CN102191260A - 一种耐高温中性木聚糖酶基因及含有该基因的工程菌 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种耐高温中性木聚糖酶基因及含有该基因的工程菌，基因序列见序列1，基因全长为1134bp，命名为XynG1-1，其编码377个氨基酸，其分子量为41267Da，其中前39个氨基酸为其信号肽，第49～235个氨基酸为糖苷水解酶GH11家族的保守序列，第263～377个氨基酸为碳水化合物结合组件CBM6家族的保守序列。本发明提供的工程菌发酵得到的重组酶的最适作用温度和最适作用pH分别为60℃和7.0，在pH7.0、70℃保温1h，相对酶活在65％以上，在pH9、温度60℃条件下保温1h，相对酶活在60％以上。本发明的木聚糖酶在高温下有良好的稳定性，适合造纸、食品和饲料等多个工业领域的应用，具有广阔的应用前景。

Description

一种耐高温中性木聚糖酶基因及含有该基因的工程菌

技术领域

本发明属于生物工程领域，尤其涉及一种耐高温中性木聚糖酶基因及含有该基因的工程菌。

背景技术

木聚糖酶(1，4-β-D-xylanase；EC3.2.1.8)是一种重要的工业用酶，在造纸工业、食品、能源、饲料以及环境等领域中显示了广阔的应用前景，特别是在纸浆生物漂白中的巨大应用潜力早已引起各界的高度关注。木聚糖酶处理各种浆料的作用是降解浆中的木聚糖，使浆中半纤维素的含量降低，并使纤维素细胞壁结构变得松弛，同时使与浆中残余木素连接的半纤维素降解，形成脱木素或有利于脱木素的状态。通过木聚糖酶的预处理，不仅可以提高纸浆的白度，降低打浆的能耗，改善浆料的强度性能，而且，可以减少后继工序漂剂的用量，降低废液的毒性，减轻环境污染。

目前，以无元素氯和全无氯漂白工艺为代表的纸浆绿色清洁漂白已经成为世界各国造纸业纸浆漂白发展的必然趋势，木聚糖酶酶法助漂新工艺已在欧洲和北美的30余家大型纸厂得到应用，成为生物技术在造纸工业应用最成功的一例。其中，加拿大已有约10％的硫酸盐法纸浆厂采用了该项新工艺。丹麦诺维信公司和美国山道斯化学公司等多家酶制剂厂商，纷纷推出了专门用于纸浆处理的木聚糖酶和纤维素酶新产品，但到目前为止，工业上用于纸浆漂白的木聚糖酶大多是中性偏酸的，最适反应温度大多在50℃左右，众所周知，纸浆蒸煮和漂白基本都是在高温和强碱的条件下进行的，使得现有的低温酸性木聚糖酶产品在此领域的应用受到了极大的限制，另外，在饲料和食品领域，木聚糖酶应用在饲料的造粒和食品的焙烤工序中，仍然要求所用的木聚糖酶在高温条件下能够保持较高的酶活，因此，研究开发耐高温的木聚糖酶产品将会带来良好的经济效益和社会效益。

国外对木聚糖酶的研究已达到了分子水平，自上世纪七十年代末开展木聚糖酶基因的研究工作以来，已有150多种来自真菌和细菌的木聚糖酶基因被克隆并在大肠杆菌中表达。其中，Ossi Turunen等人使用Swiss-pdbviewer对来源于Trichoderma ressei的GH11家族木聚糖酶XYNII的结构进行分析；并用PCR的方法在XYNII中引入5个Arg点突变时，突变酶在65℃的半衰期提高4-5倍，最适pH也有所提高；Miyazaki K等人对来源于Bacillus subtilis的木聚糖酶基因运用DNA shuffling技术进行研究，获得了一株最适反应温度提高了10℃，60℃时热稳定性提高了24倍的突变酶；2009年，Ismail Akyol等克隆到Neocallimastix sp.GMLF2的木聚糖酶基因xyn2A，并在大肠杆菌中得到表达，其最适作用温度和pH分别为50℃和6.5。

