CN114230672B - 一种牛乳铁蛋白肽融合蛋白、编码基因及其在海鲜保鲜和/或防腐中的应用 - Google Patents

一种牛乳铁蛋白肽融合蛋白、编码基因及其在海鲜保鲜和/或防腐中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于食品技术领域，具体涉及一种牛乳铁蛋白肽融合蛋白、编码基因及其在海鲜保鲜和/或防腐中的应用。本发明提供一种从N端至C端包括依次连接的α‑Factor信号肽、单链DNA结合蛋白、牛乳铁蛋白肽和组蛋白标签的牛乳铁蛋白肽融合蛋白。利用本发明所述的融合蛋白具有稳定性高的优势，能够在长时间维持海产品的新鲜度。

Description

一种牛乳铁蛋白肽融合蛋白、编码基因及其在海鲜保鲜和/或 防腐中的应用
技术领域
本发明属于食品技术领域，具体涉及一种牛乳铁蛋白肽融合蛋白、编码基因及其在海鲜保鲜和/或防腐中的应用。
背景技术
大黄鱼味道鲜美、富含蛋白质、维生素和微量元素，深受人们喜爱。在贮藏和运输过程中，由于微生物的繁殖，大黄鱼极易发生腐败。已知低温和室温贮藏大黄鱼的优势腐败菌(Specific spoilage organism，SSO)分别为腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)和气单胞菌(Aeromonas spp.)。
牛乳铁蛋白肽(LfcinB)是由25个氨基酸残基组成的阳离子抗菌肽，分子量为3.1kDa。牛乳铁蛋白在酸性条件下经胃蛋白酶水解可得到牛乳铁蛋白肽。牛乳铁蛋白肽对马苏里拉奶酪中五种潜在腐败细菌具有抑制作用，可明显延缓假单胞菌和大肠菌群的生长，这为其应用于奶酪保鲜提供了直接的证据。牛乳铁蛋白肽可控制水果和蔬菜中腐败致病菌的生长，对柑橘腐烂的重要病原菌Penicillium digitatum有明显的抑制作用。牛乳铁蛋白肽对白隐球菌、布鲁氏杆菌、膜毕赤酵母、酿酒酵母、贝氏酵母和双孢子酵母等葡萄酒腐败酵母的均有抗菌作用，可以应用于葡萄酒的保存中。但牛乳铁蛋白肽在食品中应用过程中因其稳定性不高，在酸奶中的半衰期只有4小时，限制了其作为保鲜防腐剂的作用时间和效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种牛乳铁蛋白肽融合蛋白、编码基因及其在海鲜保鲜和/或防腐中的应用。利用本发明所述的融合蛋白具有稳定性高的优势，能够在长时间维持海产品的新鲜度。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种牛乳铁蛋白肽融合蛋白，从N端至C端包括依次连接的α-Factor信号肽、单链DNA结合蛋白、牛乳铁蛋白肽和组蛋白标签。
优选的，所述牛乳铁蛋白肽融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.13所示。
优选的，所述α-Factor信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示；所述单链DNA结合蛋白的编码基因的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示；所述牛乳铁蛋白肽的氨基酸序列如SEQ ID No.11所示；所述组蛋白标签的氨基酸序列如SEQ ID No.12所示。
本发明提供了上述技术方案所述牛乳铁蛋白肽融合蛋白的编码基因，所述编码基因的核苷酸如序列SEQ ID No.1所示。
本发明提供了一种插入有上述技术方案所述编码基因的重组表达载体。
本发明提供了一种工程菌，包含上述技术方案所述的重组表达载体。
本发明提供了上述技术方案所述牛乳铁蛋白肽融合蛋白或上述技术方案所述的编码基因或上述技术方案所述的重组表达载体或上述技术方案所述的工程菌在制备海产品保鲜防腐剂中的应用。
本发明提供了一种海产品保鲜防腐剂，所述的保鲜防腐剂的有效成分包括上述技术方案所述牛乳铁蛋白肽融合蛋白或利用上述技术方案所述的工程菌产生的融合蛋白。
本发明提供了上述技术方案所述牛乳铁蛋白肽融合蛋白或利用上述技术方案所述的工程菌产生的融合蛋白或上述技术方案所述的保鲜防腐剂在海产品保鲜和/或防腐中的应用。
优选的，所述海产品包括大黄鱼。
有益效果：
本发明提供一种从N端至C端包括依次连接的α-Factor信号肽、单链DNA结合蛋白(TaqSSB)、牛乳铁蛋白肽(LfcinB)和组蛋白标签的牛乳铁蛋白肽融合蛋白。本发明所述的融合蛋白中α-Factor信号肽在LfcinB融合表达后，可有效引导LfcinB的分泌；TaqSSB具有较高的耐热性，能够保证本发明所述的融合蛋白在高于90℃的条件下保持活性；LfcinB能够有效抑制海产品中优势腐败菌的生长；在上述基因片段的作用下，保证了所述的融合蛋白的稳定性。根据本发明具体实施例记载的可知，本发明所述融合蛋白处理的海产品在保存第8天品质良好，说明本发明所述融合蛋白能够有效的抑制海产品中的腐败菌，延长海产品的货架期。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为质粒pYES2-α-Factor-TaqSSB-LfcinB-His双酶切后琼脂糖凝胶电泳结果图，其中M为DNA Marker，1为质粒pYES2，2为重组表达载体pYES2-α-Factor-TaqSSB-LfcinB-His，3为重组表达载体pYES2-α-Factor-TaqSSB-LfcinB-His双酶切产物；
图2为含pYES2-α-Factor-TaqSSB-LfcinB-His的菌落PCR琼脂糖凝胶电泳结果，其中M为1000bp Plus DNAMarker，1～5为随机挑选5个不同的菌落进行PCR；
图3为合蛋白酶解原液对腐败希瓦氏菌的抑菌曲线图；
图4为大黄鱼鱼肉感官评分趋势结果图，其中A为水处理组，B为牛乳铁蛋白肽融合蛋白的酶解物溶液处理组；
图5为大黄鱼鱼肉在贮藏过程中的变化图；
图6为生物材料订购单；
图7为菌种购买证明。
具体实施方式
如无特殊要求，本发明采用的试剂均为本领域技术人员常规购买所得。
本发明提供了一种牛乳铁蛋白肽融合蛋白，从C端至N端包括依次连接的α-Factor信号肽、单链DNA结合蛋白、牛乳铁蛋白肽和组蛋白标签。
在本发明中，所述牛乳铁蛋白肽融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.13所示：MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEAGSARGLNQVFLIGTLTARPDMRYTPGGLAILDLNLAGQDAFTDESGQEREVPWYHRVRLLGRQAEMWGDLLEKGQLIFVEGRLEYRQWEKDGEKKSEVQVRAEFIDPLEGRGRETLEDARGQPRLRRALNQVILMGNLTRDPDLRYTPQGTAVVRLGLAVNERRRGQEEERTHFLEVQAWRELAEWASELRKGDGLLVIGRLVNDSWTSSSGERRFQTRVEALRLERPTRGPAQAGGSRPPTVQTGGVDIDEGLEDFPPEEDLPFFKCRRWQWRMKKLGAPSITCVRRAFHHHHHH。
