CN106893700B - 一种人工设计自活化前导肽序列提高胰蛋白酶酶活的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人工设计自活化前导肽序列提高胰蛋白酶酶活的方法，属于基因工程领域。本发明构建的毕赤酵母工程菌，表达N端融合人工自活化前导肽序列TPAPPSDDLGTFDDDDK的胰蛋白酶。本发明得到的酵母工程菌GS115‑Sedeif的胰蛋白酶酶活(即胰蛋白酶酰胺酶酶活)达156U·mL‑1，酯酶酶活为15015.8U·mL‑1(以BAEE为底物)。是改造前的菌株胰蛋白酶酶活的1.82倍和3.29倍。该发明解决了胰蛋白酶异源表达量低的关键问题。应用该发明中的重组菌株生产胰蛋白酶，具产量高、发酵工艺简化、便于工业化应用的优点。

Description

一种人工设计自活化前导肽序列提高胰蛋白酶酶活的方法
技术领域
本发明涉及一种人工设计自活化前导肽序列提高胰蛋白酶酶活的方法，属于基因工程技术领域。
背景技术
胰蛋白酶作为一种专一的多肽水解酶，在许多领域有广泛的应用。作为皮革加工的重要酶制剂，应用于皮革局部处理及脱灰软化：裸皮中的皮垢清除，纤维基质的去除，疏松胶原，从而增强皮革的丰满柔软度、弹性、粒面光滑度；应用在医药，加速创面净化、促进肉芽组织新生、抗炎症作用、治疗蛇毒咬伤、消化道疾病等；特异性水解胶原蛋白等天然蛋白，制备功能性多肽；胰蛋白酶还应用在冷冻食品加工、多肽质谱分析等。
动物来源的胰蛋白酶对人体有潜在的免疫原性，因此异源表达与牛胰蛋白酶同源性高的微生物来源灰色链霉菌胰蛋白酶具有重要的应用价值。目前对胰蛋白酶异源表达，酶学性质分析、底物亲和力和底物结合特性有了基础研究。由于胰蛋白酶异源表达以包涵体或低表达量的问题，目前未见到胰蛋白酶的高效表达报道。目前，利用毕赤酵母表达胰蛋白酶的研究较多，但是仍然存在诸多问题。胰蛋白酶以酶原形式表达存在在体外活化效率低，生产成本高的问题。表达成熟胰蛋白酶序列，也存在如下问题：胰蛋白酶作为蛋白酶，在分泌表达过程中对表达宿主有蛋白酶毒性；进而引发胞内的降解，最终导致表达量低。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种提高胰蛋白酶酶活的方法，将氨基酸序列如SEQID NO.1所示的人工自活化前导肽与氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的成熟胰蛋白酶融合表达；所述人工前导肽序列融合在胰蛋白酶的N端。
所述融合蛋白被分泌到胞外后，自催化切割人工自活化前导肽。
得到所述SEQ ID NO.1所示人工自活化前导肽的序列的方法是：以链霉菌Streptomyces erythraeus胰蛋白酶的前导肽序列TPAPPSDDLGTF与部分牛胰蛋白酶前导肽序列DDDDK融合，以得到人工自活化前导肽序列TPAPPSDDLGTFDDDDK。
编码所述成熟胰蛋白酶的基因序列是SEQ ID NO.4所示的序列。
编码所述人工自活化前导肽的基因序列是SEQ ID NO.3所示的序列。
本发明的第二个目的是提供一种高产胰蛋白的酵母工程菌，所述酵母工程菌表达编码氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的基因。
所述SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列上含有分别编码人工自活化前导肽、胰蛋白酶的序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的序列，且SEQ ID NO.1所示的序列位于SEQ IDNO.2所示序列的前端，两者之间还融合有肠激酶酶切氨基酸位点DDDDK。
所述编码SEQ ID NO.6所示氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
在本发明的一种实施方式中，所述人工自活化前导肽的前端与SEQ ID NO.5编码的α-factor信号肽融合，再与胰蛋白酶融合。所述α-factor信号肽，来源于Sacccharomycescerevisiae。
本发明的第三个目的是提供一种所述酵母工程菌的构建方法，是采用全基因合成或融合PCR技术，获得SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，将该核苷酸序列连接到表达质粒载体中构建重组表达质粒，重组表达质粒转化宿主酵母后即得到酵母工程菌。
