B.megaterium MS941(pSTREPHIS1525)的胞外蛋白；4：B.megaterium MS941(pSH-XynG1-1B43CC16)的胞外蛋白；5：纯化后XynG1-1B43CC16BM；6:XynG1-1B43CC16BM的酶谱分析。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
本发明利用易错PCR和定点突变技术对坎皮纳斯类芽孢杆菌木聚糖酶基因进行定向改造获得耐高温高碱木聚糖酶突变基因，具体为利用易错PCR技术对坎皮纳斯类芽孢杆菌木聚糖酶基因(XynG1-1)进行随机突变和耐碱性的定向筛选，得到耐碱性木聚糖酶突变基因(XynG1-1B43)，其突变位点为：Val90Arg和Pro172His；再对耐碱性木聚糖酶突变基因(XynG1-1B43)进行定点突变，突变位点为：Asp16Tyr、Thr84Cys和Thr182Cys，得到耐高温高碱木聚糖酶基因(XynG1-1B43CC16)；然后将得到的耐高温高碱木聚糖酶基因克隆到大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭表达载体pSTREPHIS1525上，转化到宿主菌Bacillus megateriumMS941中，实现耐高温高碱木聚糖酶的分泌表达，成功制备获得一种耐高温高碱木聚糖酶。
一、易错PCR随机突变文库的构建
1、设计引物
利用Primer 5.0设计出一对扩增类芽孢杆菌木聚糖酶基因成熟肽序列的引物，分别为：
XynG1-1上游引物(序列1)：
5’-CCCAAGCTTGCAACCACGATCACTTCTAACGAGA-3’(下划线部分为加入的HindIII酶切位点，CCC为保护碱基)
XynG1-1下游引物(序列4)：
5’-CCGCTCGAGTCACCGGATCTCCAAATAGTCAATG-3’(下划线部分为加入的XhoI酶切位点，CCG为保护碱基)
2、易错PCR扩增条件
以提取的质粒pET-XynG1-1为模板，应用扩增XynG1-1成熟肽的引物进行易错PCR反应，反应体系(100μL)如下：
PCR反应条件为：95℃ 5min；94℃ 45S，55℃ 45S，72℃ 90S，30个循环；72℃延长10min。
使用PCR产物纯化试剂盒纯化目的DNA产物，将其溶解于30μL ddH2O中，应用0.8%琼脂糖凝胶进行电泳检测。
3、随机突变文库的构建
易错PCR获得的突变基因，用限制性内切酶HindIII和XhoI分别对突变基因和质粒pET22b(+)进行双酶切，并将酶切后的基因产物和载体在16℃下连接4h，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，将得到的所有克隆共培养并提取质粒，并将混合质粒转化至E.coli BL21感受态细胞，将重组细胞涂布于木聚糖筛选平板上，即得到随机突变的单克隆子，实验流程见图1。
二、耐碱性突变酶的筛选
应用碱性木聚糖平板初筛和96孔板酶活测定复筛，对突变基因进行高通量筛选，最终获得5个耐碱性明显提高的突变酶，分别为XynG1-1B05(V90R)、XynG1-1B22(V90R/I124T)、XynG1-1B43(V90R/P172H)、XynG1-1B56(V90R/P172H/I124T)和XynG1-1B72(P172H)，其中，突变体XynG1-1B43在pH9.0、60℃条件下的酶活力为12.15IU/mL是XynG1-1的2.5倍，为突变酶中最高，其最适作用pH提高了两个单位（pH7.0→pH9.0），在pH11.0条件下保存3h后，残余酶活为42%，比原始酶提高了50%。
三、定点突变提高耐碱性木聚糖酶XynG1-1B43的耐高温性
1、设计定点突变所用引物
