CN115219576A - 一种基于光调控灵敏度的比率电化学适配体传感器的构建方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种基于光调控比率电化学适配体传感器灵敏度的构建方法及应用；在预处理后的金电极上修饰金纳米粒子溶液后，将MB‑cDNA修饰在电极表面，孵育后继续修饰Fc‑apt在电极表面，孵育后即得到比率电化学适配体传感器；在可见光激发下，产生增强的MB电化学信号，得到的IMB和IFc的比值比无光时要高。通过这种方法，可以获得具有优异灵敏度的光调控比率电化学适配体传感器。此外，该传感器能够灵敏、选择性地检测花生样品中的AFB1，检测范围为0.5～1000ng·mL‑1，检测限为0.467ngmL‑1，可实现对AFB1是否满足国家限量标准的判定。
Description
技术领域
本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种基于光调控灵敏度的比率电化学适配体传感器的构建方法及其应用。
背景技术
黄曲霉毒素B1(AFB1)是由土壤真菌黄曲霉和寄生曲霉产生的一种有毒次生代谢产物，在适宜的温度和湿度环境中产生，普遍存在于大量坚果作物中。因此，需要发展性能优良的方法实现对AFB1的精准检测。
比率电化学方法以其响应速度快，灵敏度高，准确度好被广泛应用于分析检测领域。为了提高比率传感器检测的灵敏度，设计了多种信号扩增策略，如基于纳米材料的DNA扩增、杂交链反应等，通过多个信号分子反映一个目标识别事件的浓度，实现精准分析。然而，这种策略需要引入多种DNA探针来提高灵敏度，步骤繁琐且成本高。因此，发展新策略调控响应信号是实现提高灵敏度亟需解决的技术问题。
发明内容
本文旨在发明一种基于光调控灵敏度的比率电化学适配体传感器；提出了一种新型高灵敏度的比率电化学适配体传感器的构建方法，实现对AFB1的检测。
我们研制了一种基于亚甲基蓝(MB)与金纳米粒子(AuNPs)溶液之间的距离，利用光调控比率电化学传感器灵敏度的方法。利用此方法，获得高灵敏度的光调控比率电化学适配体传感器。此外，所研制的适体传感器能够对花生及花生土壤样品中的AFB1进行灵敏和选择性的检测，为光调控在农业样品分析中的应用提供了广阔的前景。
通过如下技术方案实现本发明的目的：
本发明首先提供一种基于光调控灵敏度的比率电化学适配体传感器，步骤如下：
(1)电极预处理：将金电极在H2SO4溶液中进行扫描处理，然后在乙醇和水中超声后于空气中自然干燥，得到处理后的金电极；
(2)将金纳米粒子(AuNPs)溶液修饰在步骤(1)预处理后的金电极表面，在室温下自然晾干，修饰后的电极记为AuNPs/AuE；
(3)被巯基与亚甲基蓝(MB)修饰的适配体互补链，记为MB-cDNA；将MB-cDNA修饰在步骤(2)得到的AuNPs/AuE表面，并在一定温度条件下进行孵育，孵育后的材料记为MB-cDNA/AuNPs/AuE；
(4)二茂铁(Fc)标记的AFB1适配体，记为Fc-apt；将Fc-apt修饰在步骤(3)中MB-cDNA/AuNPs/AuE表面，孵育后即得到比率电化学适配体传感器，记为Fc-apt/MB-cDNA/AuNPs/AuE。
优选的，步骤(1)中，所述金电极的直径d＝3mm，H2SO4溶液的浓度为0.1M；所述扫描处理的方法为循环伏安法，扫描电压为-0.3V～1.4V，扫描圈数为50圈；所述在乙醇和水中超声的时间为30～60s。
优选的，步骤(2)中，所述金纳米粒子溶液修饰的用量为6μL；所述金纳米粒子溶液的浓度为5nM。
优选的，步骤(3)中，所述MB-cDNA修饰的用量为6～8μL，浓度为1μM；所述孵育的温度为4℃，孵育时间为10～14h。
优选的，步骤(4)中，所述Fc-apt修饰的用量为6μL，浓度为2μM；所述孵育的温度为4℃，孵育的时间为60～100min。
本发明还涉及一种基于光调控灵敏度的比率电化学适配体传感器检测AFB1的用途，步骤如下：
(1)首先配制不同浓度的AFB1溶液，然后在上述制得的Fc-apt/MB-cDNA/AuNPs/AuE比率电化学传感器表面依次修饰一定量不同浓度的AFB1溶液；室温下孵育后用Tris-HCl(pH＝7.4)溶液对电极进行清洗；得到修饰后的比率电化学适配体传感器；其中一个浓度的AFB1溶液对应修饰一个比率电化学适配体传感器；
