CN103173429A - 一种热稳定性提高的重组胰蛋白酶 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种热稳定性提高的重组胰蛋白酶，属于酶工程领域。本发明通过融合PCR技术，在胰蛋白酶上融合有前导肽序列，其中优选YVEF。获得了在40℃、50℃和60℃下，热稳定性分别比野生胰蛋白酶提高了1.77,2.6和31倍的重组胰蛋白酶。解决了胰蛋白酶热稳定性差的问题。该重组胰蛋白酶生产工艺简单、便于工业化应用。

Description

一种热稳定性提高的重组胰蛋白酶

技术领域

本发明涉及一种重组胰蛋白酶（thermostable trypsin，EC3.4.21.4），特别是热稳定性提高的重组胰蛋白酶，属于遗传工程领域。

背景技术

迄今为止，酶制剂已被广泛地应用于制革、食品、发酵和纺织等行业。酶在制革工业中的应用，最早仅限于酶脱毛和酶软化。随着科学技术的不断发展和进步，酶制剂在制革行业中的应用范围也不断拓展、扩大，逐渐应用于制革准备工段乃至整个制革过程。种种迹象表明，基于酶制剂的制革工艺方法的研究与开发，必将催生具有生态概念的制革新技术——生物制革。其中在制革工业中应用较为广泛且应用时间较长的是胰酶，胰酶是一类广泛应用于医药、食品、化工及制革等工业的混合酶制剂。胰酶最早是通过新鲜动物胰脏来制备，通过绞碎，配料，磨浆，消化，过滤，干燥，球磨等工艺制备成为胰酶原粉，随后加填充剂稀释成为不同酶活力标准的胰酶成品。动物源胰酶成分复杂，其中具有主要作用的是胰蛋白酶(EC 3.4.21.4)，虽然胰酶制备简便，但是制备过程比较粗放，产品不同批次间质量参差不齐，品质难以控制，而对其进行精制则成本较大；另外动物源胰酶在皮革工业中存在生物安全性低和标准化困难的缺点；制革工业中常用的的酶为蛋白酶，蛋白酶种类可分为四大类：丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶类、天冬氨酸蛋白酶类和金属蛋白酶类，链霉菌属可以产生其中的除了半胱氨酸蛋白酶类的其他三类蛋白酶，已经发现了多种可产生蛋白酶的链霉菌，主要包括灰色链霉菌（Streptomyces griseu）、变铅青链霉菌（S.lividans）、弗氏链霉菌（S.fradiae）和带小棒链霉菌（S.clavuligerus）等。通过对目前皮革工业中应用较为普遍的动物源胰酶与链霉菌属(Streptomyces)胰蛋白酶的理论比较，链霉菌源胰蛋白酶的酶活性质和作用方式均与动物源胰蛋白酶相同，而经过链霉菌胰蛋白酶氨基酸序列和胰蛋白酶基因结构的比较，发现链霉菌源胰蛋白酶的氨基酸序列和基因结构同动物源胰蛋白酶具有高度同源性，氨基酸序列相似度80.9%，酶基因序列相似度79.8%。然而，链霉菌源胰蛋白酶的生产却由于链霉菌的发酵周期长，野生菌表达酶活低，及胰蛋白酶基因表达调控复杂等因素而受到制约。

