CN116773461A - 基于双功能探针的比色-光增强电化学双模适配体传感器的构建方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种基于双功能探针的比色‑光增强电化学双模适配体传感器的构建方法及其应用。本发明利用链霉亲和素磁珠获得探针亚甲基蓝(MB)的双信号通道，通过MB在磁珠界面的特异性释放，获得具有颜色辨识度的上清液进行比色分析；并研究了还原氧化石墨烯‑金纳米离子肖特基结的电子转移路径，通过光生电子促进MB的氧化还原过程，从而实现电化学信号放大；基于光激发信号放大可以获得更高的响应灵敏度以便进行AFB1痕量分析，并可通过光激发前后IMB信号进行自检以提高检测的可靠性和准确性，本发明通过对AFB1的快速定性和精准定量，可实现农业样品霉变分析的早期预警和精准监控。
Description
技术领域
本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种基于双功能探针的比色-光增强电化学双模适配体传感器的构建方法及其应用。
背景技术
黄曲霉毒素B1(AFB1)是黄曲霉菌和寄生曲霉菌的次生代谢物，是农产品中常见的致病菌。具有高毒性和致癌性，可导致急性肝炎和出血性坏死，即使低水平暴露也会对机体生长以及免疫抗病能力有不良影响。因此，需要发展性能优良的传感器实现对AFB1的快速和精准检测。
电化学传感器因其响应快速、高灵敏度和特异性强等优点受到广泛关注。然而，电化学传感器在AFB1霉变监测中的实际应用仍具有挑战性：(1)不可避免的基质干扰可能导致探针分子的电化学信号降低，限制了复杂样品基质中AFB1痕量污染的超灵敏检测。目前多采用核酸链扩增技术进行信号放大，可有效提高响应灵敏度，但此类方法耗时长，抑制传感器构建效率，因此亟需发展新型信号放大策略；(2)相比于比色传感器的可视化分析，电化学传感器相对复杂的读出模式限制了其在现场检测的应用，双模传感方法的设计使传感平台既保留每种模式各自鲜明的优势，又可相互弥补不足，可有效提升分析性能。多种指示探针的引入可有效完成双模传感平台的构建，但相对繁琐的的组装，如沉积、蚀刻以及酶催化显色底物处理一定程度上限制了其实际应用，因此亟需发展一种简单、高效的具有双信号响应的多功能探针指示策略。
发明内容
本文旨在利用肖特基结的光生电子转移，发明一种基于双功能探针亚甲基蓝(MB)的比色-光增强电化学双模适配体传感器，实现对AFB1的快速精准检测。
本发明利用链霉亲和素磁珠获得探针MB的双信号通道，通过MB在磁珠界面的特异性释放，获得具有颜色辨识度的上清液进行比色分析。并研究了还原氧化石墨烯-金纳米离子(rGO-AuNPs)肖特基结的电子转移路径，通过光生电子促进MB的氧化还原过程，从而实现电化学信号放大。此外，本发明所研制的双模适配体传感器能够对花生及花生土壤样品中的AFB1进行高灵敏和高选择性检测，为农业样品的霉变分析提供了一种有力工具。
通过如下技术方案实现本发明的目的：
本发明首先提供一种比色-光增强电化学双模适配体传感器的制备方法，步骤如下：
(1)rGO-AuNPs纳米材料的制备：将氯金酸(HAuCl4)溶液加入还原氧化石墨烯(rGO)分散液中，磁力搅拌后离心移除上清液，收集沉淀物用超纯水洗涤离心，得到rGO-AuNPs纳米复合材料；最后，将得到的rGO-AuNPs纳米复合材料重新分散在水中，得到rGO-AuNPs纳米复合材料分散液；
优选的，步骤(1)中，所述HAuCl4溶液与rGO分散液的体积比为1：1；其中HAuCl4溶液质量浓度为1％，rGO分散液的浓度为2mg mL-1；磁力搅拌时间为12h；离心转速为10000rpm，时间为15min；所述rGO-AuNPs纳米复合材料分散液的浓度为2mg mL-1。
(2)链霉亲和素磁珠(SMBs)的预处理：将链霉亲和素磁珠经磁分离后移除磁珠保护液，收集沉淀物加入缓冲液洗涤后再经磁分离，得到SMBs沉淀，最后将SMBs沉淀重新分散在缓冲液中震荡重悬，得到SMBs悬浊液；
优选的，步骤(2)中，所述链霉亲和素磁珠的用量为100μL，浓度为10mg mL-1；所述缓冲液为Tris-HCl缓冲液，pH＝7.4，每次洗涤缓冲液用量为1mL；所述SMBs悬浊液的浓度为2～3mg mL-1。
