CN103397013A

CN103397013A - 药物组合物胰酶肠溶胶囊及其制备方法

Info

Publication number: CN103397013A
Application number: CN2013102880177A
Authority: CN
Inventors: 金鑫; 朱菊红; 毛道斌; 丁莉梅; 傅姗瑚
Original assignee: Zhejiang Zhongyi Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Zhejiang Huarun 39 Zhongyi Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 2013-07-10
Filing date: 2013-07-10
Publication date: 2013-11-20
Anticipated expiration: 2033-07-10
Also published as: CN103397013B

Abstract

本发明提供了一种胰酶及其肠溶胶囊。该胰酶胰酶的氨基酸序列如SEQIDNO：2等所示；该胰酶肠溶胶囊中的颗粒由丸芯和包裹在丸芯外的包衣组成，其中丸芯由胰酶、蔗糖、糊精和羟丙甲基纤维素组成，包衣由聚丙烯酸树脂、柠檬酸三乙酯和滑石粉组成。

Description

药物组合物胰酶肠溶胶囊及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体而言，本发明涉及一种胰酶及其肠溶胶囊。另外，本发明还涉及上述产品的制备方法及应用等。

背景技术

胰酶，以胰蛋白酶原的形式在哺乳动物的胰腺细胞中合成，能够为肠激酶所活化，也能在弱碱性pH（如，生理pH）下自我活化。例如，中国专利02805619公开了生产重组胰蛋白酶的方法，通过在pH3.0-4.0的体系中表达来实现分泌表达，并且发现截短的胰酶（原）表达量更多，但是（自）激活后的活性只有180-200U/mg，而且没有提示其他位点的序列变化会造成的影响；中国专利200910055493通过在截短的胰酶（原）N端增加序列来增加胰酶的活性和稳定性，其试验数据值得考证，但是至少其生理温度（37℃）下无法被辅助激活（更无法自激活），这对于在人体中施用是极为不利的。

胰酶（原）适合在肠道环境中发挥作用，为了防止被胃酸等降解，通常配制成肠控释（如，肠溶）制剂，如参见中国专利99103124、200680029728、200710039100等。

本发明人经过长期研究，令人意外地发现了一种高活性的胰酶，其具有高自激活性，而且激活的最适温度接近于生理温度，并且在低温下几乎没有自激活性，因此特别适合实际的施用和储运、保存。另外，本发明人研究出了胰酶的肠溶性制剂的配方，其肠特异性释放性质已经达到国外著名药厂的水平，特别适合本发明的胰酶来配制。

发明内容

本发明的要解决的技术问题在于提供新的胰酶及其肠溶胶囊，其中无论胰酶本身，还是肠溶胶囊的原辅料配方和工艺，都有创新。另外，本发明还提供了一些中间产物和应用等。

具体而言，在提供了胰酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，或是在SEQ ID NO：2所示序列上添加、确实和/或取代一个或几个氨基酸残基而得的。在本发明的具体实施方式中，胰酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。该胰酶可以是化学合成的，但是优选是通过重组DNA技术表达获得的。

在第二方面，本发明提供了基因，其编码本发明第一方面的胰酶。基因的化学成分是核酸，通过经典的重组DNA技术，就能表达其编码的蛋白质/酶。在本发明的具体实施方式中，基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

在第三方面，本发明提供了载体，其包含本发明第二方面的基因。在第四方面，本发明提供了细胞，其包含本发明第二方面的基因。现在有诸多厂商提供了很成熟的载体和细胞以供克隆和表达。

在第五方面，本发明提供了用于治疗或预防肠道疾病的药物组合物，其包括本发明第一方面的胰酶和药学上可接受的载体。在本文中，如无相反指示，肠道疾病指的是胰酶能够治疗或预防的肠道疾病，优选是消化不良。所以，优选该药物组合物是用于治疗或预防消化不良。

在第六方面，本发明提供了胰酶肠溶胶囊，其由胶囊壳和装在胶囊壳中的颗粒组成，其中颗粒由丸芯和包裹在丸芯外的包衣组成，其中丸芯由胰酶、蔗糖、糊精和羟丙甲基纤维素组成，包衣由聚丙烯酸树脂、柠檬酸三乙酯和滑石粉组成。其中胰酶可以是本发明第一方面的胰酶，也可以是现有的胰蛋白酶、胰脂肪酶和/或胰淀粉酶。

