JP2018530353A

JP2018530353A - ミトコンドリアｄｎａの定量化および胚の品質を決定するための方法

Info

Publication number: JP2018530353A
Application number: JP2018539224A
Authority: JP
Inventors: ウェルズ，ダガン; フラグリ，エルピーダ; マンネ，サンティアゴ
Original assignee: CooperSurgical Inc
Current assignee: CooperSurgical Inc
Priority date: 2015-10-16
Filing date: 2016-06-02
Publication date: 2018-10-18
Also published as: WO2017065839A1; US20170107571A1; EP3362566A1; CN109312349A; EP3362566A4

Abstract

【課題】本発明は、ミトコンドリアＤＮＡの定量化および胚の品質を決定するための方法に関する。
【解決手段】本明細書で提供される材料および方法は、正倍数体胚のための着床閾値を決定するため、および正倍数体胚が着床し、妊娠を開始する可能性を決定するために有用である。
【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１０月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／２４２，４６０号（その全内容は参照により本明細書に組み込まれる）の優先権を主張する。

本開示は一般に、生殖医療の分野に関する。より特定的には、この開示は、胚の、着床し、妊娠を開始する可能性を決定するための非侵襲的方法およびキットに関する。

より高い着床の可能性を有する胚の選択は、体外受精（ＩＶＦ）などの生殖補助技術における大きな課題の１つである。ＩＶＦは、卵子と精子を研究室内において体外で結合させ、胚を形成させることを含む。胚が形成するとすぐに、これは子宮に着床され、そこで、さらに発生する。ＩＶＦ技術が直面する１つの課題は胚着床および妊娠の低い成功率である。そのようなものとして、適正な胚発生に影響するメカニズムをよりよく理解する必要があり、これにより、ひいては、高い着床の可能性を有する胚を識別し、妊娠の成功率を増加させるためのツールの開発が可能になる。最適な着床の可能性を有する胚を選択することにより、体外受精手順の成功の見込みが改善する。ＩＶＦの費用を考えると、これにより、妊娠の成功を得る前に頻繁に手順を繰り返す必要がなくなる可能性があるので、数千または数万ドルの節約が得られる。

よって、生殖補助治療の効率を改善するために、生存胚の識別のためのすぐれた方法が緊急に必要とされる。子宮に移植する前の染色体異常についての胚のスクリーニングにより、胚性不全（すなわち異数性）の主原因が回避される。しかしながら、形態学的に「完全な」胚（これは加えて、生検細胞の分析後、染色体的に正常と考えられる）の移植ですら、成功する妊娠の開始を保証することができない（そのような胚の約３分の２のみが実際に子供を産み出す）。追加の要素が、胚生存率において役割を果たすことが明らかである。重要な因子はおそらく、ミトコンドリア数／容量およびＡＴＰ量および／または代謝活性に対する付随効果を含むであろう［１７］。

ミトコンドリアは胚発生において極めて重要な役割を果たす。それらはエネルギー産生の主要部位であり、様々な他の重大な細胞機能を有する。ミトコンドリアは、複数の必須細胞過程、例えばアポトーシス、アミノ酸合成、カルシウムホメオスタシス、および酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）のプロセスを介するＡＴＰの形態でのエネルギーの生成の調節に関与する［１−５］。この理由のために、ミトコンドリアは主な細胞発電所として考えられる。それらは、それら自身のゲノムの１つ以上のコピーを含むという点で、動物細胞における他の小器官と比べて独特である。この小器官の重要性にもかかわらず、着床前の個々のヒト胚間のｍｔＤＮＡの変異の程度、またはｍｔＤＮＡの相対量と子宮内に着床するヒト胚の能力の間の関連についてほとんど知られていない。

本開示は一部、胚（例えば、ヒト胚）中のｍｔＤＮＡの相対量は、子宮内に着床する胚の能力を予測するという予想外の発見に基づく。よって、胚中で見出されるｍｔＤＮＡの相対量に基づき、胚についての着床閾値を決定するための、および胚（例えば、正倍数体胚）の着床の可能性を決定するための材料および方法が本明細書で提供される。本明細書で提供される材料および方法は、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）定量化のための公知のアッセイと関連する制限を克服する。本明細書で記載される発明の方法は高い感度および特異性を示す。

本明細書で示されるように、ｍｔＤＮＡ量と胚の着床の可能性の間には相関がある。ｍｔＤＮＡ量の評価は、着床の最も高い可能性を有する胚を識別し、健康な妊娠を導くために使用することができる。

１つの態様では、本開示は、胚中のミトコンドリアＤＮＡの相対量を決定するための方法を提供し、これは、胚から得られたＤＮＡ試料を提供すること、ＤＮＡ試料中のミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の量を決定すること、ＤＮＡ試料中の基準ＤＮＡの量を決定すること、およびｍｔＤＮＡの量を基準ＤＮＡの量と比較して、胚中のｍｔＤＮＡの相対量を決定することを含む。胚中のｍｔＤＮＡの相対量は胚の着床の可能性の信頼できる指標を提供する。

１つの態様では、本開示は胚の着床の可能性を決定するための方法を提供し、方法は、胚から得られたＤＮＡ試料を提供すること、ＤＮＡ試料中のミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の量を決定すること、ＤＮＡ試料中の基準ＤＮＡの量を決定すること、およびｍｔＤＮＡの量を基準ＤＮＡの量と比較して、胚中のｍｔＤＮＡの相対量を決定することを含み、ここで、胚中のｍｔＤＮＡの相対量は、胚の着床の可能性を示す。いくつかの実施形態では、胚は正倍数体胚である。

ＤＮＡ試料中のｍｔＤＮＡの量を決定すること、およびＤＮＡ試料中の基準ＤＮＡの量を決定することは、例えば、リアルタイムＰＣＲなどの定量的ＰＣＲを使用して実施することができる。

本明細書で開示される方法のいくつかの実施形態では、ＤＮＡ試料は着床後１、２、３、４、５、６または７日の胚から得られる。例えば、ＤＮＡ試料は、受精後１−３日、２−４日、３−５日、５−７日、１−７日、または４−７日の胚から得られる。

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ試料中のｍｔＤＮＡの量を決定することは、ＤＮＡ試料を、１６Ｓアンプリコンを生成させるために、１６Ｓを転写する配列を標的とする配列番号：２および３を含むプライマー対、または、ＭＴ−ＮＤ４アンプリコンを生成させるために、ＮＡＤＨ−ユビキノンオキシドレダクターゼ鎖４（ＭＴ−ＮＤ４）をコードする配列を標的とする配列番号：８および９を含むプライマー対と接触させることにより、ｍｔＤＮＡを増幅させることを含む。方法は、ＤＮＡ試料を、１６Ｓアンプリコン内の配列を標的とする配列番号：４を含むプローブと接触させることにより、１６Ｓアンプリコンを検出すること、および／またはＤＮＡ試料を、ＭＴ−ＮＤ４アンプリコン内の配列を標的とする配列番号：１０を含むプローブと接触させることにより、ＭＴ−ＮＤ４アンプリコンを検出することをさらに含み得る。

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ試料中の基準ＤＮＡの量を決定することは、ＤＮＡ試料を、Ａｌｕアンプリコンを生成させるために、Ａｌｕ配列を標的とする配列番号：５および６を含むプライマー対と接触させることにより基準ＤＮＡを増幅させることを含む。方法は、ＤＮＡ試料を、Ａｌｕアンプリコン内の配列を標的とする配列番号：７を含むプローブと接触させることにより、Ａｌｕアンプリコンを検出することをさらに含み得る。

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ試料中の基準ＤＮＡの量を決定することは、ＤＮＡ試料を、反復ＤＮＡ配列またはマルチコピー配列（例えば、Ｌ１リピートまたはＡｌｕ配列）を標的とするプライマー対と接触させ、標的アンプリコンを生成させることにより、基準ＤＮＡを増幅させることを含む。方法は、ＤＮＡ試料を、アンプリコン内の配列を標的とするプローブと接触させることにより、標的アンプリコンを検出することをさらに含み得る。本明細書で記載される実施形態において標的にされる反復ＤＮＡ配列またはマルチコピー配列は当技術分野で知られている。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ試料中の基準ＤＮＡの量を決定することは、少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、など）を増幅させることを含む。

いくつかの態様では、本明細書で開示される方法は、正倍数体胚中のｍｔＤＮＡの相対量を着床可能性閾値と比較することを含み、ここで、着床可能性閾値未満の胚中のｍｔＤＮＡの相対量は、正倍数体胚の有利な着床の可能性を示し、着床可能性閾値を超える胚中のｍｔＤＮＡの相対量は、正倍数体胚の不利な着床の可能性を示す。

１つの態様では、本開示は着床のための胚を選択するための方法を提供し、方法は、胚中の基準核酸配列と比較して、胚試料中のミトコンドリアＤＮＡの相対量を決定することを含み、ここで、決定は、ｉ）胚由来の核酸試料；ｉｉ）第１のミトコンドリアＤＮＡ配列に対するものである第１の合成オリゴヌクレオチドプライマー対；ならびにｉｉｉ）基準標的核酸配列に対するものである基準合成オリゴヌクレオチドプライマー対を含む反応混合物を調製すること、反応混合物を増幅させ、第１のミトコンドリアＤＮＡ配列産物および基準標的核酸配列産物を生成させること；増幅された第１のミトコンドリアＤＮＡ配列産物の量を、増幅された基準標的核酸配列産物の量と比較して評価することを含み、ならびに増幅された基準標的核酸配列産物に対して、増幅された第１のミトコンドリアＤＮＡ配列産物の測定された量が着床可能性閾値未満である場合、着床のための胚を選択することを含む。基準核酸配列は染色体核酸配列とすることができる。

反応混合物は、第２のミトコンドリアＤＮＡ配列に対するものである第２の合成オリゴヌクレオチドプライマー対を含み得る。いくつかの実施形態では、反応混合物は、第３のミトコンドリアＤＮＡ配列に対するものである第３の合成オリゴヌクレオチドプライマー対を含み得る。いくつかの実施形態では、反応混合物は、第４のミトコンドリアＤＮＡ配列に対するものである第４の合成オリゴヌクレオチドプライマー対を含み得る。いくつかの実施形態では、反応混合物は、５つ以上（例えば、５、６、７、８、９、または１０、など）のミトコンドリアＤＮＡ配列に対するものである５つ以上（例えば、５、６、７、８、９、または１０、など）の合成オリゴヌクレオチドプライマー対を含み得る。

いくつかの実施形態では、方法は、反応混合物を増幅させ、第１のミトコンドリアＤＮＡ配列産物、第２のミトコンドリアＤＮＡ配列産物、および基準染色体標的核酸配列産物を生成させること；ならびに各増幅産物の量を測定すること；増幅された第１のミトコンドリアＤＮＡ配列産物および増幅された第２のミトコンドリアＤＮＡ配列産物の測定された量を、増幅された基準染色体標的核酸配列産物と比較すること；ならびに、増幅された基準染色体標的核酸配列産物に対する、増幅された第１のミトコンドリアＤＮＡ配列産物および増幅された第２のミトコンドリアＤＮＡ配列産物の測定された量が、着床可能性閾値未満である場合に、着床のための胚を選択することを含む。いくつかの実施形態では、反応混合物は、第３のミトコンドリアＤＮＡ配列に対するものである第３の合成オリゴヌクレオチドプライマー対を含み得る。

１つの態様では、本開示は、着床のための胚を選択するための方法を提供し、方法は、基準核酸試料と比較した、胚試料中のミトコンドリアＤＮＡの相対量を測定することを含み、ここで、測定は、ｉ）胚由来の核酸試料；ｉｉ）第１のミトコンドリアＤＮＡ配列に対するものである第１の合成オリゴヌクレオチドプライマー対；ｉｉｉ）第２のミトコンドリアＤＮＡ配列に対するものである第２の合成オリゴヌクレオチドプライマー対；ならびにｉｖ）基準染色体標的核酸配列に対するものである基準合成オリゴヌクレオチドプライマー対を含む反応混合物を調製すること、反応混合物を増幅させ、第１のミトコンドリアＤＮＡ配列産物、第２のミトコンドリアＤＮＡ配列産物、および基準染色体標的核酸配列産物を生成させること；ならびに各増幅産物の量を測定すること；第１のミトコンドリアＤＮＡ配列産物および第２のミトコンドリアＤＮＡ配列産物の測定された量を基準染色体標的核酸配列産物と比較すること；ならびに、基準染色体標的核酸配列産物に対する、第１のミトコンドリアＤＮＡ配列産物および第２のミトコンドリアＤＮＡ配列産物の測定された量が着床可能性閾値未満である場合に、着床のための胚を選択することを含む。いくつかの実施形態では、胚は、基準染色体標的核酸配列産物に対する、第１のミトコンドリアＤＮＡ配列産物および第２のミトコンドリアＤＮＡ配列産物の量が、着床可能性閾値を超える場合、着床に好適ではないと識別される。

いくつかの実施形態では、ｍｔＤＮＡ（例えば、第１または第２）を標的とする合成オリゴヌクレオチドプライマー対は、１２ＳＲＮＡをコードするミトコンドリアＤＮＡ配列、１６ＳＲＮＡをコードするミトコンドリアＤＮＡ配列、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット１（ＭＴ−ＮＤ１）をコードするミトコンドリアＤＮＡ配列、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット２（ＭＴ−ＮＤ２）をコードするミトコンドリアＤＮＡ配列、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット３（ＭＴ−ＮＤ３）をコードするミトコンドリアＤＮＡ配列、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット４（ＭＴ−ＮＤ４）をコードするミトコンドリアＤＮＡ配列、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット５（ＭＴ−ＮＤ５）をコードするミトコンドリアＤＮＡ配列、チトクロムｂ、ミトコンドリアチトクロムｃオキシダーゼサブユニット１、２または３をコードするミトコンドリアＤＮＡ配列、およびＡＴＰシンターゼをコードするミトコンドリアＤＮＡ配列の群から選択されるミトコンドリアＤＮＡ配列に対するものである。

いくつかの実施形態では、第１の合成オリゴヌクレオチドプライマー対は、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列をコードするミトコンドリアＤＮＡ配列に対するものである。例えば、第１の合成オリゴヌクレオチドプライマー対は、配列番号：２の核酸配列に対して少なくとも７０％配列同一性を有するプライマーおよび配列番号：３の核酸配列に対して少なくとも７０％配列同一性を有するプライマーを含む。

いくつかの実施形態では、第２の合成オリゴヌクレオチドプライマー対はＮＡＤＨ−ユビキノンオキシドレダクターゼ鎖４（ＭＴ−ＮＤ４）遺伝子配列をコードするミトコンドリアＤＮＡ配列に対するものである。例えば、第２の合成オリゴヌクレオチドプライマー対は、配列番号：８の核酸配列に対して少なくとも７０％配列同一性を有するプライマーおよび配列番号：９の核酸配列に対して少なくとも７０％配列同一性を有するプライマーを含む。

いくつかの実施形態では、基準合成オリゴヌクレオチドプライマー対は、Ａｌｕ配列、Ｌ１配列、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、またはβ−アクチン（ＡｃｔＢ）に対するものである。いくつかの実施形態では、基準合成オリゴヌクレオチドプライマー対は、Ａｌｕ配列に対するものである。例えば、基準合成オリゴヌクレオチドプライマー対は、配列番号：５の核酸配列に対して少なくとも７０％配列同一性を有するプライマーおよび配列番号：６の核酸配列に対して少なくとも７０％配列同一性を有するプライマーを含む。

いくつかの実施形態では、増幅工程は定量的または半定量的ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて実施される。

１つの態様では、本開示は胚の着床の可能性を決定するためのキットを提供し、キットは、第１のミトコンドリアＤＮＡ配列に対するものである第１の合成オリゴヌクレオチドプライマー対および基準遺伝子配列ＤＮＡに対するものである第２の合成オリゴヌクレオチドプライマー対を含む。基準遺伝子配列は染色体遺伝子配列とすることができる。いくつかの実施形態では、第１の合成オリゴヌクレオチドプライマー対は、１２ＳＲＮＡをコードするミトコンドリアＤＮＡ配列、１６ＳＲＮＡをコードするミトコンドリアＤＮＡ配列、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット１（ＭＴ−ＮＤ１）をコードするミトコンドリアＤＮＡ配列、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット２（ＭＴ−ＮＤ２）をコードするミトコンドリアＤＮＡ配列、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット３（ＭＴ−ＮＤ３）をコードするミトコンドリアＤＮＡ配列、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット４（ＭＴ−ＮＤ４）をコードするミトコンドリアＤＮＡ配列、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット５（ＭＴ−ＮＤ５）をコードするミトコンドリアＤＮＡ配列、チトクロムｂ、ミトコンドリアチトクロムｃオキシダーゼサブユニット１、２または３をコードするミトコンドリアＤＮＡ配列、およびＡＴＰシンターゼをコードするミトコンドリアＤＮＡ配列から選択されるミトコンドリアＤＮＡ配列に対するものである。

いくつかの実施形態では、キットは、１６Ｓを転写する配列を標的とする配列番号：２および３を含むプライマー対、または、ＭＴ−ＮＤ４アンプリコンを生成させるための、ＮＡＤＨ−ユビキノンオキシドレダクターゼ鎖４（ＭＴ−ＮＤ４）をコードする配列を標的とする配列番号：８および９のプライマー対を含み得る。キットは、１６Ｓアンプリコン内の配列を標的とする配列番号：４を含むプローブ、および／またはＭＴ−ＮＤ４アンプリコン内の配列を標的とする配列番号：１０のプローブをさらに含み得る。

いくつかの実施形態では、キットは、Ａｌｕアンプリコンを生成させるために、Ａｌｕ配列を標的とする配列番号：５および／または６の配列を有する基準合成オリゴヌクレオチドを含む。キットは、Ａｌｕアンプリコン内の配列を標的とする配列番号：７を含むプローブをさらに含み得る。

いくつかの実施形態では、キットは、Ａｌｕ配列、Ｌ１配列、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、またはβ−アクチン（ＡｃｔＢ）に対するものである基準合成オリゴヌクレオチドプライマー対を含む。例えば、基準合成オリゴヌクレオチドプライマー対は、Ａｌｕ配列に対するものとすることができる。

いくつかの実施形態では、キットは、配列番号：５の核酸配列に対し少なくとも７０％配列同一性を有する配列を有する基準合成オリゴヌクレオチドおよび配列番号：６の核酸配列に対し少なくとも７０％配列同一性を有するプライマーを含む。キットはまた、Ａｌｕ配列に対するものであるプローブを含むことができ、プローブは配列番号：７を含む。

いくつかの実施形態では、キットは１つ以上のデオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）、ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、例として、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼまたはＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、およびバッファー、例えばＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ＴＥ）バッファーを含む。キットは陽性対照ＤＮＡ試料および陰性対照ＤＮＡ試料を含むことができる。キットはまた、第２のミトコンドリアＤＮＡ配列に対するものである第３の合成オリゴヌクレオチドプライマー対を含むことができる。

１つの態様では、本開示は胚の着床可能性閾値を決定するための方法を提供し、方法は、着床正倍数体胚から得られた１つ以上のＤＮＡ試料中のミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の量を決定すること、非着床正倍数体胚から得られた１つ以上のＤＮＡ試料中のｍｔＤＮＡの量を決定すること、および着床正倍数体胚から得られたｍｔＤＮＡの量を非着床胚から得られたｍｔＤＮＡの量と比較すること、着床正倍数体胚から得られたｍｔＤＮＡの量と比較した、着床正倍数体胚からのｍｔＤＮＡの相対量を決定することにより着床可能性閾値を識別することを含む。ＤＮＡ試料中のｍｔＤＮＡの量の決定は、定量的ＰＣＲ、例えばリアルタイムＰＣＲを用いて実施される。

いくつかの実施形態では、第１のＤＮＡ試料中のｍｔＤＮＡの量を決定することは、ＤＮＡ試料を、１６Ｓアンプリコンを生成させるために、１６Ｓを転写する配列を標的とする配列番号２および３を含むプライマー対、または、ＭＴ−ＮＤ４アンプリコンを生成させるために、ＮＡＤＨ−ユビキノンオキシドレダクターゼ鎖４（ＭＴ−ＮＤ４）をコードする配列を標的とする配列番号：８および９を含むプライマー対と接触させることにより試料中のｍｔＤＮＡを増幅させること、ならびにＤＮＡ試料を、Ａｌｕアンプリコンを生成させるために、Ａｌｕ配列を標的とする配列番号：５および６を含むプライマー対と接触させることにより、基準ＤＮＡ配列を増幅させることを含む。

いくつかの実施形態では、方法は、ＤＮＡ試料を、１６Ｓアンプリコン内の配列を標的とする配列番号４を含むプローブと接触させることにより、１６Ｓアンプリコンを検出すること、および／またはＤＮＡ試料を、Ａｌｕアンプリコン内の配列を標的とする配列番号：７を含むプローブと接触させることにより、Ａｌｕアンプリコンを検出することを含む。

いくつかの実施形態では、方法は、ＤＮＡ試料を、ＭＴ−ＮＤ４アンプリコン内の配列を標的とする配列番号：１０を含むプローブと接触させることにより、ＭＴ−ＮＤ４アンプリコンを検出すること、および／またはＤＮＡ試料を、Ａｌｕアンプリコン内の配列を標的とする配列番号：７を含むプローブと接触させることにより、Ａｌｕアンプリコンを検出することを含む。

