CN108251386A - 一种呕吐毒素降解酶及其基因和制备方法及应用以及降解呕吐毒素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物领域，公开了一种呕吐毒素降解酶及其基因和制备方法及应用以及降解呕吐毒素的方法。具体地，本发明提供了一种呕吐毒素降解酶，该呕吐毒素降解酶具有如下(a)和/或(b)所示的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；(b)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中第430‑450位氨基酸残基中的一个或几个经过取代、缺失或添加后仍具有呕吐毒素降解酶活性的氨基酸序列。本发明提供的呕吐毒素降解酶可以高效且快速地降解呕吐毒素，具有良好的工业应用前景。

Description

一种呕吐毒素降解酶及其基因和制备方法及应用以及降解呕 吐毒素的方法

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体地，涉及一种呕吐毒素降解酶，编码该呕吐毒素降解酶的基因，含有该基因的重组载体和菌株，一种添加剂，含有该添加剂的粮油或饲料，表达该呕吐毒素降解酶的方法，和上述呕吐毒素降解酶、基因、重组载体、菌株和添加剂在降解呕吐毒素中的应用，以及降解呕吐毒素的方法。

背景技术

呕吐毒素(vomitoxin)，又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，化学名称为3α,7α,15-三羟基草镰孢菌-9-烯-8-酮，由于它可以引起猪的呕吐而得名，主要是由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、黄色镰刀菌(Fusarium culmorum)感染小麦、大麦、燕麦、玉米等谷物产生的单端孢霉烯族毒素。在全世界范围内，呕吐毒素是粮食、饲料、食品的主要污染霉菌毒素之一，严重影响人和牲畜的健康。人畜摄入了被呕吐毒素污染的食物后，会导致厌食、呕吐、腹泻、发烧、站立不稳、反应迟钝等急性中毒症状，严重时损害造血系统造成死亡，其严重危害性已经引起了各国的普遍重视。

呕吐毒素对我国谷物类原料的污染相当普遍，其检出率和检出量都是霉菌毒素中最高的一种，据甄阳光等人调查显示，中国饲料和原料呕吐毒素的超标比例接近70％，玉米中呕吐毒素的超标率为57.1％，毒素平均含量为1.01mg/kg，最高含量为2.13mg/kg。由于呕吐毒素在谷物、饲料中的普遍存在性、高含量特性和急慢性毒性，降低或者去除其毒性显得尤为重要与迫切。目前，国内外呕吐毒素脱毒方法主要有物理法、化学处理和生物方法三大类。虽然物理、化学方法脱毒已经取得一定程度的成功，但仍然存在脱毒效果有限、可能造成重要营养物质的丢失、成本较高等缺点，从而限制了这两种方法在实际生产中的应用。

生物法主要是利用微生物或其降解产物进行毒素降解的过程，具有可以在温和的条件下使毒素的毒力降低，对原料的感官性状、适口性、营养物质影响较小等优点，同时，还具有安全、环保、高效的特点，被认为是最佳脱毒方法。因此，利用现代生物技术去除粮油或/饲料中呕吐毒素的研究具有良好的应用前景。专利申请CN103243047A中公开了一株高效降解呕吐毒素的枯草芽孢杆菌及其应用，将900μL枯草芽孢杆菌ANSB471发酵液与100μL呕吐毒素(100μg/ml)反应，反应2小时对呕吐毒素的降解率为25％，反应24小时对呕吐毒素的降解率为56％，反应48小时对呕吐毒素的降解率为80％，降解率尚有待提高。

另外，现有的降解呕吐毒素的生物法大多是在温和的条件(如温度25-37℃且最高不超过40℃，pH为7左右)下进行，然而，在较高的温度负荷下(如在容器中进行运输期间或在饲料粒化期间的情况下)或苛刻的酸碱性条件下尚无较好的解决办法，这就限制了生物法在降解呕吐毒素中的应用范围。

因此，有必要寻找一种高效的且安全性高的，并且在较高的温度负荷或苛刻的酸碱条件下可以使用的生物降解呕吐毒素的方法。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的上述缺陷，提供了一种呕吐毒素降解酶，编码该呕吐毒素降解酶的基因，含有该基因的重组载体和菌株，一种添加剂，表达该呕吐毒素降解酶的方法，和上述呕吐毒素降解酶、基因、重组载体、菌株和添加剂在降解呕吐毒素中的应用，以及降解呕吐毒素的方法。

为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种呕吐毒素降解酶，其中，该呕吐毒素降解酶具有如下(a)和/或(b)所示的氨基酸序列：

(a)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；

(b)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中第430-450位氨基酸残基中的一个或几个经过取代、缺失或添加后仍具有呕吐毒素降解酶活性的氨基酸序列。

第二方面，本发明还提供了一种编码呕吐毒素降解酶的基因，其中，该基因具有编码上述呕吐毒素降解酶的核苷酸序列。

第三方面，本发明还提供了一种重组载体，其中，该重组载体含有上述基因。

第四方面，本发明还提供了一种菌株，其中，该菌株含有上述基因或者上述重组载体。

第五方面，本发明还提供了一种添加剂，其中，该添加剂含有上述呕吐毒素降解酶，和/或含有上述菌株的发酵产物。

第六方面，本发明还提供了一种粮油或饲料，其中，该粮油或饲料含有上述呕吐毒素降解酶或添加剂。

第七方面，本发明还提供了一种表达呕吐毒素降解酶的方法，其中，该方法包括：将上述重组载体导入宿主，诱导编码呕吐毒素降解酶的基因在所述宿主中表达；或者，诱导上述菌株表达呕吐毒素降解酶。

第八方面，本发明还提供了上述呕吐毒素降解酶、基因、重组载体、菌株或者添加剂在降解呕吐毒素中的应用。

第九方面，本发明还提供了一种降解呕吐毒素的方法，该方法包括：在酶降解反应的条件下，将酶剂与待处理的样品接触；其中，当所述酶剂含有上述呕吐毒素降解酶或者上述添加剂时，所述酶降解反应的条件包括：温度为25-55℃，pH值为3-9；或者，当所述酶剂含有具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的呕吐毒素降解酶时，所述酶降解反应的条件包括：温度为40-55℃，pH值为4-9。

本发明的发明人在研究过程中发现，本发明提供的呕吐毒素降解酶可以高效且快速地降解呕吐毒素，具有良好的工业应用前景。并且，本发明提供的呕吐毒素降解酶还具有耐酸碱和耐高温的特性，这进一步扩大了其应用的范围。