所述构建方法，在本发明的一种实施方式中，具体是：(1)采用化学合成或融合PCR方法得到SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，命名为Sedeif；(2)采用融合PCR技术在步骤1序列的5’端融合如核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的信号肽序列，然后连接到pPIC9K质粒中构建重组质粒pPIC9K-α-factor-Sedeif；(3)将重组质粒pPIC9K-α-factor-Sedeif电转化pichia pastoris GS115宿主，即得到酵母工程菌。
所述宿主酵母，在本发明的一种实施方式中，可以是以下任意一种：pichiapastoris GS115、pichia pastoris KM71、pichia pastoris X-33、pichia pastorisSMD1168。
所述表达质粒，在本发明的一种实施方式中，可以是以下任意一种：pGAP ZA、pAO815、pGAPαA、pPIC9K、pPIC ZB。
本发明在胰蛋白酶的N端融合人工自活化前导肽序列TPAPPSDDLGTFDDDDK。首次在胰蛋白酶前融合表达了人工前导肽序列，以酶原形式分泌表达胰蛋白酶原后自催化前导肽序列得到成熟胰蛋白酶。
本发明得到的酵母工程菌GS115-Sedeif，显著地提高了胰蛋白酶酶活。重组菌的胰蛋白酶酶活(即胰蛋白酶酰胺酶酶活)达156U·mL-1，是专利CN 104328102 A中重组菌(85.3U·mL-1)胰蛋白酶酶活的1.82倍。一方面，由于前导肽序列的存在，防止了胰蛋白酶分泌表达过程中发生自活化。这样消除了胰蛋白酶的蛋白酶毒性，所以胰蛋白酶在胞内不会被降解。另一方面，前导肽序列中含有赖氨酸(K)，胰蛋白酶可特异性切割赖氨酸羧基端肽链。最终胰蛋白酶酶原切除N端的人工前导肽序列，获得成熟胰蛋白酶。与表达猪胰蛋白酶酶原、牛胰蛋白酶酶原表达相比，自活化效率高，生产成本更低。同时，与专利CN 104328103A中所描述的方法相比，前导肽序列缩减到17个氨基酸。自活化效率明显提高，胰蛋白酶酶活是专利CN 104328103 A中重组菌生产胰蛋白酶酶活的3.29倍。该方法可简化酶原活化工艺、显著提高胰蛋白酶产量。本发明为胰蛋白酶工业化生产提供了新的思路。
附图说明
图1：克隆表达载体pPIC9K-Sedeif构建图。
图2：毕赤酵母工程菌GS115-Sedeif 3L罐发酵过程的变化曲线。
具体实施方式
胰蛋白酶酶活测定方法：胰蛋白酶特异性切割BAPNA(Na-苯甲酰-DL-对-硝基苯酰胺)羧基端的酰胺键，产物对硝基苯胺(在410nm处有最大吸收值)。在37℃下，测定100μL粗酶液同900μL 10mM BAPNA溶液(溶于50mM pH8.0Tris-HCl缓冲液)在光径0.5cm的反应池中，在410nm下10min内的吸光值变化。酶活定义为：在37℃下，每分钟410nm处光吸收值升高0.1所需要的酶量为1个胰蛋白酶水解单位。
胰蛋白酶酯酶酶活测定方法：在25℃下，测定200μL粗酶液同3mL BAEE底物溶液在光径1cm的反应池中，在253nm下1min内的吸光值变化，得到ΔA253nm/min。酶活定义为：在25℃下，ΔA253nm/min升高0.001即为胰蛋白酶的1个酯酶水解单位。
实施例1含重组胰蛋白酶基因(Sedeif)的重组质粒pPIC9K-Sedeif构建
以专利CN 104328102 A中的序列3所示核酸序列为模板，R primer(序列如SEQ IDNO.8所示)、F primer1(序列如SEQ ID NO.9所示)为引物，进行PCR得到PCR产物。再以PCR产物为模板，Rprimer(序列如SEG ID NO.8)、F primer2(序列如SEQ ID NO.10)为引物，得到SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列，命名为Sedeif。
采用融合PCR技术在Sedeif序列的5’端融合如SEQ ID NO.5所示的信号肽序列，融合酶切片段和pPIC9K分别用Not I、BamH I双酶切，纯化后T4连接酶16℃过夜连接。连接产物化学法转化JM109感受态细胞。转化液涂布含卡那霉素(50mg/L)LB平板，提取质粒双酶切验证构建的重组质粒pPIC9K-Sedeif，如图1所示。
