CN102994529A - 通过n端替换提高gh10木聚糖酶热稳定性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的是提供一种GH10木聚糖酶Aus Xyn10A热稳定性改造及重组突变酶的高效表达和纯化方法。依据Aus Xyn10A(源于Aspergillus usamii E001)与耐热木聚糖酶(源于Thermoascus Aurantiacus 751K6A)蛋白质序列比对结果，运用基因工程的方法将耐热酶的N末端区域序列替换Aus Xyn10A的对应序列。获得的突变酶命名为ATx10AM。实验结果表明突变后该酶的最适温度和热稳定性有了明显的提高，作为一种耐热型的酶制剂，该木聚糖酶具有较大的工业化生产潜力和经济价值。
Description
技术领域
本发明涉及GH10木聚糖酶改造及突变酶的高效表达方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
木聚糖酶是可将木聚糖降解成低聚木糖和木糖的一类酶的总称。狭义上木聚糖酶特指β-1，4-内切木聚糖酶(endo-β-1，4-xylanase，EC 3.2.1.8)。β-1，4-内切木聚糖酶可以从主链内部作用于木糖苷键，是木聚糖降解过程中最重要的酶之一。目前所克隆的木聚糖酶大多属于F/10和G/11家族，第10家族木聚糖酶与第11家族相比具有底物特异性低、水解速度快、水解产物聚合度低，具有较大的研究和应用价值。木聚糖酶在造纸、食品、能源、饲料及环境等领域中具有广阔的应用前景，特别是在纸浆生物漂白中的巨大应用潜力早已引起各界的高度关注。然而，目前工业生产的大多为原始菌直接发酵所得到的木聚糖酶，其最适反应温度大多在45-55℃左右，且热稳定性较差，大大制约了木聚糖酶在饲料、造纸等行业中高温环境下的应用，如Alves-Prado等在巴西塞拉多地区的土壤中分离到一株高产木聚糖酶的细菌Lysinibacillussp.strain P5B1，该木聚糖酶的最适作用温度为55℃；Menon等从印度海洋化工研究院实验盐农场的沉积物中筛选分离出一株产耐盐木聚糖酶的短小芽孢杆菌GESF1，并对该木聚糖酶进行了分离纯化和酶学性质研究，该酶的最适作用温度为40℃，虽然这些木聚糖酶其它酶学性质较好，但由于热稳定性问题较难被应用在高温制造行业。因此寻找有效途径和手段，提高木聚糖酶在高温环境中的稳定性及催化活性已成为国内木聚糖酶工业的当务之急。
发明内容
本发明的目的是提供一种GH10木聚糖酶Aus Xyn10A热稳定性改造及重组突变酶的高效表达和纯化方法。
为实现上述目的，本发明的技术方案提供了一种提高GH10木聚糖酶最适温度及热稳定性的方法，其特征在于，依据Aus Xyn10A(源于Aspergillus usamii E001)与耐热木聚糖酶(源于Thermoascus Aurantiacus 751K6A)蛋白质序列比对及计算机预测分析结果，运用基因工程的方法将耐热酶的N端区域序列替换Aus Xyn10A的相应序列。获得的突变酶命名为ATx10AM，其对应的基因和蛋白质序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。
所述的木聚糖酶的活性测定方法：
于25mL具塞试管A和B中，各加入用pH 4.6、柠檬酸-Na2HPO4缓冲液配制的质量浓度为0.5％的桦木木聚糖(Sigma，USA)溶液2.4mL，50℃预热10min，在A管中加入0.1mL适当稀释的酶液，50℃准确反应15min；立即各加入2.5mL 3′，5′-二硝基水杨酸(DNS)试剂，在B管中再补加0.1mL酶液，A和B管均煮沸7min；冷却后各加去离子水5mL，摇匀；540nm处以B管为空白对照测定A管吸光度值，并从木糖标准曲线上查出相应的还原糖(以木糖计)含量并折算成酶活性单位。酶活性单位定义：在本测定条件下，以每分钟产生1μmol还原糖所需的酶量定义为1个木聚糖酶活性单位(IU)。
所述突变酶的构建和表达方法：
(1)突变酶的构建：依据Aus Xyn10A与来源于Thermoascus Aurantiacus 751K6A的耐热木聚糖酶蛋白质序列比对及计算机预测分析结果选择NRLTTGKNA(SEQ ID NO：3)作为拟替换序列，并依此设计突变引物XynCHNR1(5′-CGGCCTTGATAATGGCAGCGTTCTTACCAGTAGTCAATC-3′)。
提取包含Aus Xyn10A基因的T载体(pUCm-T-Aus xyn10A)，依此为模板使用引物AusXyn10A基因的成熟肽引物Xyn10A-F1(5′-GAATTCCAGGCTTCAGTGAGTATTGA-3′)和引物XynCHNR1进行第一轮PCR，其后依pUCm-T-Aus xyn10A为模板，利用大引物PCR使用Xyn10A-R1(5′-GCGGCCGCCTAGAGAGCATTTGCGATAG-3′)和第一轮PCR产物作为引物进行第二轮PCR。将两轮PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pUCm-T载体连接(pUCm-T-ATx10AM)，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序，得到突变酶的成熟肽基因序列。
(2)含编码ATx10AM成熟肽基因的表达质粒的构建：
使用EcoR I和Not I对割胶回收的目的基因与pPIC9K分别进行双酶切，割胶回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pPIC9K-ATx10AM(图1)，并对重组表达质粒进行序列测定。
(3)GS115/ATx10AM重组子的构建、表达、产物纯化及活性测定：用Sal I对pPIC9K-ATx10AM进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转、筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/ATx10AM；按照手册上的标准流程进行诱导表达，用DNS法测定重组木聚糖酶活性；发酵液经冷冻离心、超滤、离子交换层析和凝胶过滤层析，获得了电泳纯的重组木聚糖酶。
