CN1675354A - 体外受精 - Google Patents

体外受精 Download PDF

Info

Publication number
CN1675354A
CN1675354A CNA038195372A CN03819537A CN1675354A CN 1675354 A CN1675354 A CN 1675354A CN A038195372 A CNA038195372 A CN A038195372A CN 03819537 A CN03819537 A CN 03819537A CN 1675354 A CN1675354 A CN 1675354A
Authority
CN
China
Prior art keywords
embryo
cell
oxygen
ovocyte
sperm
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA038195372A
Other languages
English (en)
Inventor
斯文德·林登堡
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
KOEBENHAVNS AMTS SYGEHUS HERLE
Original Assignee
KOEBENHAVNS AMTS SYGEHUS HERLE
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by KOEBENHAVNS AMTS SYGEHUS HERLE filed Critical KOEBENHAVNS AMTS SYGEHUS HERLE
Publication of CN1675354A publication Critical patent/CN1675354A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0608—Germ cells
    • C12N5/061—Sperm cells, spermatogonia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M21/00—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses
    • C12M21/06—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses for in vitro fertilization
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/34—Internal compartments or partitions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/30—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
    • C12M41/34—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration of gas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/873—Techniques for producing new embryos, e.g. nuclear transfer, manipulation of totipotent cells or production of chimeric embryos
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0604—Whole embryos; Culture medium therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0608—Germ cells
    • C12N5/0609—Oocytes, oogonia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/02—Atmosphere, e.g. low oxygen conditions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/39—Steroid hormones
    • C12N2501/392—Sexual steroids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/48—Regulators of apoptosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2517/00—Cells related to new breeds of animals
    • C12N2517/10—Conditioning of cells for in vitro fecondation or nuclear transfer

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

本发明涉及一种用于制备哺乳动物前期胚胎和质量高于现有技术的干细胞的方法和系统。所述系统包括包括用于获得哺乳动物卵母细胞的装置和用于获得哺乳动物精子的装置和一个具有至少两个独立的气密腔室的设备，其中一个腔室中的氧压可以不依赖于另一个腔室的氧压而发生变化，所述至少两个独立的气密腔室构成了一个主腔室和至少一个驻留室。用于体外制备哺乳动物前期胚胎的所述方法包括步骤：a1)提供哺乳动物卵母细胞，a2)提供哺乳动物精子，b)培养卵母细胞和精子，c)用精子使卵母细胞受精从而获得受精卵母细胞，和d)使受精卵母细胞发生细胞分裂从而获得多细胞前期胚胎，其中a1)或a2)中的至少一个步骤是在氧压低于15％的条件中进行的，或者e)使受精卵母细胞发生细胞分裂从而获得多细胞前期胚胎，其中所述培养是在适于细胞培养的氧压时进行的并且其中至少一个步骤包括氧压力的变化。干细胞是由多细胞前期胚胎产生的。

Description

体外受精
技术领域
本发明涉及卵母细胞与精子的体外共培养、体外受精(IVF)和受精配子的体外培养，其中培养条件包括整个培养周期的低氧压或培养周期的各个阶段的低氧压，或者培养条件包括整个培养周期中的氧压变化或培养周期的各个阶段的氧压变化。本发明还涉及未成熟卵母细胞或精子的体外成熟(IVM)、成熟卵母细胞与精细胞共培养以使卵子受精。
技术背景
