CN102719418B

CN102719418B - α-淀粉酶的截断体及其应用

Info

Publication number: CN102719418B
Application number: CN2012100793269A
Authority: CN
Inventors: 王成华; 黄日波; 王青艳; 申乃坤; 陈东; 黎贞崇; 黄志民
Original assignee: Guangxi Academy of Sciences
Current assignee: Guangxi Academy of Sciences
Priority date: 2012-03-23
Filing date: 2012-03-23
Publication date: 2013-09-11
Anticipated expiration: 2032-03-23
Also published as: CN102719418A

Abstract

α-淀粉酶截断体及其应用，涉及一种耐温性和催化活性同时改善的有意义α-淀粉酶变体，其特征在于截取枯草芽孢杆菌CN7α-淀粉酶的45-467氨基酸肽段，并在C端融合一段人工合成肽，该变体α-淀粉酶相对于亲本α-淀粉酶分别将耐温性提高2.7°C、催化活性提高2.23倍，变体α-淀粉酶比亲本α-淀粉酶更有利于淀粉工业的工业化生产。

Description

α-淀粉酶的截断体及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是一种α-淀粉酶的截断体及其应用。

背景技术

淀粉是由D-葡萄糖单体组成的同聚物，为植物中糖类的主要贮存形式。作为最为丰富和重要的生物质资源之一，淀粉除用于食品外，在工业上被广泛地应用于纺织、造纸、制药等领域，特别被用作发酵工业的碳源生产燃料乙醇、淀粉酶糖类等。淀粉质生物质资源开发利用的关键，在于将其降解成诸如葡萄糖、麦芽糖等可发酵性糖类，其可被用于微生物发酵生成包括有机醇、氨基酸等高附加值化工产品，包括生物乙醇、生物丁醇等在内的生物质能源、以及包括L乳酸等在内的生物基材料等。

α-淀粉酶是一类随机作用于淀粉、糖原及相关的聚糖和寡糖中D葡萄糖单元间的α-1,4糖苷键，生成α-构型的还原糖的酶类(Fischer E H,Stein E A.The Enzymes[M].New York∶Academic Press,1960.313-343.Schwimmer S,Balls A K.Isolation and Properties of CrystallineAlpha-Amylase from Germinated Barley[J].J Biol Chem.1949,179(3):1063-74)。α-淀粉酶属于糖苷水解酶类，在碳水化合物活性酶数据库（Carbohydrate Active enZyme database,CAZy数据库）（http://www.cazy.org/）中，α-淀粉酶分布在CAZy中糖苷水解酶家族（GlycosideHydrolase,GH）GH-13、GH57和GH119三个亚家族中（Withers S,Williams S.2012."GlycosideHydrolases"in Cazypedia.）。总体而言，α-淀粉酶的来源宿主囊括了从动物、植物、真菌、病毒、古菌等在内所有原核、真核和古菌三界内的生物，然而，每种α-淀粉酶应用的性能、经济性和可行性受到，包括特异性、稳定性、最适温度和pH性能（Gupta R,Gigras P,MohapatraH,et al.Microbial Alpha-Amylases:A Biotechnological Perspective[J].Process Biochemistry.2003,38(11)∶1599-1616.）在内的重要的酶学性质的影响。作为自然界长期进化的结果，这些天然的α-淀粉酶往往不能满足淀粉工业所需求的诸如高温、极端pH、不依赖钙离子、抗金属螯合性、高催化活性的条件。

目前，淀粉工业中将淀粉质原料降解为葡萄糖等发酵性糖源的过程，主要包括调浆、糊化、液化和糖化过程。以诺维信公司提供的适用于淀粉质原料燃料乙醇生产标准工艺为例，其包括如下几部分（图4-1）：1）调浆工艺，在室温下调整淀粉乳浓度为30-40%底物干重，通常玉米淀粉、木薯淀粉等的天然pH值为4.5左右；2）糊化工艺，105°C-110°C维持5min；3）液化工艺，加入耐高温α淀粉酶如Liquozyme等在98°C和pH5.3-pH5.7条件下液化处理1-2h，待糖度达到DE值为12-18；4）糖化工艺，调整液化醪pH值为4.1-4.5、温度为60°C，加入Dextrozyme GA等糖化酶，糖化处理40-70h，糖化值DE为97-98%为止。以上工艺的设计建立在耐高温α淀粉酶Liquozyme和糖化酶Dextrozyme GA的运用基础之上，Liquozyme最适pH为pH5.5-pH6.0，可以耐受110°C高温，但是酶活与稳定性必须钙离子（不少于5ppm）的添加，而Dextrozyme GA的最适pH为pH4.5左右，最适温度60°C，这种前后工序的pH值和温度的不一致，就造成了pH调整和温度的调整，增加了因化学试剂和“过度”的能耗带来的成本。通常，淀粉质原料的糊化温度在70°C左右即可，例如玉米糊化温度为玉米淀粉糊化温度68-72℃，木薯淀粉该在60-80℃间。因此，开发出新的操作温度在70°C左右、耐受pH4.5、并且不添加钙离子的液化工艺，就可以实现糊化、液化和糖化的同步发酵，省却pH调整、钙离子添加、减少升温和制冷带来的能耗问题。

对耐酸性α-淀粉酶的需求的另一个原因是，在于酸性操作条件下，可以充分的减少淀粉降解过程中的副产物，如麦芽酮糖和潘糖等，降低色素物质的生成。研究表明在pH 4.5时，酸-、碱和水催化葡萄糖重排的总速率最小，造成的副产物生成是最少的，而目前工业上应用的淀粉酶的活性和热稳定性在pH6-7之间最高，所以必须平衡这两种pH值，以最小化结构重排和酶的失活，同时最大化酶活力，减少后续工艺的葡萄糖和果糖的产量的损失（Antrim RL:Industrial enzymes.In:Enzymes in industry:Production and application.Edited by Aehle W,3rdedn.Weinheim:WILEY-VCH Verlag GmbH and Co.KGaA;2007:193-263.）。