１つの態様では、本開示は、胚中のミトコンドリアＤＮＡの相対量を決定するための方法を提供し、ここで、方法は、胚から得られたＤＮＡ試料を提供すること；ＤＮＡ試料中のミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の量を決定すること；ＤＮＡ試料中の基準ＤＮＡの量を決定すること；ならびにｍｔＤＮＡの量を基準ＤＮＡの量と比較して、胚中のｍｔＤＮＡの相対量を決定することを含む。全ての態様のいくつかの実施形態では、胚中のｍｔＤＮＡの相対量は、胚の着床の可能性を示す。

全ての態様のいくつかの実施形態では、ＤＮＡ試料中のｍｔＤＮＡの量を決定することおよびＤＮＡ試料中の基準ＤＮＡの量を決定することは定量的ＰＣＲを含む。全ての態様のいくつかの実施形態では、定量的ＰＣＲはリアルタイムＰＣＲを含む。

全ての態様のいくつかの実施形態では、ＤＮＡ試料は、着床後１、２、３、４、５、６または７日、あるいは受精後１−３日、２−４日、３−５日、５−７日、１−７日、または４−７日の胚から得られる。いくつかの実施形態では、胚は正倍数体胚である。

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ試料中のｍｔＤＮＡの量を決定することは、ＤＮＡ試料を、１６Ｓアンプリコンを生成させるために、１６Ｓを転写する配列を標的とする配列番号２および３を含むプライマー対、または、ＭＴ−ＮＤ４アンプリコンを生成させるために、ＮＡＤＨ−ユビキノンオキシドレダクターゼ鎖４（ＭＴ−ＮＤ４）をコードする配列を標的とする配列番号：８および９を含むプライマー対と接触させることにより、ｍｔＤＮＡを増幅させることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、ＤＮＡ試料を、１６Ｓアンプリコン内の配列を標的とする配列番号４を含むプローブと接触させることにより、１６Ｓアンプリコンを検出することをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法はＤＮＡ試料を、ＭＴ−ＮＤ４アンプリコン内の配列を標的とする配列番号：１０を含むプローブと接触させることにより、ＭＴ−ＮＤ４アンプリコンを検出することをさらに含む。

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ試料中の基準ＤＮＡの量を決定することは、ＤＮＡ試料を、Ａｌｕアンプリコンを生成させるために、Ａｌｕ配列を標的とする配列番号：５および６を含むプライマー対と接触させることにより基準ＤＮＡを増幅させることを含む。

いくつかの実施形態では、方法はＤＮＡ試料を、Ａｌｕアンプリコン内の配列を標的とする配列番号：７を含むプローブと接触させることにより、Ａｌｕアンプリコンを検出することをさらに含む。

いくつかの実施形態は、正倍数体胚中のｍｔＤＮＡの相対量を着床可能性閾値と比較することをさらに含み；ここで、着床可能性閾値未満の胚中のｍｔＤＮＡの相対量は、正倍数体胚の有利な着床の可能性を示し、着床可能性閾値を超える胚中のｍｔＤＮＡの相対量は、正倍数体胚の不利な着床の可能性を示す。

１つの態様では、本開示は、着床正倍数体胚から得られた１つ以上のＤＮＡ試料中のミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の量を決定すること；非着床正倍数体胚から得られた１つ以上のＤＮＡ試料中のｍｔＤＮＡの量を決定すること；ならびに着床正倍数体胚からのｍｔＤＮＡの量を非着床正倍数体胚から得られたｍｔＤＮＡの量と比較することにより着床可能性閾値を計算することを含む方法を提供する。

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ試料中のｍｔＤＮＡの量を決定することは、定量的ＰＣＲを用いて実施される。いくつかの実施形態では、定量的ＰＣＲはリアルタイムＰＣＲを含む。

いくつかの実施形態では、第１のＤＮＡ試料中のｍｔＤＮＡの量を決定することは、下記を含む：ＤＮＡ試料を、１６Ｓアンプリコンを生成させるために、１６Ｓを転写する配列を標的とする配列番号２および３を含むプライマー対、または、ＭＴ−ＮＤ４アンプリコンを生成させるために、ＮＡＤＨ−ユビキノンオキシドレダクターゼ鎖４（ＭＴ−ＮＤ４）をコードする配列を標的とする配列番号：８および９を含むプライマー対と接触させることにより、試料中のｍｔＤＮＡを増幅させること；ならびにＤＮＡ試料を、Ａｌｕアンプリコンを生成させるために、Ａｌｕ配列を標的とする配列番号：５および６を含むプライマー対と接触させることにより、基準ＤＮＡ配列を増幅させること。

いくつかの実施形態では、方法は、下記をさらに含む：ＤＮＡ試料を、１６Ｓアンプリコン内の配列を標的とする配列番号４を含むプローブと接触させることにより、１６Ｓアンプリコンを検出すること；ならびにＤＮＡ試料を、Ａｌｕアンプリコン内の配列を標的とする配列番号：７を含むプローブと接触させることにより、Ａｌｕアンプリコンを検出すること。

いくつかの実施形態では、方法はまた、下記を含む：ＤＮＡ試料を、ＭＴ−ＮＤ４アンプリコン内の配列を標的とする配列番号：１０を含むプローブと接触させることにより、ＭＴ−ＮＤ４アンプリコンを検出すること；ならびにＤＮＡ試料を、Ａｌｕアンプリコン内の配列を標的とする配列番号：７を含むプローブと接触させることにより、Ａｌｕアンプリコンを検出すること。

１つの態様では、本開示は、胚の着床の可能性を決定するための方法を提供し、方法は基準核酸試料と比較した、胚試料中のミトコンドリアＤＮＡの相対量を決定することを含み、ここで、決定は、ｉ）胚由来の核酸試料；ｉｉ）第１のミトコンドリアＤＮＡ配列に対するものである第１の合成オリゴヌクレオチドプライマー対；ならびにｉｉｉ）基準染色体標的核酸配列に対するものである基準合成オリゴヌクレオチドプライマー対を含む反応混合物を調製すること；反応混合物を増幅させ、第１のミトコンドリアＤＮＡ配列産物および基準染色体標的核酸配列産物を生成させること；ならびに増幅された基準染色体標的核酸配列産物と比較して、増幅された第１のミトコンドリアＤＮＡ配列産物の量を評価することを含み、ここで、胚中のｍｔＤＮＡの相対量は、胚の着床の可能性を示す。

全ての方法のいくつかの実施形態では、ミトコンドリアＤＮＡの相対量を決定することは、ｉｖ）第２のミトコンドリアＤＮＡ配列に対するものである第２の合成オリゴヌクレオチドプライマー対をさらに含み；ならびに増幅工程は、反応混合物を増幅させ、第２のミトコンドリアＤＮＡ配列産物を生成させることをさらに含み；ならびに、評価工程は、増幅された第２のミトコンドリアＤＮＡ配列産物の量を増幅された基準染色体標的核酸配列産物の量を用いて評価することをさらに含み、ここで、第１および第２のミトコンドリアＤＮＡ配列産物の相対量は、胚の着床の可能性を示す。

別に規定されない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、この開示が属する分野の当業者により普通に理解されるものと同じ意味を有する。方法および材料は本開示において使用するために本明細書で記載され；当技術分野で知られている他の、好適な方法および材料もまた使用することができる。材料、方法、および実施例は例示にすぎず、制限することを意図しない。本明細書で言及される、全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリー、および他の参考文献は、参照によりその全体として組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が制御する。加えて、材料、方法、および例は、例示にすぎず、制限することを意図しない。

発明の１つ以上の実施形態の詳細が添付の図面および下記説明において明記される。発明の他の特徴、目的、および利点は、説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。

ヒトミトコンドリアＤＮＡのマップである。ｍｔＤＮＡ量、女性の年齢および胚染色体構成の間の関係を示す一連のグラフを提供する。ａ）３０２の胚盤胞から取り出したＴＥ試料の定量的リアルタイムＰＣＲ分析中に得られたデータは、女性の加齢との関連でｍｔＤＮＡのレベルの統計的に有意な増加（Ｐ＝０．００３）を示した。この現象は正倍数体および異数体胚盤胞の両方について明らかであった。ｂ）３９の卵割球のリアルタイムＰＣＲ分析により、生殖的に若い女性由来の卵割期胚は、生殖的に年老いた女性により生成されるものに比べて著しく（Ｐ＝０．０１）高いｍｔＤＮＡレベルを含んだことが示された。ｃ）ＴＥ試料のリアルタイムＰＣＲ分析により、異数体胚盤胞（ｎ＝９９）は、正倍数体（ｎ＝２０３）と比べて、全ての年齢で、著しく（Ｐ＝０．０２５）大量のｍｔＤＮＡを含んだことも示された。ｍｔＤＮＡ値の統計解析は独立両側ｔ検定を用いて行われた。染色体的に正常および異常な胚盤胞のＮＧＳ分析によるｍｔＤＮＡ定量化を示すグラフである。３８の胚から生検されたＴＥ試料のＮＧＳ分析は染色体エラーの存在下で起こる、ｍｔＤＮＡレベルの統計的に有意な増加（Ｐ＝０．００６）を示した。臨床結果との関連での染色体的に正常な胚盤胞のｍｔＤＮＡ含量を示すグラフである。平均して、臨床的妊娠を確立することができる染色体的に正常な胚盤胞は、妊娠できなかった染色体的に正常な胚盤胞と比べて、著しく（Ｐ＝０．００７）低レベルのｍｔＤＮＡを含んだ。図５Ａ−５Ｃは、臨床結果との関連での胚盤胞ｍｔＤＮＡ量閾値を示す一連のグラフである。５Ａ）公知の結果を有する移植胚からのＴＥ生検のレトロスペクティブ分析により確立された、正倍数体胚盤胞についてのｍｔＤＮＡ量生存能閾値。生存可能な妊娠を生成させる全ての胚盤胞は０．００３値（レッドライン）未満のｍｔＤＮＡ量を含み、一方、この値を超えるｍｔＤＮＡ量は、進行中の臨床的妊娠の達成の失敗と関連した。５Ｂ）プロスペクティブ盲検試験の結果。使用したｍｔＤＮＡ閾値は、レトロスペクティブ研究（５Ａ）で確立されたものと同じであった。妥当性が確認された。というのも生存可能な妊娠を生成させる全ての胚盤胞はカットオフ（レッドライン）未満のｍｔＤＮＡ量を含み、この値を超えるｍｔＤＮＡ量を有する胚盤胞は進行中の臨床的妊娠を達成しなかったからである。５Ｃ）２３の正倍数体ＴＥ試料におけるｍｔＤＮＡレベルのＮＧＳ分析。対応する胚をＳＥＴ周期中に移植し、臨床結果がそれらの２１において知られることとなった。リアルタイムＰＣＲ実験と同様に、ｍｔＤＮＡレベルは、７の着床胚においてより低かった（注−ｙ軸スケールがＮＧＳ分析では異なっており、その結果としてカットオフ値が異なる）。

胚（例えば、正倍数体胚）の子宮に着床し（すなわち、「着床の可能性」）、妊娠を開始する可能性を決定するための材料および方法が本明細書で提供される。本明細書で示されるように、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）量と胚の着床の可能性の間には相関がある。ｍｔＤＮＡ量の評価は、健康な妊娠および出生に導く最高能力を有する胚を識別するために使用することができる。よって、いくつかの態様では、本開示は、胚の着床の可能性を決定するのに使用するための、着床前、すなわち、初期の胚（例えば、接合体または胚盤胞）におけるミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の定量化のための組成物および方法を提供する。例えば、胚の着床の可能性を決定するために、定量的ＰＣＲ法（例えば、リアルタイムＰＣＲ）において使用することができるプライマーおよびプローブが本明細書で提供される。

「胚」という用語は、受精卵母細胞または接合体を示す。前記受精は、古典的体外受精（ｃＩＶＦ）下、または卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）プロトコル下で介在し得る。

１つの態様では、本開示は着床のための胚を選択するための方法を提供し、方法は、下記を含む：胚試料中の基準核酸配列と比較して、胚試料中のミトコンドリアＤＮＡの量を決定すること、および決定されたミトコンドリアＤＮＡの量が胚中の決定された基準核酸試料の量と比較して増加した場合、着床のための胚を選択すること。

「増加した」、「増加する」または「上方制御された」という用語は全て、一般に、統計的に有意な量の増加を意味するために本明細書で使用され；疑いを回避するために、「増加した」または「増加する」という用語は、基準レベルと比較して、少なくとも約１０％の増加、例えば、基準レベルと比較して少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％または１００％までの増加、あるいは１０−１００％の間の任意の増加、または基準レベルと比較して少なくとも約０．５倍、または少なくとも約１．０倍、または少なくとも約１．２倍、または少なくとも約１．５倍、または少なくとも約２倍、または少なくとも約３倍、または少なくとも約４倍、または少なくとも約５倍または少なくとも約１０倍の増加、あるいは１．０倍と１０倍以上の間の任意の増加を意味する。いくつかの実施形態では、基準レベルは胚試料中の基準核酸配列のレベルである。

「減少する」、「減少した」、「低減した」、「低減」または「下方制御された」という用語は全て、一般に、統計的に有意な量の減少を意味するために本明細書で使用される。しかしながら、疑いを回避するために、「低減した」、「低減」、「下方制御された」「減少した」または「減少する」は、基準レベルと比較して少なくとも約１０％の減少、例えば、少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％の減少、または１００％までの減少（すなわち、基準試料と比較した消失レベル）、または基準レベルと比較して、１０−１００％の間の任意の減少、または基準レベルと比較して、少なくとも約０．５倍、または少なくとも約１．０倍、または少なくとも約１．２倍、または少なくとも約１．５倍、または少なくとも約２倍、または少なくとも約３倍、または少なくとも約４倍、または少なくとも約５倍または少なくとも約１０倍の減少、または１．０倍と１０倍以上の間の任意の減少を意味する。いくつかの実施形態では、基準レベルは胚試料中の基準核酸配列のレベルである。

当業者であれば、本明細書で記載される核酸分子（例えば、プライマーおよび／またはプローブ）のいずれに対しても小さな変化が可能であり、バリアント核酸分子、例えば、本明細書で記載される核酸分子、例えば、配列番号２−１０のいずれかに対し少なくともまたは約９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％配列同一性を有する核酸分子は、本明細書で提供される方法において使用することができることを認識するであろう。

当業者であれば、本明細書で記載される核酸分子（例えば、プライマーおよび／またはプローブ）は、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（１９９９Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．（編）ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）で記載される標準分子生物学技術により、または化学合成により、または核酸類似体により得ることができることを認識するであろう。

ミトコンドリアＤＮＡ
ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）は環状であり、１６．６ｋｂの二本鎖ＤＮＡから構成される（図１）。このＤＮＡ分子によりコードされる遺伝子は細胞代謝において直接的な役割を有し、電子伝達系（ＥＴＣ）内で重要な役割を有する複数の複合体のサブユニットを生成させる［６］。ミトコンドリアゲノムによりコードされる複合体は、他のＥＴＣ成分と共に、ミトコンドリア内膜に位置し、細胞内でのＡＴＰの生成に不可欠である。加えて、ｍｔＤＮＡは、２２のｔＲＮＡおよび２のｒＲＮＡを含む小器官の転写および翻訳機構の成分のいくつかをコードし、残りは、核ゲノムによりコードされる［６］。細胞は損傷した小器官を置き換え、細胞内エネルギー要求の変化に適応するように、それらのミトコンドリアを再分布させることができることが示されている［７］。

哺乳類細胞のミトコンドリア含量は、細胞の体積およびエネルギー需要により決定される数百〜数千の範囲である。ヒト成熟卵母細胞は、ミトコンドリアおよびｍｔＤＮＡの両方について最高含量を有する細胞型の１つである［１］。卵母細胞ミトコンドリア複製は胎児発生中に開始し、卵原細胞の細胞はおよそ２００のミトコンドリアを含んでいる［８においてレビュー］。複製は成熟に同調して続き、よって、受精直前、中期ＩＩで停止させた卵母細胞はおよそ１００，０００のミトコンドリアおよび５０，０００〜５５０，０００のｍｔＤＮＡのコピーを含む［１、９−１３］。

哺乳類胚は、ミトコンドリア（よって、ｍｔＤＮＡ）を、受精直前に卵母細胞で見出される集団から排他的に受け継ぐ。ヒト卵割期胚におけるｍｔＤＮＡの定量化からのデータにより、量は着床前発生の最初の３日中は安定なままであることが示唆される［１、１２−１６］。ｍｔＤＮＡの著しい複製は、胚が栄養外胚葉（ＴＥ）および内部細胞塊への第１の細胞分化を受け、胚盤胞となった後まで開始されないと考えられる［３、８］。

着床前発生は動的でエネルギーを要求するプロセスであり、その間、ミトコンドリア機能は重大である。初期胚は、各細胞分裂を通じてうまく進行することができるように、十分なエネルギーレベルを必要とする。既存のデータにより、正確な卵母細胞ミトコンドリア機能およびｍｔＤＮＡ遺伝子発現が人生のこれらの初期段階中には必須であることが示唆される。特定的には、ヒト卵母細胞のＡＴＰ量、胚の発生の可能性、およびＩＶＦサイクルの結果の間には関連が見られる［１７］。

ミトコンドリア機能は人生の最初の数日間重大であるので、発明者らは、発生の胚盤胞期にうまく到達したヒト着床前胚においてｍｔＤＮＡの完璧な調査を実施した。特定的には、発明者らは、ヒト胚盤胞ｍｔＤＮＡ含量、女性患者の年齢、胚染色体状態、生存率および着床の可能性の間の関係を調査した。加えて、我々は、ｍｔＤＮＡ複製が最初に上方制御され、個々の細胞のｍｔＤＮＡ含量が増加される可能性がある、着床前発生の段階を明らかにしようと試みた。ｍｔＤＮＡの相対定量化と同様に、突然変異、欠失および多型を探し求めて、ミトコンドリアゲノムの詳細分析を始めた。

いくつかの実施形態では、胚は正倍数体胚である。本明細書で示されるように、着床および非着床正倍数体胚盤胞から得られたｍｔＤＮＡの定量化は、閾値を確立するために使用することができる。閾値は、臨床医が、正倍数体胚の着床の可能性を決定することができる値である。例えば、閾値未満であるｍｔＤＮＡ量は、胚の有利な着床の可能性を示し、一方、閾値を超えるｍｔＤＮＡ量は胚の不利な着床の可能性を示す。

相対定量化において、標的ＤＮＡ（例えば、ｍｔＤＮＡ）の量が検出され、単一試料中の基準ＤＮＡの量に対して規準化され、標的ＤＮＡの相対量が決定される。ｍｔＤＮＡの相対量の分析により、胚の着床し（すなわち、「着床の可能性」）、妊娠を開始する可能性を決定するための閾値の確立が可能になる。本明細書で記載されるように、ｍｔＤＮＡの相対量は、多くの手段、例えば、限定はされないが、リアルタイムＰＣＲまたは次世代シーケンシング（ＮＧＳ）により決定することができる。

この閾値は、妊娠成績がわかっている試料中に存在するミトコンドリア量を分析することにより確立させることができる。いくつかの実施形態では、陽性および陰性の妊娠成績を有する胚と関連する１つ以上の試料が分析され、閾値が決定される。検量線および絶対定量化を採用することができるが、必須ではない。当業者であれば、胚の着床の可能性を決定するための閾値は、多くの変数、例えば、限定はされないが、アッセイ感度、アッセイを実施する技術者、および／または基準ＤＮＡの量／質に基づいて、最適化を必要とする可能性があることが理解されるであろう。

いくつかの実施形態では、ｍｔＤＮＡの相対量は、リアルタイムＰＣＲ、例えば定量的ＰＣＲにより決定され、着床を決定するための閾値相対ｍｔＤＮＡ量は０．００３である。約０．００３未満の相対ｍｔＤＮＡ量を有する着床前胚は着床すると予測される。例えば、着床すると予測される着床前胚は約０．００２９、約０．００２５、約０．００２、約０．００１５、約０．００１、約０．０００８、約０．０００５、約０．０００３、約０．０００２、約０．０００１、約０．００００８、または約０．００００５、約０．００００４、約０．００００３、または約０．００００２の相対ｍｔＤＮＡ量を有することができる。いくつかの実施形態では、着床すると予測される着床前胚は、０．００２未満の相対ｍｔＤＮＡ量を有する。いくつかの実施形態では、着床すると予測される着床前胚は、０．００１未満の相対ｍｔＤＮＡ量を有する。

約０．００３を超える相対ｍｔＤＮＡ量を有する着床前胚は着床することができない。例えば、着床しないと予測される着床前胚は、約０．００３１、約０．００３５、約０．００４、約０．００４５、約０．００５、約０．００６、約０．００７、約０．００８、約０．００９、約０．０１、または約０．０２の相対ｍｔＤＮＡ量を有することができる。いくつかの実施形態では、着床すると予測される着床前胚は、約０．００４を超える相対ｍｔＤＮＡ量を有する。いくつかの実施形態では、着床すると予測される着床前胚は、約０．００５を超える相対ｍｔＤＮＡ量を有する。

いくつかの実施形態では、ｍｔＤＮＡの量は、ＮＧＳにより決定され、着床を決定するための閾値相対ｍｔＤＮＡ量は０．０７である。約０．０７未満の相対ｍｔＤＮＡ量を有する着床前胚は着床すると予測される。例えば、着床すると予測される着床前胚は、約０．０６８、約０．０６５、約０．０６２５、約０．０６、約０．０５５、約０．０５、約０．０４５、約０．０４、約０．０３５．約０．０３、約０．０２５、または約０．０２の相対ｍｔＤＮＡ量を有することができる。いくつかの実施形態では、着床すると予測される着床前胚は、０．０６未満の相対ｍｔＤＮＡ量を有する。いくつかの実施形態では、着床すると予測される着床前胚は、０．０５未満の相対ｍｔＤＮＡ量を有する。