实施例2高产成熟胰蛋白酶酵母工程菌构建
将毕赤酵母表达质粒pPIC9K-Sedeif用SalI线性化，电击转化Pichia pastorisGS115感受态细胞，具体方法如下：
1)接种YPD平板活化的Pichia pastoris GS115于25mL/250mL三角瓶，30℃过夜培养；1％接种上述培养液于50mL/500mL三角瓶，培养菌体浓度OD600为1.3～1.5；
2)5000r/min，4℃离心10min收集菌体，分别用50mL、25mL无菌水悬浮细胞；3)5mL1M山梨醇重悬上述细胞，5000r/min，4℃离心10min收集菌体；
4)500μL 1M山梨醇重悬上述细胞，分装80μL/1.5mL EP管用于电转化感受态细胞；
5)20μL线性化质粒与上述80μL感受态细胞混合，冰上静置15min；
6)上述混合物加入预冷的无菌电转化杯(0.2cm)，1500V、25μF、200Ω电击一次，加入1mL 1M山梨醇；
7)取上述混合物150μL涂布MD平板，30℃培养3天；
8)挑取上述平板中白色菌落，筛选正确的转化子。分别点种在1、2、3、4mg/mL(遗传霉素)YPD平板中，挑选在4mg/mL遗传霉素平板中的单菌落重组菌株GS115-Sedeif用于摇瓶发酵。
实施例3重组毕赤酵母3L罐发酵
将实施例2构建的工程菌作为生产菌株(以专利CN 104328102 A中构建的重组菌为对照菌株)，在YPD平板活化后，接种50mL/250mL种子培养基，30℃，220r/min培养24h作为发酵培养种子液。10％接种800mL/3L发酵培养基，pH 5.5，30℃分阶段培养：0-19h，500rmp/min培养，溶氧从100％下降至8％左右，然后上升至60％左右；19-34h，转速逐渐上升至1000rmp/min，指数流加50％甘油，DO开始下降至7％左右，随后上升至79.1％；34-168h，流加1.8％(V/V)甲醇诱导产胰蛋白酶。
种子培养基(g·L–1)：蛋白胨20，酵母提取物10，葡萄糖20。
发酵培养基(g·L–1)：甘油40；K2SO418；KOH 4.13；MgSO4·7H2O 14.9；H3PO427mL；CaSO 40.948；微量元素离子液(PTM1)4.4mL；121℃灭菌15min。
PTM 1(g·L–1)：CuSO4·5H2O 6；KI 0.09；MnSO4·H2O 3；H3BO30.02；MoNa2O4·2H2O0.2；CoC l20.5；ZnCl 220；FeSO4·7H2O 65；Biotin 0.2；H2SO45mL；0.22μm过滤除菌。补料生长培养基:50％(w/v)的甘油(含12ml·L–1PTM1)。
发酵过程中，毕赤酵母工程菌GS115-Sedeif的酶活如图2所示。从图2可以看出，发酵在32h时开始甲醇诱导产酶，在诱导前16h，胰蛋白酶酶活(即胰蛋白酶酰胺酶酶活)迅速增加。发酵48h后胰蛋白酶增加速度减缓，至发酵144h时胰蛋白酶酶活最高达156U·mL–1，是对照菌株的最高酶活85.3U·mL–1的1.82倍。此外，毕赤酵母工程菌GS115-Sedeif在3L罐发酵胰蛋白酶酶活是专利CN 104328103 A中重组菌生产胰蛋白酶酶活的3.29倍。
此外，毕赤酵母工程菌的胰蛋白酶酯酶酶活为15015.8U·mL-1(以BAEE为底物)。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种人工设计自活化前导肽序列提高胰蛋白酶酶活的方法
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Gln Asp Ile Val Leu Thr Ala Ala His Cys Val Ser Gly Ser Gly Asn
35 40 45
Asn Thr Ser Ile Thr Ala Thr Gly Gly Val Val Asp Leu Gln Ser Ser
50 55 60
Ser Ala Val Lys Val Arg Ser Thr Lys Val Leu Gln Ala Pro Gly Tyr