另外，本发明使用酿酒酵母、地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌作为宿主菌株，将其产生的发酵产物直接添加于粮油和/或饲料中，对粮油和/或饲料的适口性的影响较小；而现有技术中通常使用大肠杆菌作为宿主菌株，将其产生的发酵产物添加至粮油和/或饲料中，会影响粮油和/或饲料的适口性。可见，通过本发明提供的方法制备得到的呕吐毒素降解酶具有更为广阔的应用前景，特别是应用于粮油和/或饲料中。

本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

第一方面，本发明提供了一种呕吐毒素降解酶，其中，该呕吐毒素降解酶具有如下(a)和/或(b)所示的氨基酸序列：

(a)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；

(b)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中第430-450位氨基酸残基中的一个或几个经过取代、缺失或添加后仍具有呕吐毒素降解酶活性的氨基酸序列。其中，仍具有呕吐毒素降解酶活性是指在相同的测定条件下，由(a)衍生的蛋白质对呕吐毒素的降解率与(a)对呕吐毒素的降解率之间的百分比(相对活性)不低于90％(或91％，或92％，或93％，或94％，或95％，或96％，或97％，或98％，或99％，或100％，或大于100％)。

组成蛋白质的20种氨基酸残基，按照侧链极性可以分成四类：1、非极性的氨基酸：丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)和脯氨酸(Pro)；2、极性不带电荷的氨基酸：甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、天冬氨酸(Asn)、谷氨酰胺(Gln)和酪氨酸(Tyr)；3、带正电荷的氨基酸：精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)和组氨酸(His)；4、带负电荷的氨基酸：天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)(参见“生物化学”(第二版)上册，沈同、王镜岩，第82-83页，高等教育出版社，1990年12月)。蛋白质中如果发生同属一个类别的氨基酸残基取代，例如由Arg取代Lys或由Leu取代Ile，所述残基在蛋白质结构域中所起的作用(比如提供正电荷或形成疏水囊袋结构的作用)没有改变，因此对蛋白质的立体结构并不会产生影响，因此仍然可以实现蛋白的功能。所述同属一个类别的氨基酸残基取代可以发生在上述酶的任意一个氨基酸残基位置上。

如前所述，本发明提供的酶还可以进行修饰或突变，得到衍生的蛋白质。本发明所述“衍生的蛋白质”指与具有上述氨基酸序列的酶具有氨基酸序列上的差异，也可以有不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白包括天然或诱导的遗传变异体。所述诱导变异体可以通过各种技术得到，如辐射或诱变剂等产生的随机突变，也可以通过如定点突变法或其他已知分子生物学的技术。所述“衍生的蛋白质”还包括具有天然L型氨基酸的残基的类似物(如D型氨基酸)，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β-氨基酸、γ-氨基酸等)的类似物。

修饰(通常不改变一级结构，即不改变氨基酸序列)形式包括：体内或体外的蛋白的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的蛋白。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白。

为了方便纯化，还可以采用本领域常见的标签(如Poly-Arg、Poly-His、FLAG、Strep-tagⅡ和c-myc中的至少一种)对(a)或(b)进行添加修饰。举例来说，(b)可以通过在(a)的氨基末端和/或羧基末端连接标签(如Poly-Arg、Poly-His、FLAG、Strep-tagⅡ和c-myc中的至少一种)而获得(即，(b)为SEQ ID NO：2的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列)。所述标签不会影响本发明提供的酶的活性，在实际应用过程中，可以根据需求选择是否添加标签。

在优选的情况下，所述呕吐毒素降解酶具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4或SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，或者，在SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列。

本发明的呕吐毒素降解酶可以通过人工合成得到，也可以先合成其编码基因，再通过生物表达获得。

第二方面，本发明还提供了一种编码呕吐毒素降解酶的基因，其中，该基因具有编码上述呕吐毒素降解酶的核苷酸序列。

本领域公知的是，组成蛋白质的20种不同的氨基酸中，除Met(ATG)或Trp(TGG)分别为单一密码子编码外，其他18种氨基酸分别由2-6个密码子编码(Sambrook等，分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989，见950页附录D)。即由于遗传密码子的简并性，决定一个氨基酸的密码子大多不止一个，三联体密码子中第三个核苷酸的置换，往往不会改变氨基酸的组成，因此编码相同蛋白的基因的核苷酸序列可以不同。本领域人员根据公知的密码子表，从本发明公开的氨基酸序列，以及由所述氨基酸序列得到的酶活性不变的氨基酸序列，完全可以推导出能够编码它们的基因的核苷酸序列，通过生物学方法(如PCR方法、突变方法)或化学合成方法得到所述核苷酸序列，因此该部分核苷酸序列都应该包括在本发明范围内。相反，利用本文公开的DNA序列，也可以通过本领域公知的方法，例如Sambrook等的方法(分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989)进行，通过修改本发明提供的核酸序列，得到与本发明所述酶的活性一致的氨基酸序列。

在优选的情况下，所述基因具有SEQ ID NO：7(编码SEQ ID NO：2所示的呕吐毒素降解酶)、SEQ ID NO：8(编码SEQ ID NO：3所示的呕吐毒素降解酶)、SEQ ID NO：9(编码SEQID NO：4所示的呕吐毒素降解酶)或SEQ ID NO：10(编码SEQ ID NO：5所示的呕吐毒素降解酶)所示的核苷酸序列。

如上所述，相应地，核苷酸序列的5'端和/或3'端还可以连接有本领域常见的标签(如Poly-Arg、Poly-His、FLAG、Strep-tagⅡ和c-myc中的至少一种)的编码序列。

本发明提供的核苷酸序列通常可以用聚合酶链式反应(PCR)扩增法、重组法或人工合成的方法获得。例如，本领域技术人员根据本发明所提供的核苷酸序列，可以很容易得到模板和引物，利用PCR进行扩增获得有关序列。

一旦获得了有关核苷酸序列，就可以用重组法大批量的获得有关氨基酸序列。通常将所得核苷酸序列克隆入载体，再转入宿主中，然后通过常规的方法从增殖后的宿主细胞分离得到有关核苷酸序列。