約０．０７を超える相対ｍｔＤＮＡ量を有する着床前胚は着床することができない。例えば、着床しないと予測される着床前胚は、約０．０７５、約０．０８、約０．０９、約０．１０、約０．１１、約０．１２、約０．１３、約０．１４、約０．１５、約０．１６、約０．１８、約０．２０、約０．２２、約０．２５、約０．２８、約０．３０、または約０．３２の相対ｍｔＤＮＡ量を有することができる。いくつかの実施形態では、着床すると予測される着床前胚は、０．０８を超える相対ｍｔＤＮＡ量を有する。いくつかの実施形態では、着床すると予測される着床前胚は、０．１０を超える相対ｍｔＤＮＡ量を有する。

加えて、閾値自体に割り当てられる数値は、胚を調査するために使用される技術によって異なるであろう（例えば、Ｎｅｘｔ−Ｇｅｎシーケンシングを使用する定量化についての閾値は、定量的ＰＣＲから得られたものとは異なる数値を有し得る）。

標的配列の増幅
本発明によれば、従来の分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、免疫学、細胞生物学および当技術分野の技能内の他の関連技術が使用され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，（２００１）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ．第３版ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ：ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，（１９８９）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ．第２版ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ：ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，編（２００５）ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ．ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，Ｉｎｃ．：Ｈｏｂｏｋｅｎ，Ｎ．Ｊ．；Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏｅｔａｌ．，編（２００５）ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ．ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，Ｉｎｃ．：Ｈｏｂｏｋｅｎ，Ｎ．Ｊ．；Ｃｏｌｉｇａｎｅｔａｌ．，編（２００５）ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，Ｉｎｃ．：Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ．；Ｃｏｉｃｏｅｔａｌ．，編（２００５）ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，Ｉｎｃ．：Ｈｏｂｏｋｅｎ，Ｎ．Ｊ．；Ｃｏｌｉｇａｎｅｔａｌ．，編（２００５）ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉｅｎｃｅ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，Ｉｎｃ．：Ｈｏｂｏｋｅｎ，Ｎ．Ｊ．；Ｅｎｎａｅｔａｌ．，編（２００５）ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，Ｉｎｃ．：Ｈｏｂｏｋｅｎ，Ｎ．Ｊ．；Ｈａｍｅｓｅｔａｌ．，編（１９９９）ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ．ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ：Ｏｘｆｏｒｄ；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（２０００）ＣｕｌｔｕｒｅｏｆＡｎｉｍａｌＣｅｌｌｓ：ＡＭａｎｕａｌｏｆＢａｓｉｃＴｅｃｈｎｉｑｕｅ．第４版Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ；などを参照されたい。上記で列挙される最新プロトコル（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ）は毎年数回更新される。

核酸標的配列（例えば、ｍｔＤＮＡまたは基準ＤＮＡ）を増幅させる方法は当技術分野でよく知られており、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、標的配列の増幅はリアルタイムＰＣＲを含む。リアルタイムＰＣＲは標準リアルタイムＰＣＲまたは高速リアルタイムＰＣＲとすることができる。当業者によれば、高速リアルタイムＰＣＲを適用させるために、例えば、計測手段（例えば、温度のより高速変化を実行するため）、酵素（例えば、正確さを維持するより高速の酵素）、および／またはサイクリングパラメータ（例えば、ＰＣＲ工程の短縮またはさらには結合）に対して変更を行う必要がある可能性があることが理解されるであろう。

リアルタイムＰＣＲは少なくとも３つの工程の熱サイクル（すなわち、反復加熱および冷却のサイクル）を含む：ＤＮＡ二重らせんの２つの鎖を分離するための第１の変性工程、プライマーをＤＮＡテンプレートに結合させる第２のアニーリング工程、およびＤＮＡポリメラーゼ（例えば、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ）により実施されるＤＮＡ合成を促進する第３の伸長工程。場合によっては、第４の工程、および中程度に高い温度（例えば、８０℃）を含めることができ、その間、蛍光を測定することができる。

第１の工程は二本鎖ＤＮＡを一緒に保持する水素結合を破壊する高温を含む。第１の工程は、約９５℃の温度を含むことができる。第１の工程は、約１０秒〜１分の時間を含むことができる。例えば、第１の工程は約１５秒続くことができる。いくつかの実施形態では、第１の工程は９５℃の温度を含み、１５秒続く。

第２の工程は、より低い温度を含み、そのため、ＰＣＲプライマーは、ＤＮＡ標的配列に結合することができる。第２の工程は約５０−６０℃の温度を含むことができる。例えば、温度は約５０℃、約５２℃、約５４℃、約５５℃、約５７℃、約５９℃、または約６０℃とすることができる。第２の工程は約１５秒、約３０秒、または約６０秒続くことができる。いくつかの実施形態では、第２の工程は５５℃の温度を含み、１５秒続く。

第３の工程は、中間温度を含み、これにより、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ）は、プライマーをＤＮＡ標的配列に沿って伸長させることができる。第３の工程は約５８−７２℃の温度を含むことができる。例えば、温度は約５８℃、約６２℃、約６５℃、約６８℃、約７０℃、または約７２℃とすることができる。第３の工程は約４５秒、約６０秒、または約９０秒続くことができる。いくつかの実施形態では、第３の工程は６０℃の温度を含み、１分続く。

これらの工程は典型的には２５−５０回繰り返される（すなわち、サイクルされる）。当業者により理解されるように、ＰＣＲ増幅には３つの相が存在する：１）指数関数相、その間試薬は新鮮で使用可能であり、産物の正確な倍加が毎サイクルで起こる（１００％反応効率と仮定）；２）直線相、その間、増幅の結果、試薬のいくらかが消費され、ＰＣＲ産物はもはや毎サイクルで倍加されない；ならびに３）プラトー相、その間、反応は停止される。いくつかの実施形態では、サイクル数は指数関数相を超えない。例えば、熱サイクル工程は、２５回、３０回、３２回、３５回、３８回、４０回、４５回、または５０回繰り返すことができる。いくつかの実施形態では、熱サイクル工程は３５回繰り返される。

リアルタイムＰＣＲ熱サイクルでは、室温では不活性な熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを活性化するために、高温（例えば、約９５℃）での延長保持が先行することができる。サイクル設定は、しばしば、「ホットスタート」サイクルと呼ばれるそのような延長保持を含んだ。延長保持は約２０秒〜約１０分とすることができる。当業者により理解されるように、様々な熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは異なる活性化時間を必要とする。例えば、いくつかの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは９５℃での１０分活性化を必要とし、ここで、他の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＦａｓｔＤＮＡポリメラーゼ）は９５℃で２０秒活性化しか必要としない。いくつかの実施形態では、リアルタイムＰＣＲは約９５℃での１０分延長保持を含む。

当業者により理解されるように、熱サイクルパラメータは、多くの因子に基づき調整される必要がある可能性がある。例えば、最適なプライマーアニーリング温度は、塩基組成（すなわち、Ａ、Ｔ、Ｇ、およびＣヌクレオチドの割合）、プライマー濃度、およびイオン反応環境に依存し得る。例えば、伸長時間は、アンプリコン長に依存し得る（すなわち、伸長は典型的には約１分／ｋｂを必要とする）。

いくつかの実施形態では、リアルタイムＰＣＲは、約９５℃での１０分延長保持ならびに約９５℃で約１５秒間の第１の工程、約５０−６０℃で約１５秒間の第２の工程、および約６８−７２℃で約１分間の第３の工程を含む熱サイクルを含み、ここで、第１、第２、および第３の工程は約３５回サイクルされる。

ＰＣＲは、ｍｔＤＮＡ配列の領域に相補的な配列を含む、少なくとも２つのプライマー（すなわち、「プライマー対」または「プライマーセット」）を含む。プライマーは短い合成オリゴヌクレオチド分子であり、これは、より長い核酸配列の合成を開始させるために使用することができる。プライマーは、相補的標的ＤＮＡ配列（例えば、ｍｔＤＮＡ）に核酸ハイブリダイゼーションによりアニールさせることができ、プライマーと標的ＤＮＡ配列の間のハイブリッドが形成され、その後、プライマーは標的ＤＮＡ配列に沿ってＤＮＡポリメラーゼ酵素により伸長される。標的ＤＮＡ配列に隣接する、少なくとも２つのプライマー（例えば、フォワードプライマーおよびリバースプライマー）のセットは、標的ＤＮＡ配列を増幅させ、増幅産物（アンプリコンとも呼ばれる）を生成させるために使用することができる。開示された方法と共に使用することができるプライマーは約１０−５０ヌクレオチド、例えば約１２−５０ヌクレオチド、１５−４０ヌクレオチド、１５−３０ヌクレオチド、１２−４０ヌクレオチド、１８〜３５ヌクレオチド、１８〜３０ヌクレオチド、１９〜３０ヌクレオチド、１９〜２９ヌクレオチド、または２０〜２９ヌクレオチドとすることができる。

標的配列は１つ以上のｍｔＤＮＡ配列とすることができる。ＰＣＲプライマーは、ｍｔＤＮＡの任意の部分を標的とするように設計された任意のプライマーとすることができる。標的ｍｔＤＮＡは、例えば、ＮＣ＿０１２９２０（配列番号：１）において明記されるヒトｍｔＤＮＡとすることができる。ヒトｍｔＤＮＡ標的の位置を示す概略は図１に明記される。例えば、ＰＣＲプライマーは、限定はされないが、１２ＳＲＮＡをコードするミトコンドリアＤＮＡ配列、１６ＳＲＮＡをコードするミトコンドリアＤＮＡ配列、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット１（ＭＴ−ＮＤ１）をコードするミトコンドリアＤＮＡ配列、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット２（ＭＴ−ＮＤ２）をコードするミトコンドリアＤＮＡ配列、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット３（ＭＴ−ＮＤ３）をコードするミトコンドリアＤＮＡ配列、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット４（ＭＴ−ＮＤ４）をコードするミトコンドリアＤＮＡ配列、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット５（ＭＴ−ＮＤ５）をコードするミトコンドリアＤＮＡ配列、チトクロムｂ、ミトコンドリアチトクロムｃオキシダーゼサブユニット１、２または３をコードするミトコンドリアＤＮＡ配列、ＡＴＰシンターゼをコードするミトコンドリアＤＮＡ配列を標的とすることができる。ＰＣＲプライマーを設計するためのツールおよび戦略は当技術分野で知られている。

いくつかの実施形態では、ＰＣＲプライマーは、Ｆｒｅｇｅｌｅｔａｌ．（２０１１ＦｏｒｅｎｓｉｃＳｃｉｅｎｃｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＧｅｎｅｔｉｃｓＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔＳｅｒｉｅｓ３（１）：ｅ３０３−３０４）において記載されるように、１６ＳＲＮＡをコードするミトコンドリアＤＮＡ配列（例えば、ヒト１６Ｓ配列）を標的とするように設計することができる。例えば、１６ＳＲＮＡを転写するヒトｍｔＤＮＡの部分を標的とするプライマー対は、配列ＧＧＴＧＡＴＡＧＣＴＧＧＴＴＧＴＣＣＡＡＧＡＴ（配列番号２）を含むフォワードプライマーおよび配列ＣＣＴＡＣＴＡＴＧＧＧＴＧＴＴＡＡＡＴＴＴＴＴＴＡＣＴＣＴＣＴＣ（配列番号：３）を含むリバースプライマーを含むことができる。

いくつかの実施形態では、ＰＣＲプライマーは、ＮＡＤＨ−ユビキノンオキシドレダクターゼ鎖４（ＭＴ−ＮＤ４）をコードするミトコンドリアＤＮＡ配列（例えば、ヒトＭＴ−ＮＤ４配列）を標的とするように設計することができる。例えば、ＭＴ−ＮＤ４をコードするヒトｍｔＤＮＡの部分を標的とするプライマー対は、配列ＣＴＧＴＴＣＣＣＣＡＡＣＣＴＴＴＴＣＣＴ（配列番号：８）を含むフォワードプライマーおよび配列ＣＣＡＴＧＡＴＴＧＴＧＡＧＧＧＧＴＡＧＧ（配列番号：９）を含むリバースプライマーを含むことができる。

いくつかの実施形態では、ＰＣＲプライマーは、Ｋａｖｌｉｃｋら（Ｕ．Ｓ．９，０８０，２０５号；、２０１５年７月１４日に発行）において記載されるように、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット５（ＮＡＤＨ５）（例えば、ヒトＮＡＤＨ５配列）をコードするミトコンドリアＤＮＡ配列を標的とするように設計することができる。

標的配列は染色体ＤＮＡとすることができる。相対定量化は試料中の標的ＤＮＡ（例えば、ｍｔＤＮＡ）の量を試料中の基準ＤＮＡ（例えば染色体ＤＮＡ）の量と比較することに基づく。基準ＤＮＡは任意の染色体ＤＮＡ（例えば、ハウスキーピング遺伝子、マルチコピー遺伝子または反復配列遺伝子）とすることができる。例えば、基準ＤＮＡはＡｌｕ配列、Ｌ１配列、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、β−アクチン（ＡｃｔＢ）、アルブミン、β−グロビンまたは１８ＳｒＲＮＡとすることができる。いくつかの実施形態では、基準ＤＮＡはヒト核ゲノムにおけるマルチコピー配列とすることができる（例えば、ＡｌｕまたはＬ１）。いくつかの実施形態では、基準対照として複数の個々のＤＮＡ断片を使用し、それらの結果を一緒に合わせて単一基準値を生成させることが企図される。しかしながら、このために、事実上ゲノム中のＤＮＡ配列の任意の組み合わせを使用することができ、そのため、それらを特定しようしても意味がない。基準ＤＮＡ配列に対するものであるプライマーおよび／またはプローブは設計、および／または合成することができる。あるいは、基準ＤＮＡ配列に対するものであるプライマーおよび／またはプローブは商業的に入手することができる。

いくつかの実施形態では、ＰＣＲプライマーは、基準ＤＮＡとしてのＡｌｕ配列（例えば、ヒトＡｌｕ配列）を標的とするように設計することができる。例えば、ヒトＡｌｕ配列を標的とするプライマー対は、配列ＧＴＣＡＧＧＡＧＡＴＣＧＡＧＡＣＣＡＴＣＣＴ（配列番号：５）を含むフォワードプライマーおよび配列ＡＧＴＧＧＣＧＣＡＡＴＣＴＣＧＧＣ（配列番号：６）を含むリバースプライマーを含むことができる。

ｍｔＤＮＡのＰＣＲ増幅は、シングルプレックスＰＣＲ（標的ｍｔＤＮＡの増幅および基準ＤＮＡの増幅は独立した反応で実施される；例えば、別々のチューブまたはウェルにおいて）またはデュプレックスＰＣＲ（標的ｍｔＤＮＡの増幅および基準ＤＮＡの増幅は同じ反応で実施される；例えば、同じチューブまたはウェルにおいて）とすることができる。

本明細書で記載されるＰＣＲ試薬のいずれも反応混合物として一緒に提供することができる。例えば、反応混合物は、プライマー対、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ；ｄＵＴＰありまたはなし）、バッファー（例えば、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ＴＥ）バッファー）、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼまたはＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼなどの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ）、および／またはヌクレアーゼフリー水の２つ以上を含むことができる。デオキシヌクレオチド、バッファーおよびＤＮＡポリメラーゼを含む市販の反応混合物（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＵｎｉｖｅｒｓａｌＭａｓｔｅｒＭｉｘ）を入手することができ、プライマー対は市販の反応混合物に添加することができる。

増幅された標的配列の検出
定量的ＰＣＲ（例えば、リアルタイムＰＣＲ）はアンプリコンの検出を含む。開示された方法と共に使用することができるアンプリコンは約７０−２００ヌクレオチド、例えば約８０−１８０ヌクレオチド、９０−１７０ヌクレオチド、１００−１６０ヌクレオチド、または１１０−１５０ヌクレオチドとすることができる。アンプリコンは任意の好適な手段（例えば、蛍光）により検出することができる。例えば、標的配列の増幅で蛍光を発生させることができ、アンプリコンの検出は、蛍光の検出を含むことができる。リアルタイムＰＣＲにおける蛍光の生成は、例えば、任意の二本鎖ＤＮＡにインターカレートする非特異的蛍光色素、または蛍光レポーター色素（プローブのその相補的配列とのハイブリダイゼーション後にのみ検出が可能となる）で標識されたオリゴヌクレオチドから構成される配列特異的プローブを含むことができる。

リアルタイムＰＣＲが、任意の二本鎖ＤＮＡにインターカレートする非特異的蛍光色素を含む場合、蛍光色素をインターカレートさせる任意のＤＮＡを使用することができる。蛍光色素をインターカレートさせるＤＮＡの非限定的な例としては、ＬＣＧｒｅｅｎ（登録商標）色素、ＳＹＴＯ（登録商標）色素、ＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標）色素、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ色素、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ色素、Ｃｈｒｏｍｏｆｙ（商標）色素、オキサゾールイエロー、チアゾールオレンジ、およびピコグリーンが挙げられる。当業者により理解されるように、１つ以上の蛍光色素の存在はＤＮＡの融解温度に影響する可能性がある。そのようなものとして、リアルタイムＰＣＲ熱サイクルパラメータの第１の工程の高温の調整（例えば、約１−３℃だけ）は、それに応じて増加または減少させることができる。

リアルタイムＰＣＲが蛍光標識されたプローブを含む場合、任意の好適なプローブが使用され得る。プローブはアンプリコンのある領域に相補的または実質的に相補的であるオリゴヌクレオチドであり、アンプリコンを検出または捕捉するために使用することができる。例えば、増幅に基づく検出方法において使用するのに好適なプローブは、アンプリコン内に位置する任意の配列から設計することができる。開示された方法と共に使用することができるプローブは約１０−５０ヌクレオチド、例えば約１２−５０ヌクレオチド、１５−４０ヌクレオチド、１５−３０ヌクレオチド、１２−４０ヌクレオチド、１８〜３５ヌクレオチド、１８〜３０ヌクレオチド、１９〜３０ヌクレオチド、１９〜２９ヌクレオチド、または２０〜２９ヌクレオチドとすることができる。

いくつかの実施形態では、プローブは、１６ＳＲＮＡを転写するｍｔＤＮＡの部分（例えば、ヒトｍｔＤＮＡ１６Ｓ）を標的とするプライマー対により生成されるアンプリコンを標的とすることができる。例えば、ヒトｍｔＤＮＡ１６Ｓアンプリコンを標的とするプローブは、配列ＡＡＴＴＴＡＡＣＴＧＴＴＡＧＴＣＣＡＡＡＧＡＧ（配列番号４）を含むことができる。

いくつかの実施形態では、プローブは、ＭＴ−ＮＤ４をコードするｍｔＤＮＡの部分（例えば、ＭＴ−ＮＤ４をコードするヒトｍｔＤＮＡ）を標的とするプライマー対により生成されるアンプリコンを標的とすることができる。例えば、ヒトＭＴ−ＮＤ４アンプリコンを標的とするプローブは、配列ＧＡＣＣＣＣＣＴＡＡＣＡＡＣＣＣＣＣ（配列番号：１０）を含むことができる。

いくつかの実施形態では、ＰＣＲプライマーは、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット５（ＮＡＤＨ５）をコードするｍｔＤＮＡの部分（例えば、ヒトＮＡＤＨ５配列）を標的とするように設計することができる。

いくつかの実施形態では、プローブは、基準ＤＮＡ（例えば、ヒトＡｌｕ配列）を標的とするプライマー対により生成されるアンプリコンを標的とすることができる。例えば、ヒトＡｌｕアンプリコンを標的とするプローブは、配列ＡＧＣＴＡＣＴＣＧＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＣＡＧＧＡ（配列番号：７）を含むことができる。

リアルタイムＰＣＲが蛍光標識されたプローブを含む場合、任意の好適な蛍光レポーター色素が使用され得る。蛍光レポーター色素の非限定的な例としてはＮＥＤ（商標）、シアニン（例えば、Ｃｙ（商標）２、Ｃｙ（商標）３、Ｃｙ（商標）３．５、Ｃｙ（商標）５、Ｃｙ（商標）５．５、およびＣｙ（商標）７）、フルオレセイン（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、およびＦＡＭホスホラミダイト）、ローダミン（例えば、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ（商標））、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）、スルホローダミン１０１、テキサスレッド（登録商標）、およびローダミンレッド（登録商標））、およびＲＯＸ（商標）が挙げられる。蛍光レポーター色素は、プローブのいずれかの端でコンジュゲートさせることができ、蛍光標識されたプローブが生成される。デュプレックスＰＣＲが使用される場合、ｍｔＤＮＡアンプリコンを検出するプローブおよび基準ＤＮＡアンプリコンを検出するプローブは異なる蛍光レポーター色素を必要とすることが理解されるべきである。

場合によっては、蛍光標識されたプローブは一端に蛍光レポーター色素を、および反対端にクエンチャー分子を含む。クエンチャー分子が蛍光レポーター色素にごく近接すると、クエンチャー分子は、蛍光レポーター色素の発光を（例えば、励起エネルギーを吸収することにより）除去または低減させる。ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性は物理的レポーター−クエンチャー近接を破壊し、よって、蛍光レポーター色素のクエンチされていない発光が可能になる。クエンチャー分子の非限定的な例としては、無蛍光クエンチャー（ＮＦＱ）、ジメチルアミノアゾベンゼンスルホン酸（ＤＡＢＳＹＬ）、ＢｌａｃｋＨｏｌｅクエンチャー、Ｑｘｌクエンチャー、ＩｏｗａｂｌａｃｋＦＱ、ＩｏｗａｂｌａｃｋＲＱ、ＩＲＤｙｅＱＣ−１が挙げられる。当業者により理解されるように、クエンチャー分子は典型的には、特定の範囲の蛍光発光で最も有効である。例えば、ＤＡＢＳＹＬは緑色スペクトルで吸収し、しばしば、フルオレセインと共に使用される。