在本发明中，所述α-Factor信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示：MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEA。
在本发明中，所述单链DNA结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示：ARGLNQVFLIGTLTARPDMRYTPGGLAILDLNLAGQDAFTDESGQEREVPWYHRVRLLGRQAEMWGDLLEKGQLIFVEGRLEYRQWEKDGEKKSEVQVRAEFIDPLEGRGRETLEDARGQPRLRRALNQVILMGNLTRDPDLRYTPQGTAVVRLGLAVNERRRGQEEERTHFLEVQAWRELAEWASELRKGDGLLVIGRLVNDSWTSSSGERRFQTRVEALRLERPTRGPAQAGGSRPPTVQTGGVDIDEGLEDFPPEEDLPF。
在本发明中，所述牛乳铁蛋白肽的氨基酸序列如SEQ ID No.11所示：FKCRRWQWRMKKLGAPSITCVRRAF。
在本发明中，所述组蛋白标签的氨基酸序列如SEQ ID No.12所示：HHHHHH。
本发明所述的融合蛋白中α-Factor信号肽在牛乳铁蛋白肽(LfcinB)融合表达后，可有效引导LfcinB的分泌；单链DNA结合蛋白(TaqSSB)具有较高的耐热性，能够保证本发明所述的融合蛋白在高于90℃的的条件下保持活性；LfcinB能够有效抑制海产品中优势腐败菌的生长；本发明首先构建了牛乳铁蛋白肽与单链DNA结合蛋白的融合蛋白表达体系，目的是降低牛乳铁蛋白肽对宿主细胞的毒性，提高其在表达体系内的稳定性；将牛乳铁蛋白肽与组蛋白标签与和单链DNA结合蛋白融合表达，可以非常方便地优化纯化工艺，提高产物收率；同时由于本发明所述的融合蛋白内含有耐高温的单链DNA结合蛋白，在高温条件下融合蛋白可以维持溶解状态，而其他蛋白则变性沉淀，利用该性质可以很方便优化纯化工艺，得到纯化融合蛋白，提高产物收率。根据本发明具体实施例记载的可知，本发明所述融合蛋白处理的海产品在保存第8天品质良好，说明融合蛋白酶解物溶液能够有效的抑制海产品中的腐败菌，延长海产品的货架期。
本发明提供了上述技术方案所述的牛乳铁蛋白肽融合蛋白的编码基因，所述编码基因的核苷酸如序列SEQ ID No.1所示：AAGCTTATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGGATCCGCTAGAGGTTTGAACCAAGTCTTCTTGATTGGTACTTTGACTGCTAGACCAGATATGAGATATACTCCCGGTGGTTTGGCTATTTTGGATTTGAATTTGGCTGGTCAAGACGCCTTTACTGATGAATCTGGTCAAGAAAGAGAGGTCCCATGGTATCATAGAGTCAGATTGTTGGGTAGACAAGCTGAAATGTGGGGTGATTTGTTGGAAAAAGGTCAATTGATTTTCGTCGAGGGTAGATTGGAATACAGACAATGGGAAAAAGACGGTGAAAAAAAGTCTGAGGTCCAAGTTAGGGCTGAGTTTATTGACCCATTGGAGGGTAGAGGTAGAGAAACTTTGGAAGATGCTAGAGGTCAACCAAGATTGAGAAGAGCTTTGAATCAAGTTATTTTGATGGGCAACCTGACTAGGGACCCAGACTTGAGATACACTCCACAAGGTACTGCTGTTGTTAGATTGGGTTTGGCTGTTAATGAAAGGAGGAGAGGTCAAGAAGAAGAGAGAACTCATTTTTTGGAGGTCCAAGCATGGAGAGAATTGGCTGAATGGGCTTCTGAATTGAGAAAAGGTGATGGTTTGTTGGTCATTGGCAGGTTGGTTAATGACTCTTGGACTTCTTCTTCTGGCGAAAGAAGATTTCAAACTAGGGTCGAGGCTTTGAGATTGGAGAGACCAACTAGAGGTCCAGCTCAAGCTGGTGGTTCTAGACCACCAACTGTTCAAACTGGTGGTGTTGATATTGATGAGGGTTTGGAAGATTTTCCACCAGAGGAAGATTTGCCATTTTTTAAGTGCAGAAGATGGCAGTGGAGAATGAAGAAATTGGGTGCTCCATCTATTACTTGCGTCAGAAGAGCTTTTCATCATCATCATCATCATTAAGAATTC。
在本发明中，所述α-Factor信号肽的编码基因的核苷酸优选如SEQ ID No.2所示：ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCT。
在本发明中，所述单链DNA结合蛋白的编码基因的核苷酸序列优选如SEQ ID No.3所示：GCTAGAGGTTTGAACCAAGTCTTCTTGATTGGTACTTTGACTGCTAGACCAGATATGAGATATACTCCCGGTGGTTTGGCTATTTTGGATTTGAATTTGGCTGGTCAAGACGCCTTTACTGATGAATCTGGTCAAGAAAGAGAGGTCCCATGGTATCATAGAGTCAGATTGTTGGGTAGACAAGCTGAAATGTGGGGTGATTTGTTGGAAAAAGGTCAATTGATTTTCGTCGAGGGTAGATTGGAATACAGACAATGGGAAAAAGACGGTGAAAAAAAGTCTGAGGTCCAAGTTAGGGCTGAGTTTATTGACCCATTGGAGGGTAGAGGTAGAGAAACTTTGGAAGATGCTAGAGGTCAACCAAGATTGAGAAGAGCTTTGAATCAAGTTATTTTGATGGGCAACCTGACTAGGGACCCAGACTTGAGATACACTCCACAAGGTACTGCTGTTGTTAGATTGGGTTTGGCTGTTAATGAAAGGAGGAGAGGTCAAGAAGAAGAGAGAACTCATTTTTTGGAGGTCCAAGCATGGAGAGAATTGGCTGAATGGGCTTCTGAATTGAGAAAAGGTGATGGTTTGTTGGTCATTGGCAGGTTGGTTAATGACTCTTGGACTTCTTCTTCTGGCGAAAGAAGATTTCAAACTAGGGTCGAGGCTTTGAGATTGGAGAGACCAACTAGAGGTCCAGCTCAAGCTGGTGGTTCTAGACCACCAACTGTTCAAACTGGTGGTGTTGATATTGATGAGGGTTTGGAAGATTTTCCACCAGAGGAAGATTTGCCATTT。