优选在本发明第六方面的胰酶肠溶胶囊中，胰酶是本发明第一方面的胰酶。

目前药用辅料非常多，选取既要能够形成颗粒、又要在（肠道）碱性条件下快速释放、还要成本便宜并能使用当前设备的辅料，则非常困难。所以，优选在本发明第六方面的胰酶肠溶胶囊中，胰酶、蔗糖、糊精和羟丙甲基纤维素的重量比为23-35：3-12：2-7：0.3-1，优选为25-30：6-10：3-5：0.5-0.7，更优选为28：8：4：0.6。

另外优选在本发明第六方面的胰酶肠溶胶囊中，聚丙烯酸树脂、柠檬酸三乙酯和滑石粉的重量比为23-35：1-5：5-12，优选为27-31：2-4：6-9，更优选为29：3：7.5。

也优选在本发明第六方面的胰酶肠溶胶囊中，丸芯和包衣的重量比为优选为2-8：1-3，优选为4-6：1.5-2.5，更优选为5：2。

在第七方面，本发明提供了本发明第六方面的胰酶肠溶胶囊的制备方法，其包括

（1）将羟丙甲基纤维素溶于乙醇和水的混合溶液中，配制成羟丙甲基纤维素的乙醇水溶液，优选配制成1.5-3%（如2%）（W/W）羟丙甲基纤维素的乙醇水溶液；

（2）将胰酶、蔗糖和糊精混合后与步骤（1）获得的羟丙甲基纤维素的乙醇水溶液离心造粒成丸芯，优选造粒成粒径为0.85-0.95mm（优选0.9mm）的丸芯；

（3）将柠檬酸三乙酯与水（优选其中檬酸三乙酯与水的重量比为2-4：450-550，更优选为3：500）混合后，调入聚丙烯酸树脂乳胶液（优选其中聚丙烯酸树脂浓度为27-32%（W/W），更优选为29%（W/W））中，再加入滑石粉混合，配制成肠溶包衣液；

（4）通过沸腾包衣机将步骤（3）获得的肠溶包衣液包裹在步骤（2）获得的丸芯外，获得颗粒，优选获得粒径为1-1.2mm（优选1.1mm）的颗粒；和

（5）将步骤（4）获得的颗粒装入胶囊壳中。

在第八方面，本发明提供了本发明第一方面的胰酶在制备用于治疗或预防肠道疾病的药物中的应用。优选其中，药物是本发明第六方面的胰酶肠溶胶囊。

在第八方面，本发明提供了本发明第六方面的胰酶肠溶胶囊在制备用于治疗或预防肠道疾病的药物中的应用。优选其中，药物包含本发明第一方面的胰酶。

本发明取得的有益效果在于：获得了新的胰酶；精心摸索的胰酶肠溶颗粒的原辅料、配比和工艺所获得的产品释放性能已经达到国外著名药厂的水平，而且辅料成本便宜，并能延续使用国内当前常用的设备，进一步节约了成本；本发明的胰酶肠溶颗粒的稳定性好，尤其是较强酸性条件下稳定性不弱，甚至更好，因此制成胶囊后无需特别关注服药时间，方便了患者。

为了便于理解，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，其全文内容均纳入本文进行参考。以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见了。

具体实施方式

以下实施例所述实验方法，没有具体说明的，按照《分子克隆实验指南》(2002年，第三版，科学出版社)、《细胞实验指南》(2001年，科学出版社)等实验手册所述的方法进行，或者根据实验中具体用到的试剂、仪器的厂商所提供的说明书或手册来进行。

实施例1 胰酶的制备

我们设计了本发明的胰酶基因在酵母中的优化表达序列，其核苷酸如SEQ ID NO：1所示，其编码的胰酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。我们委托上海生工公司人工合成该基因序列并参照常规方法克隆入酵母细胞构建成表达工程菌，简而言之，以合成的基因序列为模板，用如SEQ ID NO：3和4所示的上下游引物PCR扩增，然后连接到pPICZαA（可购自美国Invitrogen公司）的EcoR I和Xba I之间，阳性构建体电转化入酵母GS115株（可购自美国Invitrogen公司）中，以Zeocin筛选出阳性酵母细胞作为工程菌。

将构建好的工程菌接种于25ml种子培养基（配方为：2%（W/W）蛋白胨、1%（W/W）酵母提取物、1.34%（W/W） YNB（无氨基酵母氮源）、4*10^-5%（W/W）生物素、和pH3.2磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（0.2M磷酸氢二钠：0.1M柠檬酸（体积比）=1：3）），于30℃、200rpm震荡培养，直至OD600达到3。然后，将25ml种子培养产物接种入100ml发酵培养基（配方为：2%（W/W）蛋白胨、1%（W/W）酵母提取物、1.34%（V/V） YNB（无氨基酵母氮源）、4*10^-5%（W/W）生物素、0.5%（V/V）甲醇和pH3.2磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液）中，于30℃、150rpm震荡培养，每12小时补加甲醇至0.5%（V/V），培养96小时。然后，于4℃、1500rpm离心发酵培养产物，保留上清液，上样于Sephadex G-75层析柱，以pH3.2磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液进行洗脱，收集280nm紫外检测出的最大洗脱峰，然后冷冻干燥，于4℃保存，即制备出本发明的胰酶。经检测，胰酶表达量为3g/L。