プローブは、グルーブバインダ（ＭＧＢ）部分を含むことができる。ＭＧＢ部分は、プローブがアンプリコンにアニールした時に形成される二本鎖の安定性を増加させる。ＭＧＢ部分は、プローブの一端にコンジュゲートさせることができる。プローブが蛍光標識されたプローブである場合、ＭＧＢ部分はプローブと蛍光標識またはクエンチャーの間に配置することができ、または、ＭＧＢ部分は蛍光標識またはクエンチャーの末端に配置することができる。

いくつかの実施形態では、プローブは蛍光標識されたプローブ（例えば、配列ＡＡＴＴＴＡＡＣＴＧＴＴＡＧＴＣＣＡＡＡＧＡＧ（配列番号：４）を含む）であり、これは、一端にＦＡＭ蛍光レポーター色素ならびに反対端にＭＢＧ部分およびＮＦＱクエンチャー分子を含む。

いくつかの実施形態では、プローブは蛍光標識されたプローブ（例えば、配列ＧＡＣＣＣＣＣＴＡＡＣＡＡＣＣＣＣＣ（配列番号：１０）を含む）であり、これは、一端にＮＥＤ蛍光レポーター色素および反対端にＮＦＱクエンチャー分子を含む。

いくつかの実施形態では、プローブは蛍光標識されたプローブ（例えば、配列ＡＧＣＴＡＣＴＣＧＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＣＡＧＧＡ（配列番号：７）を含む）であり、これは、一端にＦＡＭ蛍光レポーター色素ならびに反対端にＭＢＧ部分およびＮＦＱクエンチャー分子を含む。

本明細書で示されるように、ｍｔＤＮＡ量を使用して、胚盤胞の着床の可能性を決定することができる。ｍｔＤＮＡの閾値量が存在し、これを超えると、胚盤胞（例えば、正倍数体胚盤胞）の着床が決して観察されなかった。このカットオフは、胚形態または患者が治療を受けているクリニックなどの他の考慮事項に関係なく、有効なままであった。

標的配列の定量化
本明細書では、「ＤＮＡの量を決定すること」は、試料中に存在する核酸の量を定量することを示す。

本明細書におけるいくつかの方法においては、試料中に存在するＤＮＡを検出し、定量することが望ましい。ＤＮＡの検出および定量化は、当技術分野でよく知られた多くの方法のいずれか１つにより達成することができる。ｍｔＤＮＡまたは基準ＤＮＡ配列についてよく知られた配列を使用して、特定のプローブおよびプライマーを、必要に応じて、下記で記載される検出方法において使用するために設計することができる。

核酸標的配列（例えば、ｍｔＤＮＡまたは染色体ＤＮＡ）を定量する方法は当技術分野でよく知られており、例えば、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）、分光光度的定量化、およびＤＮＡ色素の存在下でのＵＶ蛍光が挙げられる。本開示は、特定の定量化方法に制限されない。いくつかの実施形態では、ｍｔＤＮＡの定量化はリアルタイムＰＣＲを含む。

リアルタイムＰＣＲは定量的に（定量的リアルタイムＰＣＲ）、半定量的に（半定量的リアルタイムＰＣＲ）または定性的に（定性的リアルタイムＰＣＲ）使用され得る。当分野において理解されるように、ＰＣＲは、数桁にわたるＤＮＡ断片の単一コピーまたは数コピーの増幅を含む。いくつかの実施形態では、リアルタイムＰＣＲは定量的である。

相対定量化では、試料中の標的配列（例えば、ｍｔＤＮＡ）の量が、同じ試料中の基準ＤＮＡ（例えば、染色体ＤＮＡ）の量に対して分析される。本明細書で記載されるように、ｍｔＤＮＡの相対量は、多くの手段、例えば、限定はされないが、リアルタイムＰＣＲまたは次世代シーケンシング（ＮＧＳ）により決定することができる。

いくつかの実施形態ではｍｔＤＮＡの相対量は、リアルタイムＰＣＲにより決定される。標的ＤＮＡを定量するためにリアルタイムＰＣＲを使用する方法としては、例えば、比較Ｃ_Ｔ（ΔＣ_Ｔ）方法（相対定量）、相対検量線法（相対定量）、および検量線法（絶対定量）が挙げられる。

ｍｔＤＮＡの相対量は、例えば、Ｌｉｖｉｋｅｔａｌ．（２００１ＭＥＴＨＯＤＳ２５：４０２−４０８）により、記載される式２^{−ΔΔＣＴ}によって計算することができる。指数関数相に焦点を当てるリアルタイムＰＣＲは、各試料について、検出閾値（すなわち、反応がバックグラウンドを超える蛍光強度に到達する検出のレベル）および閾値サイクル（Ｃ_Ｔ；すなわち、試料が検出閾値と交わるサイクル数）を計算する。

ΔＣ_Ｔ値は、試料における標的ｍｔＤＮＡのＣ_Ｔ値と基準ＤＮＡのＣ_Ｔ値の間の差を記し（ΔＣ_Ｔ＝標的ＤＮＡＣ_Ｔ−基準ＤＮＡＣ_Ｔ）、試料内で使用されるテンプレートの量について規準化するために使用される。例えば、ΔＣｔは（ｍｔＤＮＡ１６ＳＣ_Ｔ）−（ＡｌｕＣ_Ｔ）とすることができ、またはΔＣ_Ｔは（ＭＴ−ＮＤ４Ｃ_Ｔ）−（ＡｌｕＣ_Ｔ）とすることができる。ΔＣ_Ｔ値は複数の試料について決定することができる；例えば、試料胚、着床胚、および／または非着床胚。いくつかの実施形態では、ΔＣ_Ｔ値は、単一の試料の複数（例えば、２連、３連、など）の実行から得られた平均Ｃ_Ｔを用いて計算することができる。

ΔΔＣ_Ｔ値は第１の試料（例えば、試料胚）中のｍｔＤＮＡの平均ΔＣ_Ｔ値と第２の試料（例えば、着床胚または非着床胚）中のｍｔＤＮＡの平均ΔＣ_Ｔ値の間の差を記す。例えば、ΔΔＣ_ＴはｍｔＤＮＡ^着床ΔＣＴ−ｍｔＤＮＡ^非着床ΔＣＴとすることができる。

着床胚中のｍｔＤＮＡの相対量および非着床胚中のｍｔＤＮＡの相対量は、臨床医に胚の着床の可能性を決定させる閾値を決定するために使用される。

使用方法
本明細書で提供される方法は、着床閾値を決定するための方法、着床のための胚を選択するための方法、および胚（例えば、正倍数体胚）の着床の可能性を決定するための方法を含む。

着床閾値を決定するための方法は、例えば、着床胚から得られた第１のＤＮＡ試料を提供すること、第１のＤＮＡ試料中のミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の量を決定すること、非着床胚から得られた第２のＤＮＡ試料を提供すること、および第２のＤＮＡ試料中のｍｔＤＮＡの量を決定することを含む。着床閾値を決定するための方法はまた、第１のＤＮＡ試料中のｍｔＤＮＡの量を第２の試料中のｍｔＤＮＡの量と比較して、着床可能性閾値を決定することを含む。

例えば、第１のＤＮＡ試料（例えば、着床胚由来のＤＮＡ試料）中のｍｔＤＮＡの相対量は、第２のＤＮＡ試料（例えば、非着床胚由来のＤＮＡ試料）中のｍｔＤＮＡの相対量と比較することができる。着床胚対非着床胚中のｍｔＤＮＡの相対量の分析により、胚の着床し（すなわち、「着床の可能性」）、妊娠を開始する可能性を決定するための閾値の確立が可能になる。

胚の着床の可能性を決定するための方法は、例えば、胚から得られたＤＮＡ試料を提供すること、ＤＮＡ試料中のミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の量を決定すること、およびＤＮＡ試料中の基準ＤＮＡの量を決定することを含む。胚の着床の可能性を決定するための方法はまた、ｍｔＤＮＡの量を基準ＤＮＡの量と比較して、胚中のｍｔＤＮＡの相対量を決定することを含み、ここで、胚中のｍｔＤＮＡの相対量は、胚の着床の可能性を示す。

例えば、ＤＮＡ試料（例えば、試料胚由来のＤＮＡ試料）中のｍｔＤＮＡの量は、同じＤＮＡ試料中の基準ＤＮＡの相対量と比較することができ、ｍｔＤＮＡの相対量が確立される。ｍｔＤＮＡの相対量の分析により、臨床医は、胚の着床し（すなわち、「着床の可能性」）、妊娠を開始する可能性を決定することができる。場合によっては、ＤＮＡ試料（例えば、試料胚由来のＤＮＡ試料）中のｍｔＤＮＡの相対量は、胚の着床の可能性を決定するために確立された閾値と比較することができる。例えば、胚の着床の可能性を決定するための閾値未満である、第１のＤＮＡ試料（例えば、着床胚由来のＤＮＡ試料）中のｍｔＤＮＡの相対量は、胚の有利な着床の可能性を示す（すなわち、胚は着床する可能性がある）。例えば、胚の着床の可能性を決定するための閾値を超える、第１のＤＮＡ試料（例えば、着床胚由来のＤＮＡ試料）中のｍｔＤＮＡの相対量は、胚の不利な着床の可能性を示す（すなわち、胚は着床しない）。

本明細書で提供される方法は、胚（例えば、試料胚、着床胚、または非着床胚）から得られたＤＮＡ試料を提供することを含むことができる。試料胚は着床の可能性がわかっていない胚（例えば、体外受精のために調製された胚）である。いくつかの態様では、本明細書で記載される方法は、研究または臨床決定のため、ならびに胚性幹細胞株の作製における候補である。胚から得られたＤＮＡ試料は、任意の胚性起源（例えば、組織、細胞、胚が培養された培地、胚の胞胚腔内からの流体）から得られたＤＮＡとすることができる。胚から得られたＤＮＡ試料は、胚由来のｍｔＤＮＡおよび染色体ＤＮＡの両方を含む。胚から得られたＤＮＡ試料は、着床前胚性起源から得ることができる。いくつかの実施形態では、着床前胚から得られたＤＮＡ試料は、受精後１、２、３、４、５、６、または７日あるいは受精後１−２日、１−３日、３−５日または４−７または１−７日の胚から得られる。ＤＮＡの着床前胚性起源としては、例えば、栄養外胚葉（ＴＥ）、胚盤胞、卵割球、胚が培養された培地、胚の胞胚腔内からの流体が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ試料は、ＴＥ試料から得られる。胚から得られたＤＮＡ試料は増幅させることができる（例えば、ｍｔＤＮＡの定量化を実施する前に）。ＤＮＡ試料を増幅させる方法は、例えば、全ゲノム増幅法を含み、限定はされないが、多置換増幅（ＭＤＡ）、多重アニーリングおよびループ化による増幅（ＭＡＬＢＡＣ）、アダプターのライゲーション、続いてＰＣＲに基づく方法（例えばＳｕｒｅＰｌｅｘ、ＰｉｃｏＰｌｅｘ、ＧｅｎｏｍｅＰｌｅｘ）、縮重オリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲ（ＤＯＰ−ＰＣＲ）、マルチプレックスＰＣＲが挙げられる。

胚（およびこのように、胚から得られたＤＮＡ試料）は任意の哺乳類胚とすることができる。哺乳類の非限定的な例としては、例えば、ヒト、非ヒト霊長類（例えば類人猿およびサル）、ウシ、ウマ、ヒツジ、ラット、マウス、ブタ、およびヤギが挙げられる。いくつかの実施形態では、試料は、ヒト胚から得ることができる。

本明細書で提供される方法は、本明細書で記載されるように、胚から得られたＤＮＡ試料中のｍｔＤＮＡの量を決定することを含むことができる。胚から得られたＤＮＡ試料中のｍｔＤＮＡの量は、定量的ＰＣＲ（例えば、リアルタイムＰＣＲ）により決定することができる。例えば、胚から得られたＤＮＡ試料中のｍｔＤＮＡの量を決定することは、本明細書で記載されるように、プライマー（例えば、配列番号：２−３）および、任意で、プローブ（例えば、配列番号：４）を使用して、１６ＳＲＮＡを転写するｍｔＤＮＡ配列の量を決定することを含むことができる。例えば、胚から得られたＤＮＡ試料中のｍｔＤＮＡの量を決定することは、本明細書で記載されるように、プライマー（例えば、配列番号：８−９）および、任意で、プローブ（例えば、配列番号：１０）を使用して、ＭＴ−ＮＤ４をコードするｍｔＤＮＡ配列の量を決定することを含むことができる。

本明細書で提供される方法は、本明細書で記載されるように、胚から得られたＤＮＡ試料中の基準ＤＮＡの量を決定することを含むことができる。胚から得られたＤＮＡ試料中の基準ＤＮＡの量は、定量的ＰＣＲ（例えば、リアルタイムＰＣＲ）により決定することができる。例えば、胚から得られたＤＮＡ試料中の基準ＤＮＡの量を決定することは、プライマーおよび任意でプローブを使用して基準ＤＮＡ中のある配列の量を決定すること、例えば、本明細書で記載されるように、プライマー（例えば、配列番号５−６）および、任意で、プローブ（例えば、配列番号：７）を使用してＡｌｕ配列の量を決定することを含むことができる。

キット
本明細書で記載される方法を実施するのに有用なキットもまた、本明細書で提供される。いくつかの態様では、本明細書で提供されるキットは、第１のミトコンドリアＤＮＡ配列に対するものである第１の合成オリゴヌクレオチドプライマー対および基準染色体遺伝子配列ＤＮＡに対するものである第２の合成オリゴヌクレオチドプライマー対を含む。

第１の合成オリゴヌクレオチドプライマー対は、本明細書で記載されるミトコンドリアＤＮＡ配列（例えば、１２ＳＲＮＡをコードするミトコンドリアＤＮＡ配列、１６ＳＲＮＡをコードするミトコンドリアＤＮＡ配列、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット１（ＭＴ−ＮＤ１）をコードするミトコンドリアＤＮＡ配列、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット２（ＭＴ−ＮＤ２）をコードするミトコンドリアＤＮＡ配列、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット３（ＭＴ−ＮＤ３）をコードするミトコンドリアＤＮＡ配列、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット４（ＭＴ−ＮＤ４）をコードするミトコンドリアＤＮＡ配列、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット５（ＭＴ−ＮＤ５）をコードするミトコンドリアＤＮＡ配列、チトクロムｂ、ミトコンドリアチトクロムｃオキシダーゼサブユニット１、２または３をコードするミトコンドリアＤＮＡ配列、ＡＴＰシンターゼをコードするミトコンドリアＤＮＡ配列）に対するものとすることができる。いくつかの実施形態では、キットは、１６ＳＲＮＡ遺伝子配列をコードするミトコンドリアＤＮＡ配列に対するものである合成オリゴヌクレオチドプライマー対および、任意で、１６ＳＲＮＡをコードするミトコンドリアＤＮＡ配列に対するものであるプローブを含む。いくつかの実施形態では、キットは、ＮＡＤＨ−ユビキノンオキシドレダクターゼ鎖４（ＭＴ−ＮＤ４）をコードするミトコンドリアＤＮＡ配列に対するものである合成オリゴヌクレオチドプライマー対および、任意で、ＭＴ−ＮＤ４をコードするミトコンドリアＤＮＡ配列に対するものであるプローブを含む。

基準合成オリゴヌクレオチドプライマー対は、Ａｌｕ配列、Ｌ１配列、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、またはβ−アクチン（ＡｃｔＢ）、アルブミン、β−グロビンまたは１８ＳｒＲＮＡに対するものとすることができる。いくつかの実施形態では、基準ＤＮＡはヒト核ゲノムにおけるマルチコピー配列とすることができる（例えばＡｌｕまたはＬ１）。いくつかの実施形態では、キットはＡｌｕ配列に対するものである合成オリゴヌクレオチドプライマー対および、任意で、Ａｌｕ配列に対するものであるプローブを含む。

発明のキットは様々な形態をとることができる。典型的には、キットは、試料中のＤＮＡの存在を決定する、またはこれを定量するのに好適な試薬を含む。任意で、キットは、１つ以上の対照試料を含み得る。また、キットは、場合によっては、基準（例えば、所定の値）を提供する書面情報（証拠）を含み、ここで、胚中の核酸レベルと基準（所定の値）との間の比較は、臨床状態を示す。

場合によっては、キットは、ＤＮＡレベルまたは発生率を基準（例えば、予測モデル）と比較するのに有用なソフトウェアを含む。通常、ソフトウェアはコンピュータ可読フォーマット、例えばコンパクトディスクで提供されるが、これはまた、インターネット経由でダウンロードして使用可能であってもよい。しかしながら、キットはそのように制限されず、他の変形が当業者に明らかであろう。本方法はまた、遺伝子セットの発現レベル（例えば、本明細書で開示されるもの）に基づいて、被験体のための治療を選択する、および／または治療計画を決定するために使用することができる。

基準レベルは、好適なデータ記憶媒体（例えば、データベース）に保存され得、よって、これはまた、将来の診断のために使用可能である。これにより、効率的に分析が可能になる。というのも、好適な基準結果は、対応する基準試料が得られた被験体はうまく着床したことが確認された（将来）時点で、データベースにおいて識別することができるからである。本明細書では、「データベース」は、好適な記憶媒体上の収集されたデータ（例えば、分析物および／または基準レベル情報および／または患者情報）を含む。その上、データベースは、データベース管理システムをさらに含み得る。データベース管理システムは、好ましくは、ネットワーク形、階層的またはオブジェクト指向データベース管理システムである。より好ましくは、データベースは、分散（連邦型）システム、例えばクライアントサーバシステムとして実行されるであろう。より好ましくは、データベースは、探索アルゴリズムに、試験データセットをデータコレクションにより構成されるデータセットと比較させるように構成される。特定的には、そのようなアルゴリズムを使用することにより、データベースは、ｍｔＤＮＡレベルを示す同様または同一のデータセットについて探索され得る。よって、同一または同様のデータセットがデータコレクションにおいて識別することができる場合、試験データセットは着床の可能性と関連するであろう。その結果として、データコレクションから得られた情報は、基準胚試料から得られた試験データセット基づいて胚着床の可能性を予測するために使用することができる。

発明はさらに、アッセイ結果または診断またはその両方の、技術者、例えば医師または患者への連絡を提供する。ある一定の実施形態では、コンピュータが、アッセイ結果または診断またはその両方を利害関係者、例えば、医師および彼等の患者に連絡するために使用される。

本明細書で提供されるキットはまた、標準ＰＣＲ試薬を含むことができる。ＰＣＲ試薬は当業者に知られており、例えば、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼまたはＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼなどの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ）、バッファー、例えばＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ＴＥ）バッファー、および／またはヌクレアーゼフリー水を含むことができる。

本明細書で提供されるキットはまた、陽性対照および／または陰性対照を含むことができる。場合によっては、陽性および／または陰性対照は増幅アッセイのための品質管理を提供することができる。例えば、陽性対照は、増幅される配列を有することがわかっているＤＮＡ試料（例えば、精製ベクター）とすることができ、プライマーおよび／またはプローブが適正に働くことを確認するために使用することができ；ならびに、陰性対照は、増幅のための全てのテンプレートを欠く試料とすることができる（例えば、ヌクレアーゼフリー水）。場合によっては、陽性および／または陰性対照は、公知の量的および／または質的情報を有するＤＮＡ配列を提供することができる。例えば、陽性対照は、着床することがわかっている胚から得られたＤＮＡ試料とすることができ；ならびに、陰性対照は着床しないことがわかっている胚から得られたＤＮＡ試料とすることができる。

本明細書で提供されるキット内の１つ以上の試薬は、パッケージングおよび輸送を容易にする形態で提供することができる。例えば、バッファーは濃縮形態（例えば、１０×バッファー）で提供することができ、プライマーおよび／またはプローブは凍結乾燥形態で提供することができる、などである。

キットは、任意の適切なパッケージングを含むことができる。例えば、冷蔵を必要とする試薬はアイスパックと共にパッケージングされ得る。例えば、凍結を必要とする試薬はドライアイスと共にパッケージングされ得る。

キットは、取扱説明書を含むことができる。

発明は下記実施例においてさらに記載される。これらの実施例は、特許請求の範囲において記載される発明の範囲を制限しない。

下記実施例は３７９の胚におけるｍｔＤＮＡの量の生物学的および臨床的関連性を調査する。胚をマイクロアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（ａＣＧＨ）、定量的ＰＣＲおよび次世代シーケンシング（ＮＧＳ）の組み合わせにより調査し、染色体状態についての情報、ｍｔＤＮＡの量、およびミトコンドリアゲノム中の突然変異の存在を提供した。