通过www.swissmodel.expasy.org网站的蛋白质数据，对XynG1-1B43进行同源建模，将其空间结构和氨基酸序列与已报道的耐高温木聚糖酶进行对比分析，并结合已报道的影响木聚糖酶耐热性的因素，选择三个突变位点，其中，T84C和T182C两个突变点共同构成一个新的二硫键(C84-C182)；而突变点D16Y是为了在XynG1-1B43的表面增加芳香族氨基酸残基，通过与两边的Y15和Y17形成疏水相互作用，从而提高木聚糖酶的热稳定性。所用引物见表1。
表1定点突变引物(序列1~8)
2、定点突变方法
重叠PCR1：PCR扩增分两轮进行，第一轮以携带XynG1-1B43基因(序列12)的质粒为模板，并分别以P1，P2和P3，P4为引物，应用Pyrobest高保真DNA聚合酶分别进行PCR扩增反应，扩增条件为：95℃ 5min；94℃ 45s，55℃ 45s，72℃ 90s，30个循环；72℃ 10min。第二轮PCR以第一轮得到的两种PCR产物等体积混合稀释10倍后作为模板，P1和P4为上下游引物，应用Pyrobest高保真DNA聚合酶进行第二轮PCR扩增，扩增条件为：95℃ 5min；94℃ 45s，55℃ 45s，72℃ 90s，30个循环；72℃ 10min。最终得到含有目标突变点T84C的木聚糖酶突变基因，进行下一步操作。
重叠PCR2：PCR扩增分两轮进行，第一轮以上一步获得的突变基因为模板，并分别以P1，P5和P6，P4为引物，应用Pyrobest高保真DNA聚合酶分别进行PCR扩增反应，扩增条件为：95℃ 5min；94℃ 45s，55℃ 45s，72℃ 90s，30个循环；72℃ 10min。第二轮PCR以第一轮得到的两种PCR产物等体积混合稀释10倍后作为模板，P1和P4为上下游引物，应用Pyrobest高保真DNA聚合酶进行第二轮PCR扩增，扩增条件为：95℃ 5min；94℃ 45s，55℃ 45s，72℃ 90s，30个循环；72℃ 10min。最终得到含有目标突变点T84C、T182C的木聚糖酶突变基因XynG1-1B43CC，进行下一步操作。
两步PCR：第一步PCR以携带XynG1-1B43CC基因的质粒为模板，以P8和P4为上下游引物，应用Pyrobest高保真DNA聚合酶分别进行PCR扩增反应，扩增条件为：95℃ 5min；94℃ 45s，55℃ 45s，72℃ 90s，30个循环；72℃ 10min。第二步PCR以第一步PCR产物稀释50倍后为模板，以P7和P4为上下游引物，应用Pyrobest高保真DNA聚合酶进行第二轮PCR扩增，扩增条件为：95℃5min；94℃ 45s，55℃ 45s，72℃ 90s，30个循环；72℃ 10min。最终得到含有目的突变点D16Y的木聚糖酶突变基因XynG1-1B43CC16，进行下一步操作。
3、突变酶重组表达载体的构建
应用HindIII和XhoI同步双酶切PCR产物及载体DNA(pET-22b)，37℃酶切过夜(质粒酶切2h)。载体DNA与PCR产物按摩尔比为1:1~10的比例混合，再加入等体积的DNA连接试剂盒中的Solution I，在16℃恒温连接2~4h。连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，将得到的所有克隆共培养并提取质粒，并将混合质粒转化至E.coli BL21感受态细胞，将重组细胞涂布于木聚糖筛选平板上，即得到随机突变的单克隆子，送样测序。
4、重组突变酶的表达与纯化
应用1mmol/L IPTG对含有各突变酶基因的工程菌进行诱导表达，表达后蛋白应用镍离子亲和层析对粗酶液进行纯化，所得纯酶进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果如图2所示。
5、耐高温高碱突变酶XynG1-1B43 CC 16的酶学性质测定
