JP2020519253A - リゾチーム活性を有するポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド並びにその使用及び組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、参照により本明細書に組み込まれるコンピューター可読形式の配列リストを含有する。
(a)配列番号3のポリペプチドと少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(b)配列番号6のポリペプチドと少なくとも94%の配列同一性を有するポリペプチド;
(c)配列番号9のポリペプチドと少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド;
(d)配列番号12のポリペプチドと少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド;
(e)配列番号15のポリペプチドと少なくとも87%の配列同一性を有するポリペプチド;
(f)配列番号18のポリペプチドと少なくとも81%の配列同一性を有するポリペプチド;
(g)配列番号21のポリペプチドと少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド;
(h)配列番号24のポリペプチドと少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド;
(i)配列番号27のポリペプチドと少なくとも87%の配列同一性を有するポリペプチド;
(j)配列番号30のポリペプチドと少なくとも96.2%の配列同一性を有するポリペプチド;
(k)配列番号33のポリペプチドと少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド;
(l)配列番号36のポリペプチドと少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド;
(m)配列番号39のポリペプチドと少なくとも81%の配列同一性を有するポリペプチド;
(n)配列番号42のポリペプチドと少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド;
(o)配列番号3のポリペプチドの変異体であって、リゾチーム活性を有し、且つ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又は11位において1つ以上のアミノ酸置換、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸欠失、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸挿入又はその任意の組合せを含む変異体;
(p)配列番号6のポリペプチドの変異体であって、リゾチーム活性を有し、且つ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12又は13位において1つ以上のアミノ酸置換、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸欠失、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸挿入又はその任意の組合せを含む変異体;
(q)配列番号9及び配列番号36からなる群から選択されるポリペプチドの変異体であって、リゾチーム活性を有し、且つ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43又は44位において1つ以上のアミノ酸置換、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸欠失、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸挿入又はその任意の組合せを含む変異体;
(r)配列番号12、配列番号21、配列番号24、配列番号33及び配列番号42からなる群から選択されるポリペプチドの変異体であって、リゾチーム活性を有し、且つ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44又は45位において1つ以上のアミノ酸置換、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸欠失、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸挿入又はその任意の組合せを含む変異体;
(s)配列番号15及び配列番号27からなる群から選択されるポリペプチドの変異体であって、リゾチーム活性を有し、且つ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28又は29位において1つ以上のアミノ酸置換、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸欠失、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸挿入又はその任意の組合せを含む変異体;
(t)配列番号18及び配列番号39からなる群から選択されるポリペプチドの変異体であって、リゾチーム活性を有し、且つ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41又は42位において1つ以上のアミノ酸置換、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸欠失、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸挿入又はその任意の組合せを含む変異体;
(u)配列番号30のポリペプチドの変異体であって、リゾチーム活性を有し、且つ1、2、3、4、5、6、7又は8位において1つ以上のアミノ酸置換、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸欠失、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸挿入又はその任意の組合せを含む変異体;
(v)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)又は(u)のポリペプチド並びにN末端及び/又はC末端のHisタグ及び/又はHQタグを含むポリペプチド;
(w)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)又は(u)のポリペプチド並びに最大10アミノ酸、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10アミノ酸のN末端及び/又はC末端伸長を含むポリペプチド;及び
(x)リゾチーム活性を有し、且つ成熟ポリペプチドの長さの少なくとも90%を有する、(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)又は(u)のポリペプチドの断片
からなる群から選択される単離ポリペプチドにさらに関する。
配列番号1は、ペニシリウム・シンプリシシマム(Penicillium simplicissimum)から単離されたLYSポリペプチドのcDNA配列である。
動物:用語「動物」は、ヒトを除く任意の動物を指す。動物の例は、ブタ(pig)又はブタ(swine)(限定されないが、子ブタ、成長期ブタ及び雌ブタを含む)を含むが、これらに限定されない単胃動物;シチメンチョウ、アヒル、ウズラ、ホロホロチョウ、ガチョウ、ハト(雛鳥を含む)及びニワトリ(限定されないが、食用若鶏(本明細書でブロイラーと称される)、ヒヨコ、産卵雌鶏(本明細書で産卵鶏と称される)を含む)などの家禽;ウマ(限定されないが、熱血種、冷血種及び温血種を含む)、甲殻類(限定されないが、小エビ及びクルマエビを含む)及び魚類(限定されないが、ブリ、ピラルクー、バルブ、バス、アミキリ、ボカチコ、ブリーム、カジカ、コロソマ、コイ、ナマズ、カトラ、サバヒー、チャー、シクリッド、スギ、タラ、クラッピー、ヨーロッパヘダイ、ニベ、ウナギ、ハゼ、キンギョ、グーラミ、ハタ、グァポート、オヒョウ、ジャワ、ラベオ、イケカツオ、ドジョウ、サバ、ミルクフィッシュ、クロサギ、マッドフィッシュ、ボラ、パコ、パールスポット、ペヘレイ、パーチ、カワカマス、ポンパーノ、ローチ、サケ、ヒゲナガヒレナマズ、ソーガー、シーバス、タイ、シャイナー、カワアナゴ、スネークヘッド、フエダイ、アカメ、シタビラメ、アイゴ、チョウザメ、マンボウ、アユ、テンチ、テラー、テラピア、マス、マグロ、ターボット、シロマス、ウォールアイ及びホワイトフィッシュを含む)である。
(同一の残基×100)/(アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップの総数)。
(同一のデオキシリボヌクレオチド×100)/(アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップの総数)。
本発明の目的のために、命名法[E/Q]は、この位置のアミノ酸がグルタミン酸(Glu、E)又はグルタミン(Gln、Q)であり得ることを意味する。同様に、命名法[V/G/A/I]は、この位置のアミノ酸がバリン(Val、V)、グリシン(Gly、G)、アラニン(Ala、A)又はイソロイシン(Ile、I)であり得ることを意味し、本明細書に記載される他の組合せについても同様である。他でさらに限定されない限り、アミノ酸Xは、20種の天然アミノ酸のいずれかであり得ると定義される。
本発明者らは、リゾチーム活性を有する完全に新しいクラスのポリペプチドを発見した。前記ポリペプチドは、既知のリゾチームと構造的に大きく異なる。下記の配列同一性マトリックスに示されるとおり、本発明のポリペプチドは、全て国際公開第2013/076259号パンフレットに開示される先行技術の配列に対して45%未満の配列同一性を有し、これは、これらの新規のポリペプチドが既知のリゾチームと異なるフォールディングパターンを有し得ることを示唆している。
第1の態様において、本発明は、組成物1キログラム当たり少なくとも0.01mgのLYSポリペプチドを含む組成物であって、ポリペプチドは、(a)リゾチーム活性を有し、且つ(b)1つ以上のLAD触媒ドメインを含み、LAD触媒ドメインは、配列番号46〜187及びhmmbuildソフトウェアプログラムを使用して作製されるプロファイル隠れマルコフモデル(HMM)を用いて問い合わせされるとき、少なくとも180のdomTスコアを与え、問い合わせは、HMMによってLAD触媒ドメインを決定する方法によってhmmscanソフトウェアプログラムを使用して実行される、組成物に関する。
(a)LYSポリペプチドは、リゾチーム活性を有し;
(b)LYSポリペプチドは、1つ以上のLAD触媒ドメインを含み、LAD触媒ドメインは、配列番号46〜187及びhmmbuildソフトウェアプログラムを使用して作製されるプロファイル隠れマルコフモデル(HMM)を用いて問い合わせされるとき、少なくとも180のdomTスコアを与え、問い合わせは、HMMによってLAD触媒ドメインを決定する方法によってhmmscanソフトウェアプログラムを使用して実行され;
(c)ポリペプチドは、1つ以上のLEDドメインを含み、LEDは、配列番号188〜316及びhmmbuildソフトウェアプログラムを使用して作製されるプロファイル隠れマルコフモデルを用いて問い合わせされるとき、少なくとも100のdomTスコアを与え、問い合わせは、hmmscanソフトウェアプログラムを使用して実行される、組成物にさらに関する。
(a)配列番号3のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(b)配列番号6のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(c)配列番号9のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(d)配列番号12のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(e)配列番号15のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(f)配列番号18のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(g)配列番号21のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(h)配列番号24のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(i)配列番号27のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(j)配列番号30のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(k)配列番号33のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(l)配列番号36のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(m)配列番号39のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(n)配列番号42のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(o)配列番号45のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(p)配列番号3、配列番号6、配列番号9、配列番号12、配列番号15、配列番号18、配列番号21、配列番号24、配列番号27、配列番号30、配列番号33、配列番号36、配列番号39、配列番号42及び配列番号45からなる群から選択されるポリペプチドの変異体であって、リゾチーム活性を有し、且つ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44又は45位において1つ以上のアミノ酸置換、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸欠失、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸挿入又はその任意の組合せを含む変異体;
(q)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)又は(p)のポリペプチド並びにN末端及び/又はC末端のHisタグ及び/又はHQタグを含むポリペプチド;
(r)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)又は(p)のポリペプチド並びに最大10アミノ酸、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10アミノ酸のN末端及び/又はC末端伸長を含むポリペプチド;及び
(s)リゾチーム活性を有し、且つ成熟ポリペプチドの長さの少なくとも90%を有する、(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)又は(p)のポリペプチドの断片
からなる群から選択される、組成物に関する。
(a)配列番号3のアミノ酸84〜226と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(b)配列番号6のアミノ酸84〜226と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(c)配列番号9のアミノ酸81〜220と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(d)配列番号12のアミノ酸161〜304と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(e)配列番号15のアミノ酸85〜228と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(f)配列番号18のアミノ酸88〜230と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(g)配列番号21のアミノ酸87〜230と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(h)配列番号24のアミノ酸90〜232と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(i)配列番号27のアミノ酸85〜228と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(j)配列番号30のアミノ酸85〜228と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(k)配列番号33のアミノ酸84〜226と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(l)配列番号36のアミノ酸83〜222と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(m)配列番号39のアミノ酸82〜225と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(n)配列番号42のアミノ酸161〜303と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;及び
(o)配列番号45のアミノ酸85〜227と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド
からなる群から選択されるLAD触媒ドメインを含む、組成物に関する。
(a)配列番号3のアミノ酸84〜226と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(b)配列番号6のアミノ酸84〜226と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(c)配列番号9のアミノ酸81〜220と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(d)配列番号12のアミノ酸161〜304と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(e)配列番号15のアミノ酸85〜228と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(f)配列番号18のアミノ酸88〜230と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(g)配列番号21のアミノ酸87〜230と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(h)配列番号24のアミノ酸90〜232と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(i)配列番号27のアミノ酸85〜228と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(j)配列番号30のアミノ酸85〜228と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(k)配列番号33のアミノ酸84〜226と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(l)配列番号36のアミノ酸83〜222と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(m)配列番号39のアミノ酸82〜225と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(n)配列番号42のアミノ酸161〜303と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;及び
(o)配列番号45のアミノ酸85〜227と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド
からなる群から選択されるLAD触媒ドメインを含み;
LYSポリペプチドは、
(a)配列番号3のアミノ酸1〜73と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(b)配列番号6のアミノ酸1〜73と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(c)配列番号9のアミノ酸1〜73と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(d)配列番号12のアミノ酸1〜72と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(e)配列番号15のアミノ酸1〜73と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(f)配列番号18のアミノ酸1〜73と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(g)配列番号21のアミノ酸1〜73と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(h)配列番号24のアミノ酸1〜73と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(i)配列番号27のアミノ酸1〜73と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(j)配列番号30のアミノ酸1〜73と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(k)配列番号33のアミノ酸1〜73と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(l)配列番号36のアミノ酸1〜73と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(m)配列番号39のアミノ酸1〜72と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(n)配列番号42のアミノ酸1〜73と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(o)配列番号45のアミノ酸1〜73と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(d)配列番号12のアミノ酸96〜167と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;及び
(n)配列番号42のアミノ酸96〜168と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド
からなる群から選択されるLEDドメインを含む、組成物に関する。
第2の態様において、本発明は、LYSポリペプチドを含む顆粒であって、ポリペプチドは、(a)リゾチーム活性を有し、且つ(b)1つ以上のLAD触媒ドメインを含み、LAD触媒ドメインは、配列番号46〜187及びhmmbuildソフトウェアプログラムを使用して作製されるプロファイル隠れマルコフモデル(HMM)を用いて問い合わせされるとき、少なくとも180のdomTスコアを与え、問い合わせは、HMMによってLAD触媒ドメインを決定する方法によってhmmscanソフトウェアプログラムを使用して実行される、顆粒に関する。一実施形態において、顆粒は、コア粒子及び1つ以上のコーティングを含む。好ましい実施形態において、コーティングは、塩、及び/又はワックス、及び/又は小麦粉を含む。好ましい配合物は、下記の配合の節において開示される。
(a)LYSポリペプチドは、リゾチーム活性を有し;
(b)LYSポリペプチドは、1つ以上のLAD触媒ドメインを含み、LAD触媒ドメインは、配列番号46〜187及びhmmbuildソフトウェアプログラムを使用して作製されるプロファイル隠れマルコフモデルを用いて問い合わせされるとき、少なくとも170のdomTスコアを与え、問い合わせは、HMMによってLAD触媒ドメインを決定する方法によってhmmscanソフトウェアプログラムを使用して実行され;
(c)ポリペプチドは、1つ以上のLEDドメインを含み、LEDは、配列番号188〜316及びhmmbuildソフトウェアプログラムを使用して作製されるプロファイル隠れマルコフモデルを用いて問い合わせされるとき、少なくとも100のdomTスコアを与え、通常、問い合わせは、HMMによってリゾチーム強化ドメインを決定する方法によってhmmscanソフトウェアプログラムを使用して実行される、顆粒にさらに関する。
(a)配列番号3のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(b)配列番号6のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(c)配列番号9のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(d)配列番号12のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(e)配列番号15のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(f)配列番号18のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(g)配列番号21のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(h)配列番号24のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(i)配列番号27のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(j)配列番号30のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(k)配列番号33のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(l)配列番号36のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(m)配列番号39のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(n)配列番号42のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(o)配列番号45のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(p)配列番号3、配列番号6、配列番号9、配列番号12、配列番号15、配列番号18、配列番号21、配列番号24、配列番号27、配列番号30、配列番号33、配列番号36、配列番号39、配列番号42及び配列番号45からなる群から選択されるポリペプチドの変異体であって、リゾチーム活性を有し、且つ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44又は45位において1つ以上のアミノ酸置換、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸欠失、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸挿入又はその任意の組合せを含む変異体;
(q)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)又は(p)のポリペプチド並びにN末端及び/又はC末端のHisタグ及び/又はHQタグを含むポリペプチド;
(r)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)又は(p)のポリペプチド並びに最大10アミノ酸、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10アミノ酸のN末端及び/又はC末端伸長を含むポリペプチド;及び
(s)リゾチーム活性を有し、且つ成熟ポリペプチドの長さの少なくとも90%を有する、(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)又は(p)のポリペプチドの断片
からなる群から選択される、顆粒に関する。
(a)配列番号3のアミノ酸84〜226と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(b)配列番号6のアミノ酸84〜226と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(c)配列番号9のアミノ酸81〜220と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(d)配列番号12のアミノ酸161〜304と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(e)配列番号15のアミノ酸85〜228と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(f)配列番号18のアミノ酸88〜230と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(g)配列番号21のアミノ酸87〜230と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(h)配列番号24のアミノ酸90〜232と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(i)配列番号27のアミノ酸85〜228と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(j)配列番号30のアミノ酸85〜228と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(k)配列番号33のアミノ酸84〜226と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(l)配列番号36のアミノ酸83〜222と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(m)配列番号39のアミノ酸82〜225と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(n)配列番号42のアミノ酸161〜303と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;及び
(o)配列番号45のアミノ酸85〜227と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド
からなる群から選択されるLAD触媒ドメインを含む、顆粒に関する。
(a)配列番号3のアミノ酸84〜226と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(b)配列番号6のアミノ酸84〜226と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(c)配列番号9のアミノ酸81〜220と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(d)配列番号12のアミノ酸161〜304と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(e)配列番号15のアミノ酸85〜228と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(f)配列番号18のアミノ酸88〜230と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(g)配列番号21のアミノ酸87〜230と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(h)配列番号24のアミノ酸90〜232と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(i)配列番号27のアミノ酸85〜228と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(j)配列番号30のアミノ酸85〜228と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(k)配列番号33のアミノ酸84〜226と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(l)配列番号36のアミノ酸83〜222と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(m)配列番号39のアミノ酸82〜225と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(n)配列番号42のアミノ酸161〜303と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;及び
(o)配列番号45のアミノ酸85〜227と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド
からなる群から選択されるLAD触媒ドメインを含み;
LYSポリペプチドは、
(a)配列番号3のアミノ酸1〜73と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(b)配列番号6のアミノ酸1〜73と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(c)配列番号9のアミノ酸1〜73と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(d)配列番号12のアミノ酸1〜72と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(e)配列番号15のアミノ酸1〜73と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(f)配列番号18のアミノ酸1〜73と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(g)配列番号21のアミノ酸1〜73と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(h)配列番号24のアミノ酸1〜73と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(i)配列番号27のアミノ酸1〜73と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(j)配列番号30のアミノ酸1〜73と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(k)配列番号33のアミノ酸1〜73と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(l)配列番号36のアミノ酸1〜73と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(m)配列番号39のアミノ酸1〜72と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(n)配列番号42のアミノ酸1〜73と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(o)配列番号45のアミノ酸1〜73と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(d)配列番号12のアミノ酸96〜167と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;及び
