CN104630183A - 一种耐热木聚糖酶及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种耐热木聚糖酶及其编码基因与应用，所述木聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还提供了一种分泌耐热木聚糖酶的菌株，保藏编号为CGMCC No.10369，保藏日期为2015年1月19日。所述菌株分泌表达的木聚糖酶具有热稳定性，在饲料的制备过程中不会因高温而失活，使得饲料中含有具有活性的木聚糖酶。

Description

一种耐热木聚糖酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种耐热木聚糖酶及其编码基因与应用。

背景技术

随着对饲料原料的不断开发和研究，将小麦作为玉米的替代资源加以利用，具有一定的现实意义和经济价值。但小麦中含有较高的非淀粉多糖(NSP)，以阿拉伯木聚糖和β-葡聚糖为主。

木聚糖是通过木糖苷键连接的木糖聚合物，侧链上常具有多种取代基。它是植物半纤维素的重要组成部分，占植物碳水化合物总量的1/3，其含量仅次于纤维素，是在自然界中一类重要的再生生物资源。

因单胃动物消化道内缺乏消化这类多糖的内源酶，故这些物质不能被消化利用，而且会影响其他养分的吸收利用，具有很强的抗营养作用，从而影响单胃动物的生产性能。降解木聚糖的酶类主要是以内切方式水解木聚糖分子中β-1,4-木糖苷键的酶，其水解产物主要为木二糖与木二糖以上的低聚木糖，也有少量木糖和阿拉伯糖。

为解决这一问题，针对不同饲料国内外已提出了许多改进措施，如加强原料的品种培育、脱壳、加外源性酶制剂等，其中，加外源性酶制剂被认为是最有潜力的途径，因为它可以针对其中的特异性底物专一性的发挥作用，不仅可以降低或消除非淀粉多糖等抗营养因子的抗营养作用，而且可使一部分营养物质得以利用，提高整个营养物质的消化利用率，从而提高饲料的利用价值。因此，向日粮中添加木聚糖酶可以有效的解决木聚糖的抗营养作用。但饲料在加过过程中要经过高温制粒过程，普通木聚糖酶在这一过程中会丧失活性，研制耐热木聚糖酶具有非常重要的意义。

目前提高酶热稳定性的主要方法有自然选择法、蛋白质工程法、化学修饰法等。基因工程技术和生物信息学的快速发展，为分子生物学的研究开辟了新的前景。我们可以运用生物信息学及计算机相关软件对酶分子进行定向改造提高其热稳定性，然后使用基因工程的手段对木聚糖酶进行改造，以加速木聚糖酶在各种领域中的应用过程。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种耐热木聚糖酶及其编码基因与应用。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种耐热木聚糖酶，所述木聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了编码前述木聚糖酶的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了含有前述编码基因的载体或质粒。

本发明还提供了含有前述编码基因的工程菌。

本发明还提供了一种分泌耐热木聚糖酶的菌株，分类命名为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏日期为2015年1月19日，保藏编号为CGMCC No.10369。

本发明还提供了前述编码基因在制备单胃动物饲料中的应用。

本发明还提供了前述工程菌在制备单胃动物饲料中的应用。

本发明还提供了前述菌株在制备单胃动物饲料中的应用，具体为：利用所述菌株分泌表达的木聚糖酶具有热稳定性，在饲料的制备过程中不会因高温而失活，使得饲料中含有具有活性的木聚糖酶。

本发明的有益效果在于：

本发明通过基因工程技术，以硫色曲霉(Aspergillus sulphureus)的木聚糖酶基因序列(GenBank登录号：DQ355509)为模板，进行重叠PCR和反向PCR以引入二硫键和脯氨酸，构建突变质粒，并将其转入毕赤酵母中，从而能获得耐热木聚糖酶。在5升发酵罐的发酵活力达到1684U/mL，最适催化温度为55℃，最适pH值为3.0。在60℃、70℃和80℃条件下，半衰期分别为39.6、9.5和1.6min，同时，该木聚糖酶在低pH值的高催化活性、耐酸性及金属离子耐受性，使之在饲料添加剂领域中具有较好的应用前景。

附图说明

图1为本发明获取突变xynA^53-142-46基因序列的流程图。

图2为本发明毕赤酵母工程菌X-33/xynA^53-142-46在5L发酵罐中的发酵过程；

其中：a1：利用以葡萄糖为基础的碳源；a2：在葡萄糖用尽后(以溶氧量为指标)，向培养基中加入50％(v/v)甘油；a3：甲醇诱导阶段。■：湿菌重；▲：木聚糖酶活性，取三次测量值的平均值。

图3为本发明5L发酵罐中产出的β-1,4-木聚糖酶的电泳分析；

其中：M：蛋白质分子量标准；1-9：12，24，36，48，60，72，84，96和108h诱导产物样本。

图4为本发明木聚糖酶的最适催化温度分析图。

图5为本发明木聚糖酶的最适pH值分析图。

图6为本发明木聚糖酶的耐酸性分析图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1同源建模模拟xynA蛋白的空间结构