此外，还可用公知的人工化学合成的方法来合成有关核苷酸序列。

第三方面，本发明还提供了一种重组载体，其中，该重组载体含有上述基因。

在本发明中，所述重组载体可以含有本发明提供的上述基因。重组载体中使用的“载体”可选用本领域已知的各种载体，如市售的各种质粒、粘粒、噬菌体及反转录病毒等，本发明优选使用质粒作为载体。重组载体的构建可以采用能够在载体多克隆位点具有切割位点的各种核酸内切酶(如对于pUC18，可以使用SalI、BamH I、EcoRI等；对于pPICZɑA，可以使用NdeI、NheI、EcoRI、BamH I、Hind III等；对于PET30a，可以使用BamH I、Hind III、NdeI、XhoI等)进行酶切获得线性质粒，与采用相同核酸内切酶切割的基因片段连接，获得重组质粒。本发明优选采用NdeI和XhoI双酶切PET30a载体及与其连接的基因片段，经连接酶连接，构建得到重组载体。

第四方面，本发明还提供了一种菌株，其中，该菌株含有上述基因或者上述重组载体。

在本发明中，所述菌株可以为含有本发明所述基因的菌株，也可以通过本领域常规的方法将上述重组载体转化、转导或者转染到宿主中以获得的重组菌株，如氯化钙法、化学转化或电击转化，优选电击转化。

根据本发明，所述菌株(或宿主)可以为细菌和/或真菌；优选地，所述菌株为球菌、杆菌、螺旋菌、酵母和霉菌中的至少一种；更优选地，所述菌株为酿酒酵母、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、乳酸肠球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德式乳杆菌乳酸亚种、植物乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、产朊假丝酵母、酿酒酵母、沼泽红假单胞菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、嗜热链球菌、罗伊氏乳杆菌、动物双歧杆菌、黑曲霉、米曲霉、迟缓芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、纤维二糖乳杆菌、发酵乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、产丙酸丙酸杆菌、布氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、凝结芽孢杆菌和侧孢短芽孢杆菌中的至少一种；进一步优选地，所述菌株为地衣芽孢杆菌(Bacillus lincheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的至少一种。

第五方面，本发明还提供了一种添加剂，其中，该添加剂含有本发明提供的呕吐毒素降解酶，和/或含有上述菌株的发酵产物。

在优选的情况下，所述添加剂以本发明提供的呕吐毒素降解酶作为活性成分。以所述添加剂的总重量为基准，所述呕吐毒素降解酶的含量为10-90重量％。

在本发明中，所述添加剂中还可以含有本领域技术人员公知的溶剂(如甘油、糖类和蛋白酶抑制剂等蛋白保护剂)、激动剂等。

在本发明中，所述添加剂还可以含有如前所述的菌株，在此不再赘述。

在本发明中，所述添加剂优选作为粮油和/或饲料添加剂。

第六方面，本发明还提供了一种粮油或饲料，其中，该粮油或饲料含有上述呕吐毒素降解酶或添加剂。以所述粮油或饲料的总重量为基准，所述呕吐毒素降解酶的含量为1-10ppm，优选为2-8ppm，更优选为4-6ppm。在本发明中，当所述粮油或饲料为液体时，“ppm”表示的是“μg/mL”；当所述粮油或饲料为固体时，“ppm”表示的是“μg/g”。

在本发明中，术语“粮油”是指对谷类、豆类等粮食和油料及其加工成品和半成品的统称，特别是指人类可以食用的产品。例如，所述粮油可以为本领域常见的人类可以食用的粮油产品，具体地，所述粮油可以包括谷物及其农副产品、油和脂肪制品、酒类、奶及其制品等中的至少一种。

在本发明中，术语“饲料”是指农业或牧业饲养的动物的食物的总称。例如，所述饲料可以为本领域常见的饲养动物所使用的食物，具体地，所述饲料可以包括：a)谷类，例如小粒谷物(如小麦、大麦、裸麦、燕麦以及它们的组合)和/或大粒谷物如玉蜀黍或高粱；b)来自谷类的副产物，例如玉米蛋白粉、干酒糟及可溶物(DDGS)、麦麸、小麦粗粉、小麦次粉、米糠、稻壳、燕麦壳，棕榈仁和柑橘渣；c)青贮饲料；d)得自如下来源的蛋白质：例如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、卡诺拉、鱼粉、干血浆蛋白、肉和骨粉、马铃薯蛋白、乳清、干椰肉、芝麻；e)从植物和动物来源获得的油和脂肪；f)矿物质和维生素。

在本发明中，所述粮油或饲料还可以含有生理学上可接受的载体，其中，所述生理上可接受的载体选自如下物质中的至少一种：麦芽糖糊精、石灰石(碳酸钙)、环糊精、小麦、麦麸或小麦组分、稻米或米糠、蔗糖、淀粉、Na₂SO₄和滑石粉以及它们的混合物。

第七方面，本发明还提供了一种表达呕吐毒素降解酶的方法，其中，该方法包括：将上述重组载体导入宿主，诱导编码呕吐毒素降解酶的基因在所述宿主中表达；或者，诱导上述菌株表达呕吐毒素降解酶。

根据本发明，所述宿主可以为细菌和/或真菌；优选地，所述宿主为球菌、杆菌、螺旋菌、酵母和霉菌中的至少一种；更优选地，所述宿主为酿酒酵母、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、乳酸肠球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德式乳杆菌乳酸亚种、植物乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、产朊假丝酵母、酿酒酵母、沼泽红假单胞菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、嗜热链球菌、罗伊氏乳杆菌、动物双歧杆菌、黑曲霉、米曲霉、迟缓芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、纤维二糖乳杆菌、发酵乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、产丙酸丙酸杆菌、布氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、凝结芽孢杆菌和侧孢短芽孢杆菌中的至少一种；进一步优选地，所述宿主为地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母中的至少一种。

在本发明中，可以采用本领域常规使用的方式将上述重组载体导入宿主，例如，氯化钙法、化学转化或电击转化，优选电击转化。

在本发明中，诱导表达的条件可以包括：温度为30-40℃，pH值为6-8，时间为12-72h。优选地，诱导表达的条件包括：温度为35-40℃，pH值为6.5-7.5，时间为24-72h。

第八方面，本发明还提供了上述呕吐毒素降解酶、基因、重组载体、菌株或者添加剂在降解呕吐毒素中的应用，优选为在降解粮油和/或饲料中的呕吐毒素中的应用。

第九方面，本发明还提供了一种降解呕吐毒素的方法，该方法包括：在酶降解反应的条件下，将酶剂与待处理的样品接触；其中，当所述酶剂含有上述呕吐毒素降解酶或者上述添加剂时，所述酶降解反应的条件包括：温度为25-55℃，pH值为3-9；优选地，温度为30-40℃，pH值为6-8。