在本发明中，所述牛乳铁蛋白肽的编码基因的核苷酸序列优选如SEQ ID No.4所示：TTTAAGTGCAGAAGATGGCAGTGGAGAATGAAGAAATTGGGTGCTCCATCTATTACTTGCGTCAGAAGAGCTTTT。
在本发明中，所述组蛋白标签的编码基因的核苷酸序列优选如SEQ ID No.5所示：CATCATCATCATCATCATTAA。
本发明提供了一种插入有上述技术方案所述编码基因的重组表达载体。本发明所述重组表达载体的质粒为pYES2质粒；本发明优选将所述编码基因插入在pYES2的EcoRI和HindⅢ酶切位点之间。
本发明提供了一种工程菌，包含上述技术方案所述的重组表达载体。本发明对所述工程菌的基础菌没有特殊要求，采用本领域技术人员常规采用的基础菌即可；在本发明具体实施例中，所述工程菌的基础菌优选为酿酒酵母，更优选为酿酒酵母W303-1A。
本发明提供了上述技术方案所述的融合蛋白或所述的编码基因或所述的重组表达载体或者所述的工程菌在制备海产品保鲜防腐剂中的应用。
本发明提供了一种海产品保鲜防腐剂，所述的保鲜防腐剂的有效成分包括上述技术方案所述的融合蛋白或利用上述技术方案所述的工程菌产生的融合蛋白。在本发明中，所述融合蛋白优选为融合蛋白酶解产物；本发明所述保鲜防腐剂中融合蛋白酶解产物的浓度优选为0.1～10μg/mL，进一步优选为1～8μg/mL，更优选为3～7μg/mL，最优选为5μg/mL。在本发明中，所述保鲜防腐剂的使用方法优选包括浸泡或喷洒；所述浸泡的时间优选为10～60min，进一步优选为20～50min，更优选为30～40min；所述浸泡的温度优选为常温；所述喷洒的方式优选为表面喷洒；所述喷洒的剂量优选为1～10ml/100cm2，即1～10ml喷洒100cm2表面积。
本发明所述融合蛋白酶解产物的制备方法优选包括以下步骤：将融合蛋白溶液与酶解液混合，得融合蛋白酶解产物。在本发明中，所述酶解液优选为胃蛋白酶解液；所述酶解液的添加量以添加酶解液所得的酶解融合蛋白液中酶解液的浓度计(酶解液的质量/(酶解液+融合蛋白溶液的总体积)＝酶解液的浓度)，浓度优选为0.1～5mg/ml，即酶解融合蛋白液中酶解液的终浓度优选为0.1～5mg/ml，进一步优选为1～4mg/ml，更优选为2～4mg/ml；所述酶解液的pH优选为1～5，进一步优选为1～2。在本发明中，所述酶解的温度优选为30～40℃，进一步优选为32～38℃，更优选为34～36℃；所述酶解的时间优选为0.5～3h，进一步优选为1.8～3h，更优选为2～3h。在本发明中，所述融合蛋白酶解产物的pH优选为1～8，进一步优选为4～8，更优选为4。本发明所述融合蛋白酶解产物优选采用NaOH溶液调节；所述NaOH溶液的浓度优选为1mol/L。
在本发明中，所述融合蛋白溶液的制备方法优选为：将融合蛋白与PBS溶液混合后，得融合蛋白溶液。在本发明中，所述融合蛋白溶液的浓度优选为10g/L。在本发明中，所述融合蛋白溶液的pH优选为3；所述融合蛋白溶液的pH优选采用盐酸溶液调节；所述盐酸溶液的浓度优选为1mol/L。本发明具体实施例中采用融合蛋白蛋白酶解产物进行大黄鱼的保鲜处理，结果表明该融合蛋白酶解产物在冷藏条件下长期维持大黄鱼的新鲜度。
本发明提供了上述技术方案所述的融合蛋白或利用上述技术方案所述的工程菌产生的融合蛋白或上述技术方案所述的保鲜防腐剂在海产品保鲜和/或防腐中的应用。在本发明中，所述海产品优选包括大黄鱼。
本发明利用融合蛋白进行了大黄鱼鱼肉的保鲜实验，大黄鱼鱼肉保存第8天品质良好，可见融合蛋白能够有效的抑制海产品中的腐败菌，延长海产品的货架期。
本发明上述技术方案所述牛乳铁蛋白肽融合蛋白的制备方法优选包括以下步骤：
将表达上述技术方案所述的牛乳铁蛋白肽融合蛋白的工程菌菌体依次进行破壁、高温变性、His-Tag蛋白纯化磁珠磁性分离后，得牛乳铁蛋白肽融合蛋白。
在本发明中，所述工程菌的制备方法优选包括以下步骤：将表达上述技术方案所述的融合蛋白的重组表达载体转化至基础菌中，得工程菌。本发明对所述基础菌的种类没有特殊限定，采用本领域技术人员所熟知的即可；在本发明具体实施例中，所述基础菌优选为酿酒酵母，更优选为酿酒酵母W303-1A。
在本发明中，所述表达上述技术方案所述的融合蛋白的重组表达载体的制备方法优选为在骨架质粒的EcoRI和HindⅢ酶切位点处插入所述融合蛋白的编码基因的核苷酸序列；所述骨架质粒优选为pYES2。
在本发明中，所述转化的方式优选包括将所述基础菌、质粒和鲑鱼精蛋白DNA混合，得混合液；将所述混合液与酿酒酵母液体培养基混合后依次进行震荡和金属浴，得初级工程菌液；将初级工程菌液与酿酒酵母液体培养基混合后进行第一培养和离心，得沉淀物；将沉淀物与酿酒酵母液体培养基混合后依次进行重悬、涂板和第二培养，得菌落；挑取菌落单克隆进行摇瓶培养，得工程菌。
在本发明中，所述基础菌、质粒和鲑鱼精蛋白DNA的体积比优选为100:2:5；所述鲑鱼精蛋白DNA的浓度优选为10mg/mL。本发明所述震荡优选为剧烈震荡；所述金属浴的时间优选为30min，温度优选为30℃。
在本发明中，所述第一培养的温度优选为28℃，转速优选为220rpm，时间优选为90min；所述离心的时间优选为5s，离心力优选为14000×g。
本发明对所述重悬和涂板的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员常规所熟知的方式即可。在本发明中，所述第二培养的时间优选为3d，温度优选为28℃。
本发明对所述摇瓶培养的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员常规所熟知的方式即可。在本发明具体实施例中，所述摇瓶培养的温度优选为28℃，时间优选为90min，转速优选为220rpm。
在本发明中，所述破壁优选为破壁优选采用组织研磨机破碎；所述破碎时，采用的玻璃珠的质量优选为工程菌菌体等重；所述破碎的时间优选为1min。
所述破壁前，本发明优选将工程菌菌体进行重悬和预冷。在本发明中，所述重悬采用的溶剂优选为市售酵母破碎缓冲液；本发明在重悬时，所述工程菌菌体与酵母破碎缓冲液的质量体积比优选为2g：1ml；所述预冷的温度优选为-20℃，时间优选为1h。
在本发明中，所述高温变性的时间优选为20min，温度优选为80℃。