在pH9.0，不同的温度(40~90℃)条件下，分别测定XynG1-1及XynG1-1B43CC16的最适作用温度，并且将XynG1-1及XynG1-1B43CC16在90℃下保温2h，测定各酶在高温下的稳定性，结果如图3-1和3-2。原始酶XynG1-1的最适作用温度为60℃，突变酶XynG1-1B43CC16的最适作用温度为70℃，且在温度高于70℃时的相对酶活均比XynG1-1有所提高；突变酶XynG1-1B43CC16在90℃、pH9.0下保温2h，残余酶活为38.2%，与XynG1-1相比热稳定性有更大的提高。
在70℃、不同pH(pH6～11)条件下，测定XynG1-1及XynG1-1B43CC16的最适作用pH，并且，将XynG1-1及XynG1-1B43CC16在pH11条件下保存3h，测定各酶在高碱下的稳定性，结果如图3-3和3-4。原始酶XynG1-1的最适pH为7，突变酶XynG1-1B43CC16的最适pH为9，且在pH度高于9时的相对酶活均比XynG1-1有所提高；突变酶XynG1-1B43CC16在70℃、pH11下保温3h，残余酶活为43%，与XynG1-1相比pH稳定性有更大的提高。
高产耐高温高碱木聚糖酶工程菌的构建
1、突变酶基因XynG1-1B43CC16的PCR扩增
以携带耐高温高碱木聚糖酶基因XynG1-1B43CC16(序列13)的质粒pET-XynG1-1B43CC16为模板，设计上下游引物分别为：
上游引物(序列9)：
5’-CGAGCTCGTATGAAAATCTATGGGAAGAGGAGGA-3’(下划线为SacI酶切位点)
下游引物(序列10)：
5’-CGGGGTACCTCACCGGATCTCCAAATAGTCAATG-3’(下划线为KpnI酶切位点)
PCR扩增体系为(50μL)：10×buffer 5.0μL，dNTP(2.5mmol/L each)5.0μL，上游引物(10μmol/L)1.5μL，下游引物(10μmol/L)1.5μL；适当稀释的基因组DNA模板1μL，Taq DNA聚合酶3U，加水补足50μL。反应条件为：95℃ 5min；94℃ 45s，55℃ 45s，72℃ 90s，30个循环；72℃ 10min。
2、酶切与连接
PCR产物DNA(或载体pSTREPHIS1525)先后用KpnI和SacI进行分步酶切，即KpnI酶切后，回收酶切产物，再用SacI进行酶切，酶切反应体系为(50μL)：20μL目的基因(质粒30μL)，5μL 10×L Buffer，3μL KpnI(4μL SacI)，加无菌水补足50μL；酶切反应条件为：37℃恒温反应过夜；将酶切后的目的基因和质粒DNA分别切胶回收，回收后的质粒与目的基因按比例混合(1:1~10)并加入等体积的SolutionI，在16℃下连接过夜，构建重组质粒，如图4所示，所得重组质粒命名为pSH-XynG1-1B43CC16。
3、巨大芽孢杆菌原生质体的制备
挑取活化好的Bacillus megaterium MS941单菌落，接种于新鲜AB3培养基中，37℃、180r/min下培养12~16h，以2%的接种量转接至50mL新鲜的AB3培养基中，37℃、180r/min摇瓶培养至OD600=1，培养液在室温下，3000r/min离心15min，弃上清，收集菌体沉淀，用5mL SMMP将其重悬，加入溶菌酶(终浓度1mg/mL)，在37℃下保温，定时取样进行镜检，观察原生质体的形成情况，待观察到菌体全部转变成原生质体时(约30~60min)，在3000r/min下离心15min沉淀原生质体，用5mL SMMP轻柔的将沉淀清洗一遍后，3000r/min下离心15min，最后用4mL的SMMP轻柔重悬，分装，立即使用。
4、原生质体转化方法
原生质体转化按照MoBiTec公司提供的操作手册，逐步进行：
(1)取5μg重组质粒DNA，在10mL无菌离心管中与500μL新鲜制备的Bacillus megaterium MS941原生质体悬浮液混合。
(2)加入1.5mL的PEG-P，室温放置2min。
(3)加入5mLSMMP，轻轻滚动离心管，使其混合均匀。
