CN106057394A - 一种免疫磁性纳米微粒的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种免疫磁性纳米微粒的制备方法。本发明利用硅酸酯对四氧化三铁磁纳米微粒进行表面包覆，降低其表面活化能，从而大大提高磁纳米微粒的稳定性，同时可调节硅酸酯的浓度包覆厚度，然后在其表面进行羧基修饰，整个过程反应条件温和，无需惰性气体环境、不用高温高压等苛刻条件，无需复杂装置与大型设备，原物料易得、无需大量有机溶剂，同时合成的磁微粒粒径可调控，将羧基修饰的磁微粒通过活化剂活化后与生物活性分子的游离氨基通过酰胺键共价结合，相较于醛胺缩合反应的亚胺结构以及胶体金的非共价结合更加牢固。

Description

一种免疫磁性纳米微粒的制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种免疫磁性纳米微粒的制备方法。
背景技术
四氧化三铁纳米微粒具有良好的生物相容性和磁学性能，其在外加磁场作用下，可迅速聚集并与其它组分分离，使其在细胞分选和标记，蛋白质分离纯化，药物输送，磁共振造影、细胞标记、靶向药物载体等方面得到广泛应用；然而，未经表面修饰处理的四氧化三铁纳米微粒在溶液中由于其粒径小，表面活化能大，颗粒间静磁与电偶矩相互作用，导致其稳定性很差，容易团聚，产生沉积，同时还容易被氧化。因此需要对其进行修饰，改变其表面性质，防止其被氧化并能够更好地分散在水相中。同时其表面经修饰的高密度活性基团能够与生物分子、细胞表面以及其它活性分子进行偶联以满足不同的应用。
目前已经有多种四氧化三铁纳米微粒的制备、表面修饰以及偶联生物分子的方法。公开号分别为CNI01241130A、CN1667413A的发明专利为包覆聚苯乙烯等有机高分子聚合物的结构，公开号分别为CNI015196482B和CN1872028A的发明专利是通过修饰和活化羧基制备出免疫磁性微粒。公开号为CN 103357359 A利用Schiff反应生成亚胺来偶联磁纳米微粒与生物活性分子，公开号为CN 102766191 B是通过在磁微粒表面多次修饰与基团保护从而与蛋白质偶联。目前这些磁微粒的制备技术存在的问题是工艺条件要求较高、制备过程繁琐、涉及有机毒性物质、需要大型仪器设备、批间重复性差、难以大量稳定制备、生物活性分子偶联效率低、容易脱落等，因此在工业化应用上受到较大限制。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术工艺条件要求较高、制备过程繁琐、涉及有机毒性物质、难以大量稳定制备、偶联效率低、稳定性差、易脱落等技术瓶颈，从而提出一种偶联效率高、粒径均匀、稳定性好、工艺简单、周期短、低毒、低成本、无需大型设备的免疫磁性纳米微粒的制备工艺。
为解决上述技术问题，本发明公开了一种免疫磁性纳米微粒的制备方法，所述方法包括如下步骤：
a.制备四氧化三铁纳米微粒内核
配制二价铁盐溶液，然后加至含柠檬酸钠以及高浓度硝酸盐的碱性溶液中搅拌；然后进行沉淀离心分离，得到磁悬浮液；
b.制备表面硅包覆的纳米磁微粒
用步骤a制备的纳米磁微粒，磁性分离，用碱液洗涤悬液，重分散于碱液中；将正硅酸乙酯溶解于乙醇中，并加入至分散液中，搅拌，在磁微粒表面生成的一层二氧化硅得到的包覆，磁分离得到表面硅包覆的磁微粒；
c.制备表面羧基修饰的磁微粒
称取氨基化硅烷与酸酐，在无水溶剂中搅拌，得到羧基化硅烷；将羧基化硅烷溶解于无水乙醇中，加入纳米磁微粒，加碱液，并搅拌，然后用无水乙醇与纯化水洗涤，磁分离，得到表面羧基修饰的纳米磁微粒；
d.制备免疫磁微粒
将步骤c制备的羧基磁微粒洗涤分散于缓冲液中，用Sulfo-NHS与EDC活化反应后，磁分离，加入抗原、抗体或其它生物活性分子，振荡反应，磁分离即得免疫磁性纳米微粒。
优选的，所述方法步骤如下：
a.制备四氧化三铁纳米微粒内核
配制二价铁盐溶液，加至剧烈搅拌的含柠檬酸钠以及高浓度硝酸盐的碱性溶液中，在25～90℃条件下搅拌5分钟以上，得到稳定的磁悬浮液；
b.制备表面硅包覆的纳米磁微粒