在本发明中，当所述酶剂含有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的呕吐毒素降解酶时，所述酶降解反应的条件包括：温度为40-55℃，pH值为4-9。

在本发明中，以所述待处理的样品的总重量为基准，所述呕吐毒素降解酶的用量为1-10ppm，优选为2-8ppm，更优选为4-6ppm。在本发明中，当所述待处理的样品为液体时，“ppm”表示的是“μg/mL”；当所述待处理的样品为固体时，“ppm”表示的是“μg/g”。

在本发明中，所述酶降解反应的时间可以为1-48h，优选为12-36h。

在本发明中，对所述酶剂的形式并没有特别的限定，只要保证加入所述酶剂后可以使所述待处理的样品中呕吐毒素降解即可，例如，所述酶剂的形式可以为液体，也可以为冷冻干燥后的干粉。

根据本发明，所述待处理的样品可以为粮油和/或饲料。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

以下实施例和对比例中，呕吐毒素标准品购于Sigma公司；“室温”指“25℃”。

LB液体培养基的配制：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，补水至1000mL，115℃灭菌20min备用，pH 7。

按照《GB/T 30956-2014饲料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定免疫亲和柱净化－高效液相色谱法》测定呕吐毒素含量。

呕吐毒素的降解率(％)＝(反应前样品中呕吐毒素的量-反应后样品中呕吐毒素的量)/反应前样品中呕吐毒素的量×100％。

实施例1

本实施例用于说明本发明提供的呕吐毒素降解酶及其制备方法和应用。

(1)基因的获得

通过人工化学合成法合成(委托宝生物工程(大连)有限公司，下同)如下核苷酸序列：在如SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的5’端添加保护性碱基CGC和NdeI酶切位点，在3’端添加保护性碱基CCG和XhoI酶切位点，以获得相应的基因片段。

(2)重组质粒的构建

使用限制性内切酶NdeI和XhoI(购自NEB公司)分别对步骤(1)的基因片段和PET30a质粒(具有His标签，购于美国Invitrogen公司)进行双酶切，于37℃水浴酶切4h，酶切体系(50μL)如下：

将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳后，纯化回收目的片段(分别为质粒酶切片段和基因酶切片段)。然后，使用T4连接酶(购于Takara公司)进行酶连，于室温下连接4h，获得重组质粒。使用的连接体系(10μL)如下：

然后对获得的重组质粒进行PCR验证，并对PCR产物进行测序验证。PCR使用的上游引物和下游引物分别如SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示，PCR扩增条件为：98℃ 1min；98℃ 15s，68℃ 7min，循环30次；72℃ 3min；4℃保持。

然后将PCR产物进行凝胶电泳，结果显示得到约1350bp的片段，大小与预期相符，并且测序结果显示PCR产物中含有SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列，这表明重组质粒构建成功。

(3)重组菌株的获得

在Bio-Rad Gene Pulse电转仪上使用由步骤(2)获得的重组质粒电转BL21(DE3)PlysS大肠杆菌菌株(购自北京华越洋生物科技有限公司，货号为NRR01330，下同)，电转化条件为：电压1500V，电容25μF，电阻200Ω，转化时间随DNA样品的不同而变化，并由仪器自动给出，通常在3.5-4s范围内。然后，将转化后的细胞涂布于含有氯霉素(Cam)的LB固体平板上进行筛选，于37℃倒置培养2天，挑取阳性菌落接种于LB液体培养基中，以获得重组菌株。

(4)酶的制备

将得到的重组菌株接种于LB液体培养基(牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，补水至1000mL，115℃灭菌20min备用，pH 7)中，于37℃培养3天至OD₆₀₀值在2-6之间，收集菌悬液冰浴30min，在4℃条件下，10000rpm离心20min，离心收集菌体，用磷酸盐缓冲液(PBS，135mMNaCl，2.7mM KCl，1.5mM KH₂PO_4，8mM K₂HPO₄，pH 7.2)溶液悬浮后，超声波破碎，然后在4℃条件下，10000rpm离心20min，收集上清液，获得粗酶液。

将粗酶液置于冰上，缓慢加入磨碎的硫酸铵粉末，边加边搅拌，添加到硫酸铵饱和为止。在4℃静置24h，12000r/min离心50min，弃上清，用少量PBS(pH 7.2)溶解沉淀。将PBS溶解的沉淀透析，除去硫酸铵，重悬于缓冲液(pH 7.4，50mM NaCl，含10mM咪唑)中。根据表达出的重组酶含有His标签，利用Ni柱进行亲和层析纯化，1mL/min平衡Ni柱后，以流量0.5mL/min直接将重悬的粗酶液上样；继续使用缓冲液(pH 7.4，50mM NaCl，含10mM咪唑)1mL/min洗脱未吸附或吸附的非特异性杂蛋白；以缓冲液(pH 7.4，50mM NaCl，500mM咪唑)洗脱收集目的蛋白，以获得纯化的酶液。

(5)酶的活性检测

取900μL步骤(4)得到的酶液置于1.5mL离心管中，加入呕吐毒素标准品溶液，混合均匀，得到混合液，其中，混合液中呕吐毒素的终浓度为50ppm。

①反应时间对酶活性的影响

将上述混合液于37℃、pH 7的条件下进行反应，分别在反应1h、12h、24h、36h、48h时取反应的样品20μL用于检测呕吐毒素的残留。结果如表1所示。

通过表1的结果可知，反应24h可以使呕吐毒素的降解率达90％以上。因此，在接下来的实验中以24h作为反应时间。

②温度对酶活性的影响

将6份上述混合液分别于25℃、30℃、40℃、45℃、50℃和55℃，pH值为7的条件下反应24h后，取反应后的样品20μL用于检测呕吐毒素的残留。结果如表2所示。

③pH对酶活性的影响

将7份上述混合液分别于37℃下，pH值为2、3、4、5、6、8和9的条件下反应24h，取反应后的样品20μL用于检测呕吐毒素的残留。结果如表3所示。

实施例2

本实施例用于说明本发明提供的呕吐毒素降解酶及其制备方法和应用。

根据实施例1的方法制备呕吐毒素降解酶，所不同的是，使用人工化学合成法合成的如SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列代替实施例1步骤(1)中的SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。

反应时间对酶活性的影响的结果如表1所示，温度对酶活性的影响的结果如表2所示，pH对酶活性的影响的结果如表3所示。

实施例3

本实施例用于说明本发明提供的呕吐毒素降解酶及其制备方法和应用。

根据实施例1的方法制备呕吐毒素降解酶，所不同的是，使用人工化学合成法合成的如SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列代替实施例1步骤(1)中的SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。