实施例2 胰酶的性质研究

将实施例1制备的胰酶溶于含20mM氯化钙的pH8.0 Tris-HCl缓冲液中，装入透析袋，于4℃在pH8.0 Tris-HCl缓冲液（0.1M）中透析两次，每次15分钟，然后加入Tos-Gly-Pro-Arg-4-pNA（Chromozym TRY）作为底物，以不同温度使胰酶自激活1小时后，检测其活性。结果如表1所示，本发明的胰酶在生理温度下具有高自激活性，而在低温下几乎没有活性，而且37℃的酶活性能够在短时间内就达到300U/mg以上。

表1 本发明的胰酶的性质

温度（℃）	4	25	37	50
					活性（U/mg）	2.8	276	311	65

实施例3胰酶肠溶胶囊的制备

（1）将羟丙甲基纤维素溶于水，再加入95%乙醇溶液，配制成2%（W/W）羟丙甲基纤维素的乙醇水溶液（乙醇：水（体积比）=1：1）。

（2）取实施例1制备的胰酶28份、蔗糖8份和糊精4份混合均匀后置于离心造粒机（可购自山东临沂环世微丸设备有限公司，BZL-300型）中，根据厂商说明书，喷射步骤（1）的羟丙甲基纤维素的乙醇水溶液32份（经测定，约有0.6份羟丙甲基纤维素粘合到丸芯中），进行造粒，形成丸芯，烘干后，其粒径平均为0.9mm，备用。

（3）将柠檬酸三乙酯3份加入到蒸馏水500份中，混合均匀后调入聚丙烯酸树脂乳胶液（购可自连云港万泰医药材料有限公司，含固量29%的水溶性悬浮液）100份中，再加入滑石粉7.5份，混合均匀，即得肠溶包衣液，备用。

（4）将步骤（2）制备的丸芯置于沸腾包衣机（可购自山东临沂环世微丸设备有限公司，LBY-1型）中，将步骤（3）制备的肠溶包衣液通过喷枪均匀地喷在该微丸表面，其中，雾化压力0.1Mpa，调节使进风温度（50-55℃）以保持出风温度稳定为40℃左右，进行25分钟，完成包衣，制备得到肠溶颗粒。经包衣，制得的肠溶颗粒比步骤(2)制备的丸芯干燥后增重约40％，其粒径平均为1.1mm。

（5）将制得的肠溶颗粒可以装入胶囊，即制得本发明的胰酶肠溶胶囊。

将本发明的胰酶肠溶胶囊中的肠溶颗粒分别置于pH3和pH5的磷酸缓冲液中，于37℃以50rpm搅拌，检测抗酸稳定性。结果如表2所示，稳定性能够达到国际大厂的水平，尤其在pH3-5.5之间基本保持稳定，其中随着酸性增大而稳定性略有增强。另外，通过以上工艺但使用药典的胰酶，获得的胰酶肠溶胶囊进行抗酸稳定性检测，其pH3-5.5的稳定性均大于97%，表明本发明的胰酶肠溶胶囊的（原辅料）配方和工艺可以推广到其他胰酶上。