(n)配列番号42のアミノ酸96〜168と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド
からなる群から選択されるLEDドメインを含む、顆粒に関する。
第3の態様において、本発明は、液体配合物であって、
(a)0.01%〜25%w/wのLYSポリペプチドであって、
(i)LYSポリペプチドは、リゾチーム活性を有し;
(ii)LYSポリペプチドは、1つ以上のLAD触媒ドメインを含み、LAD触媒ドメインは、配列番号46〜187及びhmmbuildソフトウェアプログラムを使用して作製されるプロファイル隠れマルコフモデルを用いて問い合わせされるとき、少なくとも170のdomTスコアを与え、問い合わせは、HMMによってLAD触媒ドメインを決定する方法によってhmmscanソフトウェアプログラムを使用して実行される、LYSポリペプチド;
(b)20%〜80%w/wのポリオール;
(c)0.01%〜2.0%w/wの保存剤;及び
(d)水
を含む液体配合物に関する。
(a)0.01%〜25%w/wのLYSポリペプチドであって、
(i)LYSポリペプチドは、リゾチーム活性を有し;
(ii)LYSポリペプチドは、1つ以上のLAD触媒ドメインを含み、LAD触媒ドメインは、配列番号46〜187及びhmmbuildソフトウェアプログラムを使用して作製されるプロファイル隠れマルコフモデルを用いて問い合わせされるとき、少なくとも170のdomTスコアを与え、問い合わせは、HMMによってLAD触媒ドメインを決定する方法によってhmmscanソフトウェアプログラムを使用して実行され;
(iii)LYSポリペプチドは、1つ以上のLEDドメインを含み、LEDは、配列番号188〜316及びhmmbuildソフトウェアプログラムを使用して作製されるプロファイル隠れマルコフモデルを用いて問い合わせされるとき、少なくとも100のdomTスコアを与え、問い合わせは、HMMによってリゾチーム強化ドメインを決定する方法によってhmmscanソフトウェアプログラムを使用して実行される、LYSポリペプチド;
(b)20%〜80%w/wのポリオール;
(c)0.01%〜2.0%w/wの保存剤;及び
(d)水
を含む液体配合物にさらに関する。
(A)0.01%〜25%w/wのLYSポリペプチドであって、
(a)配列番号3のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(b)配列番号6のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(c)配列番号9のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(d)配列番号12のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(e)配列番号15のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(f)配列番号18のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(g)配列番号21のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(h)配列番号24のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(i)配列番号27のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(j)配列番号30のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(k)配列番号33のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(l)配列番号36のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(m)配列番号39のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(n)配列番号42のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(o)配列番号45のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(p)配列番号3、配列番号6、配列番号9、配列番号12、配列番号15、配列番号18、配列番号21、配列番号24、配列番号27、配列番号30、配列番号33、配列番号36、配列番号39、配列番号42及び配列番号45からなる群から選択されるポリペプチドの変異体であって、リゾチーム活性を有し、且つ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44又は45位において1つ以上のアミノ酸置換、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸欠失、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸挿入又はその任意の組合せを含む変異体;
(q)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)又は(p)のポリペプチド並びにN末端及び/又はC末端のHisタグ及び/又はHQタグを含むポリペプチド;
(r)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)又は(p)のポリペプチド並びに最大10アミノ酸、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10アミノ酸のN末端及び/又はC末端伸長を含むポリペプチド;及び
(s)リゾチーム活性を有し、且つ成熟ポリペプチドの長さの少なくとも90%を有する、(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)又は(p)のポリペプチドの断片
からなる群から選択されるLYSポリペプチド;
(B)20%〜80%w/wのポリオール;
(C)0.01%〜2.0%w/wの保存剤;及び
(D)水
を含む液体配合物に関する。
(A)0.01%〜25%w/wのLYSポリペプチドであって、
(a)配列番号3のアミノ酸84〜226と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(b)配列番号6のアミノ酸84〜226と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(c)配列番号9のアミノ酸81〜220と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(d)配列番号12のアミノ酸161〜304と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(e)配列番号15のアミノ酸85〜228と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(f)配列番号18のアミノ酸88〜230と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(g)配列番号21のアミノ酸87〜230と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(h)配列番号24のアミノ酸90〜232と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(i)配列番号27のアミノ酸85〜228と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(j)配列番号30のアミノ酸85〜228と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(k)配列番号33のアミノ酸84〜226と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(l)配列番号36のアミノ酸83〜222と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(m)配列番号39のアミノ酸82〜225と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(n)配列番号42のアミノ酸161〜303と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;及び
(o)配列番号45のアミノ酸85〜227と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド
からなる群から選択されるLAD触媒ドメインを含むLYSポリペプチド;
(B)20%〜80%w/wのポリオール;
(C)0.01%〜2.0%w/wの保存剤;及び
(D)水
を含む液体配合物に関する。
(A)0.01%〜25%w/wのLYSポリペプチドであって、
(a)配列番号3のアミノ酸84〜226と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(b)配列番号6のアミノ酸84〜226と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(c)配列番号9のアミノ酸81〜220と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(d)配列番号12のアミノ酸161〜304と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(e)配列番号15のアミノ酸85〜228と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(f)配列番号18のアミノ酸88〜230と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(g)配列番号21のアミノ酸87〜230と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(h)配列番号24のアミノ酸90〜232と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(i)配列番号27のアミノ酸85〜228と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(j)配列番号30のアミノ酸85〜228と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(k)配列番号33のアミノ酸84〜226と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(l)配列番号36のアミノ酸83〜222と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(m)配列番号39のアミノ酸82〜225と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(n)配列番号42のアミノ酸161〜303と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;及び
(o)配列番号45のアミノ酸85〜227と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド
からなる群から選択されるLAD触媒ドメインを含み;
(B)(a)配列番号3のアミノ酸1〜73と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(b)配列番号6のアミノ酸1〜73と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(c)配列番号9のアミノ酸1〜73と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(d)配列番号12のアミノ酸1〜72と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(e)配列番号15のアミノ酸1〜73と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(f)配列番号18のアミノ酸1〜73と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(g)配列番号21のアミノ酸1〜73と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(h)配列番号24のアミノ酸1〜73と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(i)配列番号27のアミノ酸1〜73と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(j)配列番号30のアミノ酸1〜73と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(k)配列番号33のアミノ酸1〜73と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(l)配列番号36のアミノ酸1〜73と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(m)配列番号39のアミノ酸1〜72と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(n)配列番号42のアミノ酸1〜73と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(o)配列番号45のアミノ酸1〜73と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(d)配列番号12のアミノ酸96〜167と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;及び
(n)配列番号42のアミノ酸96〜168と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド
からなる群から選択されるLEDドメインを含む、LYSポリペプチド;
(C)20%〜80%w/wのポリオール;
(D)0.01%〜2.0%w/wの保存剤;及び
(E)水
を含む液体配合物に関する。
第4の態様において、本発明は、配列番号2の成熟ポリペプチドと少なくとも95%、例えば少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有するリゾチーム活性を有するポリペプチドに関する。一実施形態において、ポリペプチドは、配列番号2の成熟ポリペプチドから最大11個のアミノ酸、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又は11個のアミノ酸が異なる。
ある実施形態において、LAD触媒ドメインは、1つ以上のモチーフI:AG[I/L]AT[A/G][I/L][T/V]ES(配列番号317)を含む。ある実施形態において、LAD触媒ドメインは、1つ以上のモチーフII V[G/A]XLCQXVQXSAYP(配列番号318)を含む。ある実施形態において、LEDは、1つ以上のモチーフIII:[CGY][YF][VIL][ASTP][DG]X[YF][VIT]X[TS][GAN](配列番号319)を含む。ある実施形態において、LAD触媒ドメインは、1つ以上のモチーフI:AG[I/L]AT[A/G][I/L][T/V]ES(配列番号317)及び1つ以上のモチーフII V[G/A]XLCQXVQXSAYP(配列番号318)を含む。ある実施形態において、LAD触媒ドメインは、1つ以上のモチーフI:AG[I/L]AT[A/G][I/L][T/V]ES(配列番号317)を含み、LEDは、1つ以上のモチーフIII:[CGY][YF][VIL][ASTP][DG]X[YF][VIT]X[TS][GAN](配列番号319)を含む。ある実施形態において、LAD触媒ドメインは、1つ以上のモチーフII V[G/A]XLCQXVQXSAYP(配列番号318)を含み、LEDは、1つ以上のモチーフIII:[CGY][YF][VIL][ASTP][DG]X[YF][VIT]X[TS][GAN](配列番号319)を含む。ある実施形態において、LAD触媒ドメインは、1つ以上のモチーフI:AG[I/L]AT[A/G][I/L][T/V]ES(配列番号317)及び1つ以上のモチーフII V[G/A]XLCQXVQXSAYP(配列番号318)を含み、LEDは、1つ以上のモチーフIII:[CGY][YF][VIL][ASTP][DG]X[YF][VIT]X[TS][GAN](配列番号319)を含む。