本发明的有益效果：本发明的目的是提供一种GH10木聚糖酶Aus Xyn10A改造及重组突变酶的高效表达和纯化方法。依据Aus Xyn10A与来源于Thermoascus Aurantiacus 751K6A的耐热木聚糖酶蛋白质序列比对结果，运用基因工程的方法将耐热酶的N末端区域序列替换Aus Xyn10A的对应区域。获得的突变酶命名为ATx10AM。ATx10AM较原酶最适温度和热稳定性都有了一定幅度的提高，具有一定的工业化生产和应用潜力以及经济价值，也为其它木聚糖酶的研究奠定了基础。
附图说明
图1：重组质粒pPIC9K-ATx10AM示意图
具体实施方式
以下结合具体实施例，进一步阐述本发明的操作方法。但是这些实施例仅用于详细说明本发明，而不用于限制本发明的范围。
实施例1突变酶的构建
提取包含Aus Xyn10A基因的T载体(pUCm-T-Aus xyn10A)，依此为模板使用Aus Xyn10A基因的成熟肽引物Xyn10A-F1和引物XynCHNR1进行第一轮PCR，其反应条件为：94℃5min；2个循环，94℃30s，45℃30s，72℃70s；28个循环94℃30s，55℃30s，72℃30s；72℃10min；10℃保存；其后依pUCm-T-Ausxyn10A为模板，利用大引物PCR使用Xyn10A-R1(5′-GCGGCCGCCTAGAGAGCATTTGCGATAG-3′)和第一轮PCR产物作为引物进行第二轮PCR，其反应条件为：94℃5min；2个循环，94℃30s，45℃30s，72℃70s；28个循环94℃30s，55℃30s，72℃70s；72℃10min；10℃保存。将两轮PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pUCm-T载体连接(pUCm-T-ATx10AM)，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序，得到突变酶的成熟肽基因序列。
实施例2含编码ATx10AM成熟肽基因的表达质粒的构建
使用EcoR I和Not I对割胶回收的目的基因与pPIC9K分别进行双酶切，酶切时间为4h，割胶回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下连接过夜(＞12h)，得到重组质粒pPIC9K-ATx10AM(图1)，并对重组表达质粒进行序列测定。
实施例3GS115/ATx10AM的构建、表达、产物纯化及活性测定
用Sal I对pPIC9K-ATx10AM进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转化、筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/ATx10AM。该工程菌用0.5％甲醇诱导72h，DNS法测得发酵液中重组木聚糖酶活性达521IU/mL。离心上清液为重组木聚糖酶粗酶液，经截留分子量为10kDa的超滤膜浓缩，再经DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析纯化，纯化后经SDS-PAGE检测为单一条带，并显示重组木聚糖酶分子量为42kDa。该重组木聚糖酶最适作用温度55℃，较原酶提高了10℃，60℃下保温10min残余酶活仍大于40％。
Claims (3)
1.一种改造后的源自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001、归属于GH10家族的木聚糖酶基因ATx10AM，其对应的基因和蛋白质序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。
2.突变酶的构建方法：
依据Aus Xyn10A与来源于Thermoascus Aurantiacus 751K6A的耐热木聚糖酶蛋白质序列比对结果选择NRLTTGKNA(SEQ ID NO：3)作为拟替换序列，并依此设计突变引物XynCHNR1(5′CGGCCTTGATAATGGCAGCGTTCTTACCAGTAGTCAATC-3′)；
提取包含Aus Xyn10A基因的T载体(pUCm-T-Aus xyn10A)，依此为模板使用引物AusXyn10A基因的成熟肽引物Xyn10A-F1(5′-GAATTCCAGGCTTCAGTGAGTATTGA-3′)和引物XynCHNR1进行第一轮PCR，其后依pUCm-T-Aus xyn10A为模板，利用大引物PCR使用Xyn10A-R1(5′-GCGGCCGCCTAGAGAGCATTTGCGATAG-3′)和第一轮PCR产物作为引物进行第二轮PCR；将两轮PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pUCm-T载体连接(pUCm-T-ATx10AM)，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序，得到突变酶的成熟肽基因序列。
3.ATx10AM表达质粒的构建、表达及纯化：
使用EcoR I和Not I对割胶回收的目的基因与pPIC9K分别进行双酶切，割胶回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pPIC9K-ATx10AM，并对重组表达质粒进行序列测定；
用Sal I对pPIC9K-ATx10AM进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转、筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/ATx10AM；按照手册上的标准流程进行诱导表达，用DNS法测定重组木聚糖酶活性；发酵液经冷冻离心、超滤、离子交换层析和凝胶过滤层析，获得了电泳纯的重组木聚糖酶。
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| CN107122624A (zh) * | 2017-05-01 | 2017-09-01 | 杨永臣 | 人类基因突变的hgvs名称生成及分析系统的实现方法 |
| CN108676787A (zh) * | 2018-05-28 | 2018-10-19 | 湖北大学 | 一种比酶活提高的嗜热嗜碱木聚糖酶突变体及其在工业中的应用 |
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| PB01 | Publication | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20130327 |