所述高温变性后，本发明优选包括对高温变性所得变性菌体进行离心，得离心液。在本发明中所述离心的转速优选为5000rpm，时间优选为30min。
在本发明中所述His-Tag蛋白纯化磁珠磁性分离优选包括第一磁性分离、第二磁性分离和第三磁性分离；所述第一磁性分离的方式优选为将离心液置于含含His-Tag蛋白纯化磁珠的离心管混合后进行磁性分离。在本发明中，所述混合优选在旋转混合仪中进行；所述混合的时间优选为20～30min，进一步优选为22～28min，更优选为24～26min。在本发明中，所述磁性分离的具体方式优选为采用磁铁吸附含His-Tag蛋白纯化磁珠。
在本发明中，所述第二磁性分离的方式优选为将第一磁性分离所得沉淀物与PBS溶液混合后进行第二磁性分离。在本发明中，所述第三磁性分离的方式优选为将第二磁性分离所得沉淀物与含咪唑的PBS溶液混合后进行第二磁性分离。
所述His-Tag蛋白纯化磁珠磁性分离后，本发明优选对His-Tag蛋白纯化磁珠磁性分离所得分离物进行冷冻干燥，得融合蛋白。
本发明若融合蛋白不立即使用的话，优选在-20℃储存。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种牛乳铁蛋白肽融合蛋白、编码基因及其在海鲜保鲜和/或防腐中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1表达载体的构建
将α-Factor信号肽与TaqSSB、牛乳铁蛋白肽基因序列依次融合设计，并在3'端添加His标签序列，得到核苷酸如SEQ ID No.6(AAGCTTATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGGATCCGCTCGAGGCCTGAACCAAGTATTCCTCATCGGCACCCTGACCGCCCGCCCCGACATGCGCTACACCCCGGGAGGCCTGGCCATCTTGGACCTGAACCTGGCGGGACAGGATGCCTTCACGGACGAGTCCGGCCAAGAGAGGGAAGTCCCCTGGTACCACCGGGTTAGGCTTCTGGGCCGCCAGGCGGAGATGTGGGGGGACCTTCTGGAAAAGGGCCAGCTCATCTTCGTGGAAGGGCGCCTGGAGTACCGCCAGTGGGAGAAGGACGGGGAGAAGAAGAGCGAAGTGCAGGTGCGGGCCGAGTTCATTGACCCCCTGGAGGGGAGGGGCCGGGAGACCCTGGAGGACGCCCGGGGCCAGCCCAGGCTTCGCCGGGCCCTGAACCAGGTGATCCTCATGGGCAACCTCACCCGGGACCCCGACCTCCGCTACACCCCTCAGGGGACGGCGGTGGTGCGCCTGGGCCTGGCGGTCAACGAGCGCCGCCGGGGCCAGGAAGAGGAGAGGACCCACTTCCTCGAGGTTCAGGCCTGGCGCGAGCTGGCGGAGTGGGCTTCGGAGCTTAGGAAGGGCGACGGGCTTTTGGTCATCGGCCGTTTGGTGAACGACTCCTGGACGAGCTCCAGCGGAGAGAGGCGCTTCCAGACCCGTGTGGAAGCCCTCAGGCTGGAGCGCCCCACCCGTGGGCCTGCCCAAGCCGGCGGAAGCAGGCCCCCCACGGTCCAGACGGGCGGGGTGGACATAGACGAAGGGCTGGAAGACTTCCCGCCGGAGGAGGATTTGCCGTTTTTCAAATGCCGCCGTTGGCAGTGGCGTATGAAAAAACTGGGTGCGCCGTCTATTACCTGCGTGCGTCGCGCGTTCCATCATCATCATCATCATTAAGAATTC)所示的序列。根据酿酒酵母密码子偏好性对融合基因进行优化，得到核苷酸如SEQ ID No.1所述的融合蛋白，即牛乳铁蛋白肽融合蛋白。
将牛乳铁蛋白肽融合蛋白进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，其中PCR引物为5'AAGCTTATGAGATTTCCTTCAA3'(SEQ ID No.7)和5'GAATTCTTAATGATGATGA3'(SEQ ID No.8)；PCR扩增体系程序为：98℃预变性30s，98℃变性5min、55℃(或其他优化退火温度)退火30s、72℃延伸30s进行35个循环，最后72℃延伸10min。
将上面得到的PCR扩增产物和质粒pYES2进行HindIII和EcoRI双酶切(刘辉，邓治，杨洪，代龙军，李德军。橡胶树HbMC2在酵母中的表达和抗逆性分析。生物技术通报.2018,34(09)：202-208)，经1％(W/V)琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，通过胶回收试剂盒把目的片段胶回收。回收后的目的片段加入含有T4连接酶(35U/μl)的酶连反应体系(T4连接酶，灭菌水，10×酶连缓冲液)中，22℃反应2h，得酶连接产物。
将上述酶连接产物，用热激法转化至大肠杆菌DH5α中，然后将转化后的大肠杆菌涂布于5mL含Amp LB固体培养基平板(Amp(氨苄青霉素)终浓度为100μg/mL)，置于37℃恒温培养箱内，先正置10min，后倒置过夜培养。
挑单菌落于5mL含Amp LB培养基(AMP终浓度为100μg/mL)，37℃，220rpm，过夜培养，提取质粒，得质粒pYES2-α-Factor-TaqSSB-LfcinB-His。
经EcoRI和HindШ双酶切鉴定(刘辉，邓治，杨洪，代龙军，李德军。橡胶树HbMC2在酵母中的表达和抗逆性分析。生物技术通报.2018,34(09)：202-208)，鉴定结果如图1所示：泳道1和2分别是未经酶切的质粒pYES2和pYES2-α-Factor-TaqSSB-LfcinB-His，提取物中含有线性、开环和超螺旋等多种构象，因此呈现多个(2～3)条带，泳道3为双酶切后的电泳，得到大小分别为5900bp和1170bp的片段，与预期一致，可见本实施例所构建的pYES2-α-Factor-TaqSSB-LfcinB-His结构正确。
实施例2融合蛋白的制备
将实施例1得到的质粒pYES2-α-Factor-TaqSSB-LfcinB-His转化(陈璐，王嘉良，梁晶丹，邓子新，汪志军。酿酒酵母表达和纯化功能性的铁载体合成蛋白PchE。微生物学报.https://doi.org/10.13343/j.cnki.wsxb.20210137)酿酒酵母W303-1A感受态细胞，具体方法如下：