本発明のリゾチーム活性を有するポリペプチドは、任意の属の微生物から得ることができる。本発明の目的のために、所与の供給源と関連させて本明細書で使用する場合の用語「から得られる」は、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが、供給源によって又は供給源に由来するポリヌクレオチドが挿入された株によって産生されることを意味するものとする。一態様において、所与の供給源から得られるポリペプチドは、細胞外に分泌される。
本発明は、本明細書で記載されるとおり、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにも関する。ある実施形態において、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、単離されている。
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸構築物であって、ポリヌクレオチドは、制御配列と適合する条件下で好適な宿主細胞においてコード配列の発現を誘導する1つ以上の制御配列に作動可能に連結されている、核酸構築物にも関する。
本発明は、本発明のポリヌクレオチド、プロモーター並びに転写及び翻訳終止シグナルを含む組換え発現ベクターにも関する。種々のヌクレオチド及び制御配列が共に連結されて、1つ以上の好都合な制限部位をこのような部位でポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの挿入又は置換を可能とするために含み得る組換え発現ベクターが生成され得る。或いは、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む核酸構築物を発現に適切なベクターに挿入することにより発現され得る。発現ベクターの形成において、コード配列は、コード配列が発現に適切な制御配列に作動可能に連結するようにベクター中に配置される。
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞であって、ポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドの産生を誘導する1つ以上の制御配列に作動可能に連結されている、組換え宿主細胞にも関する。ポリヌクレオチドを含む構築物又はベクターは、構築物又はベクターが染色体組込み体として又は先に記載される自己複製染色体外ベクターとして維持されるように宿主細胞中に導入される。用語「宿主細胞」は、複製中に起こる変異に起因して親細胞と同一ではない親細胞の任意の後代を包含する。宿主細胞の選択は、ポリペプチドをコードする遺伝子及びその供給源に大きく依存することになる。
本発明は、本発明のポリペプチドを生成する方法であって、(a)ポリペプチドの産生を促す条件下において、野生型形態でポリペプチドを産生する細胞を培養すること;及び任意選択により、(b)ポリペプチドを回収することを含む方法にも関する。
本発明は、回収可能な量でポリペプチド又はドメインを発現及び産生するように本発明のポリヌクレオチドを含む単離された植物、例えばトランスジェニック植物、植物部分又は植物細胞にも関する。ポリペプチド又はドメインは、植物又は植物部分から回収され得る。或いは、ポリペプチド又はドメインを含有する植物又は植物部分は、例えば、食品又は飼料の品質を改善する、例えば栄養価、嗜好性及び流体学的性質を向上させるため又は非栄養因子を破壊するために使用され得る。
本発明は、本発明のポリペプチドを含む発酵ブロス配合物又は細胞組成物にも関する。発酵ブロス産物は、例えば、細胞(本発明のポリペプチドをコードする遺伝子を含有する宿主細胞であって、目的のポリペプチドの産生に使用される宿主細胞を含む)、細胞片、バイオマス、発酵培地及び/又は発酵産物などの発酵プロセスで用いられる追加の成分をさらに含む。いくつかの実施形態において、組成物は、1つ又は複数の有機酸、死細胞及び/又は細胞片並びに培養培地を含有する死滅した細胞の全ブロスである。
本発明は、本発明のポリペプチドを含む組成物にも関する。好ましくは、組成物は、本発明のポリペプチドにおいて濃縮される。用語「濃縮される」は、組成物のリゾチーム活性が、例えば少なくとも1.1、例えば少なくとも1.2、少なくとも1.3、少なくとも1.4、少なくとも1.5、少なくとも2.0、少なくとも3.0、少なくとも4.0、少なくとも5.0、少なくとも10の濃縮倍率で増加していることを示す。
本発明の酵素は、液体又は固体として配合され得る。液体配合物について、配合剤は、ポリオール(例えば、グリセロール、エチレングリコール又はプロピレングリコールなど)、塩(例えば、塩化ナトリウム、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸カリウムなど)又は糖若しくは糖誘導体(例えば、デキストリン、グルコース、スクロース及びソルビトールなど)を含み得る。したがって、一実施形態において、組成物は、本発明のポリペプチド並びにグリセロール、エチレングリコール、1,2−プロピレングリコール、1,3−プロピレングリコール、塩化ナトリウム、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸カリウム、デキストリン、グルコース、スクロース及びソルビトールからなるリストから選択される1つ以上の配合剤を含む液体組成物である。液体配合物は、飼料をペレット化した後にそれに噴霧され得るか、又は動物に与える飲用水に添加され得る。
a)噴霧乾燥生成物、ここで、液体酵素含有溶液は、噴霧乾燥塔で霧化されて小さい液滴を形成し、それらが乾燥塔内を下る間に乾燥して酵素含有粒子材料を形成する;
b)積層生成物、ここで、酵素は、予め形成された不活性コア粒子の周りの層としてコーティングされ、通常、予め形成されたコア粒子が流動化されている流動層装置で酵素含有溶液が霧化され、酵素含有溶液がコア粒子に付着して乾ききると、コア粒子の表面上に乾燥酵素の層が残る。所望の粒径の有用なコア粒子を見出すことができる場合、このようにして所望の粒径の粒子を得ることができる。この種の生成物については、例えば、国際公開第97/23606号パンフレットに記載される;
c)吸収コア粒子、ここで、酵素をコアの周りに層としてコーティングするというよりむしろ、酵素がコアの表面上及び/又はその中に吸収される。このようなプロセスは、国際公開第97/39116号パンフレットに記載されている。
d)押出し又はペレット化された生成物、ここで、酵素含有ペーストが加圧によりペレット化されるか、又は圧力下で小さい開口を通じて押し出されて切断されることにより粒子となり、続いて乾燥される。押出し開口が作られる材料(通常、穿孔を有するプレート)が押出し開口に対する許容圧力降下を制限するため、このような粒子は、通常、かなりのサイズを有する。また、小さい開口を用いる場合に押出し圧力が極めて高くなると酵素ペーストの熱生成が増加し、これは、酵素にとって有害である;
e)プリリング生成物、ここで、酵素含有粉末は、溶融ワックス中において懸濁され、この懸濁液が例えば回転ディスク噴霧器を通じて冷却チャンバー内へと噴霧され、そこで液滴が急速に固化する(Michael S.Showell(編者);Powdered detergents;Surfactant Science Series;1998;vol.71;頁140−142;Marcel Dekker)。得られる生成物は、酵素が不活性材料の表面に集中する代わりに、その全体にわたって均一に分布しているものである。また、米国特許第4,016,040号明細書及び米国特許第4,713,245号明細書がこの技術に関する文献である;
f)ミキサー造粒生成物、ここで、例えば従来の造粒成分の乾燥粉末組成物に液体が添加され、酵素は、液体又は粉末のいずれか又は両方によって導入される。この液体と粉末とが混合され、液体の水分が乾燥粉末に吸収されるにつれて乾燥粉末の成分が付着して凝集し始めることになり、粒子が構築されて、酵素を含む顆粒が形成されることになる。このようなプロセスは、米国特許第4,106,991号明細書及び関連文献の欧州特許第170360号明細書、欧州特許第304332号明細書、欧州特許第304331号明細書、国際公開第90/09440号パンフレット及び国際公開第90/09428号パンフレットに記載されている。様々な高せん断ミキサーが造粒器として使用され得るこのプロセスの特定の生成物では、酵素としての酵素、充填剤及び結合剤などからなる顆粒をセルロース繊維と混合して粒子を強化することにより、いわゆるT−顆粒が得られる。より強固である強化粒子は、放出される酵素粉塵が少ない。
g)破砕、ここで、酵素を含有する大きい粒子、ペレット、錠剤、ブリケットなどの粉砕又は破砕によってコアが作製される。求められるコア粒子画分は、粉砕又は破砕生成物を篩分けすることによって得られる。過大及び過小な粒径の粒子は、再利用することができる。破砕については、(Martin Rhodes(編者);Principles of Powder Technology;1990;Chapter 10;John Wiley&Sons)に記載される;
h)流動層造粒、これは、微粒子を気流中に懸濁させ、その流動化粒子にノズルを介して液体を噴霧することを伴う。噴霧液滴が当たった粒子は、湿って粘着性になる。この粘着性粒子が他の粒子に衝突してそれらに付着し、顆粒を形成する;
i)コアは、流動層乾燥機などで乾燥に供され得る。飼料又は洗剤工業における顆粒を乾燥させるための他の既知の方法が当業者によって用いられ得る。乾燥は、好ましくは、25〜90℃の生成物温度で行われる。いくつかの酵素について、酵素を含むコアがコーティング前に少量の水を含有することが重要である。過剰な水が除去される前に感水性の酵素がコーティングされる場合、それがコア内に捕捉されることになり、酵素の活性に悪影響を及ぼし得る。乾燥後、コアは、好ましくは、0.1〜10%w/wの水を含有する。
(a)本発明によるリゾチーム活性を有するLYSプロテアーゼを含むコア、及び
(b)コアを取り囲む1つ以上の層からなるコーティング
を含む顆粒を提供する。
本発明は、リゾチーム活性を有する1つ以上のLYSポリペプチドを含む動物用飼料添加物にも関する。したがって、一実施形態において、本発明は、LYSポリペプチドを含む動物用飼料添加物であって、
(a)ポリペプチドは、リゾチーム活性を有し;
(b)ポリペプチドは、1つ以上のLAD触媒ドメインを含み;及び
(c)LAD触媒ドメインは、配列番号46〜187及びhmmbuildソフトウェアプログラムを使用して作製されるプロファイル隠れマルコフモデルを用いて問い合わせされるとき、少なくとも170のdomTスコアを与え、問い合わせは、HMMによってリゾチーム強化ドメインを決定する方法によってhmmscanソフトウェアプログラムを使用して実行される、動物用飼料添加物に関する。
(a)配列番号3のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(b)配列番号6のポリペプチドと少なくとも84%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(c)配列番号9のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(d)配列番号12のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(e)配列番号15のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(f)配列番号18のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(g)配列番号21のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(h)配列番号24のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(i)配列番号27のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(j)配列番号30のポリペプチドと少なくとも84%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(k)配列番号33のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(l)配列番号36のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(m)配列番号39のポリペプチドと少なくとも84%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(n)配列番号42のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(o)配列番号45のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(p)配列番号3、配列番号6、配列番号9、配列番号12、配列番号15、配列番号18、配列番号21、配列番号24、配列番号27、配列番号30、配列番号33、配列番号36、配列番号39、配列番号42及び配列番号45からなる群から選択されるポリペプチドの変異体であって、リゾチーム活性を有し、且つ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44又は45位において1つ以上のアミノ酸置換、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸欠失、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸挿入又はその任意の組合せを含む変異体;
(q)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)又は(p)のポリペプチド並びにN末端及び/又はC末端のHisタグ及び/又はHQタグを含むポリペプチド;
(r)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)又は(p)のポリペプチド並びに最大10アミノ酸、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10アミノ酸のN末端及び/又はC末端伸長を含むポリペプチド;及び
(s)リゾチーム活性を有し、且つ成熟ポリペプチドの長さの少なくとも90%を有する、(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)又は(p)のポリペプチドの断片
からなる群から選択される、動物用飼料添加物に関する。
本発明は、1つ以上の本発明のリゾチームを含む動物用飼料組成物にも関する。一実施形態において、本発明は、本明細書に記載される顆粒及び植物系材料を含む動物用飼料に関する。一実施形態において、本発明は、本明細書に記載される動物用飼料添加物及び植物系材料を含む動物用飼料に関する。
(a)配列番号3のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(b)配列番号6のポリペプチドと少なくとも84%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(c)配列番号9のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(d)配列番号12のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(e)配列番号15のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(f)配列番号18のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(g)配列番号21のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(h)配列番号24のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(i)配列番号27のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(j)配列番号30のポリペプチドと少なくとも84%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(k)配列番号33のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(l)配列番号36のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(m)配列番号39のポリペプチドと少なくとも84%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(n)配列番号42のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(o)配列番号45のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(p)配列番号3、配列番号6、配列番号9、配列番号12、配列番号15、配列番号18、配列番号21、配列番号24、配列番号27、配列番号30、配列番号33、配列番号36、配列番号39、配列番号42及び配列番号45からなる群から選択されるポリペプチドの変異体であって、リゾチーム活性を有し、且つ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44又は45位において1つ以上のアミノ酸置換、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸欠失、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸挿入又はその任意の組合せを含む変異体;