我国在木聚糖酶方面的研究起步较晚，但发展迅速。上世纪八十年代初期，中国科学院微生物所在张树政院士的带领下，开始了我国对木聚糖酶的早期研究工作，首次从海枣曲酶(Aspergillus phoe-nicis)中纯化得到了四种木聚糖酶：酶I、酶II、酶III和酶IV，并深入研究了活力较高的组分酶III的酶学性质。“九五”期间，山东大学微生物技术国家重点实验室曲音波教授等开展了木聚糖酶在造纸方面的应用研究，从碱性假单胞菌sp.G6-2分离出两种木聚糖酶XynA和XynB。目前，我国对木聚糖酶的研究大多停留在产酶菌株的筛选、酶的纯化和酶学性质研究方面，部分课题已涉及木聚糖酶的分子生物学研究、木聚糖酶基因克隆、表达和重组。Chen等用易错PCR技术对来源于真菌Neocallimastix patriciarum的木聚糖酶进行定向进化研究，获得了比野生型蛋白质耐碱性更强的木聚糖酶。09年Yingguo Bai等从云南温泉中分离到产木聚糖酶的菌株thermoacidophilic Alicyclobacillus sp.A4，克隆得到木聚糖酶基因XynA4，并在大肠杆菌中表达。测得该木聚糖酶XynA4的最适作用pH和最适作用温度分别为7.0和55℃。Jing Wang等在造纸厂污水中分离到产碱性木聚糖酶的Bacillus pumilus BYG野生型菌株，该木聚糖酶的最适作用pH为8.0-9.0，最适作用温度50℃，并克隆到木聚糖酶基因XynBYG，该基因长度为687bp，编码229个氨基酸，成功应用定点突变技术将该酶的最适作用温度提高了5℃。据统计，目前国内木聚糖酶的研究中，木聚糖酶的最适作用温度最高为85℃，而其最适作用pH为6.5，来自于2009年新疆大学的Wei Zhang等将嗜热网团菌(Dictyoglomus thermophilum Rt46B.1)的木聚糖酶基因xynB在Bacillus subtilis中表达后获得的木聚糖酶。

综上可见，国内外各研究机构正致力于获得不同来源的具有一定优良性质的木聚糖酶基因，并且构建合适的工程菌株，使其更适合工业应用的极端条件，开拓其更广的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于通过产木聚糖酶菌种的筛选，从而获得编码耐高温中性木聚糖酶的基因，并且进一步构建能高效表达此耐高温中性木聚糖酶的基因工程菌。

本发明实现目的的技术方案如下：

一种耐高温中性木聚糖酶基因，基因序列见序列1。

而且，具体方法如下：

根据已报道木聚糖酶基因，分析其保守序列，设计本发明的耐高温中性木聚糖酶基因的扩增引物如下：

上游引物为：序列2，下游引物为：序列3，

扩增模板为坎皮纳斯类芽孢杆菌基因组DNA，其扩增的反应条件为：95℃5min；94℃45S，55℃45S，72℃90S，30个循环；72℃延长10min；

扩增体系50μL：ddH₂O 35.5μL，10×buffer 5μL，dNTPs  2.5mmol/L每个5μL，

上游引物10μmol/L 1.5μL，下游引物10μmol/L 1.5μL，DNA模板1μL，TaqDNA聚合酶0.5μL；

PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，得到1134bp的单一条带，回收PCR产物，得到耐高温中性木聚糖酶全基因；

一种序列1的耐高温中性木聚糖酶基因的基因工程菌。

而且，宿主菌为大肠杆菌E.coli BL21。

而且，构建方法如下

(1)重组质粒pET-XynG1-1的构建与鉴定

将XynG1-1基因的PCR纯化产物与载体pET-22b(+)经Hind III和XhoI双酶切后，分别用小量DNA回收试剂盒回收酶切产物，应用DNA连接试剂盒的Solution I在16℃的条件下连接12h，将目的基因XynG1-1定向连接至载体pET-22b(+)，将连接产物应用化学转化法转化到E.coli DH5α感受态细胞中，在含有Amp的LA培养基中筛选培养，挑取阳性转化子，培养后提质粒，用Hind III和XhoI双位点单、双酶切鉴定，测序；