(3)Apt-Primer-MB的制备：将AFB1适配体溶液(记为Apt)与AFB1适配体的互补链溶液(记为Primer)混合后进行加热反应，反应后冷却至室温，得到Apt-Primer溶液；然后将亚甲基蓝(MB)溶液与Apt-Primer溶液混合，经孵育后得到Apt-Primer-MB溶液；
优选的，步骤(3)中，所述Apt溶液和Primer溶液的浓度均为10μM，体积比为1：1；所述加热反应的温度为95℃，时间为10min；冷却的时间为10～20min；所述MB溶液与Apt-Primer溶液的用量比为45μL：240μL，其中MB溶液的浓度为1mM，孵育温度为37℃，孵育时间为1h。
(4)Apt-Primer-MB SMBs的制备：将Apt-Primer-MB溶液加入步骤(2)制备的SMBs悬浊液中，旋转混合反应后进行磁分离，得到沉淀物记为Apt-Primer-MB SMBs，即为基于双功能探针MB的比色-光增强电化学双模适配体传感器。
优选的，步骤(4)中，所述SMBs悬浊液与Apt-Primer-MB溶液的体积比为9：1；所述混合反应的温度为30℃，反应时间为75min。
本发明还涉及一种基于双功能探针的比色-光激发电化学双模适配体传感器用于检测AFB1的用途，步骤如下：
(1)玻碳电极(GCE)的预处理：用三氧化二铝粉抛光打磨GCE，随后依次在无水乙醇和超纯水中超声处理，经干燥后，得到预处理后的GCE电极；
(2)将rGO-AuNPs纳米复合材料分散液修饰到步骤(1)预处理的GCE电极表面，经干燥处理后的电极记为rGO-AuNPs/GCE；
优选的，步骤(1)中，所述GCE电极直径为3mm；所用的三氧化二铝粉末的粒径为0.05μm；所述超声处理时间为30s。
优选的，步骤(2)中，所述rGO-AuNPs纳米复合材料分散液的修饰量为6μL，浓度为2mg mL-1。
(3)配制不同浓度的AFB1标准液分别与所制备的Apt-Primer-MB SMBs混合孵育，孵育后经磁分离收集上清液，得到不同浓度对应下的上清液；
优选的，步骤(3)中，所述Apt-Primer-MB SMBs沉淀与AFB1标准液的用量比均为1mg：100μL，AFB1标准液的浓度为10-3～105ng mL-1；所述孵育温度为37℃，孵育时间为40min。
(4)取引物的互补链溶液，记为Padlock溶液；将Padlock溶液分别与步骤(3)制备的上清液混合孵育，经孵育后再加入TCEP溶液进行活化反应，反应后得到Primer-Padlock-MB溶液；
优选的，步骤(4)中，所述上清液、Padlock溶液和TCEP溶液的体积比为5：5：1，其中Padlock溶液浓度为2.5μM，TCEP溶液浓度为1mM；所述孵育的温度为37℃，时间为1h；活化反应的温度为室温，反应时间为1h。
(5)取步骤(4)制备的Primer-Padlock-MB溶液修饰在上述步骤(2)制备的rGO-AuNPs/GCE表面进行孵育，孵育后将修饰电极浸泡在MB溶液中，浸泡后的修饰电极记为Primer-Padlock-MB/rGO-AuNPs/GCE；
优选的，步骤(5)中，所述Primer-Padlock-MB溶液的修饰量为6μL，孵育温度为4℃，孵育时间为12h；MB溶液的用量为200μL，浓度为5μM，浸泡时间为2min。
(6)标准曲线的构建：
(a)比色模式：以步骤(3)制备的上清液为测试对象，获取记录得到RGB值，根据欧氏距离公式计算得到总色差值△C以比色信号△C与对应AFB1浓度的对数构建标准曲线；
(b)电化学模式：以步骤(5)修饰后的Primer-Padlock-MB/rGO-AuNPs/GCE为工作电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，进行电化学检测；利用外界光源照射工作界面，并获取记录光激发前后电化学信号分别为IMBoff和IMBon；以IMBoff和IMBon两个信号与AFB1浓度的对数分别构建两条标准曲线；
优选的，步骤(6)的(a)中，所述比色测定由CS-420分光色差仪记录检测RGB值，口径为8mm，光源类型为D65，光源角度为10°。