对α-淀粉酶的不依赖钙离子性的需求原因还在于，虽然钙离子对淀粉水解的α-淀粉酶的稳定性和/或活性非常必要，但是钙离子能够抑制葡萄糖异构酶的活性，因此在将进入产品工艺前葡萄糖异构化为果糖的葡萄糖异构酶步骤前，添加的钙离子必须通过离子交换树脂进行取出。

围绕着耐酸、耐温、不依赖钙离子的α-淀粉酶的开发，人们已经从来源菌株的筛选和借助于蛋白质工程技术改造α-淀粉酶的特性方面开展了工作。例如，目前筛选到的产耐酸α-淀粉酶的菌种主要包括来源于Bacillus sp.YX-1（Liu XD,Xu Y:A novel raw starch digestingalpha-amylase from a newly isolated Bacillus sp.YX-1:purification and characterization.Bioresour Technol 2008,99(10):4315-4320.），Bacillus subtilis X-23（Ohdan K,Kuriki T,KanekoH,Shimada J,Takada T,Fujimoto Z,Mizuno H,Okada S:Characteristics of two forms ofalpha-amylases and structural implication.Appl Environ Microbiol1999,65(10):4652-4658.），Lactobacillus manihotivorans LMG18010（Aguilar G,Morlon-Guyot J,Trejo-Aguilar B,GuyotJP:Purification and characterization of an extracellular alpha-amylase produced by Lactobacillusmanihotivorans LMG18010(T),an amylolytic lactic acid bacterium.Enzyme Microb Technol2000,27(6):406-413.），Alicyclobacillus acidocaldarius（Matzke J,Schwermann B,Bakker EP:Acidostable and acidophilic proteins:the example of the alpha-amylase from Alicyclobacillusacidocaldarius.Comp Biochem Physiol A Physiol1997,118(3):475-479.）和Pyrococus furious（Dong G,Vieille C,Savchenko A,Zeikus JG:Cloning,sequencing,and expression of the geneencoding extracellular alpha-amylase from Pyrococcus furiosus and biochemical characterizationof the recombinant enzyme.Appl Environ Microbiol1997,63(9):3569-3576.）。筛选到的不依赖钙离子α-淀粉酶产生菌株主要有Bacillus sp.KR-8104（Sajedi RH,Naderi-Manesh H,Khajeh K,Ahmadvand R,Ranjbar B,Asoodeh A,Moradian F:A Ca-independentα-amylase that is active andstable at low pH from the Bacillus sp.KR-8104.Enzyme Microb Technol2005,36:666-671.）和Alkaliphilic Bacillus KSM-K38（Hagihara H,Igarashi K,Hayashi Y,Endo K,Ikawa-Kitayama K,Ozaki K,Kawai S,Ito S:Novel alpha-amylase that is highly resistant to chelating reagents andchemical oxidants from the alkaliphilic Bacillus isolate KSM-K38.Appl Environ Microbiol2001,67(4):1744-1750.）。

借助于定向进化技术提高现有商品化α-淀粉酶的耐酸性、降低钙离子依赖性方面也取得了一些进展。Show和Day通过易错PCR和DNA shuffling相结合的方法提高了地衣芽胞杆菌α-淀粉酶在酸性条件下的活性（Shaw A,Bott R,Day AG:Protein engineering ofalpha-amylase for low pH performance.Curr Opin Biotechnol1999,10(4):349-352.）。Nielsen等探讨了BLA活性随pH变化的决定因素（Nielsen JE,Borchert TV,Vriend G:The determinants ofalpha-amylase pH-activity profiles.Protein Eng2001,14(7):505-512.）。Liu等通过引入两个突变L134R/S320A将BLA在pH4.5条件下的催化效率提高14倍，同时大大提高了较低pH值下的耐受性。耐酸性实验和结构特征研究表明，静电效应在BLA在134和320位点发挥了中至关重要的作用（Liu YH,Lu FP,Li Y,Wang JL,Gao C:Acid stabilization of Bacilluslicheniformis alpha amylase through introduction of mutations.Appl Microbiol Biotechnol2008,80(5):795-803.）。然而，同时满足适合于工业用途的不依赖钙离子、耐酸、耐温的耐酸α-淀粉酶是仍需要解决的问题。

本申请人（广西科学院）筛选得到一株产耐酸、不依赖钙离子α-淀粉酶的中温枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CN7，该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M2012061，其所产α-淀粉酶粗酶液最适pH4.6，最适温度53°C，pH3.0～10.0可以保持良好的活性，该结果发表在《中国酿造》2009年第12卷上（秦艳,王青艳,陆雁,杨建,黄日波:酸性α-淀粉酶生产菌株的筛选及酶学性质研究.酿酒科技2009,12:17-19.），同时克隆并异源表达了该酶的预测的成熟肽α-淀粉酶基因（删除了N-端33氨基酸），重组成熟肽表现的最适温度为65°C，最适pH在pH6.0～6.5之间，结果发表在《微生物学通报》2010年37卷10期上（杨键,王青艳,金辉,秦艳,王成华,黄日波:一种不依赖钙离子的酸性alpha-淀粉酶基因的克隆表达.微生物学通报2010,7(10):1427-1431.），相关的序列及基因已提交GenBank，登陆号分别为JN980090和JQ045771。Bacillus subtilis CN7所产耐酸、不依赖钙离子的中温α-淀粉酶表现出的耐受pH4.5，不依赖钙离子特性以及最适温度65°C，对于上文提及的糊化、液化和糖化的同步发酵，及省却pH调整、钙离子添加、减少升温和制冷带来的能耗问题，展示了良好的应用前景。但是，需要进一步提高α-淀粉酶的耐温性和催化效率、降低最适pH，对于提高α-淀粉酶的利用率，提高淀粉水解效率，进而缩短生产周期，降低生产成。