取100μl酿酒酵母LW303-1A感受态细胞，依次加入2μL质粒pYES2-α-Factor-TaqSSB-LfcinB-His 100ng，5μL鲑鱼精蛋白DNA(10mg/mL)，混匀后，得混合液；在上述混合液中加入600μL酿酒酵母液体培养基(购自北京索莱宝公司)，剧烈震荡，30℃金属浴30min，得初级工程菌液。在初级工程菌液中加入800μL酿酒酵母培养基，28℃，220rpm，培养90min。将菌液室温14000×g，离心5s，弃上清，得沉淀物；将沉淀物用100μL酿酒酵母培养基重悬，涂板，28℃倒置培养3天待菌落长出。随机挑取5个单菌落，PCR鉴定，鉴定结果如图2所示，单菌落中含有融合蛋白基因。PCR鉴定正确后，进行摇瓶培养，28℃，220rpm，培养90min，得工程菌。
融合蛋白的制备：
(1)取2g(湿重)上面培养所得工程菌的菌体与1mL酵母破碎缓冲液混合后进行重悬，在所得重悬液加等重菌体破碎用玻璃珠，放入-20℃冰箱中预冷1h。放入组织研磨机研磨1min破碎。
得到的上清液于80℃加热20min，5000rpm离心30min，得到上清溶液。
(2)将上述的上清溶液加入含His-Tag蛋白纯化磁珠的离心管中，置旋转混合仪上，室温旋转混合30min。将离心管置磁性分离器进行磁性分离(磁铁吸附含His-Tag蛋白纯化磁珠)，在磁场的作用下将磁珠吸附在离心管底部，倾倒去除上清，得沉淀物。
(3)取10ml PBS溶液加入含步骤(2)所得沉淀物的离心管中，轻轻翻转使磁珠悬浮。再次置磁性分离器进行磁性分离，去除上清，得沉淀物。
(4)加入2ml含50mM咪唑的PBS溶液至含步骤(3)所得沉淀物的离心管中，轻轻翻转使磁珠悬浮。置磁性分离器进行磁性分离，收集上清。
(5)将上清液冷冻干燥24h后，得融合蛋白，-20℃储存。
实施例3融合蛋白对腐败希瓦氏菌的抑制作用
取实施例2制备得到的融合蛋白，以PBS溶液溶解，配制成浓度为10g/L的溶液，以1mol/L的盐酸溶液调节pH至3.0左右，加入胃蛋白酶至终浓度为1mg/ml，37℃酶解3h。以1mol/L的NaOH溶液调节pH至4.0左右，作为融合蛋白酶解原液。
用新鲜配制的MHB培养基溶液(称取北京索莱宝公司的MHB培养基21g，溶于800mL蒸馏水中，最后定容到1000mL，121℃高压灭菌15min，4℃保存)，10倍系列稀释融合蛋白酶解原液。
取购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的腐败希瓦氏菌，CGMCC编号为1.3667(图6和图7)，以MHB培养基溶液稀释至5×105CFU/mL，加至96孔细胞培养板中，每孔菌液体积为100μL。将经10倍系列稀释的融合蛋白酶解溶液，依次加入96孔细胞培养板中，每孔体积为10μL。于恒温培养箱37℃、150rpm，培养16h，用酶标仪测定OD600值。以不含融合蛋白酶解原液的培养孔为对照，OD600值小于对照孔50％的融合蛋白酶解物的浓度，记为抑制50％受试菌生长所需的最小抑菌浓度(MIC50)。抑菌曲线见表1和图3。
表1融合蛋白酶解原液对腐败希瓦氏菌的抑菌作用
融合蛋白酶解物蛋白浓度(μg/mL) OD600
0 0.901±0.08
0.078 0.904±0.12
0.156 0.923±0.09
0.312 0.883±0.10
0.625 0.820±0.11
1.25 0.785±0.15
2.5 0.767±0.10
5 0.311±0.16
10 0.156±0.08
20 0.134±0.07
40 0.091±0.05
由表1和图3记载的数据，通过SPSS程序计算，得到MIC50为5μg/mL，可见本发明所述融合蛋白能够有效抑制腐败希瓦氏菌。
实施例4重组融合蛋白对大黄鱼的保鲜作用
上述试验研究表明融合蛋白酶解物对腐败希瓦氏菌有抑制作用，而腐败希瓦氏菌正是大黄鱼的优势腐败菌，因此，采用融合蛋白酶解产物对大黄鱼鱼肉保鲜效果进行研究。
通过对大黄鱼鱼肉色泽、气味、质地的观察和评分来评论其对大黄鱼鱼肉的保鲜效果，具体方法为：
(1)将大黄鱼的鱼肉切成约2cm×2cm的小方块，分成2组，每组设置3个平行；
(2)将A组的鱼肉用水洗涤，并用纸巾擦干水分，编号A1、A2、A3，置于干净的培养皿中；
(3)将B组的鱼肉在4℃冰箱中用浓度为5μg/mL的融合蛋白酶解产物(制备方法同实施例3)溶液浸泡1h，并用纸巾擦干水分，编号B1、B2、B3，置于干净的培养皿中；
(4)将A、B组放4℃冰箱保存，分别于0天、2天、4天、8天、12天取出拍照，并记录感官、气味情况；
(5)将鱼肉的感官表现转化为分值，进行综合感官评分。对贮藏期间大黄鱼鱼肉的色泽、气味、质地进行综合评分，评分标准见表2，评分结果见表3、图4。
表2大黄鱼鱼肉的色泽、气味、质地进行综合评分表
表3大黄鱼鱼肉在贮藏过程中的色泽变化感官测定结果
由表3、图4记载的可知，从观察12天的综合评分曲线可以看出，经融合蛋白酶解物溶液浸泡处理的大黄鱼肉评分明显高于对照组。
对放置2天、4天、8天、12天的大黄鱼肉块进行拍照，结果见图5，A组在第2～4天时与B组(B组中第一个培养皿中的鱼肉的黑色部分为鱼皮)比较变化不明显，但在第8～12天时与B组比较已经腐败得很严重。
综合评分及外观结果表明，A组(经水处理的大黄鱼鱼肉)在第2天品质就有所下降，第8天已经腐败得很严重，散发出恶臭；而B组(融合蛋白酶解物溶液处理)的大黄鱼鱼肉在第8天还有8分，品质良好，保鲜效果明显好于A组，可见融合蛋白酶解物溶液能够有效的抑制大黄鱼的腐败菌，延长大黄鱼货架期。
由上述记载的可知，本发明所述的融合蛋白中α-Factor信号肽在LfcinB融合表达后，可有效引导LfcinB的分泌；TaqSSB具有较高的耐热性，能够保证本发明所述的融合蛋白在高于90℃的条件下保持活性；LfcinB能够有效抑制海产品中优势腐败菌的生长；在上述基因片段的作用下，保证了所述的融合蛋白的稳定性。根据本发明具体实施例记载的可知，本发明所述融合蛋白处理的海产品在保存第8天品质良好，说明本发明所述融合蛋白能够有效的抑制海产品中的腐败菌，延长海产品的货架期。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
序列表
<110> 华侨大学
<120> 一种牛乳铁蛋白肽融合蛋白、编码基因及其在海鲜保鲜和/或防腐中的应用
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1170
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aagcttatga gatttccttc aatttttact gcagttttat tcgcagcatc ctccgcatta 60
gctgctccag tcaacactac aacagaagat gaaacggcac aaattccggc tgaagctgtc 120