步骤(6)的(b)中，所述电化学检测由型号为Autolab PGSTAT 302N的电化学工作站记录获取，扫描电压范围为0～-0.4V，振幅为0.025V，频率为37Hz；所述光源波长为365nm，功率是7W/cm2，光源距离工作界面的垂直距离为2cm；所述测试溶液为0.1M、pH＝7.4的PBS缓冲液，含有终浓度为0.1M的抗坏血酸(AA)。
(7)实际样品中AFB1的检测：
(a)首先获取样品提取液，将步骤(3)中AFB1标准液替换为样品提取液，然后按照步骤(6)的(a)比色模式操作，测试得到相应的△C值；将数值代入步骤(6)的(a)中所构建的标准曲线，即可获知样品中AFB1的浓度，实现未知样品中AFB1检测；
(b)将步骤(3)中AFB1标准液替换为样品提取液得到上清液后，按照步骤(4)和(5)的操作得到浸泡后的修饰电极；然后再按照步骤(6)的(b)电化学模式操作，测试得到相应的IMBoff、IMBon值，最后将数值代入步骤(6)的(b)中所构建的标准曲线，即可获知样品中AFB1的浓度，实现未知样品中AFB1检测。
优选的，步骤(7)中，获取样品提取液的具体过程为：取一定量样品磨碎后浸泡在甲醇和超纯水混合液中，震荡提取上清液，随后经离心、过滤以获得样品提取液；所述样品、甲醇和超纯水的用量关系为5g：14mL：6mL；所述震荡提取的时间为1h；所述离心的转速为8000rpm，时间为15min；滤膜孔径为0.22μm。
本发明的有益效果：
(1)本发明的比色-光增强电化学双模适配体传感器构筑过程简单，灵敏度高，选择性好。
(2)本发明利用肖特基结的光生电子提高电化学适配体传感器灵敏度，与其他组装DNA的方法相比，过程简单，节约成本；由于所构建rGO-AuNPs肖特基结高效的载流子迁移，光生电子可以加速MB的电化学还原过程，在紫外光下产生增强的MB电化学信号。因此，基于光激发信号放大可以获得更高的响应灵敏度以便进行AFB1痕量分析，并可通过光激发前后IMB信号进行自检以提高检测的可靠性和准确性。
(3)本发明可以引入有蓝牙传输模式的便携式色差仪，将溶液颜色传送至智能手机，使其转化为RGB数字信号，实现AFB1的精准可视化分析，方便快捷。
(4)本发明构建的双模适配体传感器比色模式和电化学模式对AFB1的检测范围分别为5～100μg mL-1和1pg mL-1～50ng mL-1，检测限分别为1.23ng·mL-1和0.12pg mL-1，通过对AFB1的快速定性和精准定量可实现霉变分析的早期预警和精准监控。
附图说明
图1为用于AFB1检测的比色-光增强电化学双模适配体传感器的构建示意图。
图2中(A)为传感器对不同浓度AFB1的可视化颜色响应(从左到右：0,1,2,5,10,20,50,100,500,103,5×103,104,5×104,105ng mL-1)；(B)为ΔC与AFB1浓度对数的校准曲线；(C)为传感器对不同浓度AFB1的光激发前后电化学响应图(10-3,5×10-3,10-2,5×10-2,10-1,5×10-1,1,5,10,50ng mL-1)；(D)为IMB与AFB1浓度对数的校准曲线。
图3中(A)和(D)分别为传感器对OTA、ZEN、FB1、三种毒素混合物(OTA+ZEN+FB1)、AFB1、四种毒素混合物(OTA+ZEN+FB1+AFB1)的比色和电化学信号响应图；(B)和(E)分别为比色和电化学7次平行测量的重现性；(C)和(F)分别用比色和电化学信号值表征传感器的长期稳定性。
具体实施方式：
下面结合附图对本发明的实施例作详细说明：实施例以本发明的技术方案为前提进行，给出了详细实施步骤和具体操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