在自然界中，受精过程是精子细胞沉积到雌性温血动物(包括人类在内)体内，然后与卵母细胞结合并融合。然后该受精卵母细胞分裂形成胚胎。近几十年来，辅助生殖技术的应用使得科学家和临床医师能够干预这些事件，从而治疗一些个体的不孕症或者能够将精子、卵母细胞或胚胎贮存起来以备在其它地点和时间使用。体外受精(IVF)包括卵子的采集，例如通过腹腔镜检查进行采集，然后将卵子与精子混合，培养胚胎后将这些胚胎转移到雌性动物的子宫腔内而使其继续发育。最近的创新是引入了胞质内精子注射技术(ICSI)，该技术是将精子显微注射到卵子的胞质内。
在所述方法的每一个步骤中，体外干预降低了正常的存活率和精子、卵母细胞以及胚胎的功能。众多的研究已经致力于对这些方法的改进；然而，仍然不能获得彻底的成功。例如，不到20％的IVF尝试能够使孩子出生。卵母细胞和胚胎在培养后明显地丧失了功能。因此，尽管已经开展了几十年的工作，但是在辅助生殖技术领域中，尤其是在配子和胚胎的处理、培养和贮存方面还留有很大的改革空间。
尤其需要改进支持哺乳动物卵母细胞和胚胎的培养条件。经体外受精或转移的胚胎有很多在成熟前都停止了发育。结果对经济和人类水平都造成了影响。多次人类生育治疗计划涉及卵母细胞或胚胎的体外受精或转移。人类生育治疗的成功率并不高。由于成功率低，给经济和感情的投入带来了很大的损失。因此提高成功率是非常有益的。造成低成功率的众多原因之一是胚胎通常不能在体外正常生长和发育。改进培养条件以便更好地支持胚胎生长不仅提高了生育治疗的成功率而且还降低了由治疗导致的多胞胎率。由于目前方法的成功率一般较低，所以医生通常植入多个胚胎以便增加妊娠的可能性。然而多个胚胎的植入也同样增加了多胞胎的可能性。如果每个胚胎存活的可能性较高，那么可想而知同时植入多个胚胎的需要程度也就降低了，而且多胞胎的几率也就降低了。
现有技术记载了多种培养条件。US6140121中记载了一氧化氮对体外细胞如卵母细胞和胚胎的存活和发育具有不利的影响，尤其是在共培养系统中。向这种系统中添加一氧化氮抑制剂如血红蛋白可以消除该有害作用，这对体外哺乳动物卵母细胞、胚胎或其它细胞是有利的。
美国专利申请US20010028878记载了一种通过将未成熟人类卵母细胞在细胞培养基中培养10-30小时而使人类卵母细胞在体外成熟的方法。该成熟终点是分裂中期II。
US6140121记载了促进生殖细胞和胚胎的存活和功能的方法以及组合物。精子、卵母细胞和胚胎的体内或体外存活和功能通过利用含阿拉伯糖、半乳糖和/或己糖醛酸的多糖而得到改进。尤其是，含这种多糖的非杀精润滑油(例如阿拉伯胶、果胶或半乳糖醛酸)提高了性交、人工授精或精液采集过程中精子的授精率。
类似地，一种含有多糖的冷冻培养基提高了精子、卵母细胞或胚胎的存活力，所述多糖包括阿拉伯糖、半乳糖和/或己糖醛酸
US6110741记载了用于胚胎培养的含促性腺激素释放素的组合物和体外受精方法。在添加了外源性促性腺激素释放素(GnRH)的条件下培育灵长目动物胚胎导致绒毛膜促性腺激素产生量的增加，并伴有胚胎的存活力和着床力的提高。采用GnRH对体外受精的胚胎进行的治疗可被用来促进植入。GnRH的激动剂降低了胚胎的着床力，因而被用作受精后的避孕。
US6050935记载了一种阴道受精方法和包含主腔室(main chamber)和微腔(micro chamber)的培养器。
US5882928记载了哺乳动物卵母细胞体外成熟和受精的方法。一种体外受精方法包括在含卵母细胞成熟抑制剂的培养基中培养哺乳动物未成熟卵母细胞，该卵母细胞是在哺乳动物月经周期的极早期从哺乳动物的卵巢中取出的，除去所述抑制剂并使所述卵母细胞成熟和受精以便生成用于后来植入子宫的胚胎。优选，所述抑制剂是dbcAMP。
US 5837543记载了一个人类胚胎共培养系统，在该系统中，源自女性体内的卵母细胞与人输卵管上皮细胞的单层培养物接触；对所述卵母细胞授精；以及将胚胎移回到所述的女性体内。
US 5730777记载了一种用于在密封腔室内的气态环境下进行操作的装置，该装置包括i)形成第一腔室的第一腔壁，所述第一腔室内是气态环境和ii)形成第二个腔室的第二腔壁，该第二腔壁基本上将第一腔室密封起来，该第二腔室在第一与第二腔壁之间包含气态环境。
US 4892830记载了一种可进行环境调节的温育箱，在该温育箱内孵育腔室的外壳大大地减弱了波长小于约500nm的光线的传递，从而使得腔室内生物学物质免受短波长光线的有害作用。该温育箱还包括用于检测腔室内的氧气和二氧化碳浓度的传感器和用于将二氧化碳、氮气或氧气加入到温育箱内的气体环境中从而将二氧化碳和氧气维持在所需水平的装置(mean)。结果发现，空气中的标准氧浓度(21％)对小鼠的受精卵和前期胚胎有害。然而如果将氧气浓度降到5-10％，则没有观察到该抑制作用而且胚胎继续发育。
WO9830676记载一种用于细胞和组织，尤其是敏感细胞和组织如卵母细胞、受精卵母细胞和植前(pre-implantation)-胚胎的方法和温育箱，所述敏感细胞和组织需要高度稳定的适于体外发育的物理和化学环境，其被培养在浸没在恒温调控的液体浴中的密封容器中，该容器具有适宜的内部气体环境，该气体环境含有合适浓度的二氧化碳、氧气和湿度。
WO9967364记载了一种用于早期胚胎向胚泡期增殖的培养基。该培养基含有效量的人GM-CSF从而提高了发育后能转移有效胚泡的胚泡前胚胎的比率。它还记载了一种生成人早期胚胎以便转移胚泡的培养方法。该方法包括在含有效量的人GM-CSF的培养基中和在提高有效胚泡转移率的条件下将胚胎体外培育一段时间的步骤。还记载了包括使人早期胚胎生长以便转移有效胚泡的培养方法在内的IVF方案。
WO0032140记载了以下内容：与各种IVF中采用的将人生殖细胞浸没在单一培养基中的方法不同，该专利文献提供了一种方法，通过该方法生殖细胞可以象各种IVF方法一样移动(move)通过一系列不同的培养基。
发明概述
本发明涉及用于制备质量优于现有技术的哺乳动物前期胚胎(pre-embryo)的方法和系统，由此提高了利用该方法获得的前期胚胎通过体外受精妊娠的成功率。利用经本发明方法获得的前期胚胎还可以得到高质量的干细胞。
用于体外制备哺乳动物前期胚胎的所述系统包含
·用于获得哺乳动物卵母细胞的装置(means)，和
·用于获得哺乳动物精子的装置，和
·一个具有至少两个独立的气密腔室(air-tight chamber)的设备，其中一个腔室中的氧压(oxygen tension)可以独立于另一个腔室的氧压而进行变化，所述至少两个独立的气密腔室构成了主腔室(main chamber)和至少一个驻留室(residence chamber)，
·所述设备包含至少一个入口，该入口能够与用于获得哺乳动物卵母细胞和/或哺乳动物精子的装置互通(communication)，
·一个用于取出前期胚胎的出口，以及