发明内容

本发明的目的是提供一种α-淀粉酶的截断体及其应用，该变体酶可用高效降解淀粉，并可用于构建高效降解淀粉的宿主菌，所述变体酶的比活力最高提高2.2倍，转化数最高提高1.20倍，催化效率最高提高42%，半衰期温度提高2.7°C，最适pH降低一个单位。

本发明通过以下技术方案达到上述目的：一种α-淀粉酶的截断体及其应用，通过对亲本α-淀粉酶的截断和融合额外的多肽，获得催化活性提高、耐温性提高、最适pH降低的变体酶。

所述的亲本α-淀粉酶来源于中温枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CN7，保藏号为CCTCC M2012061，保藏日期为2012年3月7日，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码基因为SEQ ID NO:2所示，其在GenBank的登录号为JQ045771。从Bacillus subtilis CN7中分离纯化出的亲本α-淀粉酶具有如下的特征：

1、分子量约为67kDa；2、等电点PI值约为5.30；3、酶的最适反应温度为65°C，在60°C-70°C范围内均可保持90%以上的活力；4、酶的半衰期温度为59.6°C；5、酶的最适pH值为6.0～6.5，在pH4.5～7.0两者均可保持80%以上的活力；6、酶的反应活性不受包括Ca²⁺（10mol/L）和EDTA（1～100mmol/L）影响；7、在最适pH6.5和最适温度65°C条件下，对可溶性淀粉的K_m值为3.44±0.42g/L，转化数为1024.05±48.5s^-1，比活力为905.99±96.52U/mg；8、酶对可溶性淀粉的完全降解产物主要为葡萄糖和麦芽糖，含有少量的麦芽四糖，基本不含麦芽三糖和麦芽五糖。

本发明所述构建α-淀粉酶的截断体的方法，包括如下步骤：

1）建立目的酶的理论模型，限于解析蛋白质晶体结构的困难，本发明立足于建立计算机理论模型的方法，对目的酶进行结构的研究；目前，有大量的免费网站及商品化软件可以用来对目的氨基酸序列进行理论模型的建立，例如基于同源建模的SwissModel服务器（http://swissmodel.expasy.org/），如M4T服务器（http://manaslu.aecom.yu.edu/M4T/），I-TASSER服务器（http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/）等；因为本发明中α-淀粉酶基因与GenBank中已公布的α-淀粉酶基因具有很高的同源性，而且其氨基酸序列与晶体结构1BAG中氨基酸序列同源性约为90%，所以本发明选用SwissModel服务器，建立同源理论模型；

2）基于结构的序列比对，选择具有代表性的α-淀粉酶的晶体结构，与1）中建立的理论结构进行结构比对（Superimpose），确定对底物结合、稳定结构和催化活性相关的氨基酸残基，及功能保守区域，选择可以截断的部位；本发明以1BAG（模板晶体结构）和1BLI（商业上广泛采用的地衣芽胞杆菌的α-淀粉酶的结构）为参照酶，借助于Mammoth服务器(http://physbio.mssm.edu/～ortizg/)、和/或MOE（Molecular Operating Environment，ChemicalComputing Group公司）和/或Swiss-Pdb Viewer软件，进行结构叠合，寻找对结构和功能重要的结构区域及选择可以截断的位置；

3）对截断及引入融合多肽造成的α-淀粉酶结构的扰动进行评估，对截断体或者引入如何多肽后的氨基酸序列重新建立理论模型，并借助于上面的MOE工具进行能量最小化，同时借助于分子动力学软件如Amber等对所实施改造对蛋白质结构的影响进行评估。

本发明所述构建α-淀粉酶的截断体的另一技术方案是删除亲本α-淀粉酶N端44个信号肽的成熟α-淀粉酶（Amy7M），通过亚克隆其编码基因，以pSE380质粒为表达载体构建了重组表达质粒pSA7M，然后转化进大肠杆菌JM109构建了工程菌JA7M，JA7M在IPTG的诱导下表达重组酶，而后通过酶的纯化表征和酶解产物分析等复杂的实验步骤，鉴定获得了酶学性质改善的截断体酶。以稀碘法测定的酶学性质除保留了与亲本α-淀粉酶相同的最适pH、pH耐受性和最适温度65°C及温度耐受性，保留了不依赖钙离子特性和基本相同的底物亲和力和酶解产物，但是比活力为1694.70U/mg，转化数为1.97g.μmol^-1.s^-1，催化效率为0.52L/μmol/s。以下α-淀粉酶的变体的酶学性质表征均以Amy7M的酶学参数为参考，并以该稀碘法测定的该成熟肽的酶学性质为亲本α-淀粉酶的酶学性质。

本发明所述构建α-淀粉酶的截断体的再一技术方案是同时删除N端44个氨基酸残基和C端194个氨基酸残基的截短体Amy7D，采用与Amy7M相同的构建步骤，构建重组质粒pSA7D和含有pSA7D的工程大肠杆菌JA7D，并采用同样的表征方法，鉴定出的Amy7D的酶学性质与Amy7M基本相同，即具有相同的最适温度65°C、最适pH6.5和耐酸特性、酶解产物谱基本相同，但是表征温度耐受性的半数期温度提高2.7°C，同时Amy7D的比活力、转换数和催化效率，分别为3524.97U.mg^-1、2.74g.μmol^-1.s^-1和0.74L/μmol/s，分别为Amy7M的2.08倍和1.39倍和1.42倍。

本发明所述构建α-淀粉酶的截断体的另一技术方案是在Amy7D截断体的N端融合了由“His-tag-连接肽-肠激酶位点”组成的小肽，其氨基酸组成为HHHHHHGSGSGDDDDKA，所形成的变体α-淀粉酶Amy7E，与Amy7D相比，最适pH值酸移一个单位，从pH6.5降低为pH5.5，同样pH耐受范围从pH4.5-pH7.5变窄为pH4.5-pH6.5。