对于动物源胰蛋白酶的重组基因工程菌的构建和表达研究较多，但是由于通过原核生物表达真核生物蛋白在转录和翻译的调节上存在差异，因此得到外源表达胰蛋白酶多数为包涵体蛋白，小鼠的胰蛋白酶编码基因同细菌碱性磷酸酶启动子(phoA)在E.coli中进行融合表达，并且通过添加外源激酶激活胰蛋白酶原，实现了胰蛋白酶的外源表达，但是需要添加外源激酶激活，且产量较低，而链霉菌胰蛋白酶的活性表现不需要添加任何外源激酶，对于链霉菌胰蛋白酶的研究起始较早，但是其集中在酶学性质和生理生化特性方面的研究。对于链霉菌的胰蛋白酶的外源表达研究则主要集中在胰蛋白酶在不同的链霉菌宿主中表达的生理生化作用的研究，且链霉菌的发酵周期普遍较长，发酵控制等相对较为困难，并且链霉菌本身具有的蛋白质水解功能也会影响目的蛋白酶的产量。然而胰蛋白酶在实际应用中的作用温度通常为37℃，在此条件下，胰蛋白酶具有较高的酶催化效率，但会由于热力因素导致其缓慢失活，而导致其效力下降。而目前针对胰蛋白酶的热稳定性改造尚未有报道，生物活性酶在工业生产中具有广泛的应用，而提高酶的热稳定性是工业酶的研究重点之一。目前，提高酶热稳定性的方法主要包括：1.定向进化：通过定点突变，随即突变，饱和突变等技术，筛选得到热稳定的突变株；2.从嗜热微生物中筛选热稳定性的酶。但是，这些方法并不适用于所有酶分子热稳定性改造中。根据近些年国内外有较多的N端融合短肽来改善酶热稳定性的报道，比如在酶的N端融合双亲短肽可以明显提高RNaseHI的热稳定性。据此，对链霉菌胰蛋白酶进行重组改造，通过融合人工设计前导肽来获得热稳定性提高的重组链霉菌胰蛋白酶。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种热稳定性提高的重组胰蛋白酶（thermostabletrypsin，EC 3.4.21.4），胰蛋白酶上融合有前导肽序列。其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中前导肽的序列为：YVEF。所述胰蛋白酶为具有活性的，并且无需激活的成熟胰蛋白酶。

一种表达上述上述热稳定性提高的重组胰蛋白酶的基因工程菌的构建方法，具体步骤如下：

第一步 热稳定性提高的重组胰蛋白酶基因的获得

首先，利用融合PCR技术将人工设计前导肽Ex和灰色链霉菌（Streptomycesgriseu）[Streptomyces griseu subsp griseus ATCC 10137,2010年5月26日购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)]胰蛋白酶编码基因mt进行融合，并将连接至pMD 19Tsimple载体中，对融合胰蛋白酶基因进行PCR扩增及测序；

第二步 融合前导肽的重组酶表达质粒的构建

再次利用融合PCR技术在其5’端融合Saccharomyces cerevisiae α-factor信号肽，得到亚克隆片段α-factor signal peptide+Exmt，之后将亚克隆片段利用BamHI和NotI酶切亚克隆至表达载体pPIC9K，获得重组表达质粒pPIC9K-α-factor signal peptide+Exmt；

第三步 融合双亲短肽的重组酶表达菌株的构建

将重组质粒pPIC9K-α-factor signal peptide+Exmt转化宿主毕赤酵母宿主(Pichia pastorisGS115)，构建高效表达目的酶的诱导型毕赤酵母基因工程菌。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种发酵生产上述热稳定性提高的重组胰蛋白酶的方法。

培养基组成（g/L）：

种子培养基：蛋白胨10-20，酵母提取物5-10，葡萄糖10-20，氯化钠5-15；

优化种子培养基为：蛋白胨15，酵母提取物8，葡萄糖15，氯化钠10；

发酵培养基：酵母氮源基础培养基12～15，生物素0.0002～0.0005，甲醇10～50；微量元素溶液，MnSO₄·4H₂O 100，ZnCl₂ 70，Na₂MoO₄·2H₂O 35，H₃BO₃ 60，CoCl₂·6H₂O 200，CuSO₄·5H₂O 29，NiCl₂·6H₂O 25，37%盐酸0.9mL。

培养方法：

接种一环转化子入250mL三角瓶，装液量50mL的种子培养基，培养温度28℃～30℃，摇床转速200r/min，培养24h；离心，收集种子，用无菌生理盐水洗涤两次，按10%的接种量接入装液量为50mL发酵培养基的三角瓶（500mL）中，发酵温度30℃，摇床转速200r/min，发酵时间：3～4天。

类胰蛋白酶酶活测定方法：

类胰蛋白酶能够选择性的切断赖氨酸或精氨酸的羧基所构成的肽链，利用人工合成的具有上述肽链的N^α-苯甲酰-DL-精氨酸-对-硝基苯酰胺（BAPNA）作为底物，在410nm下测定类胰蛋白酶催化BAPNA的产物对硝基苯胺的吸光系数，利用吸光系数在10min内的变化率来反映类胰蛋白酶的酶活大小。酶活定义为：在37℃下，每水解1μg的BAPNA所需的类胰蛋白酶的量，即为类胰蛋白酶的1个BAPNA水解单位。具体测定方法为：将43.5mg BAPNA先溶解于1mL二甲基甲酰胺中，之后再将该混合体系溶解于pH 8.0的，含有10mM CaCL₂的50mM Tris-HCL缓冲液中，此即为类胰蛋白酶的底物溶液，测定过程为：在25℃下，测定10μL粗酶液同990μL BAPNA溶液在光径1cm的反应池中，在410nm下10min内的吸光值变化，得到ΔA_410nm/min，之后利用下面的公式计算得到粗酶液酶活：