·所述至少两个腔室之间的一个接口(communication port)，该接口使得卵母细胞、精子和/或前期胚胎能够在两个腔室之间进行转移。
一方面，所述系统被用于培养细胞培养物。原则上所有细胞培养物都可以在所述系统中进行培养，但是优选是利用该系统培养配子、胚胎、胚泡、干细胞和干细胞系。
所述系统能以不同的方式被用来培养细胞培养物。一方面，所述用于体外制备哺乳动物前期胚胎的方法包括下列步骤：
a1)提供哺乳动物卵母细胞，
a2)提供哺乳动物精子，
b)培养卵母细胞和精子，
c)用精子使卵母细胞受精从而获得受精卵母细胞，和
d)使受精卵母细胞分裂从而获得多细胞前期胚胎，
其中a1)或a2)中的至少一个步骤是在氧压低于15％.的条件中进行的。
另一方面，所述用于体外制备哺乳动物前期胚胎的方法包括下列步骤：
a)提供选自哺乳动物卵母细胞和哺乳动物精子的配子，
b)培养所述卵母细胞和精子，
c)用精子使卵母细胞受精从而获得受精卵母细胞，和
d)使受精卵母细胞分裂从而获得多细胞前期胚胎，
其中培养是在能够进行细胞培养的氧压下进行，且其中至少一个步骤包括氧压的变化。
一方面本发明包括一种用于植入前期胚胎的方法，包括按照本文进一步描述的方法培养卵母细胞和精子，并将得到的前期胚胎移入雌性哺乳动物的子宫内。
而且高质量的前期胚胎还可用于胚胎干细胞的生产。高质量的胚胎含有内细胞团(inner cell mass)数量增加的细胞，结果导致更多干细胞发育。
所述生产干细胞的方法包括：
a)提供本文记载的多细胞前期胚胎，
b)分离出a)中的多细胞前期胚胎，
c)从b)中的前期胚胎的内细胞团中分离出细胞，
d)在基质胶中培养从所述内细胞团中分离出的细胞，
e)获得干细胞。
另一方面是获得的干细胞，该干细胞是由本文记载的方法从多细胞前期胚胎中获得的。
一方面是干细胞，其中所述干细胞是稳定的，也就是说染色体内或细胞表面抗原性不发生突变或其它遗传改变。
干细胞可以发育成一个或多个干细胞系。一方面涉及从由本文记载的方法产生的干细胞得到的干细胞系。
可以诱导干细胞产生多种分化细胞。因此重要的是了解干细胞系的起源和用于培养所述干细胞系的培养条件。
一方面所涉及的干细胞包装产品包括：
°由本文其它部分记载的多细胞前期胚胎发育而成的干细胞
°记载干细胞和获得所述干细胞的细胞培养物的培养条件的说明书。
定义
本文中的术语“凋亡(apoptosiss)”应当被理解为受控制的细胞死亡，其中细胞本身破坏了其细胞核DNA，也就是DNA链发生断裂。
本文中的术语“裂球(blastomer)”是指卵裂后的胚胎中出现的小细胞。
本文中的术语“胚泡”和“多细胞-前期胚胎”可以互换使用，用来描述由受精卵早期分裂后的细胞簇组成的胚胎，所述细胞簇由能够形成胎盘的外层细胞和能够形成胚胎的内细胞团组成。
本文中的术语“氧压变化”是指氧压降低或增加的情况。所述变化在细胞发育阶段进行，该变化基于视觉或图像上的判断或基于对细胞培养物的发育时间框架的了解或基于前期胚胎代谢的变化。
本文中的术语“胚胎”是指构成具有两个原核(pro-nucleus)的细胞的受精卵，或已经进行了细胞分裂和由两个细胞形成一个细胞簇的受精卵。
本文中的术语“配子”是指雌性动物的未受精卵或雄性动物的精子。
本文中的术语“植入”是指将胚胎转移到雌性动物的子宫内。
本文中的术语“IVM”是指“体外成熟”。
本文中的术语“IVF”是指“体外受精”。
本文中的术语“低氧压”是指低于15％的氧压。
本文中的术语“MF-II”是指处于第二次细胞减数分裂中期的卵母细胞。MF-II卵母细胞具有一个极体、膨胀的(expanded)卵丘(cumulus)复合体并且最终经历生发泡的裂解。
本文中的术语“卵母细胞”是指雌性动物的配子。该配子可以是未成熟的也可以是成熟的。
本文中的术语“氧压”是指组织的气相中的氧浓度或细胞培养系统周围的氧浓度。
本文中的术语“氧压单位”被用来描述氧压的变化，例如从3％到5％的变化是2个单位的变化。
本文中的术语“初级卵母细胞”是指未成熟卵母细胞。该卵母细胞直到第一次减数分裂结束后才成熟。
本文中的术语“前期II(prophase II)”是指第二次减数分裂的前期(prophase)。
本文中的术语“精子”是指雄性动物的配子。所述精子可以是成熟的或不成熟的，在成熟期，它能够穿透卵母细胞并使其受精。
本文中的术语“干细胞”是指得自胚泡的内细胞团的未分化多潜能细胞或全潜能细胞。
本文中的术语“干细胞系”是指得自干细胞的细胞培养物，该干细胞系是稳定的，也就是说它经过一段时间的培养而不发生变化。干细胞系可以是部分分化的或未分化的，即多潜能的或全潜能的，多潜能是指它能在动物体内发育成一些而不是所有的细胞类型，或者全潜能是指能够分化成所有的细胞类型。
本文中的术语“合子”是指受精卵或1-细胞胚胎。
本文中的术语“透明带”是指胚胎壳。
附图说明
图1表示基于VanAbbel等的胚胎评价体系。
图2表示累积胚胎评价(CES)系统。
图3表示温育箱。
发明详述
以下说明书公开了一种体外制备哺乳动物前期胚胎的方法，该方法包括以下步骤：a)提供选自哺乳动物卵母细胞和哺乳动物精子的配子，b)培养所述卵母细胞和精子，c)用精子使卵母细胞受精从而获得受精卵母细胞，以及或者d)使受精卵母细胞分裂从而获得多细胞前期胚胎，其中至少步骤a)或b)是在氧压低于15％的条件中进行的，或者e)使受精卵母细胞分裂从而获得多细胞前期胚胎，其中所述培养是在能够进行细胞培养的氧压下进行且其中至少一个步骤包括氧压的变化。所述氧压变化包括在单个步骤中至少是在两种不同的氧压下培养细胞培养物。所述氧压变化随着其它部分记载的细胞培养物的发育阶段而进行。具体地讲，在环境氧压下处理(handling)或观察细胞培养物并不是所述氧压变化，这是本发明的目的。
通过改变或降低IVF过程中一些步骤的氧压或者改变或降低所有IVF步骤的氧压，可以提高配子和胚胎的质量。
在包括氧浓度为20-21％在内的环境条件下培养哺乳动物配子、体外受精的卵母细胞或胚胎被认为抑制了配子和卵子。将氧浓度降到1％至15％，或将氧浓度降到1％至19％并且在a)、b)、c)和e)中的一个步骤或所有步骤中改变氧压以便使更多的胚胎可以达到胚泡期。人类体外成熟和体外授精技术中存在的问题之一是游离活性氧(reactive oxygen species)的活化和浓度，所述游离活性氧最初由高氧压产生并且在制备精子和体外受精过程中进行补给。通过在低氧压或变化的氧压下处理和培养配子和胚胎，并且将卵母细胞和精子共培养，使IVF方法获得了改进，令人惊奇的是，IVF方法的改进是在与滋养细胞共培养的情况下获得的。
在如上所述的发明中，a)，b)，c)和d)中的一个或更多步骤可以在低氧压下进行，而在如上所述的发明中，a)，b)，c)和d)中的一个或更多步骤也可以在低氧压或高氧压下进行。