(q)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)又は(p)のポリペプチド並びにN末端及び/又はC末端のHisタグ及び/又はHQタグを含むポリペプチド;
(r)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)又は(p)のポリペプチド並びに最大10アミノ酸、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10アミノ酸のN末端及び/又はC末端伸長を含むポリペプチド;及び
(s)リゾチーム活性を有し、且つ成熟ポリペプチドの長さの少なくとも90%を有する、(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)又は(p)のポリペプチドの断片
からなる群から選択される、動物用飼料に関する。
別の実施形態において、本明細書に記載される組成物は、任意選択により1つ以上の酵素を含む。酵素は、NC−IUBMB,1992)からのハンドブックEnzyme Nomenclatureに基づいて分類することができ、インターネット:http://www.expasy.ch/enzyme/のENZYMEサイトも参照されたい。ENZYMEは、酵素の命名法に関する情報のリポジトリである。これは、主として国際生化学分子生物学連合(IUB−MB)の命名法委員会、Academic Press,Inc.,1992の勧告に基づき、EC(酵素委員会)番号が付与された特徴付けられている各種酵素について記載している(Bairoch A.The ENZYME database,2000,Nucleic Acids Res 28:304−305)。このIUB−MB酵素命名法は、その基質特異性に基づき、且つ場合によりその分子機構に基づき;このような分類は、これらの酵素の構造的特徴を反映しない。
ユーバイオティクスは、胃腸管内の健常なミクロフローラのバランスをもたらすように設計される化合物である。ユーバイオティクスは、以下にさらに詳細に記載されるプロバイオティクス、プレバイオティクス、植物抽出物(精油)及び有機酸など、いくつかの異なる飼料添加物を包含する。
ある実施形態において、動物用飼料組成物は、1つ以上の追加のプロバイオティクスをさらに含む。特定の実施形態において、動物用飼料組成物は、以下の属:ラクトバチルス属(Lactobacillus)、ラクトコッカス属(Lactococcus)、ストレプトコッカス属(Streptococcus)、バチルス属(Bacillus)、ペディオコッカス属(Pediococcus)、エンテロコッカス属(Enterococcus)、ロイコノストック属(Leuconostoc)、カルノバクテリウム属(Carnobacterium)、プロピオニバクテリウム属(Propionibacterium)、ビフィドバクテリウム属(Bifidobacterium)、クロストリジウム属(Clostridium)及びメガスフェラ属(Megasphaera)の1つ以上からの細菌又はこれらの任意の組合せをさらに含む。
プレバイオティクスは、宿主の良好な状態に寄与する微生物(例えば、細菌及び真菌)の増殖又は活性を誘導する物質である。プレバイオティクスは、通常、胃腸管の上部を消化されずに通過し、大腸に定着する有利な細菌の増殖又は活性を、それらのための基質として作用することにより刺激する難消化性繊維化合物である。通常、プレバイオティクスは、胃腸管内のビフィズス菌及び乳酸菌の数又は活性を増加させる。
植物抽出物は、ハーブ、香辛料又は他の植物に由来する、飼料添加物として使用される天然の成長促進物質又は非抗生物質系成長促進物質の群である。植物抽出物は、精油/抽出物から調製される単一の物質、精油/抽出物、単一の植物及び植物の混合物(ハーブ生成物)又は精油/抽出物/植物の混合物(特殊化された生成物)であり得る。
有機酸(C1〜C7)は、植物又は動物組織の通常の構成要素として自然界に広く分布している。それらは、主に大腸内の炭水化物の微生物発酵を通しても形成される。それらは、ニワトリの壊死性腸炎及び子ブタの大腸菌(Escherichia coli)感染のような、腸の問題に対する予防効果を有するため、ブタ及び家禽生産において抗生物質系成長促進物質の代用品として使用されることが多い。有機酸は、単一成分又は通常2種若しくは3種の異なる有機酸の混合物として販売され得る。有機酸の例は、プロピオン酸、ギ酸、クエン酸、乳酸、ソルビン酸、リンゴ酸、酢酸、フマル酸、安息香酸、酪酸及び酒石酸又はそれらの塩(通常、二ギ酸カリウム又は酪酸ナトリウムなどのナトリウム塩又はカリウム塩)である。
本明細書で上に例示されるとおりの飼料添加物の組成物の動物用飼料、例えば家禽飼料への取り込みは、実際には濃縮物又はプレミックスを使用して行われる。プレミックスは、1つ以上の微量原料と希釈剤及び/又は担体との好ましくは均一な混合物を意味する。プレミックスは、より大量の混合物中における微量原料の一様な分布を促進するために用いられる。本発明によるプレミックスは、飼料原料又は飲用水に固体として(例えば、水溶性粉末として)又は液体として加えることができる。
本発明の組成物は、1つ以上のアミノ酸をさらに含み得る。動物用飼料中に使用されるアミノ酸の例は、リジン、アラニン、β−アラニン、スレオニン、メチオニン及びトリプトファンである。一実施形態において、アミノ酸の量は、組成物の重量を基準として0.001%〜10%である。
別の実施形態において、動物用飼料は、1つ以上の脂溶性ビタミン及び/又は1つ以上の水溶性ビタミンなど、1つ以上のビタミンを含み得る。別の実施形態において、動物用飼料は、任意選択により、1つ以上の微量ミネラル及び/又は1つ以上の大量のミネラルなど、1つ以上のミネラルを含み得る。
本発明の組成物は、着色剤、安定剤、成長向上添加物及びアロマ化合物/香味剤、多価不飽和脂肪酸(PUFA);活性酸素発生種、抗酸化剤、抗菌ペプチド、抗真菌ポリペプチド及びマイコトキシン管理化合物をさらに含み得る。
動物用飼料における使用
本発明のLYSポリペプチドは、動物用飼料でも使用され得、ここで、用語「動物」は、ヒトを除く全ての動物を指す。動物の例は、単胃動物、例えばブタ又はイノシシ(限定されないが、子ブタ、成長期ブタ及び雌ブタを含む);家禽(限定されないが、家禽、シチメンチョウ、アヒル、ウズラ、ホロホロチョウ、ガチョウ、ハト、雛鳥、ニワトリ、ブロイラー、産卵鶏、若雌鶏及びヒヨコを含む);魚類(限定されないが、ブリ、ピラルクー、バルブ、バス、アミキリ、ボカチコ、ブリーム、カジカ、コロソマ、コイ、ナマズ、カトラ、サバヒー、チャー、シクリッド、スギ、タラ、クラッピー、ヨーロッパヘダイ、ニベ、ウナギ、ハゼ、キンギョ、グーラミ、ハタ、グァポート、オヒョウ、ジャワ、ラベオ、イケカツオ、ドジョウ、サバ、ミルクフィッシュ、クロサギ、マッドフィッシュ、ボラ、パコ、パールスポット、ペヘレイ、パーチ、カワカマス、ポンパーノ、ローチ、サケ、ヒゲナガヒレナマズ、ソーガー、シーバス、タイ、シャイナー、カワアナゴ、スネークヘッド、フエダイ、アカメ、シタビラメ、アイゴ、チョウザメ、マンボウ、アユ、テンチ、テラー、テラピア、マス、マグロ、ターボット、シロマス、ウォールアイ及びホワイトフィッシュを含む);並びに甲殻類(限定されないが、小エビ及びクルマエビを含む)である。
ある実施形態において、本発明は、動物の性能を向上させる方法であって、動物に本発明の動物用飼料又は動物用飼料添加物を投与することを含む方法にも関する。
ある実施形態において、本発明は、動物用飼料を作製するための方法であって、1つ以上の動物用飼料原料に本発明の1つ以上のLYSポリペプチドを添加することを含む方法を提供する。動物用飼料原料としては、濃縮物(本明細書で定義される)、飼草(本明細書で定義される)、酵素、生菌、ビタミン、ミネラル及びアミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書では、本発明の好ましい実施形態のリストに従う。
(b)リゾチーム強化ドメインは、1つ以上のモチーフIII:[CGY][YF][VIL][ASTP][DG]X[YF][VIT]X[TS][GAN](配列番号319)
を含む、項目1〜2のいずれかに記載の組成物。
(a)配列番号3のポリペプチドと少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド;
(b)配列番号6のポリペプチドと少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド;
(c)配列番号9のポリペプチドと少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド;
(d)配列番号12のポリペプチドと少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド;
(e)配列番号15のポリペプチドと少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド;
(f)配列番号18のポリペプチドと少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド;
(g)配列番号21のポリペプチドと少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド;
(h)配列番号24のポリペプチドと少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド;
(i)配列番号27のポリペプチドと少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド;
(j)配列番号30のポリペプチドと少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド;
(k)配列番号33のポリペプチドと少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド;
(l)配列番号36のポリペプチドと少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド;
(m)配列番号39のポリペプチドと少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド;
(n)配列番号42のポリペプチドと少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド;
(o)配列番号45のポリペプチドと少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド;
(p)配列番号3、配列番号6、配列番号9、配列番号12、配列番号15、配列番号18、配列番号21、配列番号24、配列番号27、配列番号30、配列番号33、配列番号36、配列番号39、配列番号42及び配列番号45からなる群から選択されるポリペプチドの変異体であって、リゾチーム活性を有し、且つ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44又は45位において1つ以上のアミノ酸置換、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸欠失、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸挿入又はその任意の組合せを含む変異体;
(q)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)又は(p)のポリペプチド並びにN末端及び/又はC末端のHisタグ及び/又はHQタグを含むポリペプチド;
(r)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)又は(p)のポリペプチド並びに最大10アミノ酸、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10アミノ酸のN末端及び/又はC末端伸長を含むポリペプチド;及び
(s)リゾチーム活性を有し、且つ成熟ポリペプチドの長さの少なくとも90%を有する、(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)又は(p)のポリペプチドの断片
からなる群から選択される、組成物。
(a)配列番号3のポリペプチドと少なくとも85%の配列同一性を有するポリペプチド;
(b)配列番号6のポリペプチドと少なくとも85%の配列同一性を有するポリペプチド;
(c)配列番号9のポリペプチドと少なくとも85%の配列同一性を有するポリペプチド;
(d)配列番号12のポリペプチドと少なくとも85%の配列同一性を有するポリペプチド;
(e)配列番号15のポリペプチドと少なくとも85%の配列同一性を有するポリペプチド;
(f)配列番号18のポリペプチドと少なくとも85%の配列同一性を有するポリペプチド;
(g)配列番号21のポリペプチドと少なくとも85%の配列同一性を有するポリペプチド;
(h)配列番号24のポリペプチドと少なくとも85%の配列同一性を有するポリペプチド;
(i)配列番号27のポリペプチドと少なくとも85%の配列同一性を有するポリペプチド;
(j)配列番号30のポリペプチドと少なくとも85%の配列同一性を有するポリペプチド;
(k)配列番号33のポリペプチドと少なくとも85%の配列同一性を有するポリペプチド;
(l)配列番号36のポリペプチドと少なくとも85%の配列同一性を有するポリペプチド;
(m)配列番号39のポリペプチドと少なくとも85%の配列同一性を有するポリペプチド;
(n)配列番号42のポリペプチドと少なくとも85%の配列同一性を有するポリペプチド;
(o)配列番号45のポリペプチドと少なくとも85%の配列同一性を有するポリペプチド;及び
(p)配列番号3、配列番号6、配列番号9、配列番号12、配列番号15、配列番号18、配列番号21、配列番号24、配列番号27、配列番号30、配列番号33、配列番号36、配列番号39、配列番号42及び配列番号45からなる群から選択されるポリペプチドの変異体であって、リゾチーム活性を有し、且つ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33位において1つ以上のアミノ酸置換、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸欠失、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸挿入又はその任意の組合せを含む変異体
からなる群から選択される、項目4に記載の組成物。
(a)配列番号3のポリペプチドと少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチド;
(b)配列番号6のポリペプチドと少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチド;
(c)配列番号9のポリペプチドと少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチド;
(d)配列番号12のポリペプチドと少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチド;
(e)配列番号15のポリペプチドと少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチド;
(f)配列番号18のポリペプチドと少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチド;
(g)配列番号21のポリペプチドと少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチド;
(h)配列番号24のポリペプチドと少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチド;
(i)配列番号27のポリペプチドと少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチド;
(j)配列番号30のポリペプチドと少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチド;
(k)配列番号33のポリペプチドと少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチド;
(l)配列番号36のポリペプチドと少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチド;
(m)配列番号39のポリペプチドと少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチド;
(n)配列番号42のポリペプチドと少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチド;
(o)配列番号45のポリペプチドと少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチド;及び
(p)配列番号3、配列番号6、配列番号9、配列番号12、配列番号15、配列番号18、配列番号21、配列番号24、配列番号27、配列番号30、配列番号33、配列番号36、配列番号39、配列番号42及び配列番号45からなる群から選択されるポリペプチドの変異体であって、リゾチーム活性を有し、且つ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21又は22位において1つ以上のアミノ酸置換、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸欠失、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸挿入又はその任意の組合せを含む変異体