反应时间对酶活性的影响的结果如表1所示，温度对酶活性的影响的结果如表2所示，pH对酶活性的影响的结果如表3所示。

实施例4

本实施例用于说明本发明提供的呕吐毒素降解酶及其制备方法和应用。

根据实施例1的方法制备呕吐毒素降解酶，所不同的是，使用人工化学合成法合成的如SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列代替实施例1步骤(1)中的SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。

反应时间对酶活性的影响的结果如表1所示，温度对酶活性的影响的结果如表2所示，pH对酶活性的影响的结果如表3所示。

实施例5

本实施例用于说明本发明提供的呕吐毒素降解酶及其制备方法和应用。

根据实施例1的方法制备呕吐毒素降解酶，所不同的是，使用如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列代替实施例1步骤(1)中的SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。

反应时间对酶活性的影响的结果如表1所示，温度对酶活性的影响的结果如表2所示，pH对酶活性的影响的结果如表3所示。

实施例6

本实施例用于说明本发明提供的呕吐毒素降解酶及其制备方法和应用。

根据实施例1的方法制备呕吐毒素降解酶，所不同的是，使用人工化学合成法合成的如SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列代替实施例1步骤(1)中的SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。

反应时间对酶活性的影响的结果如表1所示，温度对酶活性的影响的结果如表2所示，pH对酶活性的影响的结果如表3所示。

实施例7

本实施例用于说明本发明提供的呕吐毒素降解酶及其制备方法和应用。

根据实施例1的方法制备呕吐毒素降解酶，所不同的是，将SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列克隆至酵母表达载体pYES2(购自ThermoFisher Scientific公司，货号为V82520)，然后将得到的重组载体转化INVSc1酿酒酵母(购自ThermoFisher Scientific公司，货号为C81000)，以获得重组菌株。

反应时间对酶活性的影响的结果如表1所示，温度对酶活性的影响的结果如表2所示，pH对酶活性的影响的结果如表3所示。

实施例8

本实施例用于说明本发明提供的呕吐毒素降解酶及其制备方法和应用。

根据实施例1的方法制备呕吐毒素降解酶，所不同的是，将强启动子P43、SEQ IDNO：7所示的核苷酸序列克隆至载体pHY300PLK上，然后将得到的重组载体转化地衣芽孢杆菌ATCC14580(地衣芽孢杆菌ATCC14580购自ATCC(美国模式培养物集存库))，以获得重组菌株。

反应时间对酶活性的影响的结果如表1所示，温度对酶活性的影响的结果如表2所示，pH对酶活性的影响的结果如表3所示。

实施例9

本实施例用于说明本发明提供的呕吐毒素降解酶及其制备方法和应用。

根据实施例1的方法制备呕吐毒素降解酶，所不同的是，将SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列克隆至表达载体pHT43上，然后将得到的重组载体转化枯草芽孢杆菌WB800N(表达载体pHT43和枯草芽孢杆菌WB800N均购自NTCC典型培养物保藏中心-BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心)，以获得重组菌株。

反应时间对酶活性的影响的结果如表1所示，温度对酶活性的影响的结果如表2所示，pH对酶活性的影响的结果如表3所示。

对比例1

根据实施例1的方法制备呕吐毒素降解酶，所不同的是，使用未转入基因的空白载体PET30a质粒代替实施例1中使用的重组质粒。

对比例2

根据实施例1的方法制备呕吐毒素降解酶，所不同的是，使用人工化学合成法合成的如SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列代替实施例1步骤(1)中的SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。

反应时间对酶活性的影响的结果如表1所示，温度对酶活性的影响的结果如表2所示，pH对酶活性的影响的结果如表3所示。

表1

表2

表3

测试实施例1

分别将实施例1-4获得的粗酶液与污染有200ppm呕吐毒素的玉米粉混合，以玉米粉的重量为基准，通过测定粗酶液中酶的含量控制混合物中酶的终浓度为5ppm，于37℃、pH为7的条件下反应24h，经测定，呕吐毒素降解率分别为94.0％、94.3％、94.5％和95.0％。但是，上述粗酶液的添加对玉米粉的适口性产生一定的影响(即，混入粗酶液后玉米粉的适口性发生变化)。

另外，将实施例4获得的粗酶液与污染有20ppm呕吐毒素的玉米粉混合，以玉米粉的重量为基准，通过测定粗酶液中酶的含量控制混合物中酶的终浓度为5ppm，于37℃、pH为7的条件下反应12h，经测定，并无呕吐毒素残留。

另外，将实施例4获得的粗酶液与污染有5ppm呕吐毒素的玉米粉混合，以玉米粉的重量为基准，通过测定粗酶液中酶的含量控制混合物中酶的终浓度为5ppm，于37℃、pH为7的条件下反应6h，经测定，并无呕吐毒素残留。

测试实施例2

按照测试实施例1的方法进行，所不同的是，分别使用实施例7-9获得的粗酶液代替测试实施例1中使用的粗酶液。经测定，呕吐毒素降解率分别为88.0％、84.4％和84.8％。并且，上述粗酶液的添加未对玉米粉的适口性产生任何的影响。

通过以上实施例1-9与对比例1-2的结果相比较可知，本发明提供的呕吐毒素降解酶可以高效且快速地降解呕吐毒素，具有良好的工业应用前景。并且，本发明提供的呕吐毒素降解酶还具有耐酸碱和耐高温的特性，这进一步扩大其应用的范围。

另外，将测试实施例1与测试实施例2的结果相对比可知，测试实施例2分别使用酿酒酵母、地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌作为宿主菌株，将其产生的呕吐毒素降解酶或者其发酵产物添加于粮油和/或饲料中，粮油和/或饲料的适口性的影响较小；而测试实施例1中使用大肠杆菌作为宿主菌株，将其产生的发酵产物添加至粮油和/或饲料中，会影响粮油和/或饲料的适口性。可见，通过本发明提供的方法制备得到的呕吐毒素降解酶具有更为广阔的应用前景，特别是应用于粮油和/或饲料中。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