本发明的一个优选实施方案是其中至少a)步骤的一部分步骤和至少一个其它步骤是在氧压低于15％的条件中进行的体外培养方法。在一个实施方案中，步骤a)和b)是在低氧压时进行的。更优选的实施方案是其中a)，b)，c)和d)中的至少3个步骤是在氧压低于15％的条件中进行的方法。在另一个实施方案中，步骤a)，b)和c)是在低氧压时进行的。在另一个实施方案中，步骤b)、c)和d)是在低氧压时进行的。在另一个实施方案中，步骤a)，c)和d)是在低氧压时进行的。在另一个实施方案中，步骤a)，b)，c)和d)都是在低氧压时进行的。
所述方法的另一个优选实施方案是其中步骤d)的氧压比b)和c)中的任一个步骤的氧压高。
所述方法的另一个优选实施方案是其中a)，b)，c)和d)中的所有步骤以及将胚胎转移到子宫内的步骤是在氧压低于20％，诸如低于15％、诸如低于13％、诸如低于11％、诸如低于10％、诸如低于9％、诸如低于8％、诸如低于7％、诸如低于6％、诸如低于5％、诸如低于4％、诸如低于3％、诸如低于2％、诸如低于1％时进行的。
本发明的一个优选实施方案是本文记载的其中氧压的变化发生在步骤a)的体外培养方法。本发明的另一个优选实施方案是本文记载的其中氧压的变化发生在步骤b)的体外培养方法。本发明的一个优选实施方案是本文记载的其中氧压的变化发生在步骤c)的体外培养方法。本发明的一个优选实施方案是本文记载的其中氧压的变化发生在步骤e)的体外培养方法。
本发明的一个优选实施方案是本文记载的其中氧压的变化发生在步骤a)和步骤b)的体外培养方法。本发明的一个优选实施方案是本文记载的其中氧压的变化发生在步骤a)和步骤c)的体外培养方法。本发明的一个优选实施方案是本文记载的其中氧压的变化发生在步骤a)和步骤e)的体外培养方法。本发明的一个优选实施方案是本文记载的其中氧压的变化发生在步骤b)和步骤c)的体外培养方法。本发明的一个优选实施方案是本文记载的其中氧压的变化发生在步骤b)和步骤e)的体外培养方法。本发明的一个优选实施方案是本文记载的其中氧压的变化发生在步骤c)和步骤e)的体外培养方法。
特别是在卵母细胞的成熟过程中氧压的升高是优选的。
本发明的一个优选实施方案是本文记载的其中氧压的变化发生在步骤a)、b)和c)的体外培养方法。本发明的一个优选实施方案是本文记载的其中氧压的变化发生在步骤a)、b)和e)的体外培养方法。本发明的一个优选实施方案是本文记载的其中氧压的变化发生在步骤a)、c)和e)的体外培养方法。本发明的一个优选实施方案是本文记载的其中氧压的变化发生在步骤b)、c)和e)的体外培养方法。
本发明的一个优选实施方案是本文记载的其中氧压的变化发生在步骤a)、b)、c)和e)的体外培养方法。
在一个实施方案中，所述培养条件包括最初被选定浓度在1％至21％之间的氧压。
在一个实施方案中，氧压的变化是将氧压变为低于20％，例如低于19％，诸如低于18％，例如低于17％，诸如低于16％，例如低于15％，诸如低于14％，例如低于13％，诸如低于12％，例如低于11％，诸如低于10％，例如低于9％，诸如低于8％，例如低于7％，诸如低于6％，例如低于5％，诸如低于4％，例如低于3％，诸如低于2％，例如低于1％。
在另一个实施方案中，氧压的变化是将氧压降低至少1个单位，诸如至少2个单位，例如至少3个单位，诸如至少4个单位，例如至少5个单位，例如至少6个单位，诸如至少7个单位，例如至少8个单位，诸如至少9个单位，例如至少10个单位，诸如至少11个单位，例如至少12个单位，诸如至少13个单位，例如至少14个单位，诸如至少15个单位，例如至少16个单位，诸如至少17个单位，例如至少18个单位，诸如至少19个单位。
在另一个实施方案中，氧压的变化是将氧压降低1-19个单位，诸如1-18个单位，例如1-17个单位，诸如1-16个单位，例如1-15个单位，诸如1-14个单位，例如1-13个单位，诸如1-12个单位，例如1-11个单位，诸如1-10个单位，例如1-9个单位，诸如1-8个单位，例如1-7个单位，诸如1-6个单位，例如1-5个单位，诸如1-4个单位，例如1-3个单位，诸如1-2个单位。
在一个实施方案中，氧压的变化是将氧压变为高于2％，例如高于3％，诸如高于4％，例如高于5％，诸如高于6％，例如高于7％，诸如高于8％，例如高于9％，诸如高于10％，例如高于11％，诸如高于12％，例如高于13％，诸如高于14％，例如高于15％，诸如高于16％，例如高于17％，诸如高于18％，例如高于19％，诸如高于20％，例如高于21％。
在另一个实施方案中，氧压的变化是氧压被升高了至少1个单位，诸如至少2个单位，例如至少3个单位，诸如至少4个单位，例如至少5个单位，例如至少6个单位，诸如至少7个单位，例如至少8个单位，诸如至少9个单位，例如至少10个单位，诸如至少11个单位，例如至少12个单位，诸如至少13个单位，例如至少14个单位，诸如至少15个单位，例如至少16个单位，诸如至少17个单位，例如至少18个单位，诸如至少19个单位。
在另一个实施方案中，氧压的变化是将氧压升高至少1-3个单位，诸如至少2-5个单位，诸如至少3-7个单位，诸如至少4-9个单位，诸如至少5-11个单位，例如至少6-13个单位，诸如至少8-15个单位，例如至少10-18个单位，诸如至少12-20个单位。
在一个优选的实施方案，发生上述变化的氧压被调节到高于或低于上述的最初氧压。因此发生变化的氧压被调节到1％至21％的浓度。
氧压的监控和调节可以通过本技术领域的技术人员已知的任何方法来进行。
所述方法的另一个优选实施方案是其中所述条件包括氧压的升高以及后来氧压的降低。所述氧压的升高是至少2个单位，且所述氧压的升高维持至少30分钟。在一个实施方案中，氧压至少是0.5％，最大是20％。特别是使卵母细胞成熟时，氧压的升高是优选的。
在另一个实施方案中，氧压的变化进行至少1分钟，例如至少2分钟，诸如至少3分钟，例如至少4分钟，诸如至少5分钟，例如至少6分钟，诸如至少7分钟，例如至少8分钟，诸如至少9分钟，例如至少10分钟，诸如至少11分钟，例如至少12分钟，诸如至少13分钟，例如至少14分钟，诸如至少15分钟，例如至少16分钟，诸如至少20分钟，例如至少30分钟，诸如至少45分钟，例如至少1小时，诸如至少1.5小时，例如至少2小时，诸如至少2.5小时，例如至少3小时，诸如至少4小时，例如至少5小时，诸如至少6小时，例如至少7小时，诸如至少8小时，例如至少9小时，诸如至少10小时。
在一个优选的实施方案中，所提到的组合方式中的a)，b)，c)和e)中的每个步骤中氧压的变化按照上述记载的持续时间进行一次或多次。
在一个实施方案中，上述的变化持续时间被应用于所提到的a)，b)，c)和e)步骤的每种组合方式中，其中在一个或多个步骤中氧浓度发生变化。
所述方法的另一个优选实施方案是其中氧压根据细胞所处周期或阶段或细胞结构和卵母细胞或胚胎的条件或质量进行调节。