(2)标准曲线的构建：以步骤(1)修饰后的比率电化学适配体传感器为工作电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，利用外界光源对比率电化学适配体传感界面激发，并在激发过程中进行电化学测试，每一个浓度的AFB1修饰的电极对应获得MB与Fc的电化学信号，分别记为IMB和IFc；最后以两个信号的比值IMB/IFc与AFB1浓度的对数关系构建标准曲线；
(3)样品中AFB1的检测：首先获取样品液，修饰一定量的样品液于工作电极表面，利用外界光源对比率电化学适配体传感界面激发，并在激发过程中进行电化学测试，通过电化学测试得到IMB和IFc，然后将IMB/IFc代入步骤(2)构建的标准曲线，即可获知样品中AFB1的浓度；实现未知样品中AFB1的检测。
优选的，步骤(1)中，所述AFB1溶液的浓度为0.5ng mL-1～1000ng mL-1；所述孵育时间为30min；所述传感器表面修饰AFB1溶液的用量为6μL。
优选的，步骤(2)中所述电化学检测由型号为Autolab PGSTAT 302N的电化学工作站记录、检测；所述检测条件为在0.1M PBS(pH＝7.4)缓冲溶液中进行测试；扫描电压范围-4～0.7V，振幅为0.025V，频率为25Hz；所述外界光源功率为500mW/cm2，距离工作电极的垂直距离为3-5cm。
优选的，步骤(3)中所述样品液于传感器表面的用量为6μL；所述外界光源功率为500mW/cm2，距离工作电极的垂直距离为3-5cm。
本发明的有益效果：
(1)本发明的光调控比率电化学适配体传感器构筑过程简单，灵敏度高，选择性好。
(2)本发明将光作为提高比率电化学适配体传感器灵敏度的策略，与其他使用各种类型DNA的方法相比，过程简单，节约成本；由于电化学和光化学过程对电子的竞争，可以获得MB(IMB)的猝灭电化学信号；AFB1存在时，其与Fc-apt结合，从传感器表面剥离，导致Fc信号(IFc)降低。同时MB-cDNA变得更加灵活，接近电极表面的等离子体AuNPs，在可见光下产生增强的MB电化学信号。因此，得到的IMB和IFc的比值(IMB/IFc)比无光时要高；通过这种方法，可以获得具有优异灵敏度的光调控比率电化学适配体传感器。
(3)本发明引入具有高特异性的识别元件AFB1的适配体，提高了光调控比率电化学适配体传感器的选择性，降低了与AFB1同时存在的其他真菌毒素的干扰，实现了对AFB1的高选择分析。
(4)本发明构建的光调控比率电化学适配体传感器对AFB1的检测范围为0.5-1000ng mL-1，检测限为0.467ng mL-1，可实现对AFB1是否满足国家限量标准的判定。
附图说明
图1中(A)为光调控比率电化学适配体传感器对不同浓度AFB1的响应图；(B)为AFB1浓度取对数与电化学信号作比的变量关系图。
图2中(A)为FB1、AFB2、AFM1、三种毒素混合物(FB1、AFB2、AFM1)、AFB1、四种毒素混合物(FB1、AFB2、AFM1、AFB1)的响应图；(B)为光调控比率电化学适配体传感器的7天稳定性；(C)为6个光调控比率电化学适配体传感器之间的重现性。
具体实施方式：
下面结合附图对本发明的实施例作详细说明：实施例以本发明的技术方案为前提进行，给出了详细实施步骤和具体操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
其中，被巯基与MB修饰的适配体互补链序列为：5’-SH-(CH2)6-CGA GAC ACA GAGAGA CAA CAC GTG CCC AAC-MB-3’；Fc标记的AFB1适配体5’-Fc-GTT GGG CAC GTG TTG TCTCTC TGT GTC TCG TGC CCT TCG CTA GGC CCA CA-3’；均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
实施例1：
(1)直径d＝3mm金电极在0.1M的H2SO4溶液中分别以扫速为0.1V，0.05V扫描50圈，循环伏安法的扫描电压为-0.3～1.4V，在乙醇和水中超声30s后于空气中干燥，得到处理后的金电极；
(2)将6μL浓度为5nM的金纳米粒子(AuNPs)溶液修饰在步骤(1)所制得的金电极表面，在室温下自然晾干，修饰后的材料记为AuNPs/AuE；