登录蛋白质结构数据库Protein data bank(http://resh.org)，经BLAST比对，找到与xynA高度同源的序列。本试验选择黑曲霉木聚糖酶(PDB 2QZ2_A)为模板，并且两者的同源性为98％，可获得准确性较高的空间结构模型。

实施例2利用计算机相关软件和生物信息学理性设计耐热突变基因

以同源建模获得的野生型木聚糖酶xynA的晶体结构为模型，根据两个半胱氨酸的C-S键旋转角度χ¹，S-S键旋转角度χ^ss，C^α之间的距离r^α，C^β之间的距离r^β的平均范围，利用Coot软件预测可能形成二硫键的氨基酸位点(见表1)。结合Coot软件的预测结果和远离活性中心原则，选出P51C-T144C、T53C-T142C和S49C-A146C这3对突变位点，并利用重叠PCR引入突变位点，构建相应的突变体(xynA^P51C-T144C,xynA^T53C-T142C,xynA^S49C-A146C)。同时，由于脯氨酸在从自然界中筛选到的耐热木聚糖酶中所占比例较大，多出现于无规卷曲处，在野生型木聚糖酶xynA无规卷曲上选出D32P、G33P、S35P、T45P、T46P、Y75P、S136P、S160P、D161P这9个突变位点，并利用反向PCR引入突变位点，构建相应的突变体(xynA^D32P,xynA^G33P,xynA^S35P,xynA^T45P,xynA^T46P,xynA^Y75P,xynA^S136P,xynA^S160P,xynA^D161P)对上述12个突变体菌株进行诱导表达，测定高温条件下残余酶活，筛选出耐热性较好的突变体菌株xynA^T53C-T142C、xynA^T46P和xynA^S136P。以xynA^T53C-T142C为模板，进行反向PCR，分别引入T46P和S136P突变位点，再分别以xynA^T46P和xynA^53-142-46为模板，引入S136P这一突变位点，构建xynA^53-142-46、xynA^53-142-136、xynA^46-136和xynA^{53-142-46-136}双突变体。将这4个双突变体诱导表达，测定高温条件下残余酶活，并将其耐热性与之前得到的单突变体(xynA^T53C-T142C、xynA^T46P和xynA^S136P)进行比较，发现突变体xynA^53-142-46的耐热性显著优于其它突变体，最终得到可以显著提高耐热性的突变位点T53C-T142C和T46P。

表1 木聚糖酶分子中可能形成二硫键的氨基酸位点

实施例3突变基因xynA^53-142-46及其表达质粒的构建

根据硫色曲霉木聚糖酶xynA(GenBank登录号：DQ355509)基因序列和实施例2中设计的二硫键突变位点设计2对引物(见表1)，利用重叠PCR的方法，引入1对半胱氨酸突变。

具体PCR扩增方法为：以质粒pPIC-xynA-opt为模板，xynA-F与m3-R(T53C-T142C)配对扩增片段1，xynA-R与m3-F(T53C-T142C)配对扩增片段2，反应体系如下：

PCR反应条件为：98℃，3min；98℃，10s，55℃，30s，72℃，60s(扩增32个循环)；72℃，5min。

扩增产物(上、下游片段)用1％琼脂糖凝胶电泳检测，分别采用Bio Teke凝胶回收试剂盒回收后稀释适当倍数作为模板，以xynA-F、xynA-R为引物扩增，反应体系如下：

PCR反应条件同上。

PCR终产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，Bio Teke凝胶回收试剂盒回收。用限制性内切酶Xba I和EcoR I酶切的PCR终产物及pPICZαA载体，再用Bio Teke凝胶回收试剂盒回收后，将酶切后的PCR终产物与pPICZαA载体连接。将连接产物转化大肠杆菌Top 10，抗生素Zeocin筛选阳性菌落，提取质粒进行序列测定以证实突变的发生，将阳性质粒命名为pPIC-xynA^T53C-T142C。

再根据xynA^T53C-T142C基因序列和实施例2中设计的脯氨酸突变位点设计1对引物(见表2)。利用反向PCR的方法，引入单个脯氨酸突变。

具体PCR方法为：以质粒pPIC-xynA^T53C-T142C为模板，T46P-F与T46P-R为引物进行反向PCR，反应体系如下：

PCR反应条件为：98℃，3min；98℃，10s，58℃，30s，72℃，60s(扩增32个循环)；72℃，5min。

PCR终产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测后，用DpnI消化模板质粒后，转化大肠杆菌Top 10，抗生素筛选阳性菌落，提取质粒进行序列测定以证实突变的发生，将阳性质粒命名为xynA^53-142-46，即为xynA^53-142-46表达质粒，构建流程见图1。