在一个实施方案中，如本文所记载的细胞培养包括在本发明b)步骤中雌性和雄性配子的共-培养。所述共培养可以进行至少1分钟，诸如至少2分钟，诸如至少5分钟，诸如至少10分钟，诸如至少30分钟，诸如至少1小时，诸如至少2小时，诸如至少3小时，诸如至少4小时，诸如至少5小时，诸如至少10小时，诸如至少15小时，诸如至少20小时，诸如至少25小时，诸如至少30小时，诸如至少35小时，诸如至少40小时，诸如至少45小时，诸如至少50小时。
在另一个实施方案中，所述氧压变化进行至少1分钟，例如至少2分钟，诸如至少3分钟，例如至少4分钟，诸如至少5分钟，例如至少6分钟，诸如至少7分钟，例如至少8分钟，诸如至少9分钟，例如至少10分钟，诸如至少11分钟，例如至少12分钟，诸如至少13分钟，例如至少14分钟，诸如至少15分钟，例如至少16分钟，诸如至少20分钟，例如至少30分钟，诸如至少45分钟，例如至少1小时，诸如至少1.5小时，例如至少2小时，诸如至少2.5小时，例如至少3小时，诸如至少4小时，例如至少5小时，诸如至少6小时，例如至少7小时，诸如至少8小时，例如至少9小时，诸如至少10小时。
在一个优选的实施方案中，所提到的组合方式中a)，b)，c)和e)每个步骤中氧压的变化按照上述记载的持续时间可进行一次或多次。
在一个实施方案中，上述的变化持续时间被应用于所提到的a)，b)，c)和e)步骤的每种组合方式中，其中在一个或多个步骤中氧浓度发生变化。
卵母细胞和精子共培养的目的是提高卵母细胞的受精率。而且，所述培养条件与卵母细胞和精子的培养条件相同，也能够提高受精率。
配子
以上记载的发明可以利用任何种类的能够参与胚胎形成的细胞来进行，这种细胞的实例包括哺乳动物的卵母细胞和精子细胞。哺乳动物卵母细胞和哺乳动物精子是分别从雌性哺乳动物或雄性哺乳动物获得的配子。这些哺乳动物可以是，但不限于，人、耕畜如牛(cow)、猪、马、山羊、绵羊、鹿，其它种类的家畜如狗，猫，实验动物如兔、大鼠、小鼠、猴子或濒于灭绝的动物种类或受到威胁的动物种类(包括但不限于老虎、狮子、熊猫、大猩猩(gorilla)、鲸)，或由人控制配对的的其它哺乳动物，包括但不限于，耕畜育种、家畜育种或使得在限制动物找到配偶的条件下生存的动物(动物园动物)配对，尤其是要避免任何近交的危险。
在一个优选的实施方案中，哺乳动物卵母细胞和哺乳动物精子是从牛获得的配子。在另一个优选的实施方案中，哺乳动物卵母细胞和哺乳动物精子是从猪获得的配子。在另一个优选的实施方案中，哺乳动物卵母细胞和哺乳动物精子是从马获得的配子。在一个更优选的实施方案中，哺乳动物卵母细胞和哺乳动物精子是从人获得的配子。
卵母细胞
在多数情况下，上述卵母细胞是从希望怀孕的雌性母本获得的。而精子细胞是从可能是雄性配偶的雄性动物获得的，或者配子是从成为配偶的雌性和雄性动物获得。然而在一些情况下，优选使用得自雌性或雄性供体的细胞。
在一个优选的实施方案中，所述卵母细胞是从雌性动物卵巢中获得的未成熟卵母细胞。该卵母细胞是未成熟的，但一离开卵巢它就成为成熟卵母细胞。在雌性胚胎的卵巢中，初级卵母细胞启动第一次减数分裂的前期，在该阶段中，周围的上皮细胞进行发育且原始卵泡形成。含有处于第一次减数分裂前期与中期之间的核网期的卵母细胞的原始卵泡构成静止期，它从出生前开始直到至少青春期或一直到原始卵泡重新进入第一次减数分裂。进入原始卵泡期时，仍处于核网期的初级卵母细胞开始体积增大，周围的卵泡细胞从扁平变成立方形，然后卵母细胞与卵泡细胞之间的透明带发育。在卵母细胞和透明带周围开始长出厚细胞层，在该细胞层内侧出现了充满液体的空间，当这些空间融合在一起时就形成了囊(antrum)。当所述囊达到其最大尺寸时，卵泡成熟，被称作三级卵泡、Graafian卵泡或囊状卵泡，其直径达到6-12mm。一旦卵泡成熟，初级卵母细胞就恢复了其第一次减数分裂，并且该第一次减数分裂后马上排卵。第二次减数分裂紧接在第一次减数分裂之后开始，而且当次级卵母细胞显示形成纺锤体时，排卵，并且该卵母细胞从卵巢排出。在即将排卵前，成熟卵泡的直径约为15mm。如果卵母细胞受精，则可以完成第二次减数分裂。
在另一个优选的实施方案中，卵母细胞得自初级卵泡、次级卵泡、原囊状(preantral)卵泡、早期囊状卵泡或囊状卵泡。在本发明的一个优选实施方案中，获得了源自处于后原始阶段或初级阶段的卵泡核网期的卵母细胞。
正常排卵的妇女在每个月经周期将募集(recruit)约300个如上所述的未成熟卵母细胞。这种蓄积在实际周期前进行。在行经那一天，仍存在约20-30个未成熟卵母细胞。正常情况下，在凋亡过程中，除一个卵母细胞外，其于所有的卵母细胞都将在排卵前死亡。在第5-10天，约10-15个未成熟卵母细胞将存在于其直径为10-12mm的小卵泡中。一些仍在生长而另一些则开始进行凋亡过程。任选地本发明中使用的配子来源于直径约为8-12mm的卵泡。这种小卵泡的优点在于它们以相当大的数目存在而不需重度激素处理，它们可以用超声检测并且可以通过超声引导的阴道卵泡穿刺法来取出卵母细胞。
卵母细胞可以通过吸入针而从卵巢中取出。卵母细胞的获得通常由两种常规方法中的一种方法来实现。第一种，超声辅助吸引术是一种较小的手术操作，可以利用静脉内无痛法(analgesia)来完成。通常，将超声探头从阴道插入。所述探头发出高频声波，这些声波被转化为骨盆的图像而显示于监视屏上。当识别到一个成熟卵泡时，专业人员通过阴道将针导入卵泡。利用抽吸装置将卵子由针内取出。这被称作吸引法。所述针还可以通过腹腔壁或膀胱导入卵泡。这些方法在利用针通过阴道很难接近卵巢和其卵泡时是必需的。腹腔镜检是一种通常需要全身麻醉的外科手术。在手术室内，外科医生通过妇女肚脐下或内部的切口插入腹腔镜，所述腹腔镜是酷似望远镜的长而细的管子。通过腹腔镜观察，外科医生将针通过腹腔壁导入卵泡。然后吸出卵子和卵泡液。
在本发明的另一个实施方案中，通过取出含有初级、次级或囊状卵泡的部分或全部卵巢组织并从所述卵巢组织中获得初级、次级或囊状卵泡来得到源自卵巢的卵母细胞。卵母细胞可以从刚由雌性动物体内取出的卵巢组织中获得，并且进一步成熟直到受精阶段。卵母细胞被从卵巢组织中分离出来后还可以被冷藏(cool)或冷冻(freeze)而且进一步成熟直到受精阶段。从雌性动物体内中取出的卵巢组织可以在分离卵母细胞之前进行冷藏或冷冻。
在一个优选的实施方案中，被用来收集卵母细胞的针是注射器的一部分且所述针和所述注射器内的氧压受到控制。针和注射器可以构成一个独立的单元，易于操作而且其中氧压通过与控制单元连接而被维持在一定的压值。载有卵母细胞的注射器被转移到无菌条件下，在该无菌条件下所述卵母细胞被转到培养基中。所述无菌条件可以构成空气层流台(laminar airflow bench)或温育箱的工作区域。在一种方法中所述卵母细胞还可被转移到培养器中，在该容器内注射器的针刺穿温育箱的隔膜，然后无需打开温育箱就能将卵母细胞转移到培养器内。针和注射器还可以与温育箱直接相连。卵母细胞被以这种方式通过针和管从卵巢直接转移到温育箱的培养器中。因此，无论哪种方法，优选是在低氧压下转移卵母细胞。