本发明的另一个α-淀粉酶变体，其在截断体Amy7D的N端融合一个6xHis纯化标签得到Amy7N，保留了与Amy7D同样的最适温度、最适pH和底物代谢谱，但是获得了更加优良的酶催化特性，其比活力为4714.67U/mg、转化数为3.73g/μmol/s、催化效率为0.60L/μmol/s，分别为亲本Amy7M的2.78倍、1.89倍和1.15倍。

本发明的另一个α-淀粉酶变体是采用与Amy7N相同的截断与融合策略，将组氨酸标签融合在Amy7D的C端，得到的变体α-淀粉酶Amy7C，表征结果表明Amy7C与Amy7N相似，保留了与Amy7D同样的最适温度、最适pH和底物代谢谱，但是获得了更加优良的酶催化特性，其比活力为5472.12U/mg、转化数为4.33g/μmol/s、催化效率为0.65L/μmol/s，分别为亲本Amy7M的3.23倍、2.20倍和1.25倍。

所获得变体α-淀粉酶在淀粉降解和含淀粉材料处理中的应用，主要包括淀粉液化、液化淀粉的糖化、纺织品脱浆、造纸和纸浆工业中的淀粉修饰、酿造、乙醇生产和烘焙，尤其是用于淀粉工业中新型同步糊化、糖化和液化新工艺的开发中的应用。另外，还包括用于生产麦芽糊精的方法，其通过将变体α-淀粉酶与淀粉或淀粉水解物一起温浴，从而水解淀粉或淀粉水解物中的α-1,4糖苷键。

本发明与已有技术相比，具有以下实质性特点和显著的进步：

1．本专利公开的截断体在保留亲本α-淀粉酶的不依赖钙离子特性、最适反应温度和最适pH的同时，获得了更大的催化效率和热稳定性，与亲本α-淀粉酶（Amy7M）相比，半衰期温度提高2.7°C、比活力提高了2.23倍（Amy7C）、转化数提高了1.20倍（Amy7C），催化效率最高提高42%（Amy7D）。需要指出的是，Ohdan等（Ohdan K,Kuriki T,Kaneko H,Shimada J,Takada T,Fujimoto Z,Mizuno H,Okada S:Characteristics of two forms ofalpha-amylases and structural implication.Appl Environ Microbiol1999,65(10):4652-4658.）通过对Bacillus subtilis X-23中不同形态α-淀粉酶的研究，指出截断体形式的α-淀粉酶具有改善的热稳定性和比活力，但是转化数和催化效率基本不变。本发明采取不同的、更短的截取方法，同时通过融合小肽，在提高热稳定性和比活力的同时，大大提高了比活力、转化数和催化效率，远远超越了Ohdan等的报道。这种增加的耐温性和催化效率，将更加有利于工业生产。

2．本发明提出基于α-淀粉酶结构比对，结合功能分析与分子动力学模拟设计截断体位点，并通过添加人工合成肽提高截断体的稳定性、催化活性、耐酸性等酶学性质，分别得到了耐温性提高2.7°C、催化活性提高2.23倍、最适pH降低一个单位的α-淀粉酶变体。作为一种常用技术，本专利所提出并采用的多肽融合及酶的截断技术，与已有技术间存在着明显的不同之处。

公开号CN1233286A（申请号97198640.1，国际申请PCT/DK97/00448，国际公布WO98/16633，诺沃挪第克公司）构建了α-淀粉酶与纤维素结合域等糖类结合结构域（CBD）融合（共价连接）以用于淀粉降解，提高生淀粉的降解活性；专利要求所融合CBD的氨基酸分子量位于4kD到约40kDa之间，通过2-100个氨基酸残基的接头，连接于目的酶的N端或C端或内部。实施例中报道了内切葡聚糖酶的45个氨基酸组成的纤维素结合结构域（CBD_CenA）和粪肥纤维单孢菌内切葡聚糖酶A（CenA）的103个残基CBD_CenA与Termamyl的连接，其中酶活提高最多的是，带CBD_CenA-Termamyl比Termamyl的液化效果（以75g NU酶/克DS，液化90分钟计）的提高了49.5%（DE值从10.3提高到15.4）。

公开号CN102016044A（申请号200980115639.1，PCT/US2009/041498,WO2009/134670，丹尼斯科美国公司）描述了将AmyL淀粉酶N端部分约180个或更多连续的氨基酸残基的氨基端结构域与AmyS淀粉酶的羧基端结构域融合、形成长度为480-515个氨基酸的嵌合多肽，获得了高稳定性和良好淀粉降解性能的嵌合α-淀粉酶。同样，WO96/23874A1公开了地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis），解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）和液化淀粉芽孢杆菌（B.stearothermophilus）α-淀粉酶的嵌合体（hybrid），WO03/014358A2公开了B.licheniformis和B.amyloliquefaciens特殊的α-淀粉酶杂合体。

公开号CN1329665A（申请号99814205.0，国际申请PCT/DK99/00686，国际公布WO00/34452）通过N末端肽延伸区（包括1-100氨基酸残基，优选1-50氨基酸残基，更优选1-20AA，甚至更优选1-10AA）改良具有葡糖淀粉酶活性的酶的特性，尤其是通过将一个或更多的保守氨基酸残基加到所述亲本（成熟）葡糖淀粉酶的N末端改良了所述酶的热稳定性。

公开号CN1560242A（申请号200410049560.2，优先权JP163569/1999，花王株式会社）氨基端起11-110氨基酸序列置换为另一种液化α-淀粉酶对应于该氨基酸残基序列的氨基酸序列。并没有具体的实施例数据。

公布号CN102112621A（申请号200980130315.5，PCT/US2009/046279,WO2009/149271，丹尼斯科美国公司）描述了枯草芽孢杆菌的α-淀粉酶（AmyE）全长及成熟肽形式的N端/C端添加便于表达、检测和/或纯化的序列如信号序列或His标签。但并未见通过融合标签对活力的影响报道。文中还提及全部或部分C端淀粉酶结合域序列缺失的“截短”AmyE（“AmyE-tr”），但同样没有给出明确的仪器测量数据。