atcggttact cagatttaga aggggatttc gatgttgctg ttttgccatt ttccaacagc 180
acaaataacg ggttattgtt tataaatact actattgcca gcattgctgc taaagaagaa 240
ggggtatctc tcgagaaaag agaggctgaa gctggatccg ctagaggttt gaaccaagtc 300
ttcttgattg gtactttgac tgctagacca gatatgagat atactcccgg tggtttggct 360
attttggatt tgaatttggc tggtcaagac gcctttactg atgaatctgg tcaagaaaga 420
gaggtcccat ggtatcatag agtcagattg ttgggtagac aagctgaaat gtggggtgat 480
ttgttggaaa aaggtcaatt gattttcgtc gagggtagat tggaatacag acaatgggaa 540
aaagacggtg aaaaaaagtc tgaggtccaa gttagggctg agtttattga cccattggag 600
ggtagaggta gagaaacttt ggaagatgct agaggtcaac caagattgag aagagctttg 660
aatcaagtta ttttgatggg caacctgact agggacccag acttgagata cactccacaa 720
ggtactgctg ttgttagatt gggtttggct gttaatgaaa ggaggagagg tcaagaagaa 780
gagagaactc attttttgga ggtccaagca tggagagaat tggctgaatg ggcttctgaa 840
ttgagaaaag gtgatggttt gttggtcatt ggcaggttgg ttaatgactc ttggacttct 900
tcttctggcg aaagaagatt tcaaactagg gtcgaggctt tgagattgga gagaccaact 960
agaggtccag ctcaagctgg tggttctaga ccaccaactg ttcaaactgg tggtgttgat 1020
attgatgagg gtttggaaga ttttccacca gaggaagatt tgccattttt taagtgcaga 1080
agatggcagt ggagaatgaa gaaattgggt gctccatcta ttacttgcgt cagaagagct 1140
tttcatcatc atcatcatca ttaagaattc 1170
<210> 2
<211> 267
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgagatttc cttcaatttt tactgcagtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60
ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120
tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180
aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240
tctctcgaga aaagagaggc tgaagct 267
<210> 3
<211> 789
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gctagaggtt tgaaccaagt cttcttgatt ggtactttga ctgctagacc agatatgaga 60
tatactcccg gtggtttggc tattttggat ttgaatttgg ctggtcaaga cgcctttact 120
gatgaatctg gtcaagaaag agaggtccca tggtatcata gagtcagatt gttgggtaga 180
caagctgaaa tgtggggtga tttgttggaa aaaggtcaat tgattttcgt cgagggtaga 240
ttggaataca gacaatggga aaaagacggt gaaaaaaagt ctgaggtcca agttagggct 300
gagtttattg acccattgga gggtagaggt agagaaactt tggaagatgc tagaggtcaa 360
ccaagattga gaagagcttt gaatcaagtt attttgatgg gcaacctgac tagggaccca 420
gacttgagat acactccaca aggtactgct gttgttagat tgggtttggc tgttaatgaa 480
aggaggagag gtcaagaaga agagagaact cattttttgg aggtccaagc atggagagaa 540
ttggctgaat gggcttctga attgagaaaa ggtgatggtt tgttggtcat tggcaggttg 600
gttaatgact cttggacttc ttcttctggc gaaagaagat ttcaaactag ggtcgaggct 660
ttgagattgg agagaccaac tagaggtcca gctcaagctg gtggttctag accaccaact 720
gttcaaactg gtggtgttga tattgatgag ggtttggaag attttccacc agaggaagat 780
ttgccattt 789
<210> 4
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tttaagtgca gaagatggca gtggagaatg aagaaattgg gtgctccatc tattacttgc 60
gtcagaagag ctttt 75
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
catcatcatc atcatcatta a 21
<210> 6
<211> 1170
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aagcttatga gatttccttc aatttttact gcagttttat tcgcagcatc ctccgcatta 60