其中，AFB1适配体(Apt)为：5′-Biotin-GTT GGG CAC GTG TTG TCT CTC TGT GTCTCG TGC CCT TCG CTA GGC CCA CA-3′(50mer)；与适配体互补的引物序列(Primer)为：5′-SH-(CH2)6-CAA CTT CTA TGT GGG CCT AGC GAA-3′(24mer)；与引物互补的环状序列(Padlock)为：5′-ACA TAG AAG TTG AAG CTG CTA CAA ACG GAG AAA GGA CTC GCA CAACGC AAT CAG GTA TTC GCT AGG CCC-3′(69mer)，均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；
链霉亲和素磁珠(SMBs)购自海狸生物科技有限公司。
实施例1：
(1)rGO-AuNPs纳米材料的制备：将2mL、质量浓度为1％的HAuCl4溶液加入2mL、2mgmL-1rGO分散液中，磁力搅拌12h，随后将溶液在10000rpm条件下离心15min，移除上清液，收集沉淀物用超纯水洗涤离心3次，以除去多余的HAuCl4，得到rGO-AuNPs纳米复合材料；最后，将得到的rGO-AuNPs纳米复合材料重新分散在2mL H2O中，得到2mg mL-1rGO-AuNPs纳米复合材料分散液，并在4℃下避光保存备用；
(2)SMBs的预处理：取100μL、10mg mL-1的链霉亲和素磁珠(SMBs)经磁分离后移除磁珠保护液，收集沉淀物加入1mL Tris-HCl(pH＝7.4)缓冲液磁分离洗涤3次，最后再经磁分离得到SMBs沉淀，将SMBs重新分散在缓冲液中震荡重悬，得到SMBs悬浊液，浓度为2.2mgmL-1；
(3)Apt-Primer-MB的制备：将10μM生物素化的Apt溶液与10μM Primer溶液等体积比混合，在95℃下加热变性10min，随后冷却至室温20min，使其碱基配对，得到Apt-Primer双链溶液；然后将45μL、1mM MB溶液加入至240μL Apt-Primer双链溶液并在37℃黑暗条件下孵育1h，得到Apt-Primer-MB溶液；
(4)Apt-Primer-MB SMBs的制备：将步骤(2)制备的SMBs悬浊液和步骤(3)所制备的Apt-Primer-MB溶液以9：1比例混合，在30℃条件下旋转反应75min，得到Apt-Primer-MBSMBs溶液，随后用Tris-HCl(pH＝7.4)缓冲液磁分离、洗涤磁珠3次，以除去未结合的Apt-Primer-MB，最后磁分离后得到沉淀物记为Apt-Primer-MB SMBs，即为基于双功能探针MB的比色-光增强电化学双模适配体传感器。
基于双功能探针的比色-光增强电化学适配体传感器用于检测黄曲霉毒素B1的用途，步骤如下：
(1)GCE的预处理：用0.05um三氧化二铝粉抛光玻碳电极(GCE，Φ＝3mm)至镜面光泽，随后依次在无水乙醇和超纯水中超声处理30s后于空气中干燥；
(2)将实施例1中步骤(1)制备的2mg mL-1rGO-AuNPs纳米复合材料分散液修饰到预处理的GCE电极表面，用量为6μL，并在室温下干燥，修饰后的电极记为rGO-AuNPs/GCE；
(3)将100μL不同浓度AFB1溶液(10-3,5×10-3,10-2,5×10-2,10-1,5×10-1,1,2,5,10,20,50,100,500,103,5×103,104,5×104,105ng mL-1)分别加入实施例1步骤(4)制备的Apt-Primer-MB SMBs沉淀物中，两者为一一对应关系；然后在37℃条件下旋转混合40min，磁分离后，收集上清液用便携式彩谱CS-420分光色差仪(8mm口径，光源类型D65，光源角度10°)进行比色测定(RGB)，随后根据欧氏距离公式计算得到总色差值ΔC如图2(A)所示,在一定范围内，随着AFB1浓度增加，上清液颜色逐渐加深。具体的线性关系图如图2(B)所示，在AFB1浓度为5～100ng mL-1和0.1～100μg mL-1范围内，AFB1浓度对数与ΔC呈现两端良好的线性关系，其线性曲线分别为ΔC＝39.727lgCAFB1+20.617(R2＝0.996)和ΔC＝5.666lgC AFB1+70.680(R2＝0.994)，证明传感器性能良好；
(4)将2.5μM Padlock溶液加入步骤(3)所获取的上清液中，以1:1体积比混合，在37℃下孵育1h，以形成双链结构重新吸附解离于上清夜中的MB，然后在200μL混合溶液中加入20μL 1mM TCEP溶液，在室温条件下反应1h，以活化Primer链上巯基，以获得Primer-Padlock-MB溶液；