在一个实施方案中，用能够使卵母细胞成熟的激素治疗哺乳动物，然后从该哺乳动物获得卵母细胞。总之，有两次时机可以收集卵母细胞。通过对妇女施用激素来收集多个成熟卵母细胞，或者不对雌性动物进行激素治疗就收集未成熟卵母细胞，然后卵母细胞再进行体外成熟。基于激素治疗的方法如下所述：在提高排卵能力的过程中，采用药物进行诱导以使患者的卵巢排出数个成熟卵子而不象通常每月只发育出单个卵子。上述过程通常称为提高卵泡的募集或控制卵巢的过度刺激。根据方案和患者的具体情况，可以调整药物类型和剂量。经常是，在7至10天内给药。目前使用的药物，包括但不限于：克罗米芬(clomiphene)柠檬酸盐、人绝经促性腺激素(hCG)和被称作亮丙瑞林(leuprolide)的促性腺激素释放激素(GnRH)类似物。多数这些药物可以单独使用或与其它药物联合用药。
当临近收集卵母细胞的时间时，用超声频繁扫描卵巢来监控卵泡的发育，所述卵泡是供卵子生长的充满了液体的囊。取血样测定雌激素的血清浓度，有时也测定促黄体激素(LH)。
雌激素的产生随着卵泡的发育增加。LH引发(trigger)排卵。通过分析超声和血液检测结果，确定出收集或取出卵子的最好时机。当卵泡差不多成熟时(通常是在排卵的1天半前)，注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)。由于大约36小时后进行排卵，所以使用hCG能够控制发生排卵的时间。HCG刺激妇女的LH的自然释放，LH的自然释放通常引发排卵。该释放还引起卵子发生改变以便后来精子进入时而受精。
还可以收集未成熟卵母细胞并将其用于IVF中。用未成熟配子起始的优点有若干个。处于不孕症治疗的妇女通常进行多天的激素复杂处理以便得到足够数目的成熟前期II卵母细胞来用于体外受精。该激素治疗伴随疼痛、不适、紧张和卵巢过度刺激综合症(一种患者和医生感到畏惧的病症)的危险。这种激素疗法被制定用来挽救未成熟卵母细胞，否则这些未成熟卵母细胞将发生凋亡。因此，这些激素是卵巢中进行IVF所需的大量卵母细胞从未成熟到成熟所必需的。如果不施用激素，那么就象正常排卵妇女一样只有一个卵母细胞成熟。在凋亡过程开始前，通过从卵巢中释放这些未成熟卵母细胞并且在临床规定的培养基中使所述卵母细胞成熟，妇女可以避免激素治疗所带来的风险与不适而且仍然具有充足数目的成熟中期(MF-II)卵母细胞被用于后来的IVF治疗。
在一个优选的实施方案中，如上所述的激素治疗是利用促性腺激素来进行。因此，所述治疗可以涉及外源或内源激素以及其它作用于FSH或LH受体的药物。在另一个优选的实施方案中，所述激素是促卵泡激素(FSH)。在另一个优选的实施方案中，所述激素是促黄体激素(LH)。在另一个优选的实施方案中，所述激素是FSH或LH的衍生物或内源性相关激素。
冷冻保存
在本发明的一个实施方案中，上述获得的卵母细胞被保存起来以备后用，所述保存就是冷冻保存。当按照所述方法收集卵母细胞时，获得了多个卵母细胞，并不是所有这些卵母细胞立刻进行受精过程。在一个实施方案中，保存过程中，卵母细胞被冷藏到20℃以下，诸如10℃以下，诸如5℃以下。另一实施方案中，在保存过程中，卵母细胞被冷冻到0℃以下，诸如约-40℃，诸如约-80℃。
在IVF循环结束时，通常得到多个可用于移植的胚胎，剩余的胚胎可以按照上述方法保存起来。已经发现，移植四个以上的胚胎具有多胎妊娠的显著风险，然而它并不增加单胎妊娠比率。冷冻保存的优点是增加了妊娠的机会而不需要多次循环刺激和多次索取卵母细胞。
被选用于冷冻的胚胎可以在新鲜胚胎转移的当天冷冻或者在后来的最多四天内冷冻。可以将胚胎放置在冷冻培养基中并逐步进行冷冻。在冷冻过程结束时，可以将胚胎保存在液氮中。
精子
在上述的IVF过程中，需用精子使卵母细胞受精。所获得的用于本发明的精子可以是未成熟的精子，诸如精细胞、初级精母细胞、次级精母细胞或成熟精子。由一个初级精母细胞通过减数分裂可以得到四个精子，所述减数分裂包括第一次和第二次减数分裂。
在本发明的一个实施方案中，所述精子是在根据所采用的培养条件确定的氧压下从雄性动物获得的。雄性的精子细胞或精子通常是通过手淫获得的。另一种收集精细胞的方法是手术方法，其中将针导入男子的睾丸，然后将精细胞吸入针管。另一种方法是通过机械刺激射精并收集精液而获得。采用一种已知的洗精液的方法从精液中分离出精子。在该方法中，于试管中将精子与水溶液混合起来。然后将该试管置于离心机中并以高速旋转。离心力使得重量较大的精细胞沉淀于液层下。小心移去该液层后再注入新鲜溶液。过1小时左右，一些运动的精子飘浮到液层当中。这些精子能被用来使卵子受精。
从患有严重雄性不孕症的雄性体内收集精子，通过针穿刺活组织检查或显微外科技术可以回收到未成熟的精细胞。未成熟精子细胞及其周围的足细胞由于在培养基中具有抗凋亡活性而使精子受益和成熟。已知睾丸中的凋亡是精子功能丧失的主要因素，尤其是在不孕的雄性中。在雄性动物体内，所有有尾精子前体直到全部胞质脱离且最终看到正常精子之前都被看成是未成熟的。还可以从死亡的男性或雄性动物获得未成熟的精子细胞。而且，如果患者被诊断患有癌症，可以切下睾丸或卵巢组织并在开始可能导致不孕的处理前冷冻起来以备后来从冷冻组织中提取未成熟配子，其中所述处理如细胞抑制处理或放射处理。这些不成熟配子可以最终在合成培养基中成熟起来。
在一个实施方案中，所述精子细胞在被用于授精过程之前被冷藏。在另一个实施方案中，所述精子细胞在被用于授精过程之前被冷冻。所述冷藏和冷冻过程是为以后利用精子提供机会的贮存条件。
IVM
本发明的一个实施方案涉及IVF以及IVM，参见上述定义。在一个优选的实施方案中，本发明涉及IVM。人类配子的体外成熟是将未成熟人类配子培养在细胞培养基中。如此源自男性的配子成为未成熟精子细胞，如此源自女性的配子成为未成熟卵母细胞。通过从卵巢或睾丸组织中抽吸和提取可以从不孕症治疗的女性或男性获得未成熟配子。
收集处于体外成熟(IVM)后的不同阶段之一的卵母细胞。在一个实施方案中，从卵泡中分离出未成熟配子。在一个实施方案中，所述卵泡的直径为1-25mm，诸如2-18mm，诸如3-13mm，诸如5-12mm，诸如7-11mm，诸如8-10mm。
在另一个实施方案中，未成熟配子是初级卵母细胞。在另一个实施方案中，未成熟配子处于第一次减数分裂前期。在另一个实施方案中，未成熟配子处于第一次减数分裂核网期。在另一个实施方案中，未成熟配子处于第一次减数分裂中期的后期。在另一个实施方案中，卵母细胞得自初级卵泡。在另一个实施方案中，卵母细胞得自成熟卵泡。
一个实施方案中，未成熟配子选自初级卵原细胞或后期卵母细胞。
在本发明的一个实施方案中，得自妇女卵巢的未成熟卵母细胞被确认为是具有紧密卵丘质(tight cumulus mass)、见不到极体或生发泡的卵母细胞。