(2)大肠杆菌E.coli BL21基因工程菌的构建

将测序正确的重组质粒pET-XynG1-1应用化学转化的方法转化到E.coli BL21感受态细胞中，挑取阳性转化子，进行IPTG诱导表达。

本发明的优点和积极效果如下：

本发明提供了一种来源于坎皮纳斯类芽孢杆菌(TCCC11578)的耐高温中性木聚糖酶基因以及带有该基因序列的E.coli BL21基因工程菌，本发明提供并表达的基因区别于已报道的木聚糖酶基因序列，并在个别氨基酸组成上有差异，该重组酶的最适作用温度和最适pH分别为60℃和7.0，在pH7.0、70℃保温1h，相对酶活在65％以上，在pH9，温度60℃条件下1h，相对酶活在60％以上。本发明的木聚糖酶在高温下有良好的稳定性，适合造纸、食品和饲料等多个工业领域的应用，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明的耐高温中性木聚糖酶基因PCR扩增产物电泳图(其中M为DNAMarker从上到下分子量分别为10000bp、8000bp、6000bp、5000bp、4000bp、3500bp、3000bp、2500bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp，1为以坎皮纳斯类芽孢杆菌基因组为模板经PCR扩增到的木聚糖酶基因XynG1-1)；

图2为本发明的耐高温中性木聚糖酶基因XynG1-1与原核表达载体pET-22b(+)连接构建流程图；

图3为本发明以pET-22b(+)空质粒作对照分别单、双酶切验证pET-XynG1-1的电泳图(其中M为DNAMarker从上到下分子量分别为10000bp、8000bp、6000bp、5000bp、4000bp、3500bp、3000bp、2500bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp，1和2分别为pET-22b(+)空质粒经HindIII单切、HindIII/XhoI双酶切的结果；3和4分别为pET-XynG1-1经HindIII单切、HindIII/XhoI双酶切的结果)；

图4-1与图4-2为本发明以携带空质粒的出发菌E.coli BL21/pET-22b(+)为对照的基因工程菌E.coli BL21/pET-XynG1-1的平板筛选图(图4-1为未加IPTG的筛选平板；图4-2为加有IPTG的筛选平板)；

图5本发明重组木聚糖酶最适作用温度的测定曲线；

图6本发明重组木聚糖酶温度稳定性的测定曲线；

图7本发明重组木聚糖酶最适作用pH的测定曲线；

图8本发明重组木聚糖酶pH稳定性的测定曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

一种耐高温中性木聚糖酶基因，序列见序列1，本耐高温中性木聚糖酶基因全长为1134bp，命名为XynG1-1，其编码377个氨基酸，预测其分子量为41267Da，其中前39个氨基酸为其信号肽，第49～235个氨基酸为糖苷水解酶GH11家族的保守序列，第263～377个氨基酸为碳水化合物结合组件CBM6家族的保守序列。经NCBI序列相似性比对，发现与已报道的木聚糖酶的氨基酸序列最高相似度为97％，有14个氨基酸的差异。

一、耐高温中性木聚糖酶基因的获得

1、筛选出一种产耐高温中性木聚糖酶的菌株，经16s rDNA鉴定为坎皮纳斯类芽孢杆菌Paenibacillus campinasensis，并命名为Paenibacillus campinasensis G1-1(TCCC 11578)，提取其基因组DNA，大约20kbp，

坎皮纳斯类芽孢杆菌基因组DNA的提取步骤如下：

(1)将培养至对数期的菌液(约7～12h)取1mL，12000r/min离心1min收集菌体。

(2)将菌体悬浮于90μL ddH₂O中，加50mg/mL溶菌酶10μL，充分混匀后37℃水浴保温20min。

(3)加入400μL裂解液混匀至产生大量泡沫，补加5mol/L NaCl 200μL，轻轻颠倒混匀，1200r/min离心10min。

(4)上清转移至另一Ep管中，加1/2体积苯酚和1/2体积氯仿，温和混匀。12000r/min离心3min。

(5)取上清，加入1/2体积的苯酚、氯仿反复抽提，离心，吸上清。重复此步骤直到两相界面看不到白色物质为止。

(6)加入等体积的氯仿进行抽提，离心，吸上清。

(7)用两倍体积的无水乙醇-70℃沉淀DNA大约30min，12000r/min离心8min，200μL70％乙醇洗涤两次，12000r/min离心5min，室温晾干。