(4)室温下，3000r/min离心10min(或1300r/min离心100min)后，马上去掉上清。
(5)立即加入500μL SMMP。
(6)在37℃、100r/min下复苏培养90min。
(7)事先准备好2.5mLCR5上层琼脂培养基，融化后，43℃水浴保温备用。
(8)复苏培养后，取50μL到200μL培养液加到2.5mL的CR5上层琼脂培养基中，轻轻滚动离心管，混合均匀后，将其平铺在Tet抗性平板上。
(9)37℃静置培养16~24h后，培养基表面或内部长出转化子，由于转化子有的在上层培养基内，有的在表面，所以各转化子大小不一，并且在表面的转化子更明亮易见。
(10)挑取不同的转化子，点接到新鲜的Tet抗性平板上培养。
5、巨大芽孢杆菌工程菌的诱导发酵
挑取重组菌Bacillus megaterium MS941(pSH-XynG1-1B43CC16)的单菌落，接入含有10μg/mL Tet的LB液体培养基中，37℃、180r/min下培养12~16h后，以2%的接种量转接至含有10μg/mL Tet的50mL LB液体培养基(250mL摇瓶)中，37℃、180r/min摇瓶培养至OD600=0.3，加入木糖至终浓度为0.5%，继续培养，进行诱导表达，每隔1h取样测定木聚糖酶酶活及OD600值。
6、重组酶的分离纯化
方法同上，应用Ni2+亲和层析进行一步分离。
7、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及酶谱分析
将纯化后的酶应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，结果如图5。酶谱分析是在分离胶中加入0.1%的稻壳木聚糖，然后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳后用25%的异丙醇将凝胶洗涤2次，每次30min，洗去胶内的SDS，然后用pH9.0的Tris-盐酸缓冲液连续洗涤3次，使胶内的蛋白复性，最后在该缓冲液中，70℃恒温反应30min，反应后用0.1%的刚果红染色30min，再用1mol/L NaCl溶液进行脱色，即可看到水解条带(图5)。
8、重组木聚糖酶的酶活测定
取0.1mL经适当稀释的酶液，加入等体积1%的桦木木聚糖(Sigma)底物溶液(pH9.0)混匀，70℃水浴恒温反应10min，立即向试管中加入0.6mL DNS试剂并混匀终止反应，然后在沸水中煮沸10min，冷却后加水定容至5mL，充分摇匀，以灭活酶液做对照，测量样品540nm波长处的吸光度。
木聚糖酶活力单位的定义为：1mL酶液每分钟产生1μmoL的还原糖(以木糖计)为一个活力单位(IU)。
9、重组酶的酶学性质测定
(1)最适作用温度，在pH9.0、不同温度(40~90℃)条件下，测定重组酶酶活力，以最高酶活为100%，计算相对酶活。
(2)耐热性测定，在pH9.0、90℃条件下保存2h，每20min取样测定酶活，以初始酶活为100%，计算残余酶活。
(3)最适作用pH，在温度为70℃、不同pH(pH6.0~11.0)条件下，测定重组酶酶活力，以最高酶活为100%，计算相对酶活。
(4)耐碱性测定，在70℃、pH11.0条件下保存3h，每0.5h取样测定酶活，以初始酶活为100%，计算残余酶活。
(5)反应动力学参数，以桦木木聚糖为底物(终浓0.1~1mmol/L)，在pH9.0和70℃条件下，准确反应10min，用酶标仪记录其OD540nm值的变化，进而测定水解产物(木糖)的含量，以计算酶反应的初速度。以底物浓度的倒数为横坐标，以酶反应的初速度的倒数为纵坐标，作Lineweaver-Burk双倒数图。建立1/V-1/[S]的双倒数曲线，根据横轴截矩为-1/Km，纵轴截矩为1/Vmax，计算其Km值和Vmax值。在已知酶浓度情况下，根据测得的Vmax值，计算Kcat值，Kcat＝Vmax/[E]，酶的催化效率由Kcat/Km表示。