在一个优选的实施方案中，被收集的未成熟配子被培养并发育成熟直到中期II，该中期II伴有卵丘、细胞质和细胞核的同步成熟。卵母细胞的成熟是卵母细胞发育的最后阶段，它为受精和胚胎发育作好准备。其可被分为两个常规过程：细胞核的成熟和细胞质的成熟。细胞核的成熟被定义为减数分裂的恢复(resumption)和向MF-II的进展，而细胞质成熟被定义为基因组外的变化(该变化是为卵子活化作准备)、原核形成和早期胚胎发生。因此未成熟雌性配子应当被理解为是，通过与成熟精细胞接触中止了减数分裂从而没能接受来自精细胞的遗传物质并形成受精细胞的卵细胞。MF-II应当被理解为是具有极体、膨胀的卵丘复合体并最终经历了生发泡破裂的卵母细胞。这些卵母细胞很容易通过一般用来处理用于IVF的卵母细胞的常规技术来识别。对于人类来说，有可能产生其细胞核成熟期已经进行到MF-II的卵母细胞，但是这些卵母细胞不能完成植入前的发育。将未成熟配子从前期培育到中期II的体外成熟过程可以在20至30个小时内完成。
在本发明中，确定细胞阶段的标准不仅是细胞核的成熟期而且是细胞质和卵丘的膨胀。本发明的另一个特征在于所述成熟过程完成得更快。因此，未成熟配子在10至30小时内(诸如24至30小时，即24至26小时)完成从前期到MF-II的发育。该快速成熟可以使卵丘膨胀失败和胞质失调的危险性最小化。而且，它能使卵母细胞的暴露最小化从而使体外培育的时间比所需的时间更长。
合成的细胞培养基可以用于上述成熟过程。术语“合成培养基”是指不含生物学方法提取的血清物质并且其中所有组分及其浓度是已知的和被记载过的培养基。术语“生物学方法提取的血清物质”包括诸如免疫球蛋白等物质。激素如生长激素和促性腺激素不认为是从血清中提取出来的。如果向培养基中添加激素或得自血清的物质，优选重组的激素或得自血清的物质。
利用不含生物学提取的血清物质的培养基的优势在于不存在病毒或其它病原体或有害颗粒被带入培养基并随后带入胚胎的危险被大大减小或根本不存在。而且，血清有可能含有一种目前未知的抑制细胞核、细胞质同步成熟和卵丘膨胀的因子。
因此，本发明的一个方面涉及一种避免非授精配子在体外成熟过程中感染或污染含有已知和/或未知感染因子(诸如朊病毒、类病毒、病毒、支原体、细菌、真菌)的方法，该方法通过在不含源自至少可能含有感染因子的原料的组分的培养基中培养所述配子。在一个优选的实施方案中，该方法涉及避免污染毒性、致畸、致癌或诱变组分。
适于本发明使用的培养基的实例是：含有至少一种能够同时使细胞核、细胞质和卵丘细胞成熟的因子的培养基。在一个优选的实施方案中，所述培养基含有合成的脂质或脂质前体，诸如甾醇或其可代谢的衍生物。这可以是可的松(cortisone)。利用这些化合物的优点在于能够稳定细胞膜、提供用于膜构建的前体和作为在卵丘卵母细胞复合体中参与局部旁分泌类固醇产生的物质。可的松或其衍生物还可直接参与刺激这些未成熟卵母细胞而且最终使这些卵母细胞同步成熟。
基础培养基应当是一种既能供养卵母细胞也能供养其卵丘细胞的培养基。在本技术领域中已知向成熟培养基中添加促性腺激素和/或类固醇诸如E2能够增强例如牛、猴和人卵母细胞的授精能力和/或发育能力。向人IVM培养基中添加促性腺素(FSH和hCG)已经被广泛应用但其最适浓度(或绝对必要性)还未得到充分的确定。卵丘细胞可被确定为是一种与其它类型的体细胞的共培养物(c-culture)，它们通常需要培养基中的中高度蛋白浓度。已经提出卵母细胞需要用雌激素来启动以便产生Ca++振动(oscillation)。因此本发明的培养基优选含有雌激素，其浓度为0.1-10.mu.g/mL雌二醇17-.β，例如0.3-3.mu.g/mL雌二醇17-.β，优选1.mu.g/mL雌二醇17-.β。
在本发明的一个更优选的实施方案中，所述合成培养基含有作为抗凋亡物质的ATA(金精三羧酸(Aurin Tricarboxylic Acid))。ATA的优势在于其可能提供抑制凋亡过程而不损害卵母细胞成熟的最佳条件。ATA存在的另一优势在于其使血清衍生产物如HSA或BSA的浓度降低，以至于血清衍生产物的浓度是零。
由于取回的(retrieved)卵母细胞的卵丘体已经处于凋亡过程所以使用抗凋亡的物质是优选的。当在卵母细胞-卵丘复合体中开始凋亡时，就预示着成熟的开始。
然而，当该过程在正常卵巢中进行时，将诱导卵母细胞中的凋亡。当诱导成熟期开始的凋亡信号发出后就将卵母细胞从卵巢中取出，在含有例如终止进一步凋亡的ATA的简扼长江培养基中将进行全面的发育。
所述培养基可以是一种如PCT/EP97/06721中所记载的一种培养基，其被引入本文作为参考。作为所述培养基的添加剂，使用EP1090300或WO9967365中所使用的添加剂，这些添加剂被表示为Medi-Cult SSR 4x、Medi-Cult SSR 4xa，、Medi-Cult SSR 4xb、Medi-Cult SSR1或Medi-Cult SSR2。作为基础培养基，优选的培养基是EP1090300中记载的Medi-Cult BBEM。
除了培养基中的内含物外，当为了获得可以受精的卵母细胞而进行体外培养时其它因素也是重要的。这些因素包括吸出卵母细胞的时机和吸出时的卵泡的大小。卵泡生长过程中的凋亡早期或人工平台期可模拟具有发育能力的最终排卵前卵泡成熟期。
哺乳动物卵母细胞的体外培养不但涉及卵泡的生长，而且还涉及卵泡和卵母细胞的大小。人卵母细胞看起来具有依赖于恢复减数分裂和结束成熟期的能力的大小。可以观察到，从小于8mm的卵泡获得的卵母细胞的成熟率和裂解率降低。这些结果表示人卵母细胞成熟的能力与卵泡的成熟密切相关。如上所述，取回的正在成熟中的卵母细胞处于凋亡的早期。因此，随着卵母细胞体积的增大，获得凋亡晚期的卵母细胞的风险则增大，也就是说卵母细胞接近于死亡细胞的风险增大。基于这些实验，取回的卵母细胞的优选尺寸小于12mm。
在本发明的一个实施方案中，体外成熟是在氧压低于20％，诸如低于15％、诸如低于13％、诸如低于11％、诸如低于10％、诸如低于9％、诸如低于8％、诸如低于7％、诸如低于6％、诸如低于5％、诸如低于4％、诸如低于3％、诸如低于2％、诸如低于1％或在本文其它部分记载的条件中进行的。
在本发明的另一个实施方案中，体外成熟是在上述低氧压时进行的。一种培养条件是氧压的暂时升高，其中所述升高是氧压升高至少1个单位，诸如至少2个单位，例如至少3个单位，诸如至少4个单位，例如至少5个单位，例如至少6个单位，诸如至少7个单位，例如至少8个单位，诸如至少9个单位，例如至少10个单位，诸如至少11个单位，例如至少12个单位，诸如至少13个单位，例如至少14个单位，例如至少15个单位。