(8)DNA溶于溶于20μLddH₂O中-20℃短期保存。

2、根据已报道木聚糖酶基因，分析其保守序列，设计本发明的耐高温中性木聚糖酶基因的扩增引物如下：

上游引物为：CCCAAGCTTATGAAAATCTATGGGAAGAGGAGGA  下划线为Hind III酶切位点；

下游引物为：CCGCTCGAGTCACCGGATCTCCAAATAGTCAATG  下划线为XhoI酶切位点；

扩增模板为坎皮纳斯类芽孢杆菌基因组DNA，其扩增的反应条件为：95℃5min；94℃45S，55℃45S，72℃90S，30个循环；72℃延长10min。

扩增体系(50μL)：ddH₂O 35.5μL，10×buffer 5μL，dNTPs(2.5mmol/L each)5μL，

上游引物(10μmol/L)1.5μL，下游引物(10μmol/L)1.5μL，DNA模板1μL，TaqDNA聚合酶0.5μL；

PCR扩增产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳，得到1134bp的单一条带(图1)，用小量DNA回收试剂盒回收PCR产物，得到本发明的耐高温中性木聚糖酶全基因。

二、耐高温中性木聚糖酶基因工程菌的构建

1、重组质粒pET-XynG1-1的构建与鉴定(图2)

将PCR纯化产物与载体pET-22b(+)经Hind III和XhoI双酶切后，分别用小量DNA回收试剂盒回收酶切产物，应用DNA连接试剂盒的Solution I在16℃的条件下连接12h，将目的基因XynG1-1定向连接至载体pET-22b(+)，将连接产物应用化学转化法转化到E.coli DH5α感受态细胞中，在含有Amp的LA培养基中筛选培养，挑取阳性转化子，培养后提质粒，用Hind III和XhoI双位点单、双酶切鉴定(图3)，测序(序列1)。得到全长为1134bp的木聚糖酶基因，命名为XynG1-1，其编码377个氨基酸，预测其分子量为41267Da，其中前39个氨基酸为其信号肽，第49～235个氨基酸为糖苷水解酶GH11家族的保守序列，第263～377个氨基酸为碳水化合物结合组件CBM6家族的保守序列。经NCBI序列相似性比对，发现与已报道的木聚糖酶的氨基酸序列最高相似度为97％，有14个氨基酸的差异。

其中大肠杆菌化转感受态细胞的制备方法：

(1)从大肠杆菌平板上挑取一个单菌落，接种于2ml LB培养基试管中，37℃180r/min摇床培养过夜。

(2)取500μl菌液转接到一个含有50ml LB培养基的250ml锥型瓶中，37℃180r/min摇床培养2～3h，(此时OD_600nm≤0.4～0.5，细胞数务必＜10⁸/ml，此为实验成功关键)

(3)将菌液转移到50ml离心管中，冰上放置10min。

(4)4℃、4000r/min离心10min，回收菌体细胞。

(5)倒出培养液，将管倒置1min，以便液体培养基流尽。

(6)用冰冷的0.1mol/LCaCl₂溶液10ml悬浮沉淀，立即放在冰上保温30min。

(7)4℃、4000r/min离心10min，回收菌体细胞。

(8)用冰冷的0.1mol/LCaCl₂和15％的甘油混合液2ml重悬细胞。

(9)分装细胞，每份50μl，即得到感受态细胞。

其中重组质粒pET-XynG1-1化学转化E.coli DH5α感受态细胞的具体步骤为：

(1)加入5μl质粒DNA连接产物于50μl感受态中，充分混匀。

(2)冰上放置30min。

(3)42℃水浴90s。

(4)冰上放置1～2min。

(5)将感受态细胞加入800μlLB培养基中，摇床37℃，180r/min复苏培养1h。

(6)复苏培养后，取菌液8000r/min离心2min，吸掉1/3上清液后，将菌体重悬，涂布于Amp抗性平板，37℃倒置培养12～16。

2、大肠杆菌E.coli BL21(DE3)基因工程菌的构建

将测序正确的重组质粒载体pET-XynG1-1应用化学转化的方法转化到E.coli BL21(DE3)感受态中(转化方法同上)，挑取阳性转化子，进行IPTG诱导表达。