からなる群から選択される、項目4に記載の組成物。
(a)配列番号3のポリペプチドと少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(b)配列番号6のポリペプチドと少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(c)配列番号9のポリペプチドと少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(d)配列番号12のポリペプチドと少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(e)配列番号15のポリペプチドと少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(f)配列番号18のポリペプチドと少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(g)配列番号21のポリペプチドと少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(h)配列番号24のポリペプチドと少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(i)配列番号27のポリペプチドと少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(j)配列番号30のポリペプチドと少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(k)配列番号33のポリペプチドと少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(l)配列番号36のポリペプチドと少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(m)配列番号39のポリペプチドと少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(n)配列番号42のポリペプチドと少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(o)配列番号45のポリペプチドと少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;及び
(p)配列番号3、配列番号6、配列番号9、配列番号12、配列番号15、配列番号18、配列番号21、配列番号24、配列番号27、配列番号30、配列番号33、配列番号36、配列番号39、配列番号42及び配列番号45からなる群から選択されるポリペプチドの変異体であって、リゾチーム活性を有し、且つ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又は11位において1つ以上のアミノ酸置換、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸欠失、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸挿入又はその任意の組合せを含む変異体
からなる群から選択される、項目4に記載の組成物。
(a)モチーフI:AG[I/L]AT[A/G][I/L][T/V]ES(配列番号317);
(b)モチーフII V[G/A]XLCQXVQXSAYP(配列番号318);及び
(c)モチーフIII:[CGY][YF][VIL][ASTP][DG]X[YF][VIT]X[TS][GAN](配列番号319)からなる群から選択される1つ以上のモチーフ
を含む、項目4〜7のいずれかに記載の組成物。
1つ以上のミネラル;
1つ以上のアミノ酸;
1つ以上の植物抽出物;
1つ以上のプレバイオティクス;
1つ以上の有機酸;及び
1つ以上の他の飼料原料
からなるリストから選択される1つ以上の成分をさらに含む、項目1〜17のいずれかに記載の組成物。
1つ以上の微生物;
1つ以上のビタミン;
1つ以上のミネラル;
1つ以上のアミノ酸;
1つ以上の植物抽出物;
1つ以上のプレバイオティクス;
1つ以上の有機酸;及び
1つ以上の他の飼料原料
からなるリストから選択される1つ以上の成分をさらに含む、項目27〜32のいずれかに記載の液体配合物。
動物用飼料における;
動物用飼料添加物における;
動物用飼料における使用のための組成物の作製における;
動物用飼料の栄養価を向上させるための;
動物用飼料の消化性を増大させるための;及び/又は
動物における1つ以上の性能パラメーターを向上させるための使用。
(a)配列番号3のポリペプチドと少なくとも95%、例えば少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有するポリペプチド;
(b)配列番号6のポリペプチドと少なくとも94%、例えば少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有するポリペプチド;
(c)配列番号9のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有するポリペプチド;
(d)配列番号12のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有するポリペプチド;
(e)配列番号15のポリペプチドと少なくとも87%、例えば少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有するポリペプチド;
(f)配列番号18のポリペプチドと少なくとも81%、例えば少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有するポリペプチド;
(g)配列番号21のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有するポリペプチド;
(h)配列番号24のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有するポリペプチド;
(i)配列番号27のポリペプチドと少なくとも87%、例えば少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有するポリペプチド;
(j)配列番号30のポリペプチドと少なくとも96.2%、例えば少なくとも97%、少なくとも97.5%、少なくとも98%、少なくとも98.5%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有するポリペプチド;
(k)配列番号33のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有するポリペプチド;
(l)配列番号36のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有するポリペプチド;
(m)配列番号39のポリペプチドと少なくとも81%、例えば少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有するポリペプチド;
(n)配列番号42のポリペプチドと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有するポリペプチド;
(o)配列番号3のポリペプチドの変異体であって、リゾチーム活性を有し、且つ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又は11位において1つ以上のアミノ酸置換、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸欠失、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸挿入又はその任意の組合せを含む変異体;
(p)配列番号6のポリペプチドの変異体であって、リゾチーム活性を有し、且つ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12又は13位において1つ以上のアミノ酸置換、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸欠失、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸挿入又はその任意の組合せを含む変異体;
(q)配列番号9及び配列番号36からなる群から選択されるポリペプチドの変異体であって、リゾチーム活性を有し、且つ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43又は44位において1つ以上のアミノ酸置換、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸欠失、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸挿入又はその任意の組合せを含む変異体);
(r)配列番号12、配列番号21、配列番号24、配列番号33及び配列番号42からなる群から選択されるポリペプチドの変異体であって、リゾチーム活性を有し、且つ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44又は45位において1つ以上のアミノ酸置換、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸欠失、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸挿入又はその任意の組合せを含む変異体;
(s)配列番号15及び配列番号27からなる群から選択されるポリペプチドの変異体であって、リゾチーム活性を有し、且つ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28又は29位において1つ以上のアミノ酸置換、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸欠失、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸挿入又はその任意の組合せを含む変異体;
(t)配列番号18及び配列番号39からなる群から選択されるポリペプチドの変異体であって、リゾチーム活性を有し、且つ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41又は42位において1つ以上のアミノ酸置換、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸欠失、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸挿入又はその任意の組合せを含む変異体;
(u)配列番号30のポリペプチドの変異体であって、リゾチーム活性を有し、且つ1、2、3、4、5、6、7又は8位において1つ以上のアミノ酸置換、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸欠失、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸挿入又はその任意の組合せを含む変異体;
(v)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)又は(u)のポリペプチド並びにN末端及び/又はC末端のHisタグ及び/又はHQタグを含むポリペプチド;
(w)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)又は(u)のポリペプチド並びに最大10アミノ酸、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10アミノ酸のN末端及び/又はC末端伸長を含むポリペプチド;及び
(x)リゾチーム活性を有し、且つ成熟ポリペプチドの長さの少なくとも90%を有する、(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)又は(u)のポリペプチドの断片
からなる群から選択される単離ポリペプチド。
(a)ポリペプチドの産生を促す条件下において、野生型形態でポリペプチドを産生する細胞を培養すること;及び
(b)ポリペプチドを回収すること
を含む方法。
(a)ポリペプチドの産生を促す条件下において、項目48〜52のいずれかに記載の組換え宿主細胞を培養すること;及び
(b)ポリペプチドを回収すること
を含む方法。
Invitrogen(Life Technologies、Carlsbad、CA、USA)から購入した大腸菌(Escherichia coli)Top−10株を使用して、LYSポリペプチドをコードする本発明者らの発現ベクターを増やした。
DAP4C−1培地は、1mLのKU6金属溶液が加えられた0.5gの酵母抽出物、10gのマルトース、20gのデキストロース、11gの硫酸マグネシウム七水和物、1gのリン酸水素二カリウム、2gのクエン酸一水和物、5.2gのリン酸三カリウム一水和物、1mLのDowfax 63N10(消泡剤)、2.5gの炭酸カルシウム及び1000mLまでの脱イオンで構成された。
LYSポリペプチドをポリプロピレンチューブにおいてリン酸緩衝液(5mMのクエン酸塩、5mMのK2HPO4、0.01%のTritonX−100、pH5.0)で50μg/mLに希釈した。希釈されたLYSポリペプチドを96ウェルポリプロピレンマイクロタイタープレートにおいてリン酸緩衝液(5mMのクエン酸塩、5mMのK2HPO4、0.01%のTritonX−100、pH5.0)で5.0又は7.0μg/mLの濃度にさらに希釈した。ポリプロピレンディープウェルプレートにおいて、50μLのLYSポリペプチド希釈物を450μLの1%ミクロコッカス・リソデイキチカス(Micrococcus lysodeikticus)溶液(milli−Q水中で凍結乾燥されたミクロコッカス・リソデイキチカス(Micrococcus lysodeikticus)ATCC番号4698(Sigma M3770)と混合し、振盪させながら(500rpm)40℃で45分間インキュベートした。インキュベーション後、ディープウェルプレートを遠心分離(4000g、5分)して、不溶性材料をペレット化し、100μLの上清を96ウェルPCRプレート中で50μLの3.2MのHClと混合し、95℃で80分間インキュベートした。50μLの3.5MのNaOHをPCRプレートの各ウェルに添加し、150μLの各試料を、K−Na酒石酸/NaOH緩衝液(50g/L K−Na酒石酸+20g/L NaOH)中の75μL/ウェルの4−ヒドロキシベンズヒドラジド溶液を含有する新たなPCRプレートに移した。プレートを95℃で10分間インキュベートした後、100μL/試料を405nmでの光学密度(OD)測定のために清浄な平底マイクロタイタープレートに移した。OD測定は、3倍希釈された試料(100μLのMilli−Q水中において希釈された50μLの試料)で実施された。
凍結乾燥されたミクロコッカス・リソデイキチカス(Micrococcus lysodeikticus)ATCC番号4698(Sigma)を洗浄し、pH6.0の60mMのKH2PO4緩衝液中において基質原液として最終濃度1%(w/v)で懸濁した。株の濃度を、OD450がおよそ1に達するまでクエン酸−Na2HPO4緩衝液を添加することによって調整した。
ペニシリウム・シンプリシシマム(Penicillium simplicissimum)株NN044175をPDAプレート上に播種し、暗闇で25℃において7日間インキュベートした。いくつかの菌糸体−PDAプラグを、100mlのYPG培地を含有する500mlの振盪フラスコに播種した。フラスコを160rpmで振盪させながら25℃で9日間インキュベートした。
ペニシリウム・シンプリシシマム(Penicillium simplicissimum)株NN044175の抽出されたゲノムDNA試料を、ILLUMINA(登録商標)MiSeqシステム(Illumina,Inc.、San Diego、CA、USA)を用いるゲノム配列決定のためにExiqon A/S(Denmark)に送付した。未加工の読み取りデータを、プログラムIbdaを用いてNovozymes Denmarkでアセンブルした(Peng,Yu et al.,2010,Research in Computational Molecular Biology,6044:426−440.Springer Berlin Heidelberg)。
14個の真菌LYS野生型遺伝子であるLYS_Pesi(配列番号1)、LYS_Pv(配列番号4)、LYS_Tapr(配列番号7)、LYS_Asp2668(配列番号10)、LYS_Pean(配列番号13)、LYS_chbr(配列番号16)、LYS_Pewe(配列番号19)、LYS_Pr(配列番号22)、LYS_Pevir(配列番号25)、LYS_asni(配列番号28)、LYS_ch369(配列番号31)、LYS_Taat(配列番号34)、LYS_Tras(配列番号37)、LYS_Meca2(配列番号40)をそれぞれペニシリウム・シンプリシシマム(Penicillium simplicissimum)株NN044175、ペニシリウム・バスコニアエ(Penicillium vasconiae)株NN053742、タラロマイセス・プロテオリチカス(Talaromyces proteolyticus)株NN058285、アスペルギルス属(Aspergillus sp.)株NN053333、ペニシリウム・アンタルクティカム(Penicillium antarcticum)株NN058605、オバトスポラ・ブラジリエンシス(Ovatospora brasiliensis)株NN047528、ペニシリウム・ウェリントネンス(Penicillium wellingtonense)株NN054749、ペニシリウム・ロセオプルプレウム(Penicillium roseopurpureum)株NN054129、ペニシリウム・ビルガツム(Penicillium virgatum)株NN058650、アスペルギルス・ニーベウス(Aspergillus niveus)株NN046949、ケトミウム属(Chaetomium sp.)株NN057921、タラロマイセス・アトリコーラ(Talaromyces atricola)株NN058427、トリコクラジウム・アスペルム(Trichocladium asperum)株NN053773、メタリジウム・コルネウム(Metarhizium carneum)株NN058086からクローン化した。