材料および方法
倫理声明
倫理的承認は、ＷｅｓｔｅｒｎＩＲＢ（２００６０６８０および２０１３１４７３）およびＮＨＳ健康研究機関（ＨｅａｌｔｈＲｅｓｅａｒｃｈＡｕｔｈｏｒｉｔｙ）（ＮＲＥＳ委員会南中央（ＣｏｍｍｉｔｔｅｅＳｏｕｔｈＣｅｎｔｒａｌ））から得られた。２つの型の胚性試料を評価した：卵割期胚由来の卵割球（卵母細胞の受精後３日）および胚盤胞由来のＴＥ細胞（受精後５−６日）。この研究に含まれる胚は全て、着床前遺伝的スクリーニング（ＰＧＳ）または着床前遺伝的診断（ＰＧＤ）のいずれかとの関連でそれらの染色体を分析するために、それらを生成したカップルの要求で生検を受けた。このために我々の研究室において使用される標準プロセスは、全ゲノム増幅（ＷＧＡ）続いてａＣＧＨを含んだ。この論文で記載される調査は、ＰＧＤまたはＰＧＳが完了した後、残った、過剰増幅ＤＮＡの分析のみを含んだ。胚はいずれの追加の介入にも供されず、患者の臨床治療は、この研究の結果として変化されなかった。廃棄される増幅ＤＮＡの分析についての患者の説明と同意は認可されたプロトコル下で得られた（以上を参照されたい）。

患者および試料
過剰なＷＧＡ試料は、合計３４０の胚盤胞からのＴＥ生検由来とした（典型的には、５−１０の細胞から構成される）。胚盤胞は３８歳の平均女性年齢（２６−４２歳の範囲）の１６１のカップルから生成させた。単一の卵割球由来の過剰ＷＧＡ産物は合計３９の卵割期胚から得られた。これらの胚は３２のカップルにより生成された。この患者群の平均女性年齢は３７．４歳（年齢範囲２９−４２歳）であった。ＵＳＡおよびＵＫに位置するＩＶＦクリニックがこの調査に参加した。

胚サンプリングおよび細胞遺伝学的分析調製
染色体分析のための胚顕微操作、生検、および生検材料の調製は以前に記載される通りとした（Ｆｒａｇｏｕｌｉｅｔａｌ．，２０１３ＨｕｍＧｅｎｅｔ１３２：１００１−１０１３；Ｆｒａｇｏｕｌｉｅｔａｌ．，２０１１ＨｕｍＲｅｐｒｏｄ２６：４８０−４９０）。全ての試料をマイクロアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（ａＣＧＨ）のための単一の、非常に有効なプラットフォームを使用して分析した（Ｆｒａｇｏｕｌｉｅｔａｌ．，２０１１ＨｕｍＲｅｐｒｏｄ２６：４８０−４９０；Ｗｅｌｌｓｅｔａｌ．，２０１４ＪＭｅｄＧｅｎｅｔ５１：５５３−５６２；Ｍａｇｌｉｅｔａｌ．，２０１１ＨｕｍＲｅｐｒｏｄ２６：３１８１−３１８５；Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ−Ｍａｔｅｏｅｔａｌ．，２０１１ＦｅｒｔｉｌＳｔｅｒｉｌ９５：９５３−９５８；Ｃｈｒｉｓｔｏｐｉｋｏｕｅｔａｌ．，２０１３ＨｕｍＲｅｐｒｏｄ２８：１４２６−１４３４；Ｍｅｒｔｚａｎｉｄｏｕｅｔａｌ．，２０１３ＨｕｍＲｅｐｒｏｄ２８：１７１６−１７２４）。

マイクロアレイＣＧＨ
染色体分析を２４ＳｕｒｅＣｙｔｏｃｈｉｐＶ３マイクロアレイを用いて実施した（ＩｌｌｕｍｉｎａＬｔｄ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）。使用したプロトコルは、Ｆｒａｇｏｕｌｉｅｔａｌ．（２０１３ＨｕｍＧｅｎｅｔ１３２：１００１−１０１３）に記載される通りとした。手短に述べると、手順は細胞溶解およびＷＧＡを含んだ（ＳｕｒｅＰｌｅｘ，ＲｕｂｉｃｏｎＧｅｎｏｍｉｃｓ，ＡｎｎＡｒｂｏｒ，ＵＳＡ）。これに続いて、増幅ＤＮＡ試料、および２つの「基準」ＤＮＡ（４６，ＸＹ４６，ＸＸ）の蛍光標識、およびマイクロアレイへのハイブリダイゼーションとした。マイクロアレイを洗浄し、走査し（ＩｎｎｏＳｃａｎ７１０，Ｉｎｎｏｐｓｙｓ，Ｃａｒｂｏｎｎｅ，フランス）、得られた画像を、Ｂｌｕｅ−Ｆｕｓｅソフトウェアを用いて分析した（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）。このアプローチを用いて、卵割球またはＴＥ試料の染色体構成を決定することが可能であり、対応する胚の正常または異数体としての分類が可能になった。

ｍｔＤＮＡコピー数の相対定量化
ｍｔＤＮＡコピー数定量化は最初、胚性試料の蛍光リアルタイムＰＣＲ評価により実施された。これらは前に、上記で記載される細胞遺伝学的分析の一部としてＷＧＡを受けていた（ＳｕｒｅＰｌｅｘ、Ｒｕｂｉｃｏｎ、ＵＳＡ）。特注設計のＴａｑＭａｎアッセイ（ＡＡＴＴＴＡＡＣＴＧＴＴＡＧＴＣＣＡＡＡＧＡＧ（配列番号：４）；ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＫ）を使用して、特定のｍｔＤＮＡ断片（ミトコンドリア１６ｓリボソームＲＮＡ配列）を標的にし、増幅させた（Ｆｒｅｇｅｌｅｔａｌ．，２０１１ＦｏｒｅｎｓｉｃＳｃｉｅｎｃｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ：ＧｅｎｅｔｉｃｓＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔＳｅｒｉｅｓ３：ｅ３０３−ｅ３０４）。インプットＤＮＡの規準化はマルチコピーＡｌｕ配列を標的とする追加のＴａｑＭａｎアッセイを使用して実施した（ＹＢ８−ＡＬＵ−Ｓ６８）（ＡＧＣＴＡＣＴＣＧＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＣＡＧＧＡ（配列番号：７）；ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＫ）。核ＤＮＡ配列に対する規準化の目的は、技術的な問題（例えば、ＷＧＡの効率または生検標本内の細胞の数の差）に関するｍｔＤＮＡレベルのいずれの変動も調整することができること確保することであった。マルチコピー配列（すなわちＡｌｕ）はこのために選択した。というのも、シングルセルレベルでは、単一コピー配列では、アレルドロップアウト（ＡＤＯ）などの因子のために偽の結果が得られる可能性があるからである。各リアルタイムＰＣＲ実験は、全ての試料がこれと比較される基準ＤＮＡの分析を含んだ。基準ＤＮＡは核型的に正常な男性（４６，ＸＹ）卵割球またはＴＥ試料由来とし、ＳｕｒｅＰｌｅｘ方法を介して増幅させ（Ｒｕｂｉｃｏｎ、ＵＳＡ）、この研究の過程を通して一定に維持した。陰性対照（ヌクレアーゼフリーＨ２ＯおよびＰＣＲマスターミックス）もまた、両方のセットの増幅のために含有された。ｍｔＤＮＡおよびＡｌｕ配列の両方について三連増幅反応を設定した。各反応は１μｌの全ゲノム増幅（ＳｕｒｅＰｌｅｘ）胚性ＤＮＡ、８μｌのヌクレアーゼフリーＨ２Ｏ、１０μｌのＴａｑ−ＭａｎＵｎｉｖｅｒｓａｌマスターミックスＩＩ（２Ｘ）／ＵＮＧなし（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＫ）および１μｌの２０×Ｔａｑ−ＭａｎｍｔＤＮＡまたはＡｌｕアッセイ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＫ）を含み、総体積は２０μ１であった。使用したサーマルサイクラーはＳｔｅｐＯｎｅリアルタイムＰＣＲシステム（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＫ）であり、下記条件を使用した：５０℃で２分間のインキュベーション、９５℃で１０分間のインキュベーション、その後、９５℃で１５秒間および６０℃１分間の３０サイクル。

次世代シーケンシングによるミトコンドリアゲノム分析
様々なレベルのｍｔＤＮＡ（以前、リアルタイムＰＣＲにより確立）を有する、正倍数体ＴＥ試料由来の２３のＷＧＡ産物の群は、ＭｉＳｅｑおよびＨｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＵＳＡ）を使用する、超並列ＤＮＡシークエンシングを受けた。プロトコルは製造者により示唆された（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＵＳＡ）。ライブラリ調製は、ＺｙｍｏＤＮＡＣｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（ＺｙｍｏＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用したＳｕｒｅＰｌｅｘ増幅産物の初期精製、続いてＱｕｂｉｔｄｓＤＮＡＨＳアッセイキット（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）によるＤＮＡ濃度の定量化を含んだ。１ナノグラムのＤＮＡをその後、デュアルインデックスシーケンシングライブラリに、製造者のプロトコル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＵＳＡ）に従い、ＮｅｘｔｅｒａＸＴＤＮＡ試料調製およびＩｎｄｅｘキットを使用して変換した。

ライブラリは、２×１５０サイクルでデュアルインデクシングを用いてＩｌｌｕｍｉｎａＭｉＳｅｑ上でＭｉＳｅｑ試薬キットｖ３を用いて、または２×１００サイクルでデュアルインデクシングを用いてＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑ２０００上で、それぞれ、フローセルクラスタリングおよびシーケンシングのために、ＴｒｕＳｅｑＰＥクラスターキットｖ３−ｃＢｏｔ−ＨＳおよびＴｒｕＳｅｑＳＢＳキットｖ３−ＨＳを用いて、配列決定された（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＵＳＡ）。

読み取りデータをヒトゲノムｈｇ１９に対して、ｂｗａ（Ｌｉｅｔａｌ．，２００９Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ２５：１７５４−１７６０）またはｉＳＡＡＣ（Ｒａｃｚｙｅｔａｌ．，２０１３Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ２９：２０４１−２０４３）を用いて、それぞれ、ＭｉＳｅｑおよびＨｉＳｅｑシーケンシング実行のためにアライメントさせた。アラインメント後、マップされていない読み取りデータ、重複読み取りデータ、マッピングスコアが低い読み取りデータおよび基準ゲノムとの１を超えるミスマッチを有する読み取りデータをＢＥＤｔｏｏｌｓ（Ｑｕｉｎｌａｎｅｔａｌ．，２０１０Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ２６：８４１−８４２）およびＳＡＭｔｏｏｌｓ（Ｌｉｅｔａｌ．，２００９Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ２５：２０７８−２０７９）を用いて除去した。基準ゲノムを非オーバーラップビンに分け、よって、各ビンは、ゲノムにわたって１００の一意的にマッピングされる３６マーを含み（Ｂａｓｌａｎｅｔａｌ．，２０１２ＮａｔＰｒｏｔｏｃ７：１０２４−１０４１）、各ビンにマッピングされた読み取りデータをカウントした。バイアスを除去するために、ビンリードカウントをＧＣ含量およびインシリコ基準データセットに基づいて規準化した。コピー数／ビンを式に従い、計算した：
ここで、メジアン常染色体性リードカウントはコピー数２に対応することが予測される。１３−ビンスライディングメジアンを使用して、各染色体についてビン様コピー数値を平滑化した。各染色体についてのコピー数状態を染色体にわたる平滑化コピー数値のメジアンから誘導した。

アラインメント後、ゲノムＣｏｖｅｒａｇｅＢｅｄファイルをＢＥＤＴｏｏｌｓを用いて作製し、および核ゲノムに関してミトコンドリアゲノムにアラインメントさせた配列決定済み総塩基の割合を計算した。ＳＡＭｔｏｏｌｓを使用して、ミトコンドリア読み取りデータをＢＡＭファイルから抽出し、オンラインツールＭｉｔｏＢａｍＡｎｎｏｔａｔｏｒを用いて分析した（Ｚｈｉｄｋｏｖｅｔａｌ．，２０１１Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ１１：９２４−９２８）。

ＮＧＳによるｍｔＤＮＡ定量化
追加の３８のＴＥ試料は染色体構成評価およびｍｔＤＮＡ定量化を実施するために、ＮＧＳ分析を受けた。ＰＧＭの適用を含む（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＫ）、異なる型のＮＧＳ技術をこれらの３８のＴＥ試料の分析のために使用した。このために、多置換増幅（ＭＤＡ）の使用を含む異なる初期ＷＧＡアプローチを採用した。簡単に言うと、３８全てのＴＥ試料を、２．５μ１のアルカリ性溶解バッファー（０．７５μｌのＰＣＲグレード水［Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ］；１．２５μｌのＤＴＴ［０．ｌＭ］［Ｓｉｇｍａ、ＵＫ］；０．５μｌのＮａＯＨ［１．０Ｍ］［Ｓｉｇｍａ、ＵＫ］）を添加し、その後、これらを１０分間６５℃でサーマルサイクラーにてインキュベートすることにより溶解させた。ＭＤＡ全ゲノム増幅を、製造者により示唆されるように、Ｒｅｐｌｉ−ｇＭｉｄｉ反応キット（Ｑｉａｇｅｎ、ＵＫ）の使用により、実施した。全ての試料を、サーマルサイクラーにおいて３０℃で１２０分間、６５℃でさらに５分間インキュベートした。使用したＮＧＳ手順は、例えば、Ｗｅｌｌｓｅｔａｌ．（２０１４ＪＭｅｄＧｅｎｅｔ５１：５５３−５６２）において記載される。

統計解析
基準および試験試料の両方についての、Ａｌｕ配列に関してのｍｔＤＮＡの相対量を、式２−デルタデルタＣｔにより決定した。基準および試験試料についてのデルタＣｔはデータ規準化プロセスの最終結果であった。これは、基準および試験座位についてのデルタＣｔの計算（Ｃｔ−ｍｔＤＮＡ−Ｃｔ−Ａｌｕ）、および基準ＤＮＡ試料に関しての試験試料値の調整（デルタＣｔ＋規準化因子）を含んだ（Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎｅｔａｌ．，２００８ＮａｔＰｒｏｔｏｃ３：１１０１−１１０８）。最終ｍｔＤＮＡ値の統計解析は独立両側ｔ検定を使用した。この研究中に比較したパラメータは女性の年齢（より若い対より年老いた）、胚染色体状態（正常対異数体）、および胚生存率／着床の可能性（進行中の妊娠対着床失敗）を含んだ。

ＮＧＳを使用したｍｔＤＮＡの相対定量化は、読み取りデータの総数の割合としての、ミトコンドリアゲノムに起因するＤＮＡ配列読み取りデータの数の決定を含んだ。配列決定されたＤＮＡ断片の大半は核ゲノム由来であり、生検標本中の細胞の数に対する対照を提供する。

実施例１：胚性試料の細胞遺伝学的分析
合計３９の卵割期胚および３４０の胚盤胞（細胞遺伝学的に試験されている）を、この調査の過程中に研究した。卵割期胚の全てを、マイクロアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（ａＣＧＨ）分析後に染色体的に正常であると特徴付け、子宮に移植した。調査した胚盤胞のうち、３０２を、ａＣＧＨを用いて、３８を次世代シーケンシング（ＮＧＳ）法を用いて分析した。これらのうち、１２３を、異数体であると決定し（９９はａＣＧＨ分析により、２４はＮＧＳ分析による）、一方、残りの２１７を染色体的に正常であると特徴付けた（２０３はａＣＧＨ分析により、１４はＮＧＳ分析による）。１３１の正常胚盤胞および３９の正倍数体卵割期胚は全て、子宮移植を受けた。染色体的に正常または異数体としての胚分類は、単一卵割球（卵割期）、または５−１０のＴＥ細胞（胚盤胞）のいずれかのａＣＧＨまたはＮＧＳ分析後に得られた結果に基づいた。

実施例２：ｍｔＤＮＡ量に対する女性の年齢の効果
ｍｔＤＮＡの相対量を、女性の年齢に関して評価した。特定的には、生殖的に若い群の女性（平均年齢３４．８歳、範囲２６−３７歳）により生成された１４８の胚盤胞および生殖的に年老いた群（平均年齢３９．８歳、範囲３８−４２歳）により生成された１５４の胚盤胞の初期比較を、リアルタイムＰＣＲの使用により実施した。データ分析により、生殖的に年老いた女性由来の胚盤胞におけるｍｔＤＮＡの量の統計的に有意な増加（Ｐ＝０．００３）が明らかに示された。この現象は全ての胚盤胞を一緒に考慮した場合に明らかとなったが、染色体的に正常な、および異常な胚を別々に考慮した場合にも明らかであった（それぞれ、Ｐ＝０．０１８およびＰ＝０．０５）。調査中の女性の年齢群についての染色体的に正常および異常な胚盤胞中のｍｔＤＮＡの相対量は、表１にまとめて示され、図２ａに図示される。

女性の年齢によるｍｔＤＮＡのレベルの有意な差（Ｐ＝０．０１）はまた、卵割期でも観察された。しかしながら、胚盤胞期とは異なり、生殖的に若い女性（平均年齢３３．７歳、範囲２９−３７歳）から生成された胚から取り出された卵割球は、生殖的に年老いた女性（平均年齢３９．２歳、範囲３８−４２歳）により生成された胚から取り出されたものと比較して、より高いｍｔＤＮＡ量を含むことが示された。これらの結果は、図２ｂおよび表２に示される。

実施例３：胚染色体構成とｍｔＤＮＡ量の間の関係
染色体異常は胚発生の最初期段階中極めて一般的であり、着床後その率が減少する（Ｆｒａｇｏｕｌｉｅｔａｌ．，２０１３ＨｕｍＧｅｎｅｔ１３２：１００１−１０１３）。染色体状態に関するｍｔＤＮＡ量のリアルタイムＰＣＲ評価を、合計２０３の正常、および９９の異数体胚盤胞期胚について実施した。これらの胚全て由来のＴＥ試料をａＣＧＨを使用して評価した。染色体的に異常な胚盤胞は、正倍数体であると特徴付けられたものと比較して著しく大量のｍｔＤＮＡを含む傾向があることが明らかになった（Ｐ＝０．０２５）（図２ｃ）。

関連しない方法を使用してこれらの結果を確認するために、発明者らは異なる型の全ゲノム増幅（ＷＧＡ）方法、続いてＮＧＳを３８の追加の胚盤胞由来のＴＥ生検に適用した。ＮＧＳ技術の利点は、核およびミトコンドリアゲノムを同時に調査するその能力である。ＮＧＳ分析は、胚盤胞のうちの１４は正倍数体であり、一方、染色体異常が残りの２４についてスコアリングされたことを証明した。この所見は、各ＷＧＡ産物の別個のアリコートを使用して実施されたａＣＧＨにより確認された。リアルタイムＰＣＲ結果のように、ＮＧＳデータの統計解析は、染色体的に正常であるものと比べて、異数体胚盤胞において、ｍｔＤＮＡの量の著しい増加を示した（Ｐ＝０．００６）。これにより、リアルタイムＰＣＲ所見の独自の確認が提供された。ＮＧＳｍｔＤＮＡデータが図３に示される。

ｍｔＤＮＡ量は女性の加齢と共に増加するが、異数性との関係は独立因子であると考えられることに注意すべきである。任意の所定の年齢群では、染色体的に異常である胚盤胞では、ｍｔＤＮＡレベルが、平均して、より高くなった（表１）。

実施例４：ｍｔＤＮＡコピー数および臨床的妊娠を確立する胚盤胞の能力
ｍｔＤＮＡ含量が着床し、妊娠を開始する胚の能力へ影響したかどうかを評価するために、発明者らは、着床ありまたはなしの単一胚移植（ＳＥＴ）、または二卵性双生児または着床なしのいずれかが得られる二胚移植（ＤＥＴ）から得られたデータを遡及的に分析した。特定的には、発明者らは８９の胚盤胞のｍｔＤＮＡ含量を調査し、そのうちの８１をＳＥＴで移植し、残りの８をＤＥＴで移植した。８５人の患者が、研究のこの部分に含まれ、平均女性年齢は３８．３歳であった。これらの患者に移植された胚盤胞のうち、４２は進行中の臨床的妊娠を確立し、一方、残りの４７は着床に失敗した。

リアルタイムＰＣＲ分析により、着床できる胚盤胞は臨床的妊娠を開始することができないものと比べて、著しく低い量のｍｔＤＮＡを含んだことが明確に示された（Ｐ＝０．００７）。これらの結果は、図４にまとめて示される。

着床および非着床胚盤胞から得られたリアルタイムＰＣＲデータの分析により、これを超えると、着床が起こるのが決して見られないｍｔＤＮＡ量閾値の確立が可能になった。特定的には、臨床的妊娠にいたった４２／４２（１００％）胚盤胞は０．００３より低い相対ｍｔＤＮＡ量を含んだ。加えて、０．００３より高いｍｔＤＮＡ量を有する１４／１４（１００％）の胚は着床できなかった。これらは３０％（４７のうちの１４）の非着床胚盤胞を表し、一方、残りの７０％（４７のうちの３３）は閾値より低いｍｔＤＮＡの量を含んだ（図５Ａ）。０．００３の同定したｍｔＤＮＡ量着床閾値は胚盤胞形態、年齢および胚を作製したＩＶＦクリニックに依存しなかったことは注目すべきである。

上昇したｍｔＤＮＡレベルと着床失敗の間の関係をさらに評価するために、我々は２３のＴＥ試料を、ＮＧＳを使用して分析した。全ての胚が正倍数体であり、以前に、リアルタイムＰＣＲにより分析されていた。移植後の臨床結果は、対応する胚盤胞のうちの２１についてはわかっていた。これらのうちの７は妊娠に至り、一方、残りの１４は、着床に失敗した。着床しなかった１４の胚のうち、リアルタイムＰＣＲで、９が０．００３より高いｍｔＤＮＡ量を含んでいたことを明らかにした。ＮＧＳ分析によりリアルタイムＰＣＲの所見を確認し、生存可能であることが示されたものと比べて、非着床胚の増加したｍｔＤＮＡの量が明確に示された。上昇したｍｔＤＮＡ量は、臨床結果がわかっていないＴＥ試料の追加の３つでも観察された。これらの結果は、図５Ｃおよび表３に示される。