其中诱导表达的具体方法为：

将大肠杆菌工程菌株E.coli BL21(pET-XynG1-1)接种于2mL含Amp的LB液体培养基中，37℃水浴振荡培养过夜，按8％的接种量转接于装有5mL含Amp LB培养基的试管中，37℃水浴振荡培养2～3h(OD₆₀₀＝0.8～1.0)，一组加入IPTG(终浓度为1mmol/L)，37℃诱导表达3h，一组作为非诱导对照进行37℃培养。

3、大肠杆菌E.coli BL21(DE3)基因工程菌的筛选

由于该木聚糖酶基因的信号肽可以被E.coli BL21(DE3)宿主菌识别，所以带有该木聚糖酶基因的工程菌可在同时含有IPTG和底物木聚糖的LA平板(Amp抗性)上生长并在菌体周围形成透明圈，并且发现在不加IPTG的情况下，工程菌也能形成透明圈(图4)，这是由于在LA培养基成分中含有少量的乳糖，它是IPTG的类似物，也可以起到一定程度的诱导作用，因此，可以直接用含有木聚糖底物的LA平板(Amp抗性)筛选携带有本发明木聚糖酶基因的E.coli BL21(DE3)基因工程菌。

其中含有IPTG和底物木聚糖的LA平板(Amp抗性)配制方法如下：

100ml LA培养基+1g稻壳木聚糖+100μlAmp(50mg/ml)+20μlIPTG(20mg/ml)

121℃高压灭菌20min，倒平板(5～6个)。

三、重组木聚糖酶XynG1-1的纯化及其酶学特性分析

1、应用超声破碎仪破碎菌体细胞，破碎后4℃12000r/min离心10min取上清，即得到基因工程菌产耐高温中性木聚糖酶的粗酶液，并采用DNS法测定其酶活。

其中超声破碎方法如下：

(1)将诱导培养后的菌液转移至50ml离心管中。

(2)4℃5000r/min离心10min。

(3)离心后，倒出上清液，加入10ml细胞裂解液(20mM Tris-HCl pH7.5与100mM NaCl的混合溶液)，用移液器将沉淀的细胞打散。

(4)超声破碎电压50％，总时间30min，开5s，关9.9s。

其中木聚糖酶酶活测定方法为(DNS法)：

吸取0.1mL经适当稀释的酶液到5mL具塞刻度试管中，再加入10g/L的木聚糖底物溶液0.1mL。盖紧试管塞，50℃水浴恒温反应10min，立即向试管中加入0.6mLDNS试剂并混匀终止反应，然后在沸水中煮沸10min，冷却后加水定容至5mL，充分摇匀。根据木糖标准曲线的回归方程计算出反应体系的含糖量。