SEQUENCE LISTING

<110> 中粮营养健康研究院有限公司

中粮集团有限公司

中粮生化能源（榆树）有限公司

吉林中粮生化有限公司

中粮生物化学（安徽）股份有限公司

<120> 一种呕吐毒素降解酶及其基因和制备方法及应用以及降解呕吐毒素的方法

<130> I40377COF

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 454

<212> PRT

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caacaacctt tcatggtcaa gatctacacc caagtcagct tctgcttccc aatcaccgac 120

ccctccacac atcctgccat caccgccacc atcaaaaatg gtctgcagcg tctctcgcag 180

agtttcccct gggtagcagg ccaagtgaag gacgatggta cgggcgtatt caagataaaa 240

ccattcgagg cgacaccgag actggtagtc aaggatcttc gagatgaccc ctcagcaccg 300

acaatggagg gcttgagaaa ggcagagttc cccatgagca tgtttgacga gaacaaaatc 360

gcgccaaaga agactcttcc tattggaccc gattactcgc ctgatgatcc tcttcctgtg 420

ctgatctttc agctcaattt tattgagggc gggcttatac tcactgttaa tgggcagcat 480

ggctgcatgg acatgacggg ccaggatgag ctcattcggc tactgtcgaa ggcctgtcgc 540

gacgaggctt tcacgcaaga agagatatca acaatgaacc ttgagcgcaa gaccattgtt 600

cctcctctcg aaaattacga actcggcccg gagctggatc atcaaatcat maaaccccct 660

ccaaccactg agaccccacc agcaccgcca aaagcaagct gggcattttt ctcattcagt 720

ccacaagccc tctctgatct caaagacaag gcaacacaga ctcttgaagc aggcacgaaa 780

ttcgtttcaa cagatgatgc tctctcagcg ttcatctggc aatccgtcag ccgcgcccgc 840

cgtgctcgtc tagatgattc cacctcgact caattctgtc gcgccgttga tgtgcgcact 900

caactggatg tacccaagaa ctacccagga atcctccaaa acatgaccta cagcgtctcg 960

aaactctctc atatagccaa tgagccactc ggcatcgtgg catctcgctt gcggtctgaa 1020

ctcggccgcg atgatcttcg ccggcgaaca caagccctgg taacatatct gcacgaccag 1080

acgaacaggg caagcgtatc tgtcacagcg gacgcgaatc catcgacgga tattatgttg 1140

agttcatggg cgaagctgaa atgctgggac tatgactttg gtcttggact aggaaagcca 1200

gagagtgtga ggaggccatt gttcgagccg tttgagagtt tgatgtatct tatgcccaag 1260

agacccgatg gagaaattac tgctgcgtta tcgctgaggg atgaggatat ggagacattg 1320

aaacaagacg agaagtggaa aaagtatggg caattcattg gctag 1365

<210> 8

<211> 1365

<212> DNA

<213> 呕吐毒素降解酶

<400> 8

atgactgcac taaacattac aaacatggtc gacctagaca tagagctgga catcatcggc 60

caacaacctt tcatggtcaa gatctacacc caagtcagct tctgcttccc aatcaccgac 120

ccctccacac atcctgccat caccgccacc atcaaaaatg gtctgcagcg tctctcgcag 180

agtttcccct gggtagcagg ccaagtgaag gacgatggta cgggcgtatt caagataaaa 240

ccattcgagg cgacaccgag actggtagtc aaggatcttc gagatgaccc ctcagcaccg 300

acaatggagg gcttgagaaa ggcagagttc cccatgagca tgtttgacga gaacaaaatc 360

gcgccaaaga agactcttcc tattggaccc gattactcgc ctgatgatcc tcttcctgtg 420

ctgatctttc agctcaattt tattgagggc gggcttatac tcactgttaa tgggcagcat 480

ggctgcatgg acatgacggg ccaggatgag ctcattcggc tactgtcgaa ggcctgtcgc 540

gacgaggctt tcacgcaaga agagatatca acaatgaacc ttgagcgcaa gaccattgtt 600

cctcctctcg aaaattacga actcggcccg gagctggatc atcaaatcat maaaccccct 660

ccaaccactg agaccccacc agcaccgcca aaagcaagct gggcattttt ctcattcagt 720

ccacaagccc tctctgatct caaagacaag gcaacacaga ctcttgaagc aggcacgaaa 780

ttcgtttcaa cagatgatgc tctctcagcg ttcatctggc aatccgtcag ccgcgcccgc 840

cgtgctcgtc tagatgattc cacctcgact caattctgtc gcgccgttga tgtgcgcact 900

caactggatg tacccaagaa ctacccagga atcctccaaa acatgaccta cagcgtctcg 960

aaactctctc atatagccaa tgagccactc ggcatcgtgg catctcgctt gcggtctgaa 1020

ctcggccgcg atgatcttcg ccggcgaaca caagccctgg taacatatct gcacgaccag 1080

acgaacaggg caagcgtatc tgtcacagcg gacgcgaatc catcgacgga tattatgttg 1140

agttcatggg cgaagctgaa atgctgggac tatgactttg gtcttggact aggaaagcca 1200

gagagtgtga ggaggccatt gttcgagccg tttgagagtt tgatgtatct tatgcccaag 1260

agacccgatg gagaaattac tgctgcgtta tcgctgaggg atgaggatat ggagattttg 1320

aaacaagacg agaagtggaa aaagtatggg caattcattg gctag 1365

<210> 9

<211> 1365

<212> DNA

<213> 呕吐毒素降解酶

<400> 9

atgactgcac taaacattac aaacatggtc gacctagaca tagagctgga catcatcggc 60

caacaacctt tcatggtcaa gatctacacc caagtcagct tctgcttccc aatcaccgac 120

ccctccacac atcctgccat caccgccacc atcaaaaatg gtctgcagcg tctctcgcag 180

agtttcccct gggtagcagg ccaagtgaag gacgatggta cgggcgtatt caagataaaa 240

ccattcgagg cgacaccgag actggtagtc aaggatcttc gagatgaccc ctcagcaccg 300

acaatggagg gcttgagaaa ggcagagttc cccatgagca tgtttgacga gaacaaaatc 360

gcgccaaaga agactcttcc tattggaccc gattactcgc ctgatgatcc tcttcctgtg 420

ctgatctttc agctcaattt tattgagggc gggcttatac tcactgttaa tgggcagcat 480

ggctgcatgg acatgacggg ccaggatgag ctcattcggc tactgtcgaa ggcctgtcgc 540

gacgaggctt tcacgcaaga agagatatca acaatgaacc ttgagcgcaa gaccattgtt 600

cctcctctcg aaaattacga actcggcccg gagctggatc atcaaatcat maaaccccct 660

ccaaccactg agaccccacc agcaccgcca aaagcaagct gggcattttt ctcattcagt 720

ccacaagccc tctctgatct caaagacaag gcaacacaga ctcttgaagc aggcacgaaa 780

ttcgtttcaa cagatgatgc tctctcagcg ttcatctggc aatccgtcag ccgcgcccgc 840

cgtgctcgtc tagatgattc cacctcgact caattctgtc gcgccgttga tgtgcgcact 900

caactggatg tacccaagaa ctacccagga atcctccaaa acatgaccta cagcgtctcg 960

aaactctctc atatagccaa tgagccactc ggcatcgtgg catctcgctt gcggtctgaa 1020

ctcggccgcg atgatcttcg ccggcgaaca caagccctgg taacatatct gcacgaccag 1080

acgaacaggg caagcgtatc tgtcacagcg gacgcgaatc catcgacgga tattatgttg 1140

agttcatggg cgaagctgaa atgctgggac tatgactttg gtcttggact aggaaagcca 1200

gagagtgtga ggaggccatt gttcgagccg tttgagagtt tgatgtatct tatgcccaag 1260

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aaacaagacg agaagtggaa agaatatggg caattcattg gctag 1365