(5)取步骤(4)制备的Primer-Padlock-MB溶液修饰在步骤(2)制备的rGO-AuNPs/GCE电极表面，用量为6μL，在4℃条件下孵育12h，然后将修饰电极浸泡在200μL 5μM MB溶液中2min以加强MB吸附量，之后用PBS溶液(pH＝7.4)对电极进行清洗，记为Primer-Padlock-MB/rGO-AuNPs/GCE；
(6)以步骤(5)修饰后的Primer-Padlock-MB/rGO-AuNPs/GCE为工作电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，利用外界光源距离工作界面2cm照射，波长为365nm，功率是7W/cm2，由型号为Autolab PGSTAT302N的电化学工作站记录获得光激发前后电化学信号：IMBoff、IMBon；在含终浓度0.1M AA的0.1M、pH＝7.4的PBS缓冲溶液中进行测试，扫描电压范围为0～-0.4V，振幅为0.025V，频率为37Hz；以IMBoff和IMBon两个信号与AFB1浓度的对数分别构建两条标准曲线；如图2(C)所示，随着AFB1浓度的增加，IMBoff和IMBon逐渐升高，且呈现两条灵敏度与线性范围不同的线性关系；具体的线性关系图如图2(D)所示，在AFB1浓度为10pg mL-1～50ng mL-1范围内，AFB1浓度对数与IMBoff呈现良好的线性关系，其线性曲线为IMB(off)＝1.987lgCAFB1+13.958(R2＝0.996)，在AFB1浓度为1pg mL-1～5ng mL-1范围内，AFB1浓度对数与IMBon呈现良好的线性关系，其线性曲线为IMB(on)＝2.795lgCAFB1+16.012(R2＝0.999)，证明传感器性能良好；
为了评估双模适配体传感器的选择性，使用OTA、ZEN、FB1、三种毒素混合物(OTA+ZEN+FB1)、AFB1、四种毒素混合物(OTA+ZEN+FB1+AFB1)进行干扰实验。如图3(A)和(D)所示，与AFB1产生的信号强度相比，10倍浓度干扰物质的信号响应可以忽略不计；因此，该传感器对AFB1检测具有良好的选择性。
重现性和长期稳定性也是评估传感器实用性的关键因素；通过7次平行测量AFB1来评估传感器的重现性，结果如图3(B)和(E)所示，△C、IMBoff、IMBon的RSD分别为0.7％、2.8％、1.8％，表明传感器重现性良好。将传感器放置在4℃黑暗环境中，每天测量响应信号，以评估传感器的长期稳定性。结果如图3(C)和(F)所示，传感器放置7天后，△C、IMBoff、IMBon分别占初始信号值的97.5％、97.3％、96.7％，且具有较低的RSD。这些结果表明，该双模传感器具有相当优异的重现性和长期稳定性；
(7)基于双模传感器优异的分析性能，采集了实际样品花生及花生土壤，并对实际样品中AFB1进行分析；
首先获取样品提取液：取5g花生样品磨碎或花生土壤，浸泡在含有14mL甲醇和6mL超纯水的混合溶液中，震荡提取1h，随后在8000rpm下离心15min，上清液通过0.22μm滤膜过滤以获得样品提取液；
通过比色和电化学测试得到相应的△C、IMBoff、IMBon值；将数值代入所构建的标准曲线，即可获知样品中AFB1的浓度，实现未知样品中AFB1检测：
(a)取样品提取液，按照步骤(3)的操作，区别是将AFB1标准液替换为样品提取液；然后按照步骤(3)的比色模式测试得到相应的△C值；将数值代入步骤(3)所构建的标准曲线，即可获知样品中AFB1的浓度；
(b)将步骤(3)的AFB1标准液替换为样品提取液得到上清液后，继续按照步骤(4)和(5)的操作得到浸泡后的修饰电极；然后再按照步骤(6)的电化学模式测试得到相应的IMBoff、IMBon值，最后将数值代入步骤(6)所构建的标准曲线，即可获知样品中AFB1的浓度。