(3)取被巯基与MB修饰的适配体互补链(5’-SH-(CH2)6-CGA GAC ACA GAG AGA CAACAC GTG CCC AAC-MB-3’)，记为MB-cDNA；将6μL浓度为1μM的MB-cDNA固定在步骤(2)得到的AuNPs/AuE表面，并在4℃条件下孵育12h，孵育后的材料记为MB-cDNA/AuNPs/AuE；
(4)二茂铁(Fc)标记的AFB1适配体(5’-Fc-GTT GGG CAC GTG TTG TCT CTC TGTGTC TCG TGC CCT TCG CTA GGC CCA CA-3’)，记为Fc-apt；将6μL浓度为2μM的Fc-apt修饰在步骤(3)中MB-cDNA/AuNPs/AuE表面，4℃孵育后即得到比率电化学适配体传感器，记为Fc-apt/MB-cDNA/AuNPs/AuE。
基于光调控灵敏度的比率电化学适配体传感器用于检测黄曲霉毒素B1的用途，步骤如下：
(1)将不同浓度AFB1为0.5,1,5,10,50,100,500,1000ng mL-1修饰在实施例1制备的比率电化学适配体传感器表面，在室温条件下孵育30min后用Tris-HCl(pH＝7.4)溶液对电极进行清洗，得到修饰后的比率电化学适配体传感器；可进行测试；
(2)以步骤(1)修饰后的比率电化学适配体传感器为工作电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，利用外界光源，型号为MC-TCX300，功率是500mW/cm2，距离工作电极的距离为3cm对工作界面照射，由型号为Autolab PGSTAT 302N的电化学工作站记录获得光调控的比率电化学信号IMB，IFc；在0.1M PBS(pH＝7.4)缓冲溶液中进行测试，扫描电压范围-4～0.7V，振幅为0.025V，频率为25Hz；每一个浓度的AFB1对应一个IMB信号与一个IFc信号，以两个信号的比值IMB/IFc与AFB1浓度的对数关系构建标准曲线；随着AFB1浓度的增加，MB信号逐渐升高，Fc信号逐渐降低，在AFB1浓度为0.5～1000ng mL-1范围内与获得的两个电化学信号呈现线性关系(图1A)；具体的线性关系图如图1B所示，AFB1浓度对数与IMB/IFc呈现良好的线性关系，其线性曲线为IMB/IFc＝0.3LogCAFB1+1.2，回归系数为0.996，证明传感器性能良好。
为了评估光调控比率电化学适配体传感器的选择性，使用FB1、AFB2、AFM1、三种毒素混合物(FB1、AFB2、AFM1)、AFB1、四种毒素混合物(FB1、AFB2、AFM1、AFB1)进行了干扰实验。如图2中A图所示。光调控比率电化学适配体传感器对干扰物的响应与背景信号几乎相同。只有AFB1能对IFc/IMB/产生明显的改变，表明该光调控比率电化学适配体传感器具有良好的选择性。
如图2中B所示，光调控比率电化学适配体传感器7天测量AFB1结果的RSD为1.34％，表明其具有较好的长期稳定性。此外，通过7次平行测量AFB1来评估光调控比率电化学适配体传感器的重现性，如图2中C所示，测量结果RSD为1.87％，表明光调控比率电化学适配体传感器的重现性良好。
基于光调控比率电化学适配体传感器优异的分析性能我们对实际样品花生及花生土壤中AFB1进行了分析：首先获取样品液，修饰样品液于光调控比率电化学适配体传感器表面，通过电化学测试得到相应的电流值；将电流值代入构建的标准曲线，即可获知样品中AFB1的浓度，实现未知样品中AFB1检测的用途。
(3)样品中AFB1的检测(以花生为样品)：将5g花生样品磨碎浸泡在含有5mL甲醇，15mL超纯水的混合溶液中，震荡1.5小时，之后在6000转离心10分钟，取上清液作为花生样品液。
首先获取花生样品液，修饰6μL的样品液于工作电极表面，利用外界光源对比率电化学适配体传感界面激发，并在激发过程中进行电化学测试，通过电化学测试得到IMB和IFc，然后将IMB/IFc代入步骤(2)构建的标准曲线，即可获知样品中AFB1的浓度；实现未知样品中AFB1的检测。
分析结果如表1所示。
利用两种传感方法对实际样品花生及花生土壤中不同浓度的AFB1进行了分析，回收率分别在95.4～106％,86.3％～104％之间。与国标方法HPLC-FL相比(83.4％～90.0％与62.0％～86.2％)，提出的光调控比率电化学适配体传感器对于实际样品花生及花生土壤中AFB1的分析可靠性高。
说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。
Claims (9)
1.一种基于光调控灵敏度的比率电化学适配体传感器的构建方法，其特征在于，步骤如下：