<210> 10

<211> 1365

<212> DNA

<213> 呕吐毒素降解酶

<400> 10

atgactgcac taaacattac aaacatggtc gacctagaca tagagctgga catcatcggc 60

caacaacctt tcatggtcaa gatctacacc caagtcagct tctgcttccc aatcaccgac 120

ccctccacac atcctgccat caccgccacc atcaaaaatg gtctgcagcg tctctcgcag 180

agtttcccct gggtagcagg ccaagtgaag gacgatggta cgggcgtatt caagataaaa 240

ccattcgagg cgacaccgag actggtagtc aaggatcttc gagatgaccc ctcagcaccg 300

acaatggagg gcttgagaaa ggcagagttc cccatgagca tgtttgacga gaacaaaatc 360

gcgccaaaga agactcttcc tattggaccc gattactcgc ctgatgatcc tcttcctgtg 420

ctgatctttc agctcaattt tattgagggc gggcttatac tcactgttaa tgggcagcat 480

ggctgcatgg acatgacggg ccaggatgag ctcattcggc tactgtcgaa ggcctgtcgc 540

gacgaggctt tcacgcaaga agagatatca acaatgaacc ttgagcgcaa gaccattgtt 600

cctcctctcg aaaattacga actcggcccg gagctggatc atcaaatcat maaaccccct 660

ccaaccactg agaccccacc agcaccgcca aaagcaagct gggcattttt ctcattcagt 720

ccacaagccc tctctgatct caaagacaag gcaacacaga ctcttgaagc aggcacgaaa 780

ttcgtttcaa cagatgatgc tctctcagcg ttcatctggc aatccgtcag ccgcgcccgc 840

cgtgctcgtc tagatgattc cacctcgact caattctgtc gcgccgttga tgtgcgcact 900

caactggatg tacccaagaa ctacccagga atcctccaaa acatgaccta cagcgtctcg 960

aaactctctc atatagccaa tgagccactc ggcatcgtgg catctcgctt gcggtctgaa 1020

ctcggccgcg atgatcttcg ccggcgaaca caagccctgg taacatatct gcacgaccag 1080

acgaacaggg caagcgtatc tgtcacagcg gacgcgaatc catcgacgga tattatgttg 1140

agttcatggg cgaagctgaa atgctgggac tatgactttg gtcttggact aggaaagcca 1200

gagagtgtga ggaggccatt gttcgagccg tttgagagtt tgatgtatct tatgcccaag 1260

agacccgatg gagaaattac tgctgcgtta tcgctgaggg atgaggatat ggagattttg 1320

aaacaagacg agaagtggaa agaatatggg caattcattg gctag 1365

<210> 11

<211> 1365

<212> DNA

<213> 呕吐毒素降解酶

<400> 11

atgactgcac taaacattac aaacatggtc gacctagaca tagagctgga catcatcggc 60

caacaacctt tcatggtcaa gatctacacc caagtcagct tctgcttccc aatcaccgac 120

ccctccacac atcctgccat caccgccacc atcaaaaatg gtctgcagcg tctctcgcag 180

agtttcccct gggtagcagg ccaagtgaag gacgatggta cgggcgtatt caagataaaa 240

ccattcgagg cgacaccgag actggtagtc aaggatcttc gagatgaccc ctcagcaccg 300

acaatggagg gcttgagaaa ggcagagttc cccatgagca tgtttgacga gaacaaaatc 360

gcgccaaaga agactcttcc tattggaccc gattactcgc ctgatgatcc tcttcctgtg 420

ctgatctttc agctcaattt tattgagggc gggcttatac tcactgttaa tgggcagcat 480

ggctgcatgg acatgacggg ccaggatgag ctcattcggc tactgtcgaa ggcctgtcgc 540

gacgaggctt tcacgcaaga agagatatca acaatgaacc ttgagcgcaa gaccattgtt 600

cctcctctcg aaaattacga actcggcccg gagctggatc atcaaatcat maaaccccct 660

ccaaccactg agaccccacc agcaccgcca aaagcaagct gggcattttt ctcattcagt 720

ccacaagccc tctctgatct caaagacaag gcaacacaga ctcttgaagc aggcacgaaa 780

ttcgtttcaa cagatgatgc tctctcagcg ttcatctggc aatccgtcag ccgcgcccgc 840

cgtgctcgtc tagatgattc cacctcgact caattctgtc gcgccgttga tgtgcgcact 900

caactggatg tacccaagaa ctacccagga atcctccaaa acatgaccta cagcgtctcg 960

aaactctctc atatagccaa tgagccactc ggcatcgtgg catctcgctt gcggtctgaa 1020

ctcggccgcg atgatcttcg ccggcgaaca caagccctgg taacatatct gcacgaccag 1080

acgaacaggg caagcgtatc tgtcacagcg gacgcgaatc catcgacgga tattatgttg 1140

agttcatggg cgaagctgaa atgctgggac tatgactttg gtcttggact aggaaagcca 1200

gagagtgtga ggaggccatt gttcgagccg tttgagagtt tgatgtatct tatgcccaag 1260

agacccgatg gagaaattac tgctgcgtta tcgctgaggg atgaggatat gaaaacattg 1320

aaacaagacg agaagtggaa aaagtatggg caattcattg gctag 1365

<210> 12

<211> 1365

<212> DNA

<213> 呕吐毒素降解酶

<400> 12

atgactgcac taaacgttac aaacatggtc gacctagaca tagagctgga catcatcggc 60

caacaacctt tcatggtcaa gatctacacc caagtcagct tctgcttccc aatcaccgac 120

ccctccacac atcctgccat caccgccacc atcaaaaatg gtctgcagcg tctctcgcag 180

agtttcccct gggtagcagg ccaagtgaag gacgatggta cgggcgtatt caagataaaa 240

ccattcgagg cgacaccgag actggtagtc aaggatcttc gagatgaccc ctcagcaccg 300

acaatggagg gcttgagaaa ggcagagttc cccatgagca tgtttgacga gaacaaaatc 360