分析结果如表1所示，利用比色和电化学两种传感方法对实际样品花生及花生土壤中不同浓度的AFB1进行了分析，回收率分别在92.01％～101.12％,94.82％～110.29％之间。与国标方法HPLC-FL相比(90.05％～108.00％)，提出的双模适配体传感器对于实际样品花生及花生土壤中AFB1的分析可靠性较高。
说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。
Claims (10)
1.基于双功能探针的比色-光增强电化学双模适配体传感器的构建方法，其特征在于，步骤如下：
(1)rGO-AuNPs纳米材料的制备：将氯金酸溶液加入还原氧化石墨烯分散液中，磁力搅拌后离心移除上清液，收集沉淀物用超纯水洗涤离心，得到rGO-AuNPs纳米复合材料；最后，将得到的rGO-AuNPs纳米复合材料重新分散在水中，得到rGO-AuNPs纳米复合材料分散液；
(2)链霉亲和素磁珠的预处理：将链霉亲和素磁珠经磁分离后移除磁珠保护液，收集沉淀物加入缓冲液洗涤后再经磁分离，得到SMBs沉淀，最后将SMBs沉淀重新分散在缓冲液中震荡重悬，得到SMBs悬浊液；
(3)Apt-Primer-MB的制备：将AFB1适配体溶液与AFB1适配体的互补链溶液混合后进行加热反应，反应后冷却至室温，得到Apt-Primer溶液；然后将亚甲基蓝溶液与Apt-Primer溶液混合，经孵育后得到Apt-Primer-MB溶液；
(4)Apt-Primer-MB SMBs的制备：将Apt-Primer-MB溶液加入步骤(2)制备的SMBs悬浊液中，旋转混合反应后进行磁分离，得到沉淀物记为Apt-Primer-MB SMBs，即为基于双功能探针MB的比色-光增强电化学双模适配体传感器。
2.根据权利要求1所述的基于双功能探针的比色-光增强电化学双模适配体传感器的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述氯金酸溶液、还原氧化石墨烯分散液的体积比为1：1；其中氯金酸溶液质量浓度为1％，还原氧化石墨烯分散液的浓度为2mg mL-1；磁力搅拌时间为12h；离心转速为10000rpm，时间为15min；所述rGO-AuNPs纳米复合材料分散液的浓度为2mg mL-1。
3.根据权利要求1所述的基于双功能探针的比色-光增强电化学双模适配体传感器的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述SMBs母液的用量为100μL，浓度为10mg mL-1；所述缓冲液为Tris-HCl缓冲液，pH＝7.4，每次洗涤缓冲液用量为1mL；所述SMBs悬浊液的浓度为2～3mg mL-1。
4.根据权利要求1所述的基于双功能探针的比色-光增强电化学双模适配体传感器的构建方法，其特征在于，步骤(3)中，所述AFB1适配体溶液与AFB1适配体的互补链溶液的浓度均为10μM，体积比为1：1；所述加热反应的温度为95℃，时间为10min；冷却的时间为10～20min；所述亚甲基蓝溶液与Apt-Primer溶液的用量比为45μL：240μL，其中亚甲基蓝溶液的浓度为1mM，孵育温度为37℃，孵育时间为1h。
5.根据权利要求1所述的基于双功能探针的比色-光增强电化学双模适配体传感器的构建方法，其特征在于，步骤(4)中，所述SMBs悬浊液与Apt-Primer-MB溶液的体积比为9：1；所述混合反应的温度为30℃，反应时间为75min。
6.根据权利要求1-5任一所述方法制备的基于双功能探针的比色-光激发电化学双模适配体传感器用于检测AFB1的用途，其特征在于，步骤如下：
(1)玻碳电极的预处理：用三氧化二铝粉抛光打磨GCE，随后依次在无水乙醇和超纯水中超声处理，经干燥后，得到预处理后的GCE电极；
(2)将rGO-AuNPs纳米复合材料分散液修饰到步骤(1)预处理的GCE电极表面，经干燥处理后的电极记为rGO-AuNPs/GCE；
(3)配制不同浓度的AFB1标准液分别与所制备的Apt-Primer-MB SMBs混合孵育，孵育后经磁分离收集上清液，得到不同浓度对应下的上清液；
(4)取引物的互补链溶液，记为Padlock溶液；将Padlock溶液分别与步骤(3)制备的上清液混合孵育，经孵育后再加入TCEP溶液进行活化反应，反应后得到Primer-Padlock-MB溶液；