试验中对木聚糖酶活力单位的定义为：1mL酶液每分钟产生1μmoL的还原糖(以木糖计)为一个活力单位，用U表示，

U＝N×R/10min×0.1mL

式中：N为酶液稀释倍数；R为回归方程计算出的木糖含量。

2、对所得粗酶液应用镍离子亲和层析进行一步纯化，得到纯酶。

其中具体纯化方法如下：

超声破碎得到粗酶液，加入10％的TX-100，终浓度为1％，12000rpm，离心20min，取上清。

取1ml beads(Ni柱)于50ml离心管中，加入20ml裂解液洗脱，除去酒精，4℃，5000rpm，离心15min，去除上清。

将离好的上清(可溶蛋白)加入到beads中，混匀，冰上孵育2h(增加特异性)，孵育前加10mM咪唑。

4℃，2000rpm，离心3min，用20mM咪唑洗3次，2000rpm，离心3min，再用含50mM咪唑的washing buffer洗一次。

洗脱：250mM咪唑的洗脱液1.5ml加入beads中，混匀，冰浴10min后，洗脱。

用PD-10Desalting column去盐，即得重组木聚糖酶XynG1-1的纯蛋白。

3、重组木聚糖酶XynG1-1酶学特性的测定

其中温度对酶活力的影响

1)该木聚糖酶最适作用温度的测定：在不同温度(40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、80℃)，pH7.0条件下测定重组木聚糖酶的酶活力，单位为U/ml(图5)。

2)该木聚糖酶的温度稳定性测定：将重组木聚糖酶纯酶液分别置于不同温度(30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃)、pH为7.0的条件下，保温1h后，测定各自的残余酶活力，将其中最高酶活力定为100％(图6)。

其中pH对酶活力的影响

1)该木聚糖酶最适作用pH的测定：在不同pH(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)，温度为60℃的条件下测定重组木聚糖酶的酶活力，单位为U/ml(图7)。

2)该木聚糖酶的pH稳定性测定：将重组木聚糖酶纯酶液分别调至不同pH(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)、温度60℃条件下，保温1h后，测定各自的残余酶活力，将其中最高酶活力定为100％(图8)。

本发明的重组木聚糖酶最适作用温度为60℃，在pH7.0、70℃保温1h，相对酶活在65％以上，重组木聚糖酶最适作用pH为7.0，在pH9、温度60℃条件下1h，相对酶活在60％以上，本发明的重组木聚糖酶在以上特性上与原始菌产生的木聚糖酶基本一致，酶学特性未发生改变。

Claims (6)

1.一种耐高温中性木聚糖酶基因，其特征在于：基因序列见序列1。

2.根据权利要求1所述的耐高温中性木聚糖酶基因，其特征在于：所述耐高温中性木聚糖酶基因全长为1134bp，命名为XynG1-1，其编码377个氨基酸，其分子量为41267Da，其中前39个氨基酸为其信号肽，第49～235个氨基酸为糖苷水解酶GH11家族的保守序列，第263～377个氨基酸为碳水化合物结合组件CBM6家族的保守序列。

3.根据权利要求1所述的耐高温中性木聚糖酶基因，其特征在于：所述基因来源于坎皮纳斯类芽孢杆菌。

4.一种携带权利要求1中所述的耐高温中性木聚糖酶基因的菌株。

5.根据权利要求4所述的携带耐高温中性木聚糖酶基因的菌株，其特征在于：宿主菌为大肠杆菌E.coli BL21。

6.根据权利要求4或5所述的携带耐高温中性木聚糖酶基因的菌株，其特征在于：构建方法如下：

(1)根据已报道木聚糖酶基因，分析其保守序列，设计本发明的耐高温中性木聚糖酶基因的扩增引物如下：

上游引物为：序列2，下游引物为：序列3；

扩增模板为坎皮纳斯类芽孢杆菌基因组DNA，其扩增的反应条件为：95℃5min；94℃45S，55℃45S，72℃90S，30个循环；72℃延长10min，

PCR扩增产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳，得到1134bp的单一条带，回收PCR产物，得到耐高温中性木聚糖酶全基因；

(2)重组质粒pET-XynG1-1的构建与鉴定

将PCR纯化产物与载体pET-22b(+)经Hind III和XhoI双酶切后，分别回收酶切产物，应用DNA连接试剂盒的Solution I在16℃的条件下连接12h，将目的基因XynG1-1定向连接至载体pET-22b(+)，将连接产物应用化学转化法转化到E.coli DH5α感受态细胞中，在含有Amp的LA培养基中筛选培养，挑取阳性转化子，培养后提质粒，用Hind III和XhoI双位点单、双酶切鉴定，测序；

(3)大肠杆菌E.coli BL21基因工程菌的构建

将测序正确的重组质粒pET-XynG1-1应用化学转化的方法转化到E.coli BL21感受态细胞中，挑取阳性转化子，进行IPTG诱导表达。

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