可以看出，公开号CN1233286A、CN102016044A、WO03/014358A2和WO96/23874A1通过完整结构域的融合，通常是比较大的肽段，达到提高酶的催化活力和/或热稳定性的效果。公开号CN1329665A提出通过N末端肽延伸区添加一个或更多的保守氨基酸残基来提高热稳定性。公开号CN1560242A提出置换氨基末端11-110氨基酸为另外一种液化α-淀粉酶对应氨基酸残基的思想，但没有具体实施例数据。与以上这6个专利均通过引入额外的肽段，以达到提高热稳定性或/和催化活性的目的不同，本专利通过截断提高了比活性、催化活性和热稳定性。而公布号CN102112621A提出在成熟肽或者全长α-淀粉酶N端和/或C端引入便于表达、检测和/或纯化的序列如信号序列或His标签，并及全部或部分C端淀粉酶结合域序列缺失的“截短”AmyE（“AmyE-tr”），但是均有给出明确的仪器测量数据，也并未将所提出的截断和添加组氨酸标签用于提高酶活或者催化活力目的。本专利提出并用实验证实了截断和添加组氨酸标签及其他短肽标签用于提高α-淀粉酶的催化活力、热稳定性和最适pH值等酶学性质，并且这些酶学性质的改善远远超越了已有的报道。

附图说明

图1是重组截断体α-淀粉酶的SDS-PAG电泳图。

图中标记为：A、1-纯化的截断体Amy7M；2-蛋白质标准样品；3-纯化的截断体Amy7D；4-纯化的截断体Amy7C；5-纯化的截断体Amy7N；B、1-诱导表达的工程菌JA7E；2-蛋白质标准样品；3-诱导表达的工程菌JA7E；4-含空质粒pSE380的JM109；5-纯化的截断体Amy7E；6-纯化的截断体Amy7E。

图2是重组截断体α-淀粉酶酶活随温度变化图。

其中●代表Amy7M，■代表Amy7D，▲代表Amy7C，▼代表Amy7N，◆代表Amy7E。

图3是重组截断体α-淀粉酶酶活随pH变化图。

图4是重组截断体α-淀粉酶Amy7C酶解可溶性淀粉浆的HPLC检测图。

图中标记为：A、可溶性淀粉浆在pH4.5和65°C糊化图；B、Amy7C同步糊化液化图；C、Amy7C同步糊化液化糖化图；D、Amy7C同步糊化糖化图。其中，1-糊精；2-麦芽四糖；3-麦芽三糖；4-麦芽糖；5-葡萄糖。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步描述。

实施例1

本实施例说明亲本酶的纯化、纯化酶的表征及酶解产物分析方法

1、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CN7的培养

枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CN7分离自广西大学农场土样，菌种保藏于本实验室，同时提交中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M2012061。培养基为液体LB加1%可溶性淀粉，每升培养基中含蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，可溶性淀粉10g。固体培养基为上述液体培养基加入1.5%的琼脂。取保存于-80°C的冻存管原始菌种一管，用接种环取菌体在固体培养基平板上划线，于37°C培养箱中培养过夜，挑取单菌落接种于液体培养基中，置于37°C和220r/min恒温摇床振荡培养10小时，而后按照1%接种量再转接一次，于同样的培养条件下培养12小时，所得菌体用于提取总DNA，上清液用于纯化原始酶液。

2、亲本α-淀粉酶的纯化

发酵液中α-淀粉酶的回收纯化按照“加热除杂-超滤浓缩-硫酸铵沉淀-透析除盐-层析分离-超滤浓缩并换缓冲液”五步操作流程进行：

第一步，将1L发酵培养液于4°C、9000r/min转速下离心10min除去菌体,上清液于50°C水浴中温浴30min后，于4°C、9000r/min转速下离心30min除去变性的杂蛋白；

第二步，借助于Pall公司Minimate^TMTFF系统，采用截留量为10kDa的超滤膜（Omega^TM10K），将1L上清液浓缩至50mL，操作按照操作说明书进行；

第三步，将浓缩液进行硫酸铵分级沉淀，将饱和度为40%和80%间的沉淀物，用30mL0.05mol/L磷酸-柠檬酸缓冲液（pH6.5）重新溶解，装载于截留量为10kDa的透析袋中，于同样的缓冲液中透析24h，中间更换缓冲液两次，然后用PEG20000浓缩至4mL，整个透析操作在4°C下完成；

第四步，借助于AKTA蛋白纯化系统，将4mL浓缩样品，通过Sephacryl S300分子筛层析分离，其中柱子规格为2.5cm x80cm，操作流速为1mL/min，流动相采用0.05mol/L磷酸-柠檬酸缓冲液（pH6.5）加入0.2mol/L NaCl，按4.5mL体积分段收集洗脱液；

第五步，将各具有α-淀粉酶的分段收集液，分别置于分子截留量为10kDa的Millipore超滤管中，于4°C、3500r/min转速下离心浓缩，获得溶解于1mL0.05mol/L磷酸-柠檬酸缓冲液（pH6.5）的纯化酶液。

纯化蛋白的纯度和均一性通过SDS-PAGE进行检验，蛋白的含量通过Bradford法，以BSA为标准蛋白进行检测。

3、淀粉酶酶活的测定

本专利采用两种方法检测α-淀粉酶的酶活。

第一种检测方法是稀碘法，又称碘-淀粉法。该检测方法基于淀粉遇碘变蓝的反应原理，通过检测淀粉底物的吸光度值的变化，来测定α-淀粉酶代谢淀粉的能力。参照《中国食品工业标准汇编-发酵制品卷（上）》（第二版）（QB/T2306-1997,耐高温α-淀粉酶制剂）检测方法。500μl反应体系中含0.5%可溶性淀粉，0.05mol/L磷酸-柠檬酸缓冲液（pH6.5）及50μl适当稀释的α-淀粉酶酶液（约1μg/mL）。反应液于65℃水浴中，反应5min，加入250μl稀盐酸（0.1mol/L）和2.5ml稀碘液，于600nm处检测吸光值。酶活定义为，在65℃、pH6.5（0.05mol/L磷酸-柠檬酸缓冲液）条件下，1min液化1mg可溶性淀粉成为糊精所需要的酶量，即为1个酶活力单位，以U表示。