(5)取步骤(4)制备的Primer-Padlock-MB溶液修饰在上述步骤(2)制备的rGO-AuNPs/GCE表面进行孵育，孵育后将修饰电极浸泡在MB溶液中，浸泡后的修饰电极记为Primer-Padlock-MB/rGO-AuNPs/GCE；
(6)标准曲线的构建：
(a)比色模式：以步骤(3)制备的上清液为测试对象，获取记录得到RGB值，根据欧氏距离公式计算得到总色差值△C，以比色信号△C与对应AFB1浓度的对数构建标准曲线；
(b)电化学模式：以步骤(5)修饰后的Primer-Padlock-MB/rGO-AuNPs/GCE为工作电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，进行电化学检测；利用外界光源照射工作界面，并获取记录光激发前后电化学信号分别为IMBoff和IMBon；以IMBoff和IMBon两个信号与AFB1浓度的对数分别构建两条标准曲线；
(7)实际样品中AFB1的检测：
(a)首先获取样品提取液，将步骤(3)中AFB1标准液替换为样品提取液，然后按照步骤(6)的(a)比色模式操作，测试得到相应的△C值；将数值代入步骤(6)的(a)中所构建的标准曲线，即可获知样品中AFB1的浓度，实现未知样品中AFB1检测；
(b)将步骤(3)中AFB1标准液替换为样品提取液得到上清液后，按照步骤(4)和(5)的操作得到浸泡后的修饰电极；然后再按照步骤(6)的(b)电化学模式操作，测试得到相应的IMBoff、IMBon值，最后将数值代入步骤(6)的(b)中所构建的标准曲线，即可获知样品中AFB1的浓度，实现未知样品中AFB1检测。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，步骤(1)中，所述GCE电极直径为3mm；所用的三氧化二铝粉末的粒径为0.05μm；所述超声处理时间为30s；步骤(2)中，所述rGO-AuNPs纳米复合材料分散液的修饰量为6μL，浓度为2mg mL-1。
8.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，步骤(3)中，所述Apt-Primer-MB SMBs沉淀与AFB1标准液的用量比均为1mg：100μL，AFB1标准液的浓度为10-3～105ng mL-1；所述孵育温度为37℃，孵育时间为40min；步骤(4)中，所述上清液、Padlock溶液和TCEP溶液的体积比为5：5：1，其中Padlock的浓度为2.5μM，TCEP溶液浓度为1mM；所述孵育的温度为37℃，时间为1h；活化反应的温度为室温，反应时间为1h。
9.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，步骤(5)中，所述Primer-Padlock-MB溶液的修饰量为6μL，孵育温度为4℃，孵育时间为12h；MB溶液的用量为200μL，浓度为5μM，浸泡时间为2min；
步骤(6)的(a)中，所述比色测定由CS-420分光色差仪记录检测RGB值，口径为8mm，光源类型为D65，光源角度为10°；
步骤(6)的(b)中，所述电化学检测由型号为Autolab PGSTAT 302N的电化学工作站记录获取，扫描电压范围为0～-0.4V，振幅为0.025V，频率为37Hz；所述光源波长为365nm，功率是7W/cm2，光源距离工作界面的垂直距离为2cm；所述测试溶液为0.1M、pH＝7.4的PBS缓冲液，含有终浓度为0.1M的抗坏血酸。
10.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，步骤(7)中，获取样品提取液的具体过程为：取一定量样品磨碎后浸泡在甲醇和超纯水混合液中，震荡提取上清液，随后经离心、过滤以获得样品提取液；所述样品、甲醇和超纯水的用量关系为5g：14mL：6mL；所述震荡提取的时间为1h；所述离心的转速为8000rpm，时间为15min；滤膜孔径为0.22μm。
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