実施例５：ｍｔＤＮＡ定量化に基づくＩＶＦ結果の盲検プロスペクティブ予測
レトロスペクティブデータ分析に基づく、胚盤胞におけるｍｔＤＮＡレベルについての生存率閾値の確立後に、発明者らは、その適中度(predictive value)を評価するために、盲検プロスペクティブ研究を実施した。ｍｔＤＮＡの定量化を、染色体（ａＣＧＨ）および形態学的分析後の子宮への移植のために選択された、合計４２の正倍数体胚盤胞由来のＴＥ生検において実施した。これらの胚を生成させた女性の平均年齢は３６．７歳（年齢範囲２６−４２歳）であり、カップルを６つの異なるＩＶＦクリニックにおいて処置した。１５の胚が０．００３閾値を超えるｍｔＤＮＡレベルを有することを示し、よって、生存可能な妊娠の確立の失敗と関連すると予測された（図５Ｂ）。数週間後の生化学および超音波データの再考察により、これらの胚移植はいずれも生存可能な妊娠とはならなかったことが確認された。よって、ｍｔＤＮＡ分析の陰性適中度は１００％であった。残りの２７の胚は０．００３より低いｍｔＤＮＡ量を有し、よって、子供を生成させるいくらかの可能性を有することが予測された。盲検結果の解読後、これらの胚のうち１６が最終的に、生存可能な臨床的妊娠を確立させたことが見出された。よって、ｍｔＤＮＡ分析により潜在的に生存可能と分類された胚の５９％が、進行中の臨床的妊娠を生成させた。これは、ｍｔＤＮＡ結果に関係なく移植された、胚のこのコホートについて達成された３８％（１６／４２）の妊娠率と対照的である。これらの結果により、高いｍｔＤＮＡ量を有する胚は、臨床的妊娠を形成することができないという我々の前の所見がさらに確認された。その上、ｍｔＤＮＡ定量化が、正倍数体胚の中からの選択を補助する有効なバイオマーカーとして使用され得ることが証明された。

実施例６：非着床胚におけるｍｔＤＮＡのレベルの上昇の起源
非着床胚盤胞において見られる過剰なｍｔＤＮＡの起源が胚性であるのか、または卵母細胞に由来するのかを明らかにしようとして、発明者らは、３９の卵割期胚から取り出した卵割球中のｍｔＤＮＡ量を調査した。ミトコンドリアＤＮＡ複製は、胚盤胞期まで起こらないと考え、そのため、初期の発生段階で検出されるｍｔＤＮＡのレベルは、卵母細胞中のそれを反映すると予想される。研究のこの部分で検討される卵割期胚は全て、卵割球ａＣＧＨ分析後正倍数体として特徴付けられており、子宮に移植された。臨床結果に関する限り、１７の胚は着床することができ、臨床的妊娠に至ったが、一方、残りの２２は着床しなかった。

ＴＥ試料と比べて、卵割球はずっと高いレベルのｍｔＤＮＡを含んだことが明らかになった。これは、ＴＥ生検と比べて卵割球のずっと大きな細胞質体積を考慮すれば、予想外の所見ではなかった。

この分析中に得られたデータの評価により、着床に失敗した胚由来のものと比較した、着床した胚由来の卵割球中のｍｔＤＮＡの量では、有意の差はなかったことが示された（Ｐ＝０．７）。よって、生育不能な胚盤胞のサブセット由来の細胞中で見られたｍｔＤＮＡ含量の増加は卵割期後に生じるに違いないと結論付けた。この結論は、ミトコンドリアゲノム複製の第１の重要な波は、胚細胞のＴＥおよび内部細胞塊への分化が開始された後に始まるという考えに対応する。

実施例７：ミトコンドリアゲノム分析
ｍｔＤＮＡレベルの変化についての１つの可能性のある理由は、鍵遺伝子に突然変異を有する欠陥小器官の存在に対する代償応答としてのミトコンドリアの増殖とすることができる。この可能性を探索するために、ＮＧＳを使用して、２３のＴＥ試料の全ミトコンドリアゲノムを配列決定した。試料を染色体的に正常な胚盤胞由来として、そのうちの９が上昇した量のｍｔＤＮＡを有し（リアルタイムＰＣＲを使用して最初に決定された）、１４は、正常範囲のｍｔＤＮＡレベルを有した（表３）。ミトコンドリアゲノムを約１５０の読み取りデータの平均深さまで配列決定し、突然変異検出およびヘテロプラスミー度の推定が可能になった。突然変異は、通常ヘテロプラズミック形態にあり、全ての試料である程度見られたが、より低い量のｍｔＤＮＡを有する胚と同じく、高いｍｔＤＮＡレベルを有する胚盤胞で蔓延していなかった。

考察
女性生殖年齢と関連させて、ヒトミトコンドリアおよびｍｔＤＮＡを調査する前の研究は、胚ではなく卵母細胞の分析に焦点を当ててきた。公開された結果は完全には一致していなかったが、ほとんどが、ｍｔＤＮＡレベルは、加齢と共に、不変のままであるかたまたは減少することを報告している［１６、２１−２２］。年齢と共に卵母細胞ミトコンドリアの数が低減することもまた、より年老いたマウスにおいて報告されている［２３］。他の調査により、卵母細胞ｍｔＤＮＡコピー数の減衰は、卵巣病理と関連し得ることが示された［１、２４］。現研究中、ｍｔＤＮＡ量の著しい（Ｐ＝０．０１）減衰が、より若い患者由来のものと比べて、生殖的に年老いた女性により生成された卵割期胚由来の細胞において観察された。ｍｔＤＮＡ複製の主な波が胚盤胞形成後に開始することを考慮すると［３、８］、初期の着床前段階でのこれらの観察結果は、対応する卵母細胞中に存在したｍｔＤＮＡの量を表す可能性がある。よって、我々のデータは、卵母細胞ｍｔＤＮＡレベルは女性の加齢と共に減少するという見解を支持する。

興味深いことに、卵割期後ちょうど２日のヒト胚盤胞由来の標本の分析により、反対方向の傾向が明らかになり、ｍｔＤＮＡレベルは女性の加齢と共に著しく増加した。この関係は正倍数体および異数体胚盤胞の両方について明らかであった。観察されたｍｔＤＮＡの量の上昇はミトコンドリアの数の増加を示す可能性があるが、２つの因子の間の関係は、単一小器官は、ミトコンドリアゲノムの１を超えるコピーを含み得るという事実により複雑になる。

生存胚を生成する卵母細胞の可能性は、母親の年齢と逆相関することがよく確立されている。これはより年老いた患者についての彼女ら自身の卵母細胞を使用したＩＶＦ治療の成功率が、より若い女性により提供された配偶子を用いる患者と比べて著しく異なることにより明確に証明されている。現研究中の胚盤胞期で見られる、年齢に伴うｍｔＤＮＡの増加は、ミトコンドリアが年齢に伴う女性妊娠促進の減衰において直接的な役割を果たすかどうかという質問を引き起こす。

上昇したｍｔＤＮＡレベルは、機能が低減した不全小器官の数の増大に直面したＡＴＰ産生の規準化を目的とする代償メカニズムの結果であると考えられる。実際、動物モデルから得られたデータは、「より年老いた」ミトコンドリアの完全性の減衰およびその結果としてのＡＴＰ産生の効率の低下を示唆する［２４、２５］。より年老いたハムスターおよびマウスの卵母細胞中のミトコンドリアは、より高いレベルの活性酸素種（ＲＯＳ）を発生させ、より少ないＡＴＰを産生することが示されており、よって、着床前発生などの動的プロセスを十分に支持する能力が低減している可能性がある［２６］。同様の状況がヒトにおいて存在する場合、十分なＡＴＰレベルを維持するために、ミトコンドリア数の増加が、年老いた女性の胚では必要となる可能性がある。

年齢に伴うＡＴＰ合成能力の減衰は、ミトコンドリアゲノムにおける突然変異の蓄積に関連する可能性がある。突然変異に応じたヒト着床前胚のｍｔＤＮＡ含量の増加は前に実証されている［２７］。呼吸鎖により生成されるＲＯＳにごく接近するｍｔＤＮＡの位置は、ヒストンの欠如および劣性のＤＮＡ修復メカニズムと相まって、突然変異に特に脆弱なミトコンドリアゲノムを残す［８、２４］。理論的には、卵母細胞が受精前卵巣に長く留まるほど、ｍｔＤＮＡ突然変異が起こる機会が多くなる。いくつかの研究により、精子への曝露後に受精に失敗した卵母細胞および発生停止を受けた胚におけるミトコンドリア遺伝子発現の低減が示されている。様々な組織における加齢と関連する、一般的なミトコンドリア４９７７ｂｐ欠失の発生率の増加もまた、ヒト卵母細胞において注目されてきた［２４、２８、２９］。しかしながら、今回の研究では、ＮＧＳを使用する全ミトコンドリアゲノムのシーケンシングは、高いｍｔＤＮＡレベルを有する胚において、突然変異荷重の明らかな増加を検出することはできなかった。この所見は、ミトコンドリア突然変異が、年老いた女性由来の胚において小器官の複製を駆動している可能性と相反する。

高いｍｔＤＮＡレベルは実際には、損なわれたミトコンドリアを示す可能性があるが、根底にある欠陥は、ＤＮＡ配列の変化に関連しない。あるいは、上昇したｍｔＤＮＡの量は、最適以下の機能の小器官と比べ、増加した胚の代謝要求と関連する可能性がある。より年老いた卵母細胞により生成された胚は何らかの形態のストレス下にあり、よって、より大きなエネルギー要求を有する可能性がある。これらの質問に対処するために、機能実験が必要とされる。根底にある基礎が何であろうと、現研究は、女性生殖年齢は胚盤胞期でのｍｔＤＮＡ含量の変化と関連することを明白に証明した。

異数性は、全てのヒト着床前胚の過半数に影響を与え、初期胎児死亡の最も重要な原因であると考えられる［１８］。染色体異常の大半は卵形成（減数分裂、女性起源）中に起こるエラー由来であるが、染色体誤分離もまた、受精後の最初の数回の胚細胞分裂（有糸分裂）中に一般的である。それらの頻度および臨床的重要性にも関わらず、高レベルの減数分裂および有糸分裂エラーについての理由は依然として完全には理解されていない。

ｍｔＤＮＡ定量化を受けるのと同様に、この研究中に分析される全ての胚は前に、ルーチンＰＧＤまたはＰＧＳの一部として、有効な包括的染色体スクリーニング法を用いて、異数性について試験された［３０、３１］。生成された細胞遺伝学的（ａＣＧＨ）およびミトコンドリア（リアルタイムＰＣＲ）データの比較により、平均して、異数体胚盤胞由来の生検標本は、正倍数体である胚由来の試料よりも著しく大きな量のｍｔＤＮＡを含んだ（Ｐ＝０．０２５）ことが証明された。これらの所見を、胚の独立した群を評価する別の方法（ＮＧＳ）を用いて確認した。重要なことには、染色体的に異常な胚において見られるｍｔＤＮＡコピー数の上昇は女性の年齢との関連に対して付加的であり、そのため、異数体胚盤胞は同じ年齢の女性由来の染色体的に正常な胚と比べて、より高いレベルのｍｔＤＮＡを有する傾向があった。

ｍｔＤＮＡ／ミトコンドリアの量または機能性の変動は、染色体分離の正確さに直接影響する可能性があることは妥当である。ＡＴＰおよびピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体を含むミトコンドリア代謝因子は正確な卵母細胞紡錘体形成および染色体アラインメントにとって必須である［３２−３４］。さらに、糖尿病マウス由来の卵母細胞の検査により、損傷したミトコンドリアは異数性と関連することが証明された。ミトコンドリアは細胞分裂中に紡錘体および微小管形成中心に再分配され［３５］、おそらく紡錘体形成および染色体移動のエネルギー要求が確実に満たされることが知られている。卵母細胞内のミトコンドリア分布と減数分裂紡錘体上での染色体整列との間の関係は提案されている［３６］。さらに、受精後の有糸分裂中に起こるエラーの結果である、高レベルの染色体モザイク現象を有する胚は、低膜電位を有するミトコンドリアを頻繁に含むことが示されている［３７］。

ｍｔＤＮＡの量の増加を有する胚における異数性が、小器官に影響する、ＡＴＰ産生または他の主要な機能を妨害する欠陥の直接の結果であるかどうか、あるいは、変化したミトコンドリア数および異数性が、現在のところ規定されておらず、胚または卵母細胞に影響する別の問題の独立した、下流の結果であるかどうかは、この時点では不明確である。年齢と関連するｍｔＤＮＡの量の増加および異数性は胚盤胞においてのみ見られるが、増大の引き金は受精前の卵母細胞中にすでに存在し得ることに注目することが重要である。胚盤胞で観察される異数体のほとんどが、女性減数分裂中に起こるエラーの結果であり［３０、３８］、卵母細胞において減数分裂異数性を起こしやすくする因子はまた、その後の胚期中のｍｔＤＮＡ複製に影響することが示唆される。

ｍｔＤＮＡおよび胚盤胞着床の可能性
生殖補助治療の効率を改善するために、生存胚の識別のための優れた方法が緊急に必要とされる。子宮への移植前の染色体異常についての胚のスクリーニングにより、胚性不全（すなわち異数性）の主因が回避される。しかしながら、加えて、生検細胞の分析後に染色体的に正常と考えられる形態学的に「完全な」胚の移植であっても、成功した妊娠の開始を保証することはできない（そのような胚の約３分の２のみが実際に子を産み出す）。追加の要素が胚生存率において役割を果たすことが明らかである。重要な因子はおそらくミトコンドリア数／容量ならびにＡＴＰ量および／または代謝活性に対する付随効果を含む［１７］。この調査の一部として、ｍｔＤＮＡのレベルを遡及的に、ＰＧＤまたはＰＧＳ後に子宮に移植し、臨床結果がわかっている、正倍数卵割および胚盤胞期胚において評価した。

生検細胞において観察されるｍｔＤＮＡのレベルは、移植後に着床に失敗したものと比べて、臨床的妊娠を確立することができる胚盤胞において、平均して低かった（Ｐ＝０．００７）。この関係は最初、定量的ＰＣＲを用いて識別されたが、その後、ＮＧＳを用いて確認された。ｍｔＤＮＡ量と妊娠をもたらす能力との間の関係は発生の胚盤胞期で取られた胚試料においてのみ明確に観察された。胚生存率の損失と関連するｍｔＤＮＡ含量の増加は、年齢または異数性と関連するものよりも劇的であった。

ｍｔＤＮＡ含量データの分析により、これを超えると、染色体的に正常な胚盤胞の着床が決して観察されない閾値の確立が可能になった。このカットオフは、胚形態または患者が治療を受けているクリニックなどの他の考慮事項に関係なく、有効なままであった。生育不能な胚盤胞のおよそ３分の１が閾値を超えるｍｔＤＮＡレベルを有し、この因子は、有病率および臨床的重要性の観点から、異数性に次いで第２位の致死的に損なわれた胚の指標を表すことが示唆された。ｍｔＤＮＡ測定の予知力を確認するために、独立した一連の胚盤胞を、プロスペクティブな様式で、盲検的に評価した。再度、閾値を超えるｍｔＤＮＡレベルを有する正倍数体胚盤胞は全て着床に失敗した（１００％）。正常範囲のｍｔＤＮＡの量を有するものは５９％着床率を表し、これは、全体としての群に対する３８％と対照的である。

卵割期胚についての、ｍｔＤＮＡレベルと着床の可能性の間の明確な関係を検出することができないことにより、生育不能な胚盤胞のサブセットにおいて見られる上昇したｍｔＤＮＡの量は、受精後第３日後に起こる増大の結果であることが示唆される。ｍｔＤＮＡ複製因子の発現の上方制御は胚盤胞期で起こることが知られており、これは、一般に、ｍｔＤＮＡ合成の第１の著しい波と一致すると考えられる［３］。これはまた、ｍｔＤＮＡレベルの過剰増加がいくつかの生育不能な胚で起こる時である可能性がある。

胚盤胞期での異常に高いレベルのｍｔＤＮＡは、エネルギー要求の上昇となる何らかの形態のストレスの症状を示し得る。この可能性はＬｅｅｓｅにより提案された「静かな胚仮説」と一致し、これにより、生存胚は比較的低いまたは「静かな」代謝を有し、一方、ストレス下の、低減した発生の可能性のものは、より代謝的に活性である傾向があることが示唆される［３９］。

高いｍｔＤＮＡ量を有する胚盤胞は、生存可能な妊娠をもたらすことができず、その大部分は３８歳以上の女性により作製されたことは注目すべきである。この観察結果は、女性の加齢との関連でｍｔＤＮＡの増加が観察されたことを考慮すると、驚くに値しない。女性の年齢と胚生存率の減少の間の関係は確立されており、主として、異数性のためであることが知られている［４０］。しかしながら、我々の所見により、ミトコンドリアは重要な付加的因子を表すことが示唆される。

要約
これらの結果により、ｍｔＤＮＡ量とヒト胚の子宮に着床する能力の間の明らかな関連が証明される。特定的には、上記で提供される結果により、ｍｔＤＮＡの量は、より年老いた女性由来の胚において著しく高かったことが示される（Ｐ＝０．００３）。加えて、ｍｔＤＮＡレベルは、年齢に関係なく、異数体胚において上昇した（Ｐ＝０．０２５）。正倍数体胚の子宮への移植後の臨床結果の評価により、うまく着床した胚盤胞は、着床に失敗したものより低いｍｔＤＮＡ量を含む傾向があることが明らかになった（Ｐ＝０．００７）。重要なことには、これを超えると着床が決して観察されない、ｍｔＤＮＡ量閾値が確立された。その後、この閾値の適中度が、独立した盲検プロスペクティブ研究において確認され、異常なｍｔＤＮＡレベルが、非着床正倍数体胚の３０％において存在するが、生存可能な妊娠を形成させる胚では見られないことが示される。ＮＧＳは、上昇したｍｔＤＮＡレベルを有する胚盤胞において、突然変異の増加を明らかにしなかった。この研究の結果により、ｍｔＤＮＡの増加は代謝の上昇と関連する可能性があり、低減した生存率と関連することが示唆される。重要なことには、所見により、女性生殖年齢におけるミトコンドリアの潜在的な役割および異数性の起源が示唆される。臨床的意義として、我々はｍｔＤＮＡ含量は、生存可能な妊娠をもたらすことができない染色体的に正常な胚盤胞を明らかにする、体外受精（ＩＶＦ）治療のための潜在価値を有する新規バイオマーカーを表すことを提案する。

これらの結果により、これを超えると着床失敗が１００％となったｍｔＤＮＡ閾値が確立される。得られたデータにより、ｍｔＤＮＡの上昇と関連する胚欠陥が、正倍数体と診断された胚盤胞に影響する着床失敗の３分の１までを説明することが示唆される。規定されるｍｔＤＮＡ閾値は、異なる不妊治療クリニックにより使用されるプロセスの変動により変化しないと考えられ、胚中のｍｔＤＮＡの評価は、簡単で、安価で広く適用可能な臨床試験の基礎を形成することができることが示される。

ｍｔＤＮＡ含量、女性の年齢および胚染色体状態の間の関係もまた証明された。ｍｔＤＮＡ含量が胚生存率に対して直接影響を有する可能性および異数性との因果関係の可能性、および生殖老化に関連する他の因子は、さらなる調査を正当化する。

実施例８：リアルタイムＰＣＲによるミトコンドリアＤＮＡの定量化
基準ＤＮＡ調製
基準ＤＮＡは、単一Ｓｕｒｅｐｌｅｘ産物（栄養外胚葉試料由来の増幅ＤＮＡ）から選択され、または１０−２０μｌの様々な異なるＳｕｒｅｐｌｅｘ産物を混合することにより調製することができる。１５μｌの基準ＤＮＡの１０−１２アリコートを調製し、それらを−８０℃フリーザー内で保存することが得策である。これらのアリコートのうちの１つがリアルタイムＰＣＲプレートの各々について使用され得る。
プライマー配列：
ｍｔＤＮＡアッセイ
ＭＴＤＮＡ＿１６Ｓ＿ＦＧＧＴＧＡＴＡＧＣＴＧＧＴＴＧＴＣＣＡＡＧＡＴ（配列番号：２）
ＭＴＤＮＡ＿１６Ｓ＿ＲＣＣＴＡＣＴＡＴＧＧＧＴＧＴＴＡＡＡＴＴＴＴＴＴＡＣＴＣＴＣＴＣ（配列番号：３）ＭＴＤＮＡ＿１６Ｓ＿ＭＡＡＴＴＴＡＡＣＴＧＴＴＡＧＴＣＣＡＡＡＧＡＧ（配列番号：４）
ＦＡＭ−ＭＧＢＮＦＱ培地
ＡＬＵアッセイ
ＹＢ８−ＡＬＵ−Ｓ６８ＦＧＴＣＡＧＧＡＧＡＴＣＧＡＧＡＣＣＡＴＣＣＴ（配列番号５）
ＹＢ８−ＡＬＵ−Ｓ６８ＲＡＧＴＧＧＣＧＣＡＡＴＣＴＣＧＧＣ（配列番号：６）
ＹＢ８−ＡＬＵ−Ｓ６８ＭＡＧＣＴＡＣＴＣＧＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＣＡＧＧＡ（配列番号：７）
ＦＡＭ−ＭＧＢＮＦＱ培地
ｍｔＭａｊＡｒｃ
ｍｔＭａｊＡｒｃ＿ＦＣＴＧＴＴＣＣＣＣＡＡＣＣＴＴＴＴＣＣＴ（配列番号：８）
ｍｔＭａｊＡｒｃ＿ＲＣＣＡＴＧＡＴＴＧＴＧＡＧＧＧＧＴＡＧＧ（配列番号：９）
ｍｔＭａｊＡｒｃ＿ＭＧＡＣＣＣＣＣＴＡＡＣＡＡＣＣＣＣＣ（配列番号：１０）
ＮＥＤ−ＮＦＱ培地