国際公開第2016026938A1号パンフレットに開示される実施例5において記載されるものと同等の改善されたアスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)宿主/ベクター系を構築した。改善がなされて、プラスミドpDAu724のPART−IIに位置するFLPase発現カセット(国際公開第2016/026938号パンフレットの34頁、図7及び配列番号30を参照されたい)を宿主株のゲノムの組込み遺伝子座amy2に移動することにより、形質転換DNAのサイズが低減された。pDAu770を得るためのpDAu724からのFLPase発現カセットの増幅及びFRT−F3とpDAu703のamdS選択マーカーとの間におけるクローニングにより、FLPase発現カセットのpDAu703(国際公開第2016/026938号パンフレットの32頁及び図6及び配列番号29)へのクローニング(図1、配列番号320)が行われる。国際公開第2016/026938号パンフレットの33頁に記載されるものと同じプロトコルを用いて、線状プラスミドpDAu770によりA.オリゼ(A.oryzae)株Jal1338(国際公開第2012/160097号パンフレットに開示される)のプロトプラストを形質転換した。形質転換体をAmdS選択プレート上で選択して、株DAu785を得た。得られた組換え体宿主株DAu785は、FLPase発現カセットが追加されたDAU716(国際公開第2016/026938号パンフレット)におけるものと同等の改変されたamy2座位を有する(図2、最上段のパネル)。宿主株DAu785は、ここで、FLPase部位特異的リコンビナーゼを構成的に発現して、このカセットにおける形質転換DNAのFRT部位でのオーバラップエクステンションPCR反応(図2、中断及び最下段のパネル)によって得られ、且つ実施例7に記載されるPCR断片の組込みを可能にする。
LYSポリペプチドをコードする配列番号43のPCR増幅は、50μL量の反応及び表2において開示されるプライマーにおいてPhusion High−Fidelity DNAポリメラーゼ(New England Biolabs、BioNordika Denmark A/S、Herlev、Denmark)を使用して実施された。
プライマーが順方向に結合する配列番号327CTATATACACAACTGGGGATCCACC
プライマーが逆方向に結合する配列番号328TAGAGTCGACCCAGCCGCGCCGGCCA
アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)MT3568のプロトプラストは、国際公開第95/002043号パンフレットに従って作製された。100μlのプロトプラストをOE PCR断片KKSC0972及び250μLの60% PEG4000(Applichem、Darmstadt、Germany)(ポリエチレングリコール、分子量4,000)、10mMのCaCl2並びに10mMのTris−HCl pH7.5と混合し、緩やかに混合した。混合物を37℃で30分間インキュベートし、選択のためにプロトプラストをCOVEプレートに広げた。37℃で4〜7日間のインキュベーション後、4個の形質転換体の胞子を96ウェルマイクロタイタープレート中の0.2mLのYP+2%グルコース又はDAP4C−1培地に播種した。30℃での4日間の培養後、培養ブロスをSDS−PAGEにより分析して、最大量のLYSポリペプチドを産生する形質転換体を同定した。
精製手順のための活性検出
凍結乾燥された細菌株ミクロコッカス・リソデイキチカス(Micrococcus lysodeikticus)ATCC番号4698(Sigma)及びイグジォバクテリウム属(Exiguobacterium sp.)(土壌から単離された)を別個に洗浄し、pH6.0の60mMのKH2PO4緩衝液中において基質原液として最終濃度1%(w/v)で懸濁した。活性検出前に基質の濃度を、pH6.0又はpH4.0の60mM KH2PO4緩衝液によってOD450で約0.7に相関する0.035%に希釈した。10uLのポリペプチド試料(又は高濃度の塩を含有する場合、5ulのMQ水と5ulの試料)及び190ulの0.035%基質を96ウェルプレートに添加し、続いてOD450を読み取った。プレートを、室温又はサーモミキサーでの37℃において300rpmで30又は60分間インキュベートした。プレートを10秒間振盪し、OD450を再度読み取った。OD低下がリゾチーム活性を示した。ブランクは、pH6.0又はpH4.0の10μlの60mM KH2PO4緩衝液が添加され、各試料は、必要に応じて二つ組で測定された。
培養上清を最初に硫酸アンモニウム(80%飽和)で沈殿させ、続いてpH4.5の20mMのNaAcで透析した。溶液を0.45umのフィルターで濾過し、続いてpH4.5の20mMのNaAcで平衡化されたSP Fast Flowカラム(GE Healthcare)にロードした。0〜1Mの溶出緩衝液としてNaCl濃度の勾配上昇を適用し、続いて溶出画分及びフロースルー画分を回収して、リゾチーム活性を検出した。リゾチーム活性を有する画分をSDS−PAGEにより分析し、続いてさらなる評価のために濃縮した。タンパク質濃度をQubit(登録商標)タンパク質アッセイキット(Invitrogen、カタログQ33212)によって決定した。
培養上清を最初に硫酸アンモニウム(80%飽和)で沈殿させ、続いて沈殿物に水を加えて、コンダクタンスを約140mS/cmに調整した。溶液を0.45umのフィルターで濾過し、続いて添加された1.2Mの(NH4)2SO4を含むpH8.0の20mMのPBSで平衡化されたHIC High Performanceカラム(GE Healthcare)にロードした。1.2M〜0の溶出緩衝液として(NH4)2SO4濃度の勾配低下を適用し、続いて溶出画分及びフロースルー画分を回収して、リゾチーム活性を検出した。
培養上清を最初に硫酸アンモニウム(80%飽和)で沈殿させ、続いて沈殿物に水を加えて、コンダクタンスを約170mS/cmに調整した。溶液を0.45umのフィルターで濾過し、続いて添加された1.5Mの(NH4)2SO4を含むpH7.0の20mMのPBSで平衡化されたHIC High Performanceカラム(GE Healthcare)にロードした。1.5M〜0の溶出緩衝液として(NH4)2SO4濃度の勾配低下を適用し、続いて溶出画分及びフロースルー画分を回収して、リゾチーム活性を検出した。リゾチーム活性を有する画分をSDS−PAGEにより分析し、合わせてプールし、pH6.0の20mMのPBSで透析濾過した。タンパク質濃度をQubit(登録商標)タンパク質アッセイキット(Invitrogen、カタログQ33212)によって決定した。
培養上清を最初に硫酸アンモニウム(80%飽和)で沈殿させ、続いて沈殿物に水を加えて、コンダクタンスを約185mS/cmに調整した。溶液を0.45umのフィルターで濾過し、続いて添加された1.8Mの(NH4)2SO4を含むpH6.0の20mMのPBSで平衡化されたHIC High Performanceカラム(GE Healthcare)にロードした。1.8M〜0の溶出緩衝液として(NH4)2SO4濃度の勾配低下を適用し、続いて溶出画分及びフロースルー画分を回収して、リゾチーム活性を検出した。リゾチーム活性を有する画分をSDS−PAGEにより分析し、合わせてプールし、pH6.0の20mMのBis−Trisで透析濾過した。
培養上清を最初に硫酸アンモニウム(80%飽和)で沈殿させ、続いて沈殿物に水を加えて、コンダクタンスを約170mS/cmに調整した。溶液を0.45umのフィルターで濾過し、続いて添加された1.5Mの(NH4)2SO4を含むpH6.0の20mMのPBSで平衡化されたPhenyl Fast Flowカラム(GE Healthcare)にロードした。1.5M〜0の溶出緩衝液として(NH4)2SO4濃度の勾配低下を適用し、続いて溶出画分及びフロースルー画分を回収して、リゾチーム活性を検出した。
LYS_chbr(配列番号16)の発現からの培養上清を最初に硫酸アンモニウム(80%飽和)で沈殿させ、続いて沈殿物に水を加えて、コンダクタンスを約170mS/cmに調整した。溶液を0.45umのフィルターで濾過し、続いて添加された1.8Mの(NH4)2SO4を含むpH6.0の20mMのPBSで平衡化されたPhenyl Sepharose High Performanceカラム(GE Healthcare)にロードした。1.8M〜0の溶出緩衝液として(NH4)2SO4濃度の勾配低下を適用し、続いて溶出画分及びフロースルー画分を回収して、リゾチーム活性を検出した。リゾチーム活性を有する画分をSDS−PAGEにより分析し、画分を合わせてプールし、pH6.0の20mMのPBSで透析濾過した。タンパク質濃度をQubit(登録商標)タンパク質アッセイキット(Invitrogen、カタログQ33212)によって決定した。
LYS_chbr(配列番号16)の発現からの培養上清を最初に硫酸アンモニウム(80%飽和)で沈殿させ、続いてpH6.5の20mMのPBSで透析した。溶液を0.45umのフィルターで濾過し、続いてpH6.5の20mMのPBSで平衡化されたCapto SPカラム(GE Healthcare)にロードした。0〜1Mの溶出緩衝液としてNaCl濃度の勾配上昇を適用し、続いて溶出画分及びフロースルー画分を回収して、リゾチーム活性を検出した。リゾチーム活性を有する画分をSDS−PAGEにより分析し、続いてさらなる評価のために濃縮した。タンパク質濃度をQubit(登録商標)タンパク質アッセイキット(Invitrogen、カタログQ33212)によって決定した。
培養上清を最初に硫酸アンモニウム(80%飽和)で沈殿させ、続いて沈殿物に水を加えて、コンダクタンスを約140mS/cmに調整した。溶液を0.45umのフィルターで濾過し、続いて添加された2MのNaClを含むpH4.5の20mMのNaAcで平衡化されたPhenyl Fast Flowカラム(GE Healthcare)にロードした。2M〜0の溶出緩衝液としてNaCl濃度の勾配低下を適用し、続いて溶出画分及びフロースルー画分を回収して、リゾチーム活性を検出した。
培養上清を最初に硫酸アンモニウム(80%飽和)で沈殿させ、続いて沈殿物に水を加えて、コンダクタンスを約170mS/cmに調整した。溶液を0.45umのフィルターで濾過し、続いて添加された4MのNaClを含むpH6.0の20mMのPBSで平衡化されたHIC High Performanceカラム(GE Healthcare)にロードした。4M〜0の溶出緩衝液としてNaCl濃度の勾配低下を適用し、続いて溶出画分及びフロースルー画分を回収して、リゾチーム活性を検出した。
培養上清を最初に硫酸アンモニウム(80%飽和)で沈殿させ、続いてpH5.5の20mMのNaAcで透析した。溶液を0.45umのフィルターで濾過し、続いてpH5.5の20mMのNaAcで平衡化されたCapto SPカラム(GE Healthcare)にロードした。0〜1Mの溶出緩衝液としてNaCl濃度の勾配上昇を適用し、続いて溶出画分及びフロースルー画分を回収して、リゾチーム活性を検出した。リゾチーム活性を有する画分をSDS−PAGEによって分析した。リゾチーム活性を有する画分をプールし、濃縮したが、試料の分解は見出されなかった。
培養上清を最初に硫酸アンモニウム(80%飽和)で沈殿させ、続いてpH4.5の20mMのNaAcで透析した。溶液を0.45umのフィルターで濾過し、続いてpH4.5の20mMのNaAcで平衡化されたCapto SPカラム(GE Healthcare)にロードした。0〜1Mの溶出緩衝液としてNaCl濃度の勾配上昇を適用し、続いて溶出画分及びフロースルー画分を回収して、リゾチーム活性を検出した。リゾチーム活性を有する画分をSDS−PAGEにより分析し、続いてさらなる評価のために濃縮した。タンパク質濃度をQubit(登録商標)タンパク質アッセイキット(Invitrogen、カタログQ33212)によって決定した。
O33X73の培養上清を最初に硫酸アンモニウム(80%飽和)で沈殿させ、続いてpH4.5の20mMのNaAcで透析した。溶液を0.45umのフィルターで濾過し、続いてpH4.5の20mMのNaAcで平衡化されたCapto SPカラム(GE Healthcare)にロードした。0〜1Mの溶出緩衝液としてNaCl濃度の勾配上昇を適用し、続いて溶出画分及びフロースルー画分を回収して、リゾチーム活性を検出した。リゾチーム活性を有する画分をSDS−PAGEにより分析し、続いてさらなる評価のために濃縮した。タンパク質濃度をQubit(登録商標)タンパク質アッセイキット(Invitrogen、カタログQ33212)によって決定した。
培養上清を最初に硫酸アンモニウム(80%飽和)で沈殿させ、続いてpH7.0の20mMのPBSで透析した。溶液を0.45umのフィルターで濾過し、続いてpH7.0の20mMのPBSで平衡化されたCapto Qカラム(GE Healthcare)にロードした。0〜1Mの溶出緩衝液としてNaCl濃度の勾配上昇を適用し、続いて溶出画分及びフロースルー画分を回収して、リゾチーム活性を検出した。リゾチーム活性を有する画分をSDS−PAGEによって分析した。リゾチーム活性を有するフロースルー画分をさらなる精製のために選抜した。
培養上清を最初に硫酸アンモニウム(80%飽和)で沈殿させ、続いて沈殿物に水を加えて、コンダクタンスを約170mS/cmに調整した。溶液を0.45umのフィルターで濾過し、続いて添加された1.5Mの(NH4)2SO4を含むpH6.0の20mMのPBSで平衡化されたPhenyl Sepharose 6 Fast Flowカラム(GE Healthcare)にロードした。1.5M〜0の溶出緩衝液として(NH4)2SO4濃度の勾配低下を適用し、続いて溶出画分及びフロースルー画分を回収して、リゾチーム活性を検出した。リゾチーム活性は、フロースルー画分及び画分1〜12において依然として見出され、それらは、さらなる精製のために合わせてプールされた。
培養上清を最初に硫酸アンモニウム(80%飽和)で沈殿させ、続いて沈殿物に水を加えて、コンダクタンスを約170mS/cmに調整した。溶液を0.45umのフィルターで濾過し、続いて添加された1.5Mの(NH4)2SO4を含むpH6.0の20mMのPBSで平衡化されたPhenyl Sepharose High Performanceカラム(GE Healthcare)にロードした。1.5M〜0の溶出緩衝液として(NH4)2SO4濃度の勾配低下を適用し、続いて溶出画分及びフロースルー画分を回収して、リゾチーム活性を検出した。リゾチーム活性を有する画分をSDS−PAGEによって分析したが、2つのバンドが見出された。リゾチーム活性を有する画分をさらなる精製のために合わせてプールした。
リゾチームを有する発酵上清を、0.22μmカットオフを有するFast PES Bottle topフィルターに通して濾過した。250mlの濾過された発酵試料を250mlのMilliQ水で希釈し、pHを4.5に調整した。溶液を含有するリゾチームを、約10CVにわたる0〜100%の勾配を用いる、緩衝液Aとして50mM Na−酢酸 pH4.5、緩衝液Bとして50mM Na−酢酸+2M NaCl pH4.5を用いて、XK16カラム中においておよそ30mlのCapto S上でのクロマトグラフィーにより精製した。カラムからの画分をクロマトグラム(280nm及び254nmでの吸収)及びSDS−PAGE分析に基づいてプールした。
配列番号46〜187を、デフォルト設定によるソフトウェアプログラムMUSCLE v3.8.31を用いて整列させた。このアラインメントを用いて、HMMは、パッケージHMMER 3.0(2010年3月)(http://hmmer.org/)のソフトウェアプログラム「hmmbuild」を使用して構築され、そのソフトウェアは、コマンド:hmmscan3 −−tblout output.dat model.hmm sequences.fastaによってデフォルト設定を用いて発動された。続いて、ソフトウェアプログラム「hmmscan]にロードするためにそれによって生成されたLAD触媒ドメインのHMMプロファイルが以下に示される。
配列番号188〜316を、デフォルト設定によるソフトウェアプログラムMUSCLE v3.8.31を用いて整列させた。このアラインメントを用いて、HMMは、パッケージHMMER 3.0(2010年3月)(http://hmmer.org/)のソフトウェアプログラム「hmmbuild」を使用して構築され、そのソフトウェアは、コマンド:hmmscan3 −−tblout output.dat model.hmm sequences.fastaによってデフォルト設定を用いて発動された。続いて、ソフトウェアプログラム「hmmscan]にロードするためにそれによって生成されたリゾチーム強化ドメインのHMMプロファイルが以下に示される。
本発明のLYSポリペプチドのLADドメイン及びLEDドメインに関するDomTスコアは、本明細書で記載されるとおりの実施例10からのLAD触媒ドメインHMM及び実施例11からのリゾチーム強化ドメインHMMを使用して決定され、下の表5において提示される。