用步骤a制备的纳米磁微粒，磁性分离，用pH值为10～13的碱液洗涤悬液3次，重分散于碱液中，调节pH值为10～13，将正硅酸乙酯溶解于乙醇中，并按比例加入至分散液中，30～50℃条件下混合物搅拌4～5小时，在磁微粒表面生成的一层二氧化硅得到的包覆；磁分离得到表面硅包覆的磁微粒；
c.制备表面羧基修饰的磁微粒
按酸酐基团与氨基摩尔比(1.2～2):1将称取氨基化硅烷与酸酐在无水溶剂中搅拌10到60分钟，得到羧基化硅烷。将羧基化硅烷溶解于无水乙醇中，加入1.2制备的纳米磁微粒，用碱液调节pH值至10～13，30～50℃搅拌4～5小时，然后用无水乙醇与纯化水洗涤，磁分离，得到表面羧基修饰的纳米磁微粒；
d.制备免疫磁微粒
优选的，将步骤c制备的羧基磁微粒用pH值为6.0～7.0的MES缓冲液洗涤三次，再分散于此缓冲液中，用Sulfo-NHS与EDC在室温下活化振荡反应0.5～1小时后，磁分离，洗涤除去未反应的试剂，加入抗原、抗体、链霉亲和素分子，室温振荡反应3h，磁分离，缓冲液洗涤后即得。
优选的，所述氨基包括伯胺基和仲胺基。
优选的，所述二价铁盐为硫酸亚铁、氯化亚铁中的一种；三价铁盐为氯化铁、硫酸铁、硝酸铁、柠檬酸铁中的一种；碱液为氨水或四氨基氢氧化铵中的一种。
优选的，所述二价铁盐摩尔浓度比为0.01mol/L～1mol/L；三价铁盐的摩尔浓度为0.01mol/L～2mol/L；盐酸浓度为0.1mol/L～2mol/L；二价铁盐、三价铁盐与碱液的摩尔比为(1～2)：(1～2)：(4～20)。
优选的，所述正硅酸乙酯与四氧化三铁的质量比为(1～5)：(1～20)。
优选的，所述酸酐为丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐、马来酸酐、邻苯二甲酸酐中的一种；氨基化硅烷为γ-氨丙基三乙氧基硅烷、γ-氨丙基三甲氧基硅烷、二乙烯三氨基丙基三甲氧基硅烷、N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基三乙氧基硅烷、N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基甲基二甲氧基硅烷中的一种；无水溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜中的一种。
优选的，所述酸酐与羧基化硅烷的摩尔比为(1～5)：(1～20)。
更为优选的，所述磁纳米微粒与EDC，Sulfo-NHS的质量摩尔比为1g：(1～100mmol)：(1～50mmol)；加入的所述磁微粒与抗体的质量比1g：(0.1～10mg)。
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
(1)本发明的羧基修饰的磁纳米微粒，包括四氧化三铁内核，二氧化硅壳层以及表面修饰的活性基团羧基，羧基通过活化可偶联体外诊断所需的抗体、抗原、半抗原、亲和素、链霉亲和素等生物活性分子，由于磁微粒表面修饰的羧基密度大，偶联效率更高，可通过外磁场将待测物与其它分子快速有效分离，因此在体外诊断、微生物分离、细胞标记、靶向药物等领域具有着广泛的应用前景。
(2)制得的磁微粒粒径均一、稳定好、大小可调节，可满足不同需求，室温下存放半年以上均无沉降。
(3)制备工艺简单易行、周期短，所有原物料均低毒、价廉、易得，无需大型设备与复杂装置，易于大规模制备。
具体实施方式
实施例1本实施例公开了一种免疫磁性纳米微粒(亲和素/链霉亲合素包被的免疫磁纳米微粒)的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)四氧化三铁磁微粒内核的制备：称取40mmol FeCl2，溶于4mL纯化水中，将混合溶液倒入250ml含1mmol/L柠檬酸钠、0.8mol/L硝酸钠、0.1mol/L氢氧化钠中，70℃条件下剧烈搅拌60min，冷却至室温，用1％TMAH洗涤两次，磁力分离，弃上清。沉淀用0.1％TMAH洗涤2～3次。重悬于25mL 0.1％TMAH中。