リアルタイムＰＣＲのための試料調製
各９６−ウェルプレートについて、陽性（基準ＤＮＡ）および陰性（ヌクレアーゼフリー水）対照を、栄養外胚葉（ＴＥ）試料と共に分析する。全ての反応は三連で実施する。水および試料のマスターミックス、基準または陰性対照を下記のように調製する。

リアルタイムＰＣＲは３つのＴａｑＭａｎアッセイの分析を含むので、上記マスターミックスは、試料の各々および３つのＴａｑＭａｎアッセイの各々について別々に調製される。

これらのアリコートは調製されるとすぐに、それらはボルテックスされ、遠心分離され、４℃で、使用されることになるまで保存される。

アリコートはメインラボにてＰＣＲエンクロージャにおいて調製されるべきである。理想的には、アリコートの調製、リアルタイムＰＣＲおよびプレート上での試料ローディングの全てについて同じピペットが使用されるべきである。

リアルタイムＰＣＲプロトコル
３つのＴａｑＭａｎアッセイが評価される：ミトコンドリア（２つのＴａｑＭａｎアッセイ：ｍｔＤＮＡおよびＭａｊＡｒｃ）、およびＡＬＵ（１つのＴａｑＭａｎアッセイ）。これらのためのマスターミックスが調製され、シングルセルルームにおいてプレートにアリコートされる。

マスターミックス１：ＡＬＵ
チューブの数：３４（これは９６ウェルについてである）
１１μｌを９６−ウェルプレートの最初の３３のウェル中にアリコートする（Ａ２−Ａ１１、Ｂ１−Ｃ９）

マスターミックス２：ミトコンドリア／ｍｔＤＮＡＴａｑＭａｎアッセイ
チューブの数：３４（これは９６ウェルについてである）
１１μｌを９６−ウェルプレートの次の３１のウェル中にアリコートする（Ｃ１０−Ｆ４）

マスターミックス３：ミトコンドリア／ＭａｊＡｒｃ
チューブの数：３４（これは９６ウェルについてである）
１１μｌを９６−ウェルプレートの次の３２のウェル中にアリコートする（Ｆ５−Ｇ１２、Ｈ２−Ｈ１２）
全てのマスターミックスがプレートのウェルに入れられるとすぐに、プレートをメインラボのフードに入れ、適切な量のＤＮＡ試料、すなわち９μｌをアリコートする
ボルテックスおよびスピンさせる。

熱サイクル条件は下記の通りである：

結果の分析
第１のプレート
デルタＣｔ（ΔＣ_Ｔ）を、基準ＤＮＡおよびＴＥ試料について、ならびに両方のミトコンドリアＴａｑＭａｎアッセイについて計算した。ＡｌｕＴａｑＭａｎアッセイの平均Ｃｔ値をｍｔＤＮＡおよびＭａｊＡｒｃミトコンドリアＴａｑＭａｎアッセイの各々の平均Ｃｔ値から差し引いた。分析した試料の各々についてのｍｔＤＮＡ：
デルタＣｔ（ΔＣＴ）＝ｍｔＤＮＡ平均Ｃｔ−Ａｌｕ平均Ｃｔ
デルタＣｔ（ΔＣＴ）＝ＭａｊＡｒｃ平均Ｃｔ−Ａｌｕ平均Ｃｔ

相対ミトコンドリアＤＮＡ値を、基準ＤＮＡおよびＴＥ試料の各々について、ならびに２つのミトコンドリアＴａｑＭａｎアッセイの各々について式２^{−デルタＣｔ}（２^−ΔＣＴ）により計算した。

ｍｔＤＮＡプライマーについての閾値は０．００００５であり、ＭａｊＡｒｃについては０．００００２４であった。より高い値を有する試料はより低い着床の可能性を有した。試料を高いと呼ぶために、両方のＴａｑＭａｎアッセイについて得られた値は設定閾値を超えた。

全ての他のプレート
基準ＤＮＡおよびＴＥ試料について、ならびに両方のミトコンドリアＴａｑＭａｎアッセイについてのデルタＣｔ（ΔＣ_Ｔ）を計算した。ＡｌｕＴａｑＭａｎアッセイの平均Ｃｔ値を、ｍｔＤＮＡおよびＭａｊＡｒｃミトコンドリアＴａｑＭａｎアッセイの各々の平均Ｃｔ値から差し引いた。

分析した試料の各々についてのｍｔＤＮＡを下記の通り計算した：
デルタＣｔ（ΔＣ_Ｔ）＝ｍｔＤＮＡ平均Ｃｔ−Ａｌｕ平均Ｃｔ
分析した試料の各々についてのＭａｊＡｒｃを下記の通り計算した：
デルタＣｔ（ΔＣ_Ｔ）＝ＭａｊＡｒｃ平均Ｃｔ−Ａｌｕ平均Ｃｔ

値をデルタデルタＣｔ（ΔΔＣ_Ｔ）の計算により規準化し、プレートの残りにおける試料が第１のプレートにおけるものと同じように作用したことを確認した。

これをするために、規準化因子を現プレートにおいて得られた基準ＤＮＡデルタＣｔ（ΔＣ_Ｔ）値を第１のプレートにおける基準ＤＮＡのデルタＣｔ（ΔＣＴ）値から差し引くことにより、計算した。得られた値を規準化因子とした。これを両方のミトコンドリアＴａｑＭａｎアッセイについて実施した。

デルタデルタＣｔ（ΔΔＣ_Ｔ）を計算するために、規準化因子値を、分析したＴＥ試料について得られたデルタＣｔ（ΔＣ_Ｔ）値に付加した。これを両方のミトコンドリアＴａｑＭａｎアッセイについて実施した。

前のように、相対ｍｔＤＮＡ値を式２^{−デルタデルタＣｔ}（２^{−ΔΔＣＴ}）により計算した。

他の実施形態
本開示をその詳細な説明とともに記載したが、前記説明は本開示の範囲を説明することを意図しており、これを制限することは意図しておらず、本開示の範囲は、添付の特許請求の範囲により規定されることが理解されるべきである。他の態様、利点、および改変は下記特許請求の範囲の範囲内である。

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２１．ＢａｒｒｉｔｔＪＡ，ＣｏｈｅｎＪ，ＢｒｅｎｎｅｒＣＡ（２０００）ＭｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌＤＮＡｐｏｉｎｔｍｕｔａｔｉｏｎｉｎｈｕｍａｎｏｏｃｙｔｅｓｉｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｍａｔｅｒｎａｌａｇｅ．ＲｅｐｒｏｄＢｉｏｍｅｄＯｎｌｉｎｅ１：９６−１００．
２２．ＫｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｉｓＭ，ＡｌｆａｒａｗａｔｉＳ，ＨｕｒｄＤ，ＰａｏｌｕｃｃｉＭ，ＳｈｏｖｅｌｔｏｎＪ，ｅｔａｌ．（２０１４）Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｏｆａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ，ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ，ａｎｄｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌＤＮＡｃｏｎｔｅｎｔｉｎｈｕｍａｎｐｏｌａｒｂｏｄｉｅｓａｎｄｅｍｂｒｙｏｓｗｉｔｈｔｈｅｕｓｅｏｆａｎｏｖｅｌｍｉｃｒｏａｒｒａｙｐｌａｔｆｏｒｍ．ＦｅｒｔｉｌＳｔｅｒｉｌ：ｉｎｐｒｅｓｓ．
２３．ＮａｒｉｔａＡ（１９９５）Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｆａｃｔｏｒｓａｆｆｅｃｔｉｎｇｓｔｅｒｉｌｉｔｙｉｎｏｏｃｙｔｅｓｏｆａｇｅｄａｎｉｍａｌｓ．ＪａｐＪＦｅｒｔｉｌＳｔｅｒｉｌ４０：５７−６５．
２４．ＤｕｒａｎＨＥ，Ｓｉｍｓｅｋ−ＤｕｒａｎＦ，ＯｅｈｎｉｎｇｅｒＳＣ，ＪｏｎｅｓＨＷＪｒ，Ｃａｓｔｏｒａ（２０１１）Ｔｈｅａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｏｆｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅｗｉｔｈｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｑｕａｎｔｉｔｙ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄＤＮＡｉｎｔｅｇｒｉｔｙｉｎｈｕｍａｎｏｏｃｙｔｅｓａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｔａｇｅｓｏｆｍａｔｕｒａｔｉｏｎ．ＦｅｒｔｉｌＳｔｅｒｉｌ９６：３８４−３８８．
２５．ＰｉｋｏＬ，ＴａｙｌｏｒＫＤ（１９８７）ＡｍｏｕｎｔｓｏｆｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌＤＮＡａｎｄａｂｕｎｄａｎｃｅｏｆｓｏｍｅｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｇｅｎｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓｉｎｅａｒｌｙｍｏｕｓｅｅｍｂｒｙｏｓ．ＤｅｖＢｉｏｌ１２３：３６４−３７４．
２６．Ｓｉｍｓｅｋ−ＤｕｒａｎＦ，ＬｉＦ，ＦｏｒｄＷ，ＳｗａｎｓｏｎＲＪ，ＪｏｎｅｓＨＷＪｒ，ｅｔａｌ．（２００９）Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆａｇｉｎｇｏｎｔｈｅｍｅｔａｂｏｌｉｃｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｉｎｈａｍｓｔｅｒｏｏｃｙｔｅｓ．ＦＡＳＥＢＪ８５５：１０．
２７．ＭｏｎｎｏｔＳ，ＳａｍｕｅｌｓＤＣ，ＨｅｓｔｅｒｓＬ，ＦｒｙｄｍａｎＮ，ＧｉｇａｒｅｌＮ，ｅｔａｌ．（２０１３）ＭｕｔａｔｉｏｎｄｅｐｅｎｄａｎｃｅｏｆｔｈｅｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌＤＮＡｃｏｐｙｎｕｍｂｅｒｉｎｔｈｅｆｉｒｓｔｓｔａｇｅｓｏｆｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ．ＨｕｍＭｏｌＧｅｎｅｔ２２：１８６７−１８７２．
２８．ＨｓｉｅｈＲＨ，ＡｕＨＫ，ＹｅｈＴＳ，ＣｈａｎｇＳＪ，ＣｈｅｎｇＹＦ，ｅｔａｌ．（２００４）Ｄｅｃｒｅａｓｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｇｅｎｅｓｉｎｈｕｍａｎｕｎｆｅｒｔｉｌｉｚｅｄｏｏｃｙｔｅｓａｎｄａｒｒｅｓｔｅｄｅｍｂｒｙｏｓ．ＦｅｒｔｉｌＳｔｅｒｉｌ８１：９１２−９１８．
２９．ＨｓｉｅｈＲＨ，ＴｓａｉＮＭ，ＡｕＨＫ，ＣｈａｎｇＳＪ，ＷｅｉＹＨ，ｅｔａｌ．（２００２）ＭｕｌｔｉｐｌｅｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓｏｆｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌＤＮＡｉｎｕｎｆｅｒｔｉｌｉｚｅｄｈｕｍａｎｏｏｃｙｔｅｓ．ＦｅｒｔｉｌＳｔｅｒｉｌ７７：１０１２−１０１７．
３０．ＦｒａｇｏｕｌｉＥ，ＡｌｆａｒａｗａｔｉＳ，ＤａｐｈｎｉｓＤＤ，ＧｏｏｄａｌｌＮＮ，ＭａｎｉａＡ，ｅｔａｌ．（２０１１）ＣｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆｈｕｍａｎｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓｗｉｔｈｔｈｅｕｓｅｏｆＦＩＳＨ，ＣＧＨａｎｄａＣＧＨ：ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｄａｔａａｎｄｔｅｃｈｎｉｃａｌｅｖａｌｕａｔｉｏｎ．ＨｕｍＲｅｐｒｏｄ２６：４８０−４９０
３１．ＷｅｌｌｓＤ，ＫａｕｒＫ，ＧｒｉｆｏＪ，ＧｌａｓｓｎｅｒＭ，ＴａｙｌｏｒＪＣ，ｅｔａｌ．（２０１４）Ｃｌｉｎｉｃａｌｕｔｉｌｉｓａｔｉｏｎｏｆａｒａｐｉｄｌｏｗ−ｐａｓｓｗｈｏｌｅｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｔｅｃｈｎｉｑｕｅｆｏｒｔｈｅｄｉａｇｎｏｓｉｓｏｆａｎｅｕｐｌｏｉｄｙｉｎｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｓｐｒｉｏｒｔｏｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．ＪＭｅｄＧｅｎｅｔ５１：５５３−５６２．
３２．ＺｈａｎｇＸ，ＷｕＸＱ，ＬｕＳ，ＧｕｏＹＬ，ＭａＸ（２００６）Ｄｅｆｉｃｉｔｏｆｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ− ｄｅｒｉｖｅｄＡＴＰｄｕｒｉｎｇｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓｉｍｐａｉｒｓｍｏｕｓｅＭｉｉｏｏｃｙｔｅｓｐｉｎｄｌｅｓ．ＣｅｌｌＲｅｓ１６：８４１−８５０．
３３．ＣｈｏｉＷＪ，ＢａｎｅｒｊｅｅＪ，ＦａｌｃｏｎｅＴ，ＢｅｎａＪ，ＡｇａｒｗａｌＡ，ｅｔａｌ．（２００７）Ｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓａｎｄｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ−ｉｎｄｕｃｅｄａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓｉｎｍｅｔａｐｈａｓｅＩＩｍｏｕｓｅｏｏｃｙｔｅｓｐｉｎｄｌｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．ＦｅｒｔｉｌＳｔｅｒｉｌ８８：１２２０−１２３１．
３４．ＪｏｈｎｓｏｎＭＴ，ＦｒｅｅｍａｎＥＡ，ＧａｒｄｎｅｒＤＫ，ＨｕｎｔＰＡ（２００７）Ｏｘｉｄａｔｉｖｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｏｆｐｙｒｕｖａｔｅｉｓｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｍｅｉｏｔｉｃｍａｔｕｒａｔｉｏｎｏｆｍｕｒｉｎｅｏｏｃｙｔｅｓｉｎｖｉｖｏ．ＢｉｏｌＲｅｐｒｏｄ７７：２−８．
３５．ＹｕＹ，ＤｕｍｏｌｌａｒｄＲ，ＲｏｓｓｂａｃｈＡ，ＬａｉＦＡ，ＳｗａｎｎＫ（２０１０）ＲｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｅａｄｓｔｏｂｕｒｓｔｓｏｆＡＴＰｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｄｕｒｉｎｇｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｍｏｕｓｅｏｏｃｙｔｅｍａｔｕｒａｔｉｏｎ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｅｌｌｕｌａｒＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ２２４：６７２−６８０．
３６．ＷａｎｇＱ，ＲａｔｃｈｆｏｒｄＡＭ，ＣｈｉＭＭ，ＳｃｈｏｅｌｌｅｒＥ，ＦｒｏｌｏｖａＡ，ｅｔａｌ．（２００９）Ｍａｔｅｒｎａｌｄｉａｂｅｔｅｓｃａｕｓｅｓｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｍｅｉｏｔｉｃｄｅｆｅｃｔｓｉｎｍｕｒｉｎｅｏｏｃｙｔｅｓ．ＭｏｌＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌ２３：１６０３−１６１２．
３７．ＷｉｌｄｉｎｇＭ，ＤｅＰｌａｃｉｄｏＧ，ＤｅＭａｔｔｅｏＬ，ＭａｒｉｎｏＭ，ＡｌｖｉｇｇｉＣ，ｅｔａｌ．（２００３）Ｃｈａｏｔｉｃｍｏｓａｉｃｉｓｍｉｎｈｕｍａｎｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎｅｍｂｒｙｏｓｉｓｃｏｒｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈａｌｏｗｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｍｅｍｂｒａｎｅｐｏｔｅｎｔｉａｌ，ＦｅｒｔｉｌＳｔｅｒｉｌ７９：３４０−３４６．
３８．ＣａｐａｌｂｏＡ，ＷｒｉｇｈｔＧ，ＥｌｌｉｏｔｔＴ，ＵｂａｌｄｉＦＭ，ＲｉｅｎｚｉＬｅｔａｌ．（２０１３）ＦＩＳＨｒｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｉｎｎｅｒｃｅｌｌｍａｓｓａｎｄｔｒｏｐｈｅｃｔｏｄｅｒｍｓａｍｐｌｅｓｏｆｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙａｒｒａｙ−ＣＧＨｓｃｒｅｅｎｅｄｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓｓｈｏｗｓｈｉｇｈａｃｃｕｒａｃｙｏｆｄｉａｇｎｏｓｉｓａｎｄｎｏｍａｊｏｒｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｉｍｐａｃｔｏｆｍｏｓａｉｃｉｓｍａｔｔｈｅｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓｔａｇｅ．ＨｕｍＲｅｐｒｏｄ２８：２２９８−２３０７．
３９．ＬｅｅｓｅＨＪ（２００２）Ｑｕｉｅｔｐｌｅａｓｅ，ｄｏｎｏｔｄｉｓｔｕｒｂ：ａｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓｏｆｅｍｂｒｙｏｍｅｔａｂｏｌｉｓｍａｎｄｖｉａｂｉｌｉｔｙ．Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ２４：８４５−８４９．
４０．ＨａｒｔｏｎＧＬ，ＭｕｎｎｅＳ，ＳｕｒｒｅｙＭ，ＧｒｉｆｏＪ，ＫａｐｌａｎＢ，ＭｃＣｕｌｌｏｈＤＨ，ｅｔａｌ．（２０１３）Ｄｉｍｉｎｉｓｈｅｄｅｆｆｅｃｔｏｆｍａｔｅｒｎａｌａｇｅｏｎｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎａｆｔｅｒｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎｇｅｎｅｔｉｃｄｉａｇｎｏｓｉｓｗｉｔｈａｒｒａｙｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｇｅｎｏｍｉｃｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．ＦｅｒｔｉｌＳｔｅｒｉｌ１００：１６９５−１６７０
４１．ＭａｇｌｉＭＣ，ＭｏｎｔａｇＭ，ＫｏｓｔｅｒＭ，ＭｕｚｉＬ，ＧｅｒａｅｄｔｓＪ，ｅｔａｌ．（２０１１）ＰｏｌａｒｂｏｄｙａｒｒａｙＣＧＨｆｏｒｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｓｔａｔｕｓｏｆｔｈｅｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｏｏｃｙｔｅ．ＰａｒｔＩＩ：ｔｅｃｈｎｉｃａｌａｓｐｅｃｔｓ．ＨｕｍＲｅｐｒｏｄ２６：３１８１−３１８５．
４２．Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ−ＭａｔｅｏＣ，ＣｏｌｌｓＰ，Ｓａｎｃｈｅｚ−ＧａｒｃｉａＪ，ＥｓｃｕｄｅｒｏＴ，ＰｒａｔｅｓＲ，ｅｔａｌ．（２０１１）Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎｏｆｍｉｃｒｏａｒｒａｙｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｇｅｎｏｍｉｃｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｆｏｒｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｅｍｂｒｙｏｓ．ＦｅｒｔｉｌＳｔｅｒｉｌ９５：９５３−９５８．
４３．ＣｈｒｉｓｔｏｐｉｋｏｕＤ，ＴｓｏｒｖａＥ，ＥｃｏｎｏｍｏｕＫ，ＳｈｅｌｌｅｙＰ，ＤａｖｉｅｓＳ，ｅｔａｌ．（２０１３）Ｐｏｌａｒｂｏｄｙａｎａｌｙｓｉｓｂｙａｒｒａｙｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｇｅｎｏｍｉｃｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎａｃｃｕｒａｔｅｌｙｐｒｅｄｉｃｔｓａｎｅｕｐｌｏｉｄｉｅｓｏｆｍａｔｅｒｎａｌｍｅｉｏｔｉｃｏｒｉｇｉｎｉｎｃｌｅａｖａｇｅｓｔａｇｅｅｍｂｒｙｏｓｏｆｗｏｍｅｎｏｆａｄｖａｎｃｅｄｍａｔｅｒｎａｌａｇｅ．ＨｕｍＲｅｐｒｏｄ２８：１４２６−１４３４．
４４．ＭｅｒｔｚａｎｉｄｏｕＡ，ＳｐｉｔｓＣ，ＮｇｕｙｅｎＨＴ，ＶａｎｄｅＶｅｌｄｅＨ，ＳｅｒｍｏｎＫ（２０１３）ＥｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆａｎｅｕｐｌｏｉｄｙｕｐｔｏＤａｙ４ｏｆｈｕｍａｎｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．ＨｕｍＲｅｐｒｏｄ２８：１７１６− １７２４．
４５．ＦｒｅｇｅｌＲ，ＡｌｍｅｉｄａＭ，ＢｅｔａｎｃｏｒＥ，ＳｕａｒｅｚＮＭ，ＰｅｓｔａｎｏＪ（２０１１）ＲｅｌｉａｂｌｅｎｕｃｌｅａｒａｎｄｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌＤＮＡｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｏｒｌｏｗｃｏｐｙｎｕｍｂｅｒａｎｄｄｅｇｒａｄｅｄｆｏｒｅｎｓｉｃｓａｍｐｌｅｓ．ＦｏｒｅｎｓｉｃＳｃｉｅｎｃｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ：ＧｅｎｅｔｉｃｓＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔＳｅｒｉｅｓ３：ｅ３０３−ｅ３０４．
４６．ＬｉＨ，ＤｕｒｂｉｎＲ（２００９）ＦａｓｔａｎｄａｃｃｕｒａｔｅｓｈｏｒｔｒｅａｄａｌｉｇｎｍｅｎｔｗｉｔｈＢｕｒｒｏｗｓ- Ｗｈｅｅｌｅｒｔｒａｎｓｆｏｒｍ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ２５：１７５４−１７６０．
４７．ＲａｃｚｙＣ，ＰｅｔｒｏｖｓｋｉＲ，ＳａｕｎｄｅｒｓＣＴ，ＣｈｏｒｎｙＩ，ＫｒｕｇｌｙａｋＳｅｔａｌ．（２０１３）Ｉｓａａｃ：ｕｌｔｒａ- ｆａｓｔｗｈｏｌｅ−ｇｅｎｏｍｅｓｅｃｏｎｄａｒｙａｎａｌｙｓｉｓｏｎＩｌｌｕｍｉｎａｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｐｌａｔｆｏｒｍｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ２９：２０４１−２０４３
４８．ＱｕｉｎｌａｎＡＲ，ＨａｌｌＩＭ（２０１０）ＢＥＤＴｏｏｌｓ：Ａｆｌｅｘｉｂｌｅｓｕｉｔｅｏｆｕｔｉｌｉｔｉｅｓｆｏｒｃｏｍｐａｒｉｎｇｇｅｎｏｍｉｃｆｅａｔｕｒｅｓ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ２６：８４１−８４２．
４９．ＬｉＨ，ＨａｎｄｓａｋｅｒＢ，ＷｙｓｏｋｅｒＡ，ＦｅｎｎｅｌｌＴ，ＲｕａｎＪ，ｅｔａｌ．（２００９）ＴｈｅＳｅｑｕｅｎｃｅａｌｉｇｎｍｅｎｔ／ｍａｐ（ＳＡＭ）ｆｏｒｍａｔａｎｄＳＡＭｔｏｏｌｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ２５：２０７８−２０７９．
５０．ＢａｓｌａｎＴ，ＫｅｎｄａｌｌＪ，ＲｏｄｇｅｒｓＬ，ＣｏｘＨ，ＲｉｇｇｓＭ，ｅｔａｌ．（２０１２）Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅｃｏｐｙｎｕｍｂｅｒａｎａｌｙｓｉｓｏｆｓｉｎｇｌｅｃｅｌｌｓ．ＮａｔＰｒｏｔｏｃ７：１０２４−１０４１．
５１．ＺｈｉｄｋｏｖＩ，ＮａｇａｒＴ，ＭｉｓｈｍａｒＤ，ＲｕｂｉｎＥ（２０１１）ＭｉｔｏＢａｍＡｎｎｏｔａｔｏｒ：Ａｗｅｂ−ｂａｓｅｄｔｏｏｌｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｎｇａｎｄａｎｎｏｔａｔｉｎｇｈｅｔｅｒｏｐｌａｓｍｙｉｎｈｕｍａｎｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ１１：９２４−９２８．
５２．ＳｃｈｍｉｔｔｇｅｎＴＤ，ＬｉｖａｋＫＪ（２００８）Ａｎａｌｙｚｉｎｇｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲｄａｔａｂｙｔｈｅｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅＣＴｍｅｔｈｏｄ．ＮａｔＰｒｏｔｏｃ３：１１０１−１１０８．