第二种检测方法采用3,5－二硝基水杨酸（DNS）法。在碱性条件下，还原糖和3,5-二硝基水杨酸共热后，产生一种棕红色氨基化合物。在一定浓度范围内，该棕红色物质在540nm波长处吸光度与还原糖的量成线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。500ul反应体系中含1%可溶性淀粉，0.05M磷酸-柠檬酸缓冲液（pH6.5）及50μl适当稀释的α-淀粉酶酶液。反应液于65℃水浴中，反应5min，加入375ul DNS反应液，于沸水浴中反应5min后，于540nm处检测生成的还原糖量。一个酶活力单位（U）定义为，在65℃、pH6.5（0.05mol/L磷酸-柠檬酸缓冲液）条件下，1min液化可溶性淀粉生成1μmol还原糖所需要的酶量。

4、酶学参数的测定

最适pH测定：参照3中淀粉酶酶活测定方法，分别用pH2.5到pH8.5的0.05mol/L磷酸-柠檬酸缓冲液构建1.2.3中所述500μL反应体系，相对活力最高的缓冲体系pH值即为最适pH。

最适温度T_m：参照3中方法，分别将标准反应体系置于50～95°C反应，最高反应活力所对应的温度值即为T_m。

K_m和k_cat值：采用双倒数法，测定底物浓度分别为0.4～9g/L条件下的最初反应速度，推导出米氏常数K_m（单位为g/L），催化数k_cat（单位为s^-1）和催化效率值k_cat/K_m（单位为L/g/s）。

半衰期温度

分别将纯化酶液于50～80°C条件下热处理30min，于4°C放置2h后检测残余酶活，相对酶活丧失50%时所对应的处理温度即为

值。

5、金属离子和EDTA的影响

纯化酶液分别与金属离子（1mmol/L和5mmol/L）或者EDTA（1mmol/L-100mmol/L）于4°C放置2h后，按照3中方法检测残余酶活。

6、酶解产物的HPLC分析

2mL酶解反应体系中含有1%可溶性淀粉，0.05mol/L磷酸-柠檬酸缓冲液（pH6.5），2U纯化酶液（约1μg/mL）。反应体系于50°C水浴中，反应24h。于沸水浴中10min终止反应后，于4°C，12000r/min离心5min，上清液通过0.22μm滤膜过滤，过滤液通过酸柱AminexHPX-87H（Bio-Rad，USA）进行HPLC检测。检测条件为，RI温度50°C，流速0.5mL/min,流动相为5mmol/L硫酸。

实施例2

本实施例说明全长α-淀粉酶基因的克隆与分析、重组质粒的构建与表达、重组酶的纯化

1、全长α-淀粉酶基因的克隆与重组质粒的构建

参照《分子克隆实验指南》（萨姆布鲁克,拉塞尔.分子克隆实验指南[M].北京:科学出版社,2002.），提取Bacillus subtilis CN7总DNA，以此总DNA为模板，以引物Amy7-S和Amy7-A，PCR扩增全长为1980bp的完整α-淀粉酶基因amy7，引物序列如下：

Amy7-S：5'-GTATCATGATGTTTGAAAAACGATTCAAAAC-3'

Amy7-A：5'-GCGAAGCTTAATCAATGCGGAAGATAACCATTC-3'

为操作方便分别在上游引物Amy7-S中引入Pag I酶切位点（下划线部分），在下游引物Amy7-A中引入Hind III酶切位点（下划线部分）。

25μL PCR反应体系的构建如下：1μL总DNA，0.5μL上游引物Amy7-S（浓度为10mmol/L），0.5μL下游引物Amy7-A（浓度为10m mol/L），2μL dNTPs（每样dNTP2.5mmol/L），5μL5x

buffer，0.25μL(2.5U/μL)

DNA聚合酶，加入16.75μLddH₂O补足至25μL。体系混匀后置于PCR以上执行扩增反应。PCR反应程序如下：

第一步：95°C3分钟；第二步：98°C10秒，68°C2分钟，如此循环30次；第三步：72°C10分钟。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳，经过紫外检测目的产物后，经过Pag I和Hind III双酶切后胶回收，回收片段与经过Nco I和Hind III双酶切回收的pSE380质粒载体片段，进行连接反应，连接产物转化JM109感受态细胞。转化细胞涂布与含有氨苄青霉素（100ng/μL）的LB固体培养平板上进行筛选，阳性克隆委托上海生工进行DNA测序验证，分析克隆到的基因及读码框情况。验证正确的基因即为Bacillus subtilis CN7α-淀粉酶基因，记为amy7，将验证正确的重组子命名为pSA7，重组质粒pSA7转化的大肠杆菌JM109，记为JA7

2、α-淀粉酶基因的分析

基因amy7的序列分析通过Vector NTI10.0程序完成，序列相似性分析通过Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)完成。蛋白质结构域分析借助于PFAM tools(http://pfam.sanger.ac.uk/)信号肽的预测借助于SignalP3.0服务器^[8](http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)。Amy7的理论晶体结构通过SwissModel服务器完成（http://swissmodel.expasy.org/），并通过Pymol程序展示(The PyMOL Molecular GraphicsSystem,Version0.99rc6,DeLano Scientific LLC.)结构比对借助于Mammoth server完成。