本発明のLYSポリペプチドは、2つの酵素濃度において実施例1に従って試験され、結果は、下の表6〜表8に示される。
本発明のLYAポリペプチドは、pH4において実施例2に従って試験され、結果は、下の表8及び9において示される。
動物用飼料添加物
0.01g〜10gの酵素タンパク質を含有する本発明のLYSポリペプチド(例えば、配列番号3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45又は239)を含む配合物は、以下のプレミックスに添加される(プレミックスの1キロ当たり)。
これは、上記の動物用飼料添加物を含む動物用飼料(ブロイラー飼料)の例である。
62.55% トウモロコシ
33.8% ダイズミール(50%粗タンパク質)
1.0% ダイズ油
0.2% DL−メチオニン
0.22% DCP(リン酸二カルシウム)
0.76% CaCO3(炭酸カルシウム)
0.32% 砂
0.15% NaCl(塩化ナトリウム)
1%の上記プレミックス
Claims (20)
- 組成物1キログラム当たり少なくとも0.01mgのLYSポリペプチドを含む組成物であって、前記ポリペプチドは、(a)リゾチーム活性を有し、且つ(b)1つ以上のLAD触媒ドメインを含み、前記LAD触媒ドメインは、配列番号46〜187及びhmmbuildソフトウェアプログラムを使用して作製されるプロファイル隠れマルコフモデル(HMM)を用いて問い合わせされるとき、少なくとも180のdomTスコアを与える、組成物。
- 前記ポリペプチドは、1つ以上のリゾチーム強化ドメインをさらに含み、前記リゾチーム強化ドメインは、配列番号188〜316及びhmmbuildソフトウェアプログラムを使用して作製されるプロファイル隠れマルコフモデルを用いて問い合わせされるとき、少なくとも100のdomTスコアを与え、前記問い合わせは、hmmscanソフトウェアプログラムを使用して実行される、請求項1に記載の組成物。
- 前記ポリペプチドは、
(a)配列番号3のポリペプチドと少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド;
(b)配列番号6のポリペプチドと少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド;
(c)配列番号9のポリペプチドと少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド;
(d)配列番号12のポリペプチドと少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド;
(e)配列番号15のポリペプチドと少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド;
(f)配列番号18のポリペプチドと少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド;
(g)配列番号21のポリペプチドと少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド;
(h)配列番号24のポリペプチドと少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド;
(i)配列番号27のポリペプチドと少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド;
(j)配列番号30のポリペプチドと少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド;
(k)配列番号33のポリペプチドと少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド;
(l)配列番号36のポリペプチドと少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド;
(m)配列番号39のポリペプチドと少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド;
(n)配列番号42のポリペプチドと少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド;
(o)配列番号45のポリペプチドと少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド;
(p)配列番号3、配列番号6、配列番号9、配列番号12、配列番号15、配列番号18、配列番号21、配列番号24、配列番号27、配列番号30、配列番号33、配列番号36、配列番号39、配列番号42及び配列番号45からなる群から選択される前記ポリペプチドの変異体であって、リゾチーム活性を有し、且つ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44又は45位において1つ以上のアミノ酸置換、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸欠失、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸挿入又はその任意の組合せを含む変異体;
(q)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)又は(p)の前記ポリペプチド並びにN末端及び/又はC末端のHisタグ及び/又はHQタグを含むポリペプチド;
(r)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)又は(p)の前記ポリペプチド並びに最大10アミノ酸、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10アミノ酸のN末端及び/又はC末端伸長を含むポリペプチド;及び
(s)リゾチーム活性を有し、且つ成熟ポリペプチドの長さの少なくとも90%を有する、(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)又は(p)の前記ポリペプチドの断片
からなる群から選択される、請求項1又は2に記載の組成物。 - 前記LYSポリペプチドは、
(a)モチーフI:AG[I/L]AT[A/G][I/L][T/V]ES(配列番号317);
(b)モチーフII V[G/A]XLCQXVQXSAYP(配列番号318);及び
(c)モチーフIII:[CGY][YF][VIL][ASTP][DG]X[YF][VIT]X[TS][GAN](配列番号319)
からなる群から選択される1つ以上のモチーフを含む、請求項1〜3のいずれかに記載の組成物。 - 前記ポリペプチドは、分類学上の子嚢菌門(Ascomycota)、好ましくは分類学上のチャワンタケ亜門(Pezizomycotina)から得られるか又は得ることができる、請求項1〜4のいずれかに記載の組成物。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載の組成物を含む顆粒。
- コーティングされている、請求項6に記載の顆粒。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載の組成物又は請求項6若しくは7に記載の顆粒を含む動物用飼料添加物。
- 植物系材料と、請求項1〜5のいずれか一項に記載の組成物、請求項6若しくは7に記載の顆粒又は請求項8に記載の動物用飼料添加物とを含む動物用飼料。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載の組成物を含む液体配合物であって、前記LYSポリペプチドは、0.01%〜25%w/wの液体配合物、好ましくは0.05%〜20%w/wのLYSポリペプチド、より好ましくは0.2%〜15%w/wのLYSポリペプチド、より好ましくは0.5%〜15%w/wのLYSポリペプチド又は最も好ましくは1.0%〜10%w/wのLYSポリペプチドで投与される、液体配合物。
- 20%〜80%w/wのポリオールをさらに含む、請求項10に記載の液体配合物。
- 動物の1つ以上の性能パラメーターを向上させる方法であって、請求項1〜11のいずれか一項に記載の組成物を1匹以上の動物に投与することを含む方法。
- 動物用飼料を作製する方法であって、請求項1〜11のいずれか一項に記載の組成物を植物系材料と混合することを含む方法。
- 請求項1〜11のいずれか一項に記載の組成物の使用であって、
動物用飼料における;
動物用飼料添加物における;
動物用飼料における使用のための組成物の作製における;
動物用飼料の栄養価を向上させるための;
前記動物用飼料の消化性を増大させるための;及び/又は
動物における1つ以上の性能パラメーターを向上させるための使用。 - リゾチーム活性を有する単離ポリペプチドであって、
(a)配列番号3の前記ポリペプチドと少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド;
(b)配列番号6のポリペプチドと少なくとも94%の配列同一性を有するポリペプチド;
(c)配列番号9のポリペプチドと少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド;
(d)配列番号12のポリペプチドと少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド;
(e)配列番号15のポリペプチドと少なくとも87%の配列同一性を有するポリペプチド;
(f)配列番号18のポリペプチドと少なくとも81%の配列同一性を有するポリペプチド;
(g)配列番号21のポリペプチドと少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド;
(h)配列番号24のポリペプチドと少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド;
(i)配列番号27のポリペプチドと少なくとも87%の配列同一性を有するポリペプチド;
(j)配列番号30のポリペプチドと少なくとも96.2%の配列同一性を有するポリペプチド;
(k)配列番号33のポリペプチドと少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド;
(l)配列番号36のポリペプチドと少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド;
(m)配列番号39のポリペプチドと少なくとも81%の配列同一性を有するポリペプチド;
(n)配列番号42のポリペプチドと少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド;
(o)配列番号3の前記ポリペプチドの変異体であって、リゾチーム活性を有し、且つ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又は11位において1つ以上のアミノ酸置換、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸欠失、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸挿入又はその任意の組合せを含む変異体;
(p)配列番号6の前記ポリペプチドの変異体であって、リゾチーム活性を有し、且つ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12又は13位において1つ以上のアミノ酸置換、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸欠失、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸挿入又はその任意の組合せを含む変異体;
(q)配列番号9及び配列番号36からなる群から選択される前記ポリペプチドの変異体であって、リゾチーム活性を有し、且つ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43又は44位において1つ以上のアミノ酸置換、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸欠失、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸挿入又はその任意の組合せを含む変異体;
(r)配列番号12、配列番号21、配列番号24、配列番号33及び配列番号42からなる群から選択される前記ポリペプチドの変異体であって、リゾチーム活性を有し、且つ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44又は45位において1つ以上のアミノ酸置換、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸欠失、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸挿入又はその任意の組合せを含む変異体;
(s)配列番号15及び配列番号27からなる群から選択される前記ポリペプチドの変異体であって、リゾチーム活性を有し、且つ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28又は29位において1つ以上のアミノ酸置換、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸欠失、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸挿入又はその任意の組合せを含む変異体;
(t)配列番号18及び配列番号39からなる群から選択される前記ポリペプチドの変異体であって、リゾチーム活性を有し、且つ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41又は42位において1つ以上のアミノ酸置換、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸欠失、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸挿入又はその任意の組合せを含む変異体;
(u)配列番号30の前記ポリペプチドの変異体であって、リゾチーム活性を有し、且つ1、2、3、4、5、6、7又は8位において1つ以上のアミノ酸置換、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸欠失、及び/若しくは1つ以上のアミノ酸挿入又はその任意の組合せを含む変異体;
(v)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)又は(u)の前記ポリペプチド並びにN末端及び/又はC末端のHisタグ及び/又はHQタグを含むポリペプチド;
(w)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)又は(u)の前記ポリペプチド並びに最大10アミノ酸、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10アミノ酸のN末端及び/又はC末端伸長を含むポリペプチド;及び
(x)リゾチーム活性を有し、且つ成熟ポリペプチドの長さの少なくとも90%を有する、(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)又は(u)の前記ポリペプチドの断片
からなる群から選択される単離ポリペプチド。 - 配列番号2のアミノ酸1〜316、配列番号3のアミノ酸1〜316、配列番号4のアミノ酸1〜322、配列番号6のアミノ酸1〜318、配列番号7のアミノ酸1〜318、配列番号8のアミノ酸1〜326、配列番号10のアミノ酸1〜316、配列番号11のアミノ酸1〜316、配列番号12のアミノ酸1〜324、配列番号14のアミノ酸1〜316、配列番号15のアミノ酸1〜316、配列番号16のアミノ酸1〜324、配列番号18のアミノ酸1〜316、配列番号19のアミノ酸1〜316、配列番号20のアミノ酸1〜324、配列番号22のアミノ酸1〜316、配列番号23のアミノ酸1〜316、配列番号24のアミノ酸1〜324、配列番号26のアミノ酸1〜516、配列番号27のアミノ酸1〜516、配列番号28のアミノ酸1〜524、配列番号30のアミノ酸1〜317、配列番号31のアミノ酸1〜317、配列番号32のアミノ酸1〜325、配列番号34のアミノ酸1〜316、配列番号35のアミノ酸1〜316、配列番号36のアミノ酸1〜324、配列番号38のアミノ酸1〜316、配列番号39のアミノ酸1〜316又は配列番号40のアミノ酸1〜324を含むか又はそれからなる、請求項15に記載のポリペプチド。
- 請求項15又は16に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項17に記載のポリヌクレオチドを含む核酸構築物又は発現ベクターであって、前記ポリヌクレオチドは、発現宿主において前記ポリペプチドの産生を誘導する1つ以上の制御配列に作動可能に連結されている、核酸構築物又は発現ベクター。
- 請求項17に記載のポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞であって、前記ポリヌクレオチドは、前記ポリペプチドの産生を誘導する1つ以上の制御配列に作動可能に連結されている、組換え宿主細胞。
- 請求項15又は16に記載のポリペプチドを生成する方法であって、
(a)前記ポリペプチドの産生を促す条件下において、請求項19に記載の組換え宿主細胞を培養すること;及び
(b)前記ポリペプチドを回収すること
を含む方法。
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