(1)电极预处理：将金电极在H2SO4溶液中进行扫描处理，然后在乙醇和水中超声后于空气中自然干燥，得到处理后的金电极；
(2)将金纳米粒子溶液修饰在步骤(1)预处理后的金电极表面，在室温下自然晾干，修饰后的电极记为AuNPs/AuE；
(3)被巯基与亚甲基蓝修饰的适配体互补链，记为MB-cDNA；将MB-cDNA修饰在步骤(2)得到的AuNPs/AuE表面，并在一定温度条件下进行孵育，孵育后的材料记为MB-cDNA/AuNPs/AuE；
(4)二茂铁标记的AFB1适配体，记为Fc-apt；将Fc-apt修饰在步骤(3)中MB-cDNA/AuNPs/AuE表面，孵育后即得到比率电化学适配体传感器，记为Fc-apt/MB-cDNA/AuNPs/AuE。
2.根据权利要求1所述的基于光调控灵敏度的比率电化学适配体传感器的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述金电极的直径d＝3mm，H2SO4溶液的浓度为0.1M；所述扫描处理的方法为循环伏安法，扫描电压为-0.3～1.4V，扫描圈数为50圈；所述在乙醇和水中超声的时间为30～60s。
3.根据权利要求1所述的基于光调控灵敏度的比率电化学适配体传感器的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述金纳米粒子溶液修饰的用量为6μL；所述金纳米粒子溶液的浓度为5nM。
4.根据权利要求1所述的基于光调控灵敏度的比率电化学适配体传感器的构建方法，其特征在于，步骤(3)中，所述MB-cDNA修饰的用量为6～8μL，浓度为1μM；所述孵育的温度为4℃，孵育时间为10～14h。
5.根据权利要求1所述的基于光调控灵敏度的比率电化学适配体传感器的构建方法，其特征在于，步骤(4)中，所述Fc-apt修饰的用量为6μL，浓度为2μM；所述孵育的温度为4℃，孵育的时间为60～100min。
6.根据权利要求1～5任一项所述方法制备的传感器用于检测黄曲霉毒素B1的用途，其特征在于，步骤如下：
(1)首先配制不同浓度的AFB1溶液，然后在比率电化学传感器Fc-apt/MB-cDNA/AuNPs/AuE表面依次修饰一定量不同浓度的AFB1溶液；室温下孵育后用Tris-HCl溶液对电极进行清洗；得到修饰后的比率电化学适配体传感器；其中一个浓度的AFB1溶液对应修饰一个比率电化学适配体传感器；
(2)标准曲线的构建：以步骤(1)修饰后的比率电化学适配体传感器为工作电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，利用外界光源对比率电化学适配体传感界面激发，并在激发过程中进行电化学测试，每一个浓度的AFB1修饰的电极对应获得MB与Fc的电化学信号，分别记为IMB和IFc；最后以两个信号的比值IMB/IFc与AFB1浓度的对数关系构建标准曲线；
(3)样品中AFB1的检测：首先获取样品液，修饰一定量的样品液于工作电极表面，利用外界光源对比率电化学适配体传感界面激发，并在激发过程中进行电化学测试，通过电化学测试得到IMB和IFc，然后将IMB/IFc代入步骤(2)构建的标准曲线，即可获知样品中AFB1的浓度；实现未知样品中AFB1的检测。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，步骤(1)中，所述AFB1溶液的浓度为0.5～1000ng mL-1；所述孵育时间为30min；所述传感器表面修饰AFB1溶液的用量为6μL。
8.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，步骤(2)中电化学测试由型号为AutolabPGSTAT 302N的电化学工作站记录、检测；所述检测条件为在0.1M PBS缓冲溶液中进行测试；扫描电压范围-4～0.7V，振幅为0.025V，频率为25Hz；所述外界光源功率为500mW/cm2，距离工作电极的垂直距离为3～5cm。
9.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，步骤(3)中所述样品液于传感器表面的用量为6μL；所述外界光源功率为500mW/cm2，距离工作电极的垂直距离为3～5cm。
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