(2)表面二氧化硅修饰的磁微粒：取25mL(1)制备的磁微粒内核，加入3ml 10％的正硅酸乙酯的乙醇溶液，室温下剧烈搅拌3小时，0.1％TMAH洗涤2次，即得表面二氧化硅包覆的磁纳米微粒
(3)表面羧基修饰的磁微粒：称取25mmol丁二酸酐，10mmol N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基甲基二甲氧基硅烷溶解于1ml无水DMF中室温振荡反应30min，然后将混合物溶于20ml乙醇中，与(2)制备的二氧化硅包覆的磁微粒混合，TMAH调节pH至12.0，50℃条件下搅拌5小时，冷却至室温，磁分离，用丙酮与纯化水洗涤除去未结合物，最后分散于纯化水中
(4)磁微粒与链霉亲和素偶联：取20ml 10mg/ml羧基修饰磁微粒，加入3mmol EDC，2mmol Sulfo-NHS，室温下振荡反应2小时，磁分离，加入1mg亲和素/链霉亲合素，室温振荡反应4小时以上，磁分离，保留上清液用于测定链霉亲和素的偶联效率。用MES缓冲液洗涤分离物，即得所述的亲和素/链霉亲合素包被的免疫磁纳米微粒。
实施例2本实施例公开了一种免疫磁性纳米微粒(兔抗FITC抗体修饰的免疫磁纳米微粒)的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)四氧化三铁磁微粒内核的制备：称取15mmol Fe2(SO4)3，溶解于4mL纯化水中，将混合溶液倒入100ml含0.5mmol/L柠檬酸钠、1mol/L硝酸钾的1％TMAH溶液中，加热至60℃，剧烈搅拌反应30min。冷却至室温，磁性分离，弃上清。用0.1％TMAH洗涤分离物2～3次。重悬于15mL 0.1％TMAH中，得到稳定的磁悬浮液。
(2)表面二氧化硅修饰的磁微粒：取15mL(1)制备的磁微粒内核，加入3ml 30％的四乙氧基正硅烷的乙醇溶液，室温下剧烈搅拌3小时，1％TMAH洗涤2次，即得表面二氧化硅包覆的磁纳米微粒
(3)表面羧基修饰的磁微粒：称取15mmol丁二酸酐、10mmolγ-氨丙基三乙氧基硅烷溶解于1ml无水DMF中40℃条件下反应30min，将混合物溶于20ml乙醇中，与(2)制备的二氧化硅包覆的磁微粒混合，TMAH调节pH至12.0，50℃条件下搅拌5小时，冷却至室温，磁分离，用乙醇洗涤除去未结合的试剂，再纯化水洗涤，重悬于纯化水中。
(4)磁微粒与兔抗FITC抗体偶联：移取200mg羧基修饰磁微粒，重分散于pH值为6.5的MES缓冲液中，加入4mmol EDC，2mmol Sulfo-NHS，室温下振荡反应1小时，磁分离，加入1mg兔抗FITC抗体，室温振荡反应4小时，磁分离，保留上清液用于测定兔抗FITC抗体的偶联效率，用MES缓冲液洗涤分离物，即得所述的兔抗FITC抗体包被的免疫磁纳米微粒。
实验例
将实施例1与实施例2所得的免疫纳米微粒的偶联效率与稳定性与现有的技术所得进行对比，得到如下表格：
偶联效率 本实施例 醛胺缩合偶联 胶体金法偶联
链霉亲合素偶联磁微粒 92％ 81％ 86％
兔抗FITC抗体偶联磁微粒 93％ 83％ 86％
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (9)

1.一种免疫磁性纳米微粒的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
a.制备四氧化三铁纳米微粒内核
配制二价铁盐溶液，然后加至含柠檬酸钠以及高浓度硝酸盐的碱性溶液中搅拌；然后进行沉淀离心分离，得到磁悬浮液；
b.制备表面硅包覆的纳米磁微粒
用步骤a制备的纳米磁微粒，磁性分离，用碱液洗涤悬液，重分散于碱液中；将正硅酸乙酯溶解于乙醇中，并加入至分散液中，搅拌，在磁微粒表面生成的一层二氧化硅得到的包覆，磁分离得到表面硅包覆的磁微粒；
c.制备表面羧基修饰的磁微粒
称取氨基化硅烷与酸酐，在无水溶剂中搅拌，得到羧基化硅烷；将羧基化硅烷溶解于无水乙醇中，加入纳米磁微粒，加碱液，并搅拌，然后用无水乙醇与纯化水洗涤，磁分离，得到表面羧基修饰的纳米磁微粒；