将纯化得到的重组木聚糖酶XynG1-1B43CC16BM进行酶学性质与XynG1-1B43CC16和XynG1-1的酶学性质对比，结果如表2。
表2重组突变酶XynG1-1B43CC16BM与XynG1-1B43CC16、XynG1-1的酶学性质比较
由表2可见，XynG1-1B43CC16BM的最适作用pH和最适作用温度分别为9.0和70℃，在90℃、pH9.0条件下保温2h，残余酶活39%，在pH11.0、70℃保存3h，残余酶活44%，说明突变基因XynG1-1B43CC16在B.megaterium MS941中的表达保持了其已获得的耐高温耐碱的优良特性。在70℃、pH9.0的条件下测定重组酶的反应动力学参数，XynG1-1B43CC16BM的Km值(5.64±0.23mg/mL)和Kcat/Km(326.98±1.44)均与XynG1-1B43CC16相当，可见其底物亲和力和催化效率也没有明显变化。因此，由基因工程菌B.megateriumMS941(pSH-XynG1-1B43CC16)生产的重组突变的耐高温高碱木聚糖酶在造纸工业中具有很好的应用前景。
Claims (9)
1.一种耐高温高碱木聚糖酶基因，其特征在于：其基因序列为序列13。
2.一种耐高温高碱木聚糖酶基因的构建方法，其特征在于：应用两轮连续易错PCR方法对坎皮纳斯类芽孢杆菌木聚糖酶基因XynG1-1进行随机突变和耐碱性的定向筛选，得到耐碱性木聚糖酶突变基因XynG1-1B43，其突变位点为：Val90Arg和Pro172His；所述坎皮纳斯类芽孢杆菌木聚糖基因XynG1-1为序列11，耐碱性木聚糖酶突变基因XynG1-1B43为序列12，应用定点突变的方法对序列12的耐碱性木聚糖酶突变基因XynG1-1B43进行耐高温的定向分子改造，得到耐高温高碱木聚糖酶的突变基因XynG1-1B43CC16，其突变位点为：Asp 16Tyr、Thr84Cys和Thr182Cys。
3.一种高产耐高温高碱木聚糖酶的工程菌，其特征在于：含有如权利要求1所述的耐高温高碱木聚糖酶基因。
4.根据权利要求4所述的高产耐高温高碱木聚糖酶的工程菌，其特征在于：所述工程菌的宿主细胞为Bacillus megaterium MS941。
5.根据权利要求3或4所述的高产耐高温高碱木聚糖酶的工程菌，其特征在于：所述工程菌中的表达载体为大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒pSTREPHIS1525。
6.一种耐高温高碱木聚糖酶，其特征在于：具有如权利要求1所述的基因编码的蛋白序列。
7.根据权利要求6所述的耐高温高碱木聚糖酶，其特征在于：由权利要求3所述的工程菌发酵得到。
8.根据权利要求6所述的耐高温高碱木聚糖酶，其特征在于：所述的木聚糖酶的最适作用温度为70℃，最适作用pH为9.0。
9.一种如权利要求6所述的耐高温高碱木聚糖酶的制备方法，其特征在于：步骤如下：
⑴对坎皮纳斯类芽孢杆菌木聚糖酶基因(XynG1-1)进行随机突变和耐碱性的定向筛选，得到耐碱性木聚糖酶突变基因(XynG1-1B43)，其突变位点为：Val90Arg和Pro172His；所述坎皮纳斯类芽孢杆菌木聚糖酶基因(XynG1-1)见序列11；
⑵对耐碱性木聚糖酶突变基因(XynG1-1B43)进行定点突变，突变位点为：Asp16Tyr、Thr84Cys和Thr182Cys，得到耐高温高碱木聚糖酶基因(XynG1-1B43CC16)，所述耐碱性木聚糖酶突变基因(XynG1-1B43)见序列12；
⑶将上述耐高温高碱木聚糖酶基因与表达载体连接，构建获得携带有耐高温高碱木聚糖酶基因的重组载体；
⑷将重组载体转化入宿主菌株中，构建获得重组菌株；
⑸重组菌株分泌表达，发酵制备耐高温高碱木聚糖酶。
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