gcgccaaaga agactcttcc tattggaccc gattactcgc ctgatgatcc tcttcctgtg 420

ctgatctttc agctcaattt tattgagggc gggcttatac tcactgttaa tgggcagcat 480

ggctgcatgg acatgacggg ccaggatgag ctcattcggc tactgtcgaa ggcctgtcgc 540

gacgaggctt tcacgcaaga agagatatca acaatgaacc ttgagcgcaa gaccattgtt 600

cctcctctcg aaaattacga actcggcccg gagctggatc atcaaatcat maaaccccct 660

ccaaccactg agaccccacc agcaccgcca aaagcaagct gggcattttt ctcattcagt 720

ccacaagccc tctctgatct caaagacaag gcaacacaga ctcttgaagc aggcacgaaa 780

ttcgtttcaa cagatgatgc tctctcagcg ttcatctggc aatccgtcag ccgcgcccgc 840

cgtgctcgtc tagatgattc cacctcgact caattctgtc gcgccgttga tgtgcgcact 900

caactggatg tacccaagaa ctacccagga atcctccaaa acatgaccta cagcgtctcg 960

aaactctctc atatagccaa tgagccactc ggcatcgtgg catctcgctt gcggtctgaa 1020

ctcggccgcg atgatcttcg ccggcgaaca caagccctgg taacatatct gcacgaccag 1080

acgaacaggg caagcgtatc tgtcacagcg gacgcgaatc catcgacgga tattatgttg 1140

agttcatggg cgaagctgaa atgctgggac tatgactttg gtcttggact aggaaagcca 1200

gagagtgtga ggaggccatt gttcgagccg tttgagagtt tgatgtatct tatgcccaag 1260

agacccgatg gagaaattac tgctgcgtta tcgctgaggg atgaggatat ggagacattg 1320

aaacaagacg agaagtggaa agaatatggg caattcattg gctag 1365

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tactgacgtg atttgtaatg tttgtacc 28

<210> 14

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

cggttactta acgggtatga aaaagg 26

Claims (11)

1.一种呕吐毒素降解酶，其特征在于，该呕吐毒素降解酶具有如下(a)和/或(b)所示的氨基酸序列：

(a)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；

(b)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中第430-450位氨基酸残基中的一个或几个经过取代、缺失或添加后仍具有呕吐毒素降解酶活性的氨基酸序列；

优选地，所述呕吐毒素降解酶具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ IDNO：5所示的氨基酸序列。

2.一种编码呕吐毒素降解酶的基因，其特征在于，该基因具有编码权利要求1所述的呕吐毒素降解酶的核苷酸序列；

优选地，所述基因具有SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列。

3.一种重组载体，其特征在于，该重组载体含有权利要求2所述的基因。

4.一种菌株，其特征在于，该菌株含有权利要求2所述的基因或者权利要求3所述的重组载体。

5.根据权利要求4所述的菌株，其中，所述菌株为细菌和/或真菌；

优选地，所述菌株为球菌、杆菌、螺旋菌、酵母和霉菌中的至少一种；

更优选地，所述菌株为酿酒酵母、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、乳酸肠球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德式乳杆菌乳酸亚种、植物乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、产朊假丝酵母、酿酒酵母、沼泽红假单胞菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、嗜热链球菌、罗伊氏乳杆菌、动物双歧杆菌、黑曲霉、米曲霉、迟缓芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、纤维二糖乳杆菌、发酵乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、产丙酸丙酸杆菌、布氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、凝结芽孢杆菌和侧孢短芽孢杆菌中的至少一种；

进一步优选地，所述菌株为地衣芽孢杆菌(Bacillus lincheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的至少一种。

6.一种添加剂，其特征在于，该添加剂含有权利要求1所述的呕吐毒素降解酶，和/或含有权利要求4或5所述的菌株的发酵产物。

7.一种粮油或饲料，其特征在于，该粮油或饲料含有权利要求1所述的呕吐毒素降解酶或权利要求6所述的添加剂。

8.一种表达呕吐毒素降解酶的方法，其特征在于，该方法包括：

将权利要求3所述的重组载体导入宿主，诱导编码呕吐毒素降解酶的基因在所述宿主中表达；

或者，诱导权利要求4或5所述的菌株表达呕吐毒素降解酶。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述宿主为细菌和/或真菌；

优选地，所述宿主为球菌、杆菌、螺旋菌、酵母和霉菌中的至少一种；

更优选地，所述宿主为酿酒酵母、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、乳酸肠球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德式乳杆菌乳酸亚种、植物乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、产朊假丝酵母、酿酒酵母、沼泽红假单胞菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、嗜热链球菌、罗伊氏乳杆菌、动物双歧杆菌、黑曲霉、米曲霉、迟缓芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、纤维二糖乳杆菌、发酵乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、产丙酸丙酸杆菌、布氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、凝结芽孢杆菌和侧孢短芽孢杆菌中的至少一种；

进一步优选地，所述宿主为地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母中的至少一种。

10.权利要求1所述的呕吐毒素降解酶、权利要求2所述的基因、权利要求3所述的重组载体、权利要求4或5所述的菌株或者权利要求6所述的添加剂在降解呕吐毒素中的应用，优选为在降解粮油和/或饲料中的呕吐毒素中的应用。

11.一种降解呕吐毒素的方法，其特征在于，该方法包括：在酶降解反应的条件下，将酶剂与待处理的样品接触；

其中，当所述酶剂含有权利要求1所述的呕吐毒素降解酶或者权利要求6所述的添加剂时，所述酶降解反应的条件包括：温度为25-55℃，优选为30-40℃；pH值为3-9，优选为6-8；

或者，当所述酶剂含有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的呕吐毒素降解酶时，所述酶降解反应的条件包括：温度为40-55℃，pH值为4-9；

优选地，所述待处理的样品为粮油和/或饲料。