gctgctccag tcaacactac aacagaagat gaaacggcac aaattccggc tgaagctgtc 120
atcggttact cagatttaga aggggatttc gatgttgctg ttttgccatt ttccaacagc 180
acaaataacg ggttattgtt tataaatact actattgcca gcattgctgc taaagaagaa 240
ggggtatctc tcgagaaaag agaggctgaa gctggatccg ctcgaggcct gaaccaagta 300
ttcctcatcg gcaccctgac cgcccgcccc gacatgcgct acaccccggg aggcctggcc 360
atcttggacc tgaacctggc gggacaggat gccttcacgg acgagtccgg ccaagagagg 420
gaagtcccct ggtaccaccg ggttaggctt ctgggccgcc aggcggagat gtggggggac 480
cttctggaaa agggccagct catcttcgtg gaagggcgcc tggagtaccg ccagtgggag 540
aaggacgggg agaagaagag cgaagtgcag gtgcgggccg agttcattga ccccctggag 600
gggaggggcc gggagaccct ggaggacgcc cggggccagc ccaggcttcg ccgggccctg 660
aaccaggtga tcctcatggg caacctcacc cgggaccccg acctccgcta cacccctcag 720
gggacggcgg tggtgcgcct gggcctggcg gtcaacgagc gccgccgggg ccaggaagag 780
gagaggaccc acttcctcga ggttcaggcc tggcgcgagc tggcggagtg ggcttcggag 840
cttaggaagg gcgacgggct tttggtcatc ggccgtttgg tgaacgactc ctggacgagc 900
tccagcggag agaggcgctt ccagacccgt gtggaagccc tcaggctgga gcgccccacc 960
cgtgggcctg cccaagccgg cggaagcagg ccccccacgg tccagacggg cggggtggac 1020
atagacgaag ggctggaaga cttcccgccg gaggaggatt tgccgttttt caaatgccgc 1080
cgttggcagt ggcgtatgaa aaaactgggt gcgccgtcta ttacctgcgt gcgtcgcgcg 1140
ttccatcatc atcatcatca ttaagaattc 1170
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aagcttatga gatttccttc aa 22
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gaattcttaa tgatgatga 19
<210> 9
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser
1 5 10 15
Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln
20 25 30
Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe
35 40 45
Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu
50 55 60
Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val
65 70 75 80
Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala
85
<210> 10
<211> 263
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Ala Arg Gly Leu Asn Gln Val Phe Leu Ile Gly Thr Leu Thr Ala Arg
1 5 10 15
Pro Asp Met Arg Tyr Thr Pro Gly Gly Leu Ala Ile Leu Asp Leu Asn
20 25 30
Leu Ala Gly Gln Asp Ala Phe Thr Asp Glu Ser Gly Gln Glu Arg Glu
35 40 45
Val Pro Trp Tyr His Arg Val Arg Leu Leu Gly Arg Gln Ala Glu Met
50 55 60
Trp Gly Asp Leu Leu Glu Lys Gly Gln Leu Ile Phe Val Glu Gly Arg
65 70 75 80
Leu Glu Tyr Arg Gln Trp Glu Lys Asp Gly Glu Lys Lys Ser Glu Val
85 90 95
Gln Val Arg Ala Glu Phe Ile Asp Pro Leu Glu Gly Arg Gly Arg Glu
100 105 110
Thr Leu Glu Asp Ala Arg Gly Gln Pro Arg Leu Arg Arg Ala Leu Asn
115 120 125
Gln Val Ile Leu Met Gly Asn Leu Thr Arg Asp Pro Asp Leu Arg Tyr
130 135 140
Thr Pro Gln Gly Thr Ala Val Val Arg Leu Gly Leu Ala Val Asn Glu
145 150 155 160
Arg Arg Arg Gly Gln Glu Glu Glu Arg Thr His Phe Leu Glu Val Gln
165 170 175
Ala Trp Arg Glu Leu Ala Glu Trp Ala Ser Glu Leu Arg Lys Gly Asp
180 185 190
Gly Leu Leu Val Ile Gly Arg Leu Val Asn Asp Ser Trp Thr Ser Ser
195 200 205