3、含重组质粒工程菌株的诱导表达与纯化

挑取JA7单菌落，接种于5ml含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养液（酵母膏10g/L，蛋白胨5g/L，氯化钠10g/L，自然pH），于37°C、220r/min条件下培养过夜。将过夜培养之菌液，按照1%的接种量转接于100ml含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养液中。待菌液培养至OD₆₀₀为0.6左右，加入终浓度为1mmol/L的IPTG诱导剂，同样条件下继续诱导培养16h。

于9000r/min、4°C离心收集诱导表达的工程菌，沉淀用0.05mol/L磷酸-柠檬酸缓冲液（pH6.5）洗涤一次后，重悬于同样的缓冲液中，菌悬液于超声波400W、工作/间歇时间8s/8s下超声破胞25min，破胞液于12000r/min4°C下离心30min，上清液为粗酶液，接下来采用与实施例1中2、亲本α-淀粉酶的纯化相同的纯化方法纯化重组酶Amy7。

实施例3

本实施例说明截断体α-淀粉酶的构建与纯化

1、截断体α-淀粉酶的构建

以Amy7M-S和Amy7M-A为引物，以Bacillus subtilis CN7总DNA为模板，采用与实施例1中1、全长α-淀粉酶基因的克隆与重组质粒的构建相同的方法，构建含有截断Amy7M编码基因的重组质粒pSA7M，引物序列如下：

Amy7M-S5`-GACTCATGAGCTCGGTCAAAAACGGGACCATC-3`

Amy7M-A5`-GTACAAGCTTATGCGGAAGATAACCATTCAAA-3`

上游引物Amy7M-S中引入Pag I酶切位点（下划线部分），在下游引物Amy7M-A中引入Hind III酶切位点（下划线部分）。

以引物Amy7D-S和Amy7D-A为引物，以Bacillus subtilis CN7总DNA为模板，采用与实施例1中1、全长α-淀粉酶基因的克隆与重组质粒的构建相同的方法，构建含有截断Amy7D编码基因的重组质粒pSA7D，引物序列如下：

Amy7D-S5`-GTATCATGAGCTCGGTCAAAAACGGGACCATC-3`

Amy7D-A5`-GCGAAGCTTAATCATCAGGATAAAGAACAGCCGC-3`

上游引物Amy7D-S中引入Pag I酶切位点（下划线部分），在下游引物Amy7D-A中引入Hind III酶切位点（下划线部分）。

采用一步快速PCR方法，以质粒pSA7D为模板，构建含截短体Amy7E、Amy7C和Amy7N基因的重组质粒pSA7E、pSA7C和pSA7N。构建pSA7E的引物为：

Amy7E-S5`-TATCATGAGCCACCATCATCATCATCATGGTTCTGGTTCT

GGTGACGACGACGACAAGGCCATGGGATCCTCGGTCAAAAA

CGGGACCATC-3`（下划线部分为His-tag-连接肽-肠激酶位点）

Amy7E-A5`-GCGGAATTCTTAATCATCAGGATAAAGAACAGCCGC-3`；

构建pSA7C的引物为：

Amy7C-S：5`-CACCACCACCACCACCACTAAGCTTGGCTGTTTTGGCGG-3`

Amy7C-A：5`-GCCAAGCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGATCATCAGGATAAAGAACAG-3`

构建pSA7N的引物为：

Amy7N-S：5`-ACCATGCACCATCATCATCATCATAGCTCGGTCAAAAACGGGAC-3`

Amy7N-A：5`-ATGATGATGGTGCATGGTCTGTTTCCTGTGTGAAATTG-3`

以上划线部分为编码互补且编码组氨酸的密码子。

25μL PCR反应体系的构建如下：1μL pSA7D质粒DNA，0.5μL上游引物Amy7-S（浓度为10m mol/L），0.5μL下游引物Amy7-A（浓度为10m mol/L），2μL dNTPs（每样dNTP2.5mmol/L），5μL5x

buffer，0.25μL(2.5U/μL)DNA聚合酶，加入16.75μL ddH₂O补足至25μL。体系混匀后置于PCR以上执行扩增反应。

PCR扩增条件均为：第一步：95°C3min；第二步：98°C10s，68°C5min40s，如此循环30次；第三步：72°C10min。

各PCR产物分别经Dpn I（购自加拿大Fermentas公司）37°C消化2h，消化产物于80°C失活20min后，直接转化大肠杆菌JM109感受态细胞，转化产物在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上培养过夜，挑取单菌落接种于含100μg/mL氨苄青霉素抗性的液体LB培养液中培养，提取质粒委托上海生工测序验证。验证所得截断体质粒均正确。将含有pSA7E、pSA7C和pSA7N的工程大肠杆菌分别命名为JA7E、JA7C和JA7N。

2、截断体α-淀粉酶的表达与纯化

采用与实施例2中3、含重组质粒工程菌株的诱导表达与纯化相同的诱导表达方法，经过超声离心后，分别得到了含Amy7E、Amy7C和Amy7N的粗酶液。

上清液加入终浓度为300mmol/L的NaCl和5mmol/L的咪唑，用0.22μm滤膜过滤所得透过液直接用Ni-NTA柱纯化重组淀粉酶。纯化所得酶液，通过分子截留量为10KDa的Millipore超滤管，反复换洗缓冲液两次，以除去盐分及咪唑成份。镍柱纯化操作过程参照操作手册进行。纯化蛋白的纯度和均一性通过SDS-PAGE进行检验，蛋白的含量通过Bradford法，以BSA为标准蛋白进行检测。各截断体纯化结果如图1所示。

实施例4

本实施例说明α-淀粉酶变体的纯化及酶活分析

采用实施例2和实施例3中方法，对亲本α-淀粉酶、各截断体α-淀粉酶Amy7M、Amy7C、Amy7D、Amy7N和Amy7E进行纯化，所得各纯化酶液经SDS-PAGE检测结果如图1所示，可见均得到了电泳纯的条带。