表2 本发明的胰酶肠溶颗粒的抗酸稳定性

pH	3	5
			稳定性（%）	99.3	98.0

序列表

<110> 浙江众益制药股份有限公司

<120> 胰酶肠溶胶囊

<130> CN

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 684

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

gatgatgatg ataaaattgt gggcggctat acctgcgcgg cgaacagcat tccgtatcag 60

gtgagcctga acagcggcag ccatttttgc ggcggcagcc tgattaacag ccagtggcat 120

gtgagcgcgg cgcatgataa aagccgcatt caggtgcgcc tgggcgaaca taacattgat 180

gtgctggaag gcaacgaaca gtttattaac gcggcgaaaa ttattaccca tccgaacttt 240

aacggcaaca ccctggataa cgatattatg ctgattaaac tgagcagccc ggcgaccctg 300

aacagccgcg tgagcaccgt gagcctgccg cgcagctgcg cggcggcggg caccgaatgc 360

ctgattagcg gctgcagcaa caccaaaagc agcggcagca gctatgcgag cctgctgcag 420

tgcctgaaag cgccggtgct gagcgatagc agctgcaaaa gcagctatgg cggccagatt 480

accggcaaaa gcatttgcgt gggctttctg gaaggcggca aagatagctg ccagggcgat 540

agcggcggcc cggtggtgtg caacggccag ctgcagggca ttgtgagctg gggctatggc 600

tgcgcgcaga aaaacaaacc gggcgtgtat accaaagtgt gcaactatgt gaactggatt 660

cagcagacca ttgcggcgaa ctaa 684

<210> 2

<211> 227

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Asp Asp Asp Asp Lys Ile Val Gly Gly Tyr Thr Cys Ala Ala Asn Ser

1 5 10 15

Ile Pro Tyr Gln Val Ser Leu Asn Ser Gly Ser His Phe Cys Gly Gly

20 25 30

Ser Leu Ile Asn Ser Gln Trp His Val Ser Ala Ala His Asp Lys Ser

35 40 45

Arg Ile Gln Val Arg Leu Gly Glu His Asn Ile Asp Val Leu Glu Gly

50 55 60

Asn Glu Gln Phe Ile Asn Ala Ala Lys Ile Ile Thr His Pro Asn Phe

65 70 75 80

Asn Gly Asn Thr Leu Asp Asn Asp Ile Met Leu Ile Lys Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Ala Thr Leu Asn Ser Arg Val Ser Thr Val Ser Leu Pro Arg Ser

100 105 110

Cys Ala Ala Ala Gly Thr Glu Cys Leu Ile Ser Gly Cys Ser Asn Thr

115 120 125

Lys Ser Ser Gly Ser Ser Tyr Ala Ser Leu Leu Gln Cys Leu Lys Ala

130 135 140

Pro Val Leu Ser Asp Ser Ser Cys Lys Ser Ser Tyr Gly Gly Gln Ile

145 150 155 160

Thr Gly Lys Ser Ile Cys Val Gly Phe Leu Glu Gly Gly Lys Asp Ser

165 170 175

Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Val Val Cys Asn Gly Gln Leu Gln

180 185 190

Gly Ile Val Ser Trp Gly Tyr Gly Cys Ala Gln Lys Asn Lys Pro Gly

195 200 205

Val Tyr Thr Lys Val Cys Asn Tyr Val Asn Trp Ile Gln Gln Thr Ile

210 215 220

Ala Ala Asn

225

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cggaattcga tgatgatgat aaaattgtgg gcggc 35

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gctctagatt agttcgccgc aatggtctgc tg 32

Claims

1.胰酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，或是在SEQ ID NO：2所示序列上添加、确实和/或取代一个或几个氨基酸残基而得的。

2.基因，其编码权利要求1所述的胰酶，优选其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

3. 载体或细胞，其包含权利要求2所述的基因。

4. 用于治疗或预防肠道疾病（尤其是消化不良）的药物组合物，其包括权利要求1所述的胰酶和药学上可接受的载体。

5. 胰酶肠溶胶囊，其由胶囊（壳）和装在胶囊（壳）中的颗粒组成，其中颗粒由丸芯和包裹在丸芯外的包衣组成，其中丸芯由胰酶、蔗糖、糊精和羟丙甲基纤维素组成，包衣由聚丙烯酸树脂、柠檬酸三乙酯和滑石粉组成。

6. 权利要求5所述的胰酶肠溶胶囊，其中，

胰酶、蔗糖、糊精和羟丙甲基纤维素的重量比为23-35：3-12：2-7：0.3-1，优选为25-30：6-10：3-5：0.5-0.7，更优选为28：8：4：0.6；和/或，

聚丙烯酸树脂、柠檬酸三乙酯和滑石粉的重量比为23-35：1-5：5-12，优选为27-31：2-4：6-9，更优选为29：3：7.5；和/或，

丸芯和包衣的重量比为优选为2-8：1-3，优选为4-6：1.5-2.5，更优选为5：2。

7. 权利要求5或6所述的胰酶肠溶胶囊，其中胰酶是权利要求1所述的胰酶。

8. 权利要求5-7之任一所述的胰酶肠溶胶囊的制备方法，其包括

（5）将步骤（4）获得的颗粒装入胶囊（壳）中。

9. 权利要求1所述的胰酶在制备用于治疗或预防肠道疾病的药物中的应用，优选其中药物是权利要求5或6所述的胰酶肠溶胶囊。

10. 权利要求5或6所述的胰酶肠溶胶囊在制备用于治疗或预防肠道疾病的药物中的应用，优选其中药物包含权利要求1所述的胰酶。