Claims

胚中のミトコンドリアＤＮＡの相対量を決定するための方法であって、
前記胚から得られたＤＮＡ試料を提供すること；
前記ＤＮＡ試料中のミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の量を決定すること；
前記ＤＮＡ試料中の基準ＤＮＡの量を決定すること；ならびに
前記胚中のｍｔＤＮＡの相対量を決定するために、前記ｍｔＤＮＡの量を前記基準ＤＮＡの量と比較すること、
を含む、方法。
前記胚中のｍｔＤＮＡの相対量が、前記胚の着床の可能性を示す、請求項１に記載の方法。
前記ＤＮＡ試料中のｍｔＤＮＡの量を決定することおよび前記ＤＮＡ試料中の基準ＤＮＡの量を決定することが、定量的ＰＣＲを使用して実施される、請求項１に記載の方法。
前記定量的ＰＣＲがリアルタイムＰＣＲを含む、請求項３に記載の方法。
ＤＮＡ試料が、着床後１、２、３、４、５、６または７日、あるいは受精後１−３日、２−４日、３−５日、５−７日、１−７日、または４−７日に前記胚から得られる、請求項１に記載の方法。
前記胚は正倍数体胚である、請求項１に記載の方法。
前記ＤＮＡ試料中のｍｔＤＮＡの量を決定することが、
前記ＤＮＡ試料を、１６Ｓアンプリコンを生成させるために、１６Ｓを転写する配列を標的とする配列番号：２および３を含むプライマー対と、または、ＭＴ−ＮＤ４アンプリコンを生成させるために、ＮＡＤＨ−ユビキノンオキシドレダクターゼ鎖４（ＭＴ−ＮＤ４）をコードする配列を標的とする配列番号および９を含むプライマー対と接触させることにより、前記ｍｔＤＮＡを増幅させることを含む、請求項１に記載の方法。
前記ＤＮＡ試料を、配列番号：４を含むプローブと接触させることにより、前記１６Ｓアンプリコンを検出することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
前記ＤＮＡ試料を、配列番号：１０を含むプローブと接触させることにより、前記ＭＴ−ＮＤ４アンプリコンを検出することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
前記ＤＮＡ試料中の基準ＤＮＡの量を決定することが、前記ＤＮＡ試料を、Ａｌｕアンプリコンを生成させるために、Ａｌｕ配列を標的とする配列番号５および６を含むプライマー対と接触させることにより、基準ＤＮＡ配列を増幅させることを含む、請求項１に記載の方法。
前記ＤＮＡ試料を配列番号：７を含むプローブと接触させることにより、前記Ａｌｕアンプリコンを検出することをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
前記正倍数体胚中のｍｔＤＮＡの相対量を、着床可能性閾値と比較することをさらに含み；
前記着床可能性閾値未満の、前記胚中のｍｔＤＮＡの相対量は、前記正倍数体胚の有利な着床の可能性を示し、前記着床可能性閾値を超える前記胚中のｍｔＤＮＡの相対量は、前記正倍数体胚の不利な着床の可能性を示す、請求項１に記載の方法。
胚試料中のミトコンドリアＤＮＡの相対量を、前記胚中の基準染色体核酸配列と比較して決定することであって、決定は、
ｉ）胚由来の核酸試料；
ｉｉ）第１のミトコンドリアＤＮＡ配列に対するものである第１のオリゴヌクレオチドプライマー対；および
ｉｉｉ）基準標的核酸配列に対するものである基準オリゴヌクレオチドプライマー対
を含む反応混合物を調製すること；
第１のミトコンドリアＤＮＡ配列産物および基準標的核酸配列産物を生成するために、前記反応混合物を増幅させること；
前記増幅された第１のミトコンドリアＤＮＡ配列産物の量を、前記増幅された基準標的核酸配列産物の量と比較して評価すること、を含む、こと；ならびに
前記増幅された基準標的核酸配列産物に対する、前記増幅された第１のミトコンドリアＤＮＡ配列産物の測定された量が着床可能性閾値未満である場合、着床のための胚を選択すること
を含む、着床のための胚を選択するための方法。
前記反応混合物が、第２のミトコンドリアＤＮＡ配列に対するものである第２の合成オリゴヌクレオチドプライマー対をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
第１のミトコンドリアＤＮＡ配列産物、第２のミトコンドリアＤＮＡ配列産物；ならびに基準標的核酸配列産物を生成させるために、前記反応混合物を増幅させること、ならびに各増幅産物の量を測定すること；
前記増幅された第１のミトコンドリアＤＮＡ配列産物および前記増幅された第２のミトコンドリアＤＮＡ配列産物の測定された量を前記増幅された基準標的核酸配列産物と比較すること；ならびに
前記増幅された基準標的核酸配列産物に対する、前記増幅された第１のミトコンドリアＤＮＡ配列産物および前記増幅された第２のミトコンドリアＤＮＡ配列産物の測定された量が、着床可能性閾値未満である場合、着床のための胚を選択すること
をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
第３のミトコンドリアＤＮＡ配列に対するものである第３の合成オリゴヌクレオチドプライマー対をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
基準核酸試料と比較した、胚試料中のミトコンドリアＤＮＡの相対量を測定することであって、決定は、
ｉ）胚由来の核酸試料；
ｉｉ）第１のミトコンドリアＤＮＡ配列に対するものである第１の合成オリゴヌクレオチドプライマー対；
ｉｉｉ）第２のミトコンドリアＤＮＡ配列に対するものである第２の合成オリゴヌクレオチドプライマー対；および
ｉｖ）基準標的核酸配列に対するものである基準合成オリゴヌクレオチドプライマー対
を含む反応混合物を調製すること；
第１のミトコンドリアＤＮＡ配列産物、第２のミトコンドリアＤＮＡ配列産物；および基準標的核酸配列産物を生成させるために、前記反応混合物を増幅させること、ならびに各増幅産物の量を測定すること；
前記第１のミトコンドリアＤＮＡ配列産物および前記第２のミトコンドリアＤＮＡ配列産物の測定された量を前記基準標的核酸配列産物と比較すること、を含むこと；ならびに
前記基準標的核酸配列産物に対する、前記第１のミトコンドリアＤＮＡ配列産物および前記第２のミトコンドリアＤＮＡ配列産物の測定された量が着床可能性閾値未満である場合、着床のための胚を選択すること
を含む、着床のための胚を選択するための方法。
前記基準標的核酸配列産物に対する、前記第１のミトコンドリアＤＮＡ配列産物および前記第２のミトコンドリアＤＮＡ配列産物の量が着床可能性閾値を超える場合、胚を着床に好適ではないと識別すること
をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
前記第１または第２合成オリゴヌクレオチドプライマー対が、１２ＳＲＮＡをコードするミトコンドリアＤＮＡ配列、１６ＳＲＮＡをコードするミトコンドリアＤＮＡ配列、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット１（ＭＴ−ＮＤ１）をコードするミトコンドリアＤＮＡ配列、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット２（ＭＴ−ＮＤ２）をコードするミトコンドリアＤＮＡ配列、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット３（ＭＴ−ＮＤ３）をコードするミトコンドリアＤＮＡ配列、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット４（ＭＴ−ＮＤ４）をコードするミトコンドリアＤＮＡ配列、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット５（ＭＴ−ＮＤ５）をコードするミトコンドリアＤＮＡ配列、チトクロムｂ、ミトコンドリアチトクロムｃオキシダーゼサブユニット１、２または３をコードするミトコンドリアＤＮＡ配列、ＡＴＰシンターゼをコードするミトコンドリアＤＮＡ配列に対するものである、請求項１８に記載の方法。
前記第１の合成オリゴヌクレオチドプライマー対が、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列をコードするミトコンドリアＤＮＡ配列に対するものである、請求項１９に記載の方法。
前記第２の合成オリゴヌクレオチドプライマー対が、ＮＡＤＨ−ユビキノンオキシドレダクターゼ鎖４（ＭＴ−ＮＤ４）遺伝子配列をコードするミトコンドリアＤＮＡ配列に対するものである、請求項１９に記載の方法。
前記基準合成オリゴヌクレオチドプライマー対が、Ａｌｕ配列、Ｌ１配列、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、またはβ−アクチン（ＡｃｔＢ）に対するものである、請求項１８に記載の方法。
前記基準合成オリゴヌクレオチドプライマー対が、Ａｌｕ配列に対するものである、請求項２２に記載の方法。
前記第１の合成オリゴヌクレオチドプライマー対が、配列番号：２の核酸配列に対し少なくとも７０％配列同一性を有するプライマーおよび配列番号：３の核酸配列に対し少なくとも７０％配列同一性を有するプライマーを含む、請求項２０に記載の方法。
前記第２の合成オリゴヌクレオチドプライマー対が、配列番号：８の核酸配列に対し少なくとも７０％配列同一性を有するプライマーおよび配列番号：９の核酸配列に対し少なくとも７０％配列同一性を有するプライマーを含む、請求項２１に記載の方法。
前記基準合成オリゴヌクレオチドプライマー対が、配列番号５の核酸配列に対し少なくとも７０％配列同一性を有するプライマーおよび配列番号：６の核酸配列に対し少なくとも７０％配列同一性を有するプライマーを含む、請求項２３に記載の方法。
増幅することが、定量的または半定量的ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて実施される、請求項１７に記載の方法。
第１のミトコンドリアＤＮＡ配列に対するものである第１の合成オリゴヌクレオチドプライマー対；
基準遺伝子配列に対するものである第２の合成オリゴヌクレオチドプライマー対；
を含む、胚の着床の可能性を決定するためのキット。
前記第１の合成オリゴヌクレオチドプライマー対が、１２ＳＲＮＡをコードするミトコンドリアＤＮＡ配列、１６ＳＲＮＡをコードするミトコンドリアＤＮＡ配列、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット１（ＭＴ−ＮＤ１）をコードするミトコンドリアＤＮＡ配列、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット２（ＭＴ−ＮＤ２）をコードするミトコンドリアＤＮＡ配列、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット３（ＭＴ−ＮＤ３）をコードするミトコンドリアＤＮＡ配列、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット４（ＭＴ−ＮＤ４）をコードするミトコンドリアＤＮＡ配列、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット５（ＭＴ−ＮＤ５）をコードするミトコンドリアＤＮＡ配列、チトクロムｂ、ミトコンドリアチトクロムｃオキシダーゼサブユニット１、２または３をコードするミトコンドリアＤＮＡ配列、ＡＴＰシンターゼをコードするミトコンドリアＤＮＡ配列に対するものである、請求項２８に記載のキット。
前記第１の合成オリゴヌクレオチドプライマー対が、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列をコードするミトコンドリアＤＮＡ配列に対するものである、請求項２９に記載のキット。
前記第１の合成オリゴヌクレオチドプライマー対が、配列番号：２の核酸配列に対し少なくとも７０％配列同一性を有するプライマーおよび配列番号：３の核酸配列に対し少なくとも７０％配列同一性を有するプライマーを含む、請求項３０に記載のキット。
前記１６ＳｒＲＮＡをコードするミトコンドリアＤＮＡ配列に対するものであるプローブをさらに含み、前記プローブは配列番号：４を含む、請求項３０に記載のキット。
前記第１の合成オリゴヌクレオチドプライマー対が、ＮＡＤＨ−ユビキノンオキシドレダクターゼ鎖４（ＭＴ−ＮＤ４）遺伝子配列をコードするミトコンドリアＤＮＡ配列に対するものである、請求項２９に記載のキット。
前記第１の合成オリゴヌクレオチドプライマー対が、配列番号：８の核酸配列に対し少なくとも７０％配列同一性を有するプライマーおよび配列番号：９の核酸配列に対し少なくとも７０％配列同一性を有するプライマーを含む、請求項３３に記載のキット。
前記ＭＴ−ＮＤ４をコードするミトコンドリアＤＮＡ配列に対するものであるプローブをさらに含み、前記プローブは配列番号：１０を含む、請求項３３に記載のキット。
前記基準合成オリゴヌクレオチドプライマー対が、前記Ａｌｕ配列、前記Ｌｌ配列、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、またはβ−アクチン（ＡｃｔＢ）に対するものである、請求項２８に記載のキット。
前記基準合成オリゴヌクレオチドプライマー対が、前記Ａｌｕ配列に対するものである、請求項３６に記載のキット。
前記基準合成オリゴヌクレオチドプライマー対が、配列番号５の核酸配列に対し少なくとも７０％配列同一性を有するプライマーおよび配列番号：６の核酸配列に対し少なくとも７０％配列同一性を有するプライマーを含む、請求項３７に記載のキット。
前記Ａｌｕ配列に対するものであるプローブをさらに含み、前記プローブは配列番号：７を含む、請求項３６に記載のキット。
デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）をさらに含む、請求項２８に記載のキット。
ＤＮＡポリメラーゼをさらに含む、請求項２８に記載のキット。
前記ＤＮＡポリメラーゼが熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである、請求項４１に記載のキット。
前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼがＴａｑＤＮＡポリメラーゼまたはＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼである、請求項４２に記載のキット。
バッファーをさらに含む、請求項２８に記載のキット。
前記バッファーがＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ＴＥ）バッファーである、請求項４４に記載のキット。
陽性対照ＤＮＡ試料および陰性対照ＤＮＡ試料をさらに含む、請求項２８に記載のキット。
第２のミトコンドリアＤＮＡ配列に対するものである第３の合成オリゴヌクレオチドプライマー対をさらに含む、請求項２８に記載のキット。
着床正倍数体胚から得られた１つ以上のＤＮＡ試料中のミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の量を決定すること；
非着床正倍数体胚から得られた１つ以上のＤＮＡ試料中のｍｔＤＮＡの量を決定すること；ならびに
前記着床正倍数体胚からのｍｔＤＮＡの量を前記非着床正倍数体胚から得られたｍｔＤＮＡの量と比較することにより着床可能性閾値を計算すること
を含む、方法。
前記ＤＮＡ試料中のｍｔＤＮＡの量を決定することが、定量的ＰＣＲを用いて実施される、請求項４８に記載の方法。
前記定量的ＰＣＲがリアルタイムＰＣＲを含む、請求項４９に記載の方法。
前記第１のＤＮＡ試料中のｍｔＤＮＡの量を決定することが、
前記ＤＮＡ試料を、１６Ｓアンプリコンを生成させるために、１６Ｓを転写する配列を標的とする配列番号：２および３を含むプライマー対と、または、ＭＴ−ＮＤ４アンプリコンを生成させるために、ＮＡＤＨ−ユビキノンオキシドレダクターゼ鎖４（ＭＴ−ＮＤ４）をコードする配列を標的とする配列番号：８および９を含むプライマー対と接触させることにより、前記試料中のｍｔＤＮＡを増幅させること；ならびに
前記ＤＮＡ試料を、Ａｌｕアンプリコンを生成させるために、Ａｌｕ配列を標的とする配列番号５および６を含むプライマー対と接触させることにより、基準ＤＮＡ配列を増幅させること
を含む、請求項４８に記載の方法。
前記ＤＮＡ試料を、前記１６Ｓアンプリコン内の配列を標的とする配列番号：４を含むプローブと接触させることにより、前記１６Ｓアンプリコンを検出すること；ならびに
前記ＤＮＡ試料を、前記Ａｌｕアンプリコン内の配列を標的とする配列番号：７を含むプローブと接触させることにより、前記Ａｌｕアンプリコンを検出すること
をさらに含む、請求項５１に記載の方法。
前記ＤＮＡ試料を、前記ＭＴ−ＮＤ４アンプリコン内の配列を標的とする配列番号：１０を含むプローブと接触させることにより、前記ＭＴ−ＮＤ４アンプリコンを検出すること；ならびに
前記ＤＮＡ試料を、前記Ａｌｕアンプリコン内の配列を標的とする配列番号：７を含むプローブと接触させることにより、前記Ａｌｕアンプリコンを検出すること
をさらに含む、請求項５１に記載の方法。
基準核酸試料と比較した、胚試料中のミトコンドリアＤＮＡの相対量を決定することであって、
ｉ）胚由来の核酸試料；
ｉｉ）第１のミトコンドリアＤＮＡ配列に対するものである第１の合成オリゴヌクレオチドプライマー対；ならびに
ｉｉｉ）基準標的核酸配列に対するものである基準合成オリゴヌクレオチドプライマー対
を含む反応混合物を調製すること；
第１のミトコンドリアＤＮＡ配列産物および基準染色体標的核酸配列産物を生成させるために、前記反応混合物を増幅させること；ならびに
前記増幅された第１のミトコンドリアＤＮＡ配列産物の量を、前記増幅された基準標的核酸配列産物の量と比較して評価すること、
を含む、胚の着床の可能性を決定するための方法であって、
前記胚中のｍｔＤＮＡの相対量は、前記胚の着床の可能性を示す、方法。
前記ミトコンドリアＤＮＡの相対量を決定することが、ｉｖ）第２のミトコンドリアＤＮＡ配列に対するものである第２の合成オリゴヌクレオチドプライマー対をさらに含み；
前記増幅工程が、第２のミトコンドリアＤＮＡ配列産物を生成させるために前記反応混合物を増幅させることをさらに含み；
前記評価工程が、前記増幅された第２のミトコンドリアＤＮＡ配列産物の量を前記増幅された基準標的核酸配列産物の量を用いて評価することをさらに含み、
前記第１および第２のミトコンドリアＤＮＡ配列産物の相対量が、前記胚の着床の可能性を示す、請求項５４に記載の方法。