采用实施例1中酶活测定方法，对各纯化酶液的酶学性质进行表征，其最适pH如图2所示，最适温度如图3所示，各酶学参数如表1所示。可见各截短体保留了亲本酶的最适pH和最适温度，但是分别得到了耐温性提高2.7°C、催化活性提高2.23倍、最适pH降低一个单位的α-淀粉酶截断变体。

表1纯化的截短体α-淀粉酶酶催动力学参数

^a转化数用在测定条件下每μmolα-淀粉酶在每秒钟内催化降解可溶性淀粉的质量表示，单位为g.μmol^-1.s^-1。

实施例5

本实施例说明金属离子和EDTA对各截断体α-淀粉酶的影响

采用实施例1中5、金属离子和EDTA的影响测定方法，测定的各截断体α-淀粉酶受金属离子和EDTA的影响结果如表2所示。从表2可见，各截断体α-淀粉酶变体对包括钙离子在内的各金属离子和EDTA的反应基本一致，各α-淀粉酶酶活均不受钙离子和EDTA的影响。

表2金属离子和EDTA对截短体α-淀粉酶酶活影响

实施例6

本实施例说明截断体α-淀粉酶在水解淀粉上的应用及产物谱的HPLC检测

对制备于50mmol/L磷酸-柠檬酸缓冲液中的（pH6.5）中的1%可溶性马铃薯淀粉（质量百分比）进行酶解产物谱分析。取10g可溶性马铃薯淀粉加入少量水调浆后，加入60mL磷酸-柠檬酸缓冲液（pH6.5，50mmol/L）中，继续煮沸3min，加同样的缓冲液定容至100mL，配制成2%底物溶液。按0.1mg酶/干物质的量，向1mL底物溶液中加入实施例3和实施例4所制备的纯化的酶液，构建含1%淀粉和2U纯化酶液（约1μg/mL）的2mL酶解反应体系。反应体系于50°C水浴中，温浴24h。将样品置于沸水浴中10min以终止酶反应，于4°C，12000r/min离心5min，上清液通过0.22μm滤膜过滤，过滤液通过酸柱Aminex HPX-87H（Bio-Rad，USA）进行HPLC检测。检测条件为，RI温度50°C，流速0.5mL/min,流动相为5mmol/L硫酸。检测结果表明：截断体α-淀粉酶水解可溶性淀粉的终产物最大部分主要有葡萄糖（DP1）和麦芽糖（DP2）组成，除Amy7E的最大组份为麦芽糖，且两者所占比例约为60%外，其他变体α-淀粉酶的最大组份均为葡萄糖，且DP1和DP2占到所有组成的80%左右；除具体组份存在一定的差异外，其余包括麦芽三糖（DP3）、麦芽四糖（DP4）和麦芽五糖（DP5）及更高的寡糖含量均很少。具体结果可见下表3。各变体α-淀粉酶水解淀粉生成包括DP1和DP2在内的高比例的低分子量多糖的特性，在生产淀粉糖类及麦芽糊精的应用中具有优势。

表3纯化的截短体α-淀粉酶降解可溶性淀粉产物短链终产物组份

实施例7

本实施例说明截断体α-淀粉酶在新型糊化、液化和糖化工艺上的应用

对制备于天然水溶液中的1%可溶性淀粉（质量百分比）在65℃条件下进行同步糊化和液化的酶解产物进行分析。取30g马铃薯可溶性淀粉加入蒸馏水调制为质量百分比为3%的淀粉浆，按照0.03mg酶/g干物质的量，向淀粉浆中加入实施例3和实施例4所制备的纯化的酶液，进行同步糊化液化实验。在与上述相同的3%可溶性淀粉中、同时加入0.03mg酶/g干物质的量的截断体α-淀粉酶酶液和0.02mg酶/g干物质的量的糖化酶AMG（诺维信公司），构建同步糊化液化糖化实验体系。同时设置一个仅含有3%可溶性淀粉浆的糊化对照实验，和一个在3%可溶性淀粉浆按照0.5mg糖化酶AMG/g干物质的量添加过量糖化酶进行对照试验。将所构建反应体系置于65℃水浴摇床中温浴3h，搅拌速度为150r/min。分别于0h、0.5h、1h、2h和3h时取2mL反应液样品，于4°C，12000r/min离心5min，上清液通过0.22μm滤膜过滤，取20μL过滤液通过酸柱Aminex HPX-87H（Bio-Rad，USA）进行HPLC检测。检测条件为，RI温度50°C，流速0.5mL/min,流动相为5mmol/L硫酸。实验结果如下图4所示，其中图4A为糊化实验、图4B为同步糊化液化实验、图4C为同步糊化液化糖化实验、图4D为同步糊化糖化对照试验。可见，可溶性淀粉在65℃可以实现逐步的糊化，如图4A所示；截断体α-淀粉酶在65℃左右，可以将pH4.5左右的天然淀粉浆实现同步糊化和液化，生成主要组成为糊精和低分子量的聚麦芽糖，如图4B所示；与糖化酶AMG结合使用，在pH4.5、65℃可以实现同步糊化液化糖化发酵，如图4C所示。

Claims

1.一种α-淀粉酶截断体，其特征在于：截取了枯草芽孢杆菌CN7α-淀粉酶45-467位氨基酸组成的肽段，并在C端融合一个人工合成肽，该α-淀粉酶截断体的氨基酸序列如SEQ ID NO：17所示。

2.一种编码权利要求1所述的α-淀粉酶截断体的基因，其核苷酸序列组成如SEQ ID NO：18所示。

3.一种表达载体，其特征在于：包含权利要求2中所述的基因。

4.一种宿主细胞，其特征在于：包含权利要求3中所述的表达载体转化的原核细胞或真核细胞。

5.权利要求1所述的α-淀粉酶截断体在淀粉降解和含淀粉材料的处理中的应用。

6.权利要求1所述的α-淀粉酶截断体在淀粉工业中新型糊化、液化和糖化新工艺的开发中的应用。