表2 重叠PCR和反向PCR引入突变位点的引物序列

实施例4含突变质粒xynA^53-142-46毕赤酵母工程菌株的构建、高密度发酵及酶活测定

用限制性内切酶SacI对构建好的突变体质粒进行线性化，然后电转化毕赤酵母感受态细胞，涂布于含有Zeocin(1.0μg/mL)的YPDS平板上，28℃培养2-3d直至长出清晰菌落。接突变体菌株于5-10mLYPD中，28℃、250rpm培养过夜后，转接入含有100mL的大瓶YPD中，待菌体浓度长至OD₆₀₀值达到2-6时，接入5L含有发酵培养基的发酵罐中。发酵温度为28℃、pH为5.0，待湿菌重达到80mg/mL时，进入甘油补料阶段，补料9h后湿菌重达到160mg/mL，停止甘油补料，开始用甲醇诱导，诱导108h时，收集菌液，离心后取上清液。具体发酵过程见图2。对发酵上清液进行SDS-PAGE显示(图3)，随诱导时间增加，在25kDa处，酶蛋白表达量也逐步增加，与酶活增长的趋势一致。

对上述得到的木聚糖酶进行酶活检测。在最适条件下，以0.8％的木聚糖为底物(美国Sigma公司)用DNS法测定酶活。酶活定义为：在最适条件下每min降解底物产生1μmol木糖所需酶量为1个U。

酶活测定的具体方法：在5mL刻度试管中加入400μL浓度为0.8％的木聚糖溶液，置于电热恒温水浴锅中，最适温度预热5min。加入用最适pH的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液稀释的酶液400μL，空白对照中则加入最适pH的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。在最适温度下反应20min，向试管中加入1mL DNS溶液，终止反应。将试管转移至沸水中，沸水浴5min。待试管中液体冷却，用双蒸馏水定容至5mL，用双光束紫外可见分光光度计在540nm波长处测试样品OD值，计算酶活。实验设三次重复，每个样品测定均设三个平行实验，相对误差控制在5％以内。结果表明，发酵146h(甲醇诱导108h)时，所表达的木聚糖酶活性达到1,684U/mL。

最适温度的确定：配制pH 3.4的木聚糖底物和稀释酶液，分别在20～80℃各温度条件下，测定酶活，绘制酶活性随温度变化的曲线，确定酶的最适催化温度。实验设三次重复，结果如图4所示。结果表明，pH 3.4的条件下，上述步骤获得的木聚糖酶在55℃时酶活最高，此时的平均相对酶活力为100％。

热稳定性的确定：测定酶液置于60℃、70℃和80℃水浴中的半衰期。结果显示，在60℃、70℃和80℃条件下，半衰期分别为39.6min、9.5min和1.6min。

野生型木聚糖酶的最适催化温度为50℃，60℃时的半衰期为1.8min，与野生型木聚糖酶相比，突变型木聚糖酶xynA^53-142-46在60℃条件下的半衰期提高了22倍，而70和80℃时，野生型木聚糖酶检测不到酶活。由此可知，xynA^53-142-46的热稳定性优化效果明显，且其最适温度提高了5℃。

最适pH值的确定：采用pH值分别为2.2、2.6、3.0、3.4、4、5、6、7和8的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液分别以适当比例稀释酶液，底物也用相应的缓冲液配制，在最适温度下测酶活，确定酶的最适催化pH值。实验设三次重复，结果如图5所示。结果表明，55℃条件下，上述步骤获得的木聚糖酶在pH 3.0时酶活最高，此时的平均相对酶活力为100％。

酸稳定性的确定：将酶液分别用pH值为1.7和2.2的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液以1/10稀释，分别于保持20min、40min、60min、80min、100min和120min后，再用最适pH值的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液以适当比例稀释，在最适温度下测酶活，计算残余酶活的量。实验设三次重复，结果如图6所示。结果表明，在120min内，酶的相对活性保持在70％以上。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种耐热木聚糖酶，其特征在于，所述木聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述木聚糖酶的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.含有权利要求2所述基因的载体或质粒。

4.含有权利要求2所述基因的工程菌。

5.一种分泌耐热木聚糖酶的菌株，其特征在于，所述菌株为巴斯德毕赤酵母，保藏编号为CGMCC No.10369，保藏日期为2015年1月19日。

6.权利要求2所述基因在制备单胃动物饲料中的应用。

7.权利要求4所述工程菌在制备单胃动物饲料中的应用。

8.权利要求5所述菌株在制备单胃动物饲料中的应用，其特征在于，利用所述菌株分泌表达的木聚糖酶具有热稳定性，在饲料的制备过程中不会因高温而失活，使得饲料中含有具有活性的木聚糖酶。

9.一种含有权利要求1所述木聚糖酶的饲料。