将目的酶应用胰蛋白酶特异性亲和层析分离手段，得到电泳纯的目的酶。将目的酶在一定温度下保温，测定酶活相比初始未保温时损失50%所需要的时间(T1/2)。

本发明提供了一种热稳定性提高的重组胰蛋白酶，应用前导肽融合表达重组酶能够提高目的重组酶的热稳定性。该方法具有效果显著、工艺简单、便于推广。本发明为快速提高工业酶热稳定性提高了新的方法和思路。

具体实施方式：

实施例1：稳定性提高的重组胰蛋白酶胰蛋白酶基因的获得

胰蛋白酶基因mt来源于灰色链霉菌（Streptomyces griseu）中含类胰蛋白酶基因的编码序列（GenBank Accession No.M64471），其中第639位到第1307位是编码SprT的基因。利用融合PCR技术将人工设计的前导肽（YVEF）添加到胰蛋白酶编码基因的5’端，获得融合亚克隆片段Exmt，再利用融合PCR技术段α-factor signal peptide+Exmt，之后将亚克隆片段利用BamHI和NotI酶切亚克隆至表达载体pPIC9K，获得重组表达质粒pPIC9K-α-factor signal peptide+Exmt，转化P.pichia GS115获得能够分泌表达重组酶Exmt的重组菌，

实施例2：发酵生产类胰蛋白酶

种子培养基：蛋白胨15g/L，酵母提取物8g/L，葡萄糖15g/L，氯化钠10g/L；

发酵培养基：酵母氮源基础培养基12～15g/L，生物素0.0002～0.0005g/L，甲醇10～50g/L；

微量元素溶液，MnSO4·4H2O 100g/L，ZnCl2 70g/L，Na2MoO4·2H2O 35g/L，H3BO3 60g/L，CoCl2·6H2O 200g/L，CuSO4·5H2O 29g/L，NiCl2·6H2O 25g/L，37%盐酸0.9mL。

培养方法：

种子培养：接种一环转化子入250mL三角瓶，装液量50mL，培养温度28℃～30℃，摇床转速200r/min，培养24h；

发酵培养：离心，收集种子，用无菌生理盐水洗涤两次，按10%的接种量接入装液量为50mL的三角瓶（500mL）中，发酵温度30℃，摇床转速200r/min，3～4天后，测定发酵液中类胰蛋白酶活性，得到9U(BAPNA水解单位)/mL的酶活。

实施例3：重组胰蛋白酶的纯化与热稳定性检测

应用胰蛋白酶特异性亲和层析分离手段，得到电泳纯的目的酶。将目的酶在一定温度下保温，测定酶活相比初始未保温时损失50%所需要的时间(t1/2)。

如表1所示，采用本方法获得的胰蛋白酶其在40-60度温度下，均获得极好的效果，特别上在60度温度下，稳定性获得数量级的提高。

表1.融合前导肽提高重组胰蛋白酶的热稳定性，以未融合前导肽的野生胰蛋白酶为对照

Claims (6)

1.一种热稳定性提高的重组胰蛋白酶，其特征在于胰蛋白酶上融合有前导肽序列。

2.权利要求1所述的重组胰蛋白酶，其特征在于所述胰蛋白酶为具有活性的，并且无需激活的成熟胰蛋白酶。

3.权利要求1所述的重组胰蛋白酶，其特征在于前导肽的序列为：YVEF。

4.权利要求1-3任一所述的重组胰蛋白酶，其特征在于氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

5.制备权利要求1-3任一所述重组胰蛋白酶的方法，其特征在于将前导肽Ex与重组酶mt进行融合表达，前导肽Ex融合在重组酶的N端。

6.含有权利要求1所述重组胰蛋白酶核苷酸序列的载体或转基因细胞系。