Ser Gly Glu Arg Arg Phe Gln Thr Arg Val Glu Ala Leu Arg Leu Glu
210 215 220
Arg Pro Thr Arg Gly Pro Ala Gln Ala Gly Gly Ser Arg Pro Pro Thr
225 230 235 240
Val Gln Thr Gly Gly Val Asp Ile Asp Glu Gly Leu Glu Asp Phe Pro
245 250 255
Pro Glu Glu Asp Leu Pro Phe
260
<210> 11
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Phe Lys Cys Arg Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu Gly Ala Pro
1 5 10 15
Ser Ile Thr Cys Val Arg Arg Ala Phe
20 25
<210> 12
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
His His His His His His
1 5
<210> 13
<211> 385
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser
1 5 10 15
Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln
20 25 30
Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe
35 40 45
Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu
50 55 60
Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val
65 70 75 80
Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala Gly Ser Ala Arg Gly Leu Asn
85 90 95
Gln Val Phe Leu Ile Gly Thr Leu Thr Ala Arg Pro Asp Met Arg Tyr
100 105 110
Thr Pro Gly Gly Leu Ala Ile Leu Asp Leu Asn Leu Ala Gly Gln Asp
115 120 125
Ala Phe Thr Asp Glu Ser Gly Gln Glu Arg Glu Val Pro Trp Tyr His
130 135 140
Arg Val Arg Leu Leu Gly Arg Gln Ala Glu Met Trp Gly Asp Leu Leu
145 150 155 160
Glu Lys Gly Gln Leu Ile Phe Val Glu Gly Arg Leu Glu Tyr Arg Gln
165 170 175
Trp Glu Lys Asp Gly Glu Lys Lys Ser Glu Val Gln Val Arg Ala Glu
180 185 190
Phe Ile Asp Pro Leu Glu Gly Arg Gly Arg Glu Thr Leu Glu Asp Ala
195 200 205
Arg Gly Gln Pro Arg Leu Arg Arg Ala Leu Asn Gln Val Ile Leu Met
210 215 220
Gly Asn Leu Thr Arg Asp Pro Asp Leu Arg Tyr Thr Pro Gln Gly Thr
225 230 235 240
Ala Val Val Arg Leu Gly Leu Ala Val Asn Glu Arg Arg Arg Gly Gln
245 250 255
Glu Glu Glu Arg Thr His Phe Leu Glu Val Gln Ala Trp Arg Glu Leu
260 265 270
Ala Glu Trp Ala Ser Glu Leu Arg Lys Gly Asp Gly Leu Leu Val Ile
275 280 285
Gly Arg Leu Val Asn Asp Ser Trp Thr Ser Ser Ser Gly Glu Arg Arg
290 295 300
Phe Gln Thr Arg Val Glu Ala Leu Arg Leu Glu Arg Pro Thr Arg Gly
305 310 315 320
Pro Ala Gln Ala Gly Gly Ser Arg Pro Pro Thr Val Gln Thr Gly Gly
325 330 335
Val Asp Ile Asp Glu Gly Leu Glu Asp Phe Pro Pro Glu Glu Asp Leu
340 345 350
Pro Phe Phe Lys Cys Arg Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu Gly
355 360 365
Ala Pro Ser Ile Thr Cys Val Arg Arg Ala Phe His His His His His
370 375 380
His
385

Claims (2)

1.牛乳铁蛋白肽融合蛋白、牛乳铁蛋白肽融合蛋白的编码基因、插入有所述编码基因的重组表达载体或含有所述重组表达载体的工程菌在大黄鱼保鲜和/或防腐中的应用；
所述牛乳铁蛋白肽融合蛋白，从N端至C端包括依次连接的α-Factor信号肽、单链DNA结合蛋白、牛乳铁蛋白肽和组蛋白标签；
所述牛乳铁蛋白肽融合蛋白的编码基因的核苷酸如序列SEQ ID No.1所示；
所述牛乳铁蛋白肽融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.13所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述α-Factor信号肽的氨基酸序列如SEQID No.9所示；所述单链DNA结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示；所述牛乳铁蛋白肽的氨基酸序列如SEQ ID No.11所示；所述组蛋白标签的氨基酸序列如SEQ ID No.12所示。
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