d.制备免疫磁微粒
将步骤c制备的羧基磁微粒洗涤分散于缓冲液中，用Sulfo-NHS与EDC活化反应后，磁分离，加入抗原、抗体或其它生物活性分子，振荡反应，磁分离即得免疫磁性纳米微粒。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述方法步骤如下：
a.制备四氧化三铁纳米微粒内核
配制二价铁盐溶液，加至含有柠檬酸钠和硝酸盐的碱性溶液中，在25～90℃条件下搅拌5分钟以上，得到的沉淀离心分离后，用碱液洗涤三次，得到稳定的磁悬浮液；
b.制备表面硅包覆的纳米磁微粒
用步骤a制备的纳米磁微粒，磁性分离，调节pH值为10～13，将正硅酸乙酯溶解于乙醇中，并按一定比例加入至分散液中，30～50℃条件下混合物搅拌4～5小时，在磁微粒表面生成的一层二氧化硅得到的包覆；磁分离得到表 面硅包覆的磁微粒；
c.制备表面羧基修饰的磁微粒
按酸酐基团与氨基摩尔比(1.2～2):1将称取氨基化硅烷与酸酐在无水溶剂中搅拌10到60分钟，得到羧基化硅烷。将羧基化硅烷溶解于无水乙醇中，加入1.2制备的纳米磁微粒，用碱液调节pH值至10～13，30～50℃搅拌4～5小时，然后用无水乙醇与纯化水洗涤，磁分离，得到表面羧基修饰的纳米磁微粒；
d.制备免疫磁微粒
将步骤c制备的羧基磁微粒用pH值为6.0～7.0的MES缓冲液洗涤三次，再分散于此缓冲液中，用EDC与Sulfo-NHS在室温下活化振荡反应0.5～1小时后，磁分离，洗涤除去未反应的试剂，加入抗原、抗体或其它生物活性分子，室温振荡反应3h，磁分离，缓冲液洗涤后即得。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述氨基包括伯胺基和仲胺基。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述二价铁盐为硫酸亚铁、氯化亚铁中的一种；硝酸盐为硝酸钠、硝酸钾中的一种；碱液为氨水、四甲基氢氧化铵、氢氧化钠中的一种。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述二价铁盐摩尔浓度比为0.01mol/L～1mol/L；柠檬酸钠浓度为0.5mmol/L～10mmol/L，硝酸盐浓度为0.2mol/L～3mol/L。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述正硅酸乙酯与四氧化三铁的质量比为(1～5)：(1～20)。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述酸酐为丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐、马来酸酐、邻苯二甲酸酐中的一种；氨基化硅烷为γ-氨丙基三乙氧基硅烷、γ-氨丙基三甲氧基硅烷、二乙烯三氨基丙基三甲氧基硅烷、N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基三乙氧基硅烷、N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基甲基二甲氧基硅烷中的一种；无水溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜中的 一种。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述酸酐与氨基化硅烷的摩尔比为(1～5)：(1～20)。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述磁纳米微粒与EDC，Sulfo-NHS的质量摩尔比为1g：(1～100mmol)：(1～50mmol)；加入的所述磁微粒与抗体的质量比1g：(0.1～10mg)。
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