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Asn Gly Thr Gly Lys Asp Trp Ala Leu Ile Lys Leu Ala Gln Pro Ile
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Thr Phe Thr Val Ala Gly Trp Gly Ala Asn Ile Glu Gly Gly Ser Gln
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<213> 人工序列
<400> 8
tcagagcgtg cgggcggccg 20
<210> 9
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gacctcggca ccttcgatga cgatgacaag ttcgtagaat tcgtcgtcgg 50
<210> 10
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
acgccggcgc cgccctcgga cgacctcggc accttcgatg 40

Claims (9)

1.一种提高胰蛋白酶酶活的方法，其特征在于，是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的人工自活化前导肽与氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的胰蛋白酶进行融合表达；所述人工自活化前导肽融合在胰蛋白酶氨基酸序列的N端；所述人工自活化前导肽的N端与SEQ IDNO.5编码的α-factor信号肽融合，再与胰蛋白酶融合；所述的融合蛋白以胰蛋白酶酶原的形式分泌到胞外后，人工自活化前导肽被切割掉。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，编码所述人工自活化前导肽序列的基因序列是SEQ ID NO.3所示的序列；编码所述胰蛋白酶的基因序列是SEQ ID NO.4所示的序列。
3.一种重组表达胰蛋白酶的酵母工程菌，其特征在于，所述酵母工程菌表达编码氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的基因序列；所述氨基酸序列上含有分别编码人工自活化前导肽、胰蛋白酶的序列。
4.根据权利要求3所述的酵母工程菌，其特征在于，进一步在所述人工自活化前导肽前融合了SEQ ID NO.5所示序列编码的α-factor信号肽。
5.一种权利要求3或4所述酵母工程菌的构建方法，是采用全基因合成或融合PCR技术，获得SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列，将该核苷酸序列连接到表达质粒载体中构建重组表达质粒，重组表达质粒转化宿主酵母后即得到酵母工程菌。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述方法具体是(1)采用化学合成或融合PCR方法得到SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列；(2)采用融合PCR技术在步骤1序列的5’端融合如核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的信号肽序列，然后连接到pPIC9K质粒中构建重组质粒pPIC9K-α-factor-Sedeif；(3)将重组质粒pPIC9K-α-factor-Sedeif电转化pichiapastoris GS115宿主，即得到酵母工程菌。
7.根据权利要求5或6所述的构建方法，其特征在于，所述宿主酵母是以下任意一种：pichia pastoris GS115、pichia pastoris KM71、pichia pastoris X-33、pichiapastoris SMD1168。
8.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述表达质粒是以下任意一种：pGAPZA、pAO815、pPIC9K、pPICZB。
9.权利要求3所述酵母工程菌在胰蛋白酶生产方面的应用。
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