在另一个实施方案中，氧压的升高是最大15个单位，例如最大14个单位，诸如最大12个单位，例如最大11个单位，诸如最大10个单位，例如最大9个单位，诸如最大8个单位，例如最大7个单位，诸如最大6个单位，例如最大5个单位，诸如最大4个单位，例如最大3个单位，诸如最大2个单位，例如最大1个单位。
在另一个实施方案中，氧压升高1-15个单位，诸如1-12个单位，例如1-10个单位，诸如1-8个单位，例如1-7个单位，诸如1-6个单位，例如1-5个单位，诸如1-4个单位，例如1-3个，诸如1-2个单位。
总体上，氧压的升高进行至少5分钟，诸如至少10分钟，例如至少20分钟，诸如至少30分钟，诸如至少45分钟，例如至少1小时，诸如至少1.5小时，例如至少2小时，诸如至少2.5小时，例如至少3小时，诸如至少4小时，例如至少5小时，诸如至少6小时，例如至少7小时，诸如至少8小时，例如至少9小时，诸如至少10小时。
上述培养基还可被用于培养得自睾丸的未成熟精子前体细胞。
IVM被进一步记载在WO 9967365和美国专利申请US 20010028878中。
在本发明的一个实施方案中，未成熟精子被培养到成熟。精子的这种体外成熟是在氧压低于20％，诸如低于15％、例如低于13％、诸如低于11％、例如低于10％、诸如低于9％、例如低于8％、诸如低于7％、例如低于6％、诸如低于5％、例如低于4％、诸如低于3％、例如低于2％、诸如低于1％时进行的。
在本发明的另一个实施方案中，精子的这种体外成熟是在上述低氧压时进行的。一种培养条件是氧压的暂时升高，其中所述氧压升高是至少1个单位，诸如至少2个单位，例如至少3个单位，诸如至少4个单位，例如至少5个单位，诸如至少6个单位，例如至少7个单位，且所述氧压的升高持续至少5分钟，诸如至少10分钟，例如至少20分钟，诸如至少30分钟，诸如至少45分钟，例如至少1小时，诸如至少1.5小时，例如至少2小时，诸如至少2.5小时，例如至少3小时。
授精
当收集卵母细胞后，它们可以如上所述进行体外成熟、培养一段时间或立即受精。在本发明的一个实施方案中，这些培养物是在氧压低于20％，诸如低于15％、例如低于13％、诸如低于11％、例如低于10％、诸如低于9％、例如低于8％、诸如低于7％、例如低于6％、诸如低于5％、例如低于4％、诸如低于3％、例如低于2％、诸如低于1％时进行的。
在本发明的另一个实施方案中，所述培养物是在如上所述的低氧压时进行的。
上述氧压的变化的一个实例是在氧压为5％，氧压被升高到15％时持续一段时间，然后氧压被降低到12％的条件下培养的卵母细胞。
被回收的卵子在实验室接受检测而且每个卵子按照以下方法来确定成熟度等级。卵子的成熟度决定何时加入精子(授精)。未成熟卵母细胞被收集后立即可以授精，也可以在几小时后，在第二天或当未成熟卵母细胞成熟后进行授精。
在本发明的另一个实施方案中，在一个培养皿中将所述卵母细胞和精子一起进行共培养。在另一个实施方案中，所述共培养可以与滋养细胞一起进行共培养。这些用或不用滋养细胞进行的共培养是在氧压低于20％，诸如低于15％、例如低于13％、诸如低于11％、例如低于10％、诸如低于9％、例如低于8％、诸如低于7％、例如低于6％、诸如低于5％、例如低于4％、诸如低于3％、例如低于2％、诸如低于1％时进行的。
在本发明的一个实施方案中，在低氧压下以及有或无滋养细胞存在的条件中进行的共培养还包括氧压的暂时升高，其中所述氧压的升高是至少1个单位，诸如至少2个单位，例如至少3个单位，诸如至少4个单位，例如至少5个单位，诸如至少6个单位，例如至少7个单位，且所述氧压的升高持续至少30分钟，诸如至少45分钟，例如至少1小时，诸如至少1.5小时，例如至少2小时，诸如至少2.5小时，例如至少3小时。
每1个卵子与5000至500000个精子进行共培养。授精需要大约18个小时才能完成，并且约12个小时后受精细胞或前期胚胎分裂成两个细胞。48小时后，当每个前期胚胎通常由两至四个细胞组成时，它们即可被植入到妇女的子宫当中。该过程被称作胚胎转移。
在一个优选的实施方案中，所述授精是在氧压低于20％，诸如低于15％、例如低于13％、诸如低于11％、例如低于10％、诸如低于9％、例如低于8％、诸如低于7％、例如低于6％、诸如低于5％、例如低于4％、诸如低于3％、例如低于2％、诸如低于1％时进行的。
在本发明的一个实施方案中，在低氧压时进行的授精还包括氧压的暂时升高，其中所述氧压的升高是至少1个单位，诸如至少2个单位，例如至少3个单位，诸如至少4个单位，例如至少5个单位，诸如至少6个单位，例如至少7个单位，且所述氧压的升高持续至少30分钟，诸如至少45分钟，例如至少1小时，诸如至少1.5小时，例如至少2小时，诸如至少2.5小时，例如至少3小时。
在一个优选的实施方案中，卵母细胞和精细胞的培养包括在使卵母细胞成熟的条件下培养所述未成熟卵母细胞的步骤。所述条件包括低于15％、例如低于13％、诸如低于11％、例如低于10％、诸如低于9％、例如低于8％、诸如低于7％、例如低于6％、诸如低于5％、例如低于4％、诸如低于3％、例如低于2％、诸如低于1％的氧压。可以选定所述氧压并在培养过程中随着体外最适条件发生变化，而且还与卵母细胞的所处阶段和质量一致。
所述IVF方法与卵母细胞至胚胎的胚胎发生阶段有关。
卵母细胞是未受精的卵子。所述卵母细胞位于卵泡细胞群的中央。当卵子沿着输卵管向下移动时所述卵泡细胞群起着保护卵子本身的作用。为了到达卵子，精子必须首先穿透该卵泡细胞群(被称作卵丘(cumulus))，然后所述精子必须在直接包裹在卵子周围的弹性外膜上穿孔。
受精卵子也被称作合子或1细胞胚胎。卵子被密封在透明带(zonapellucida)中。在卵子内是两个较小的凹面球体一每个球体是由一个亲本或另一个亲本贡献的含有亲本DNA的‘原核’。在透明带内能观察到被称作‘极体’的球体。在采用第二部分母系遗传物质授精后该极体从卵子中适当地突伸出来。
授精的一天后发生第一次细胞分裂，结果产生2个细胞的胚胎。从胚胎发生的单细胞阶段到胚泡阶段的整个过程，胚胎在没有营养源的条件下自由漂浮而且被完全束缚在透明带中。因此在这整个过程中胚胎维持同样大小。
胚胎中的每个细胞再次分裂，结果产生4个细胞的胚胎。在该阶段，每个单体细胞仍然可能发育成完整的人。如果胚胎在该阶段分裂成四个细胞，将出生四个相同的四胞胎。尽管罕见，但仍有许多已知实例。
在8细胞胚胎中，分化尚未发生。每个细胞可以发育成一个完整的人(理论上)。因此，在该阶段取走任何一个细胞用以遗传诊断都不会影响余下胚胎的发育。
在胚泡中，胚胎约有64个细胞。这些细胞此时不再相等。此时的胚胎有一个充满液体的腔，且胚胎中被称作内细胞团的部分位于所述腔的一侧。内细胞团中的半打细胞正是用以发育成胎儿和婴儿的细胞。其余的细胞，外层细胞或表面细胞被称作滋养外胚层，他们帮助形成胎盘。
ICSI
在本发明的一个实施方案中，通过胞质内精子注射(intracytoplsmicsperm injection，ICSI)用精子使所述卵母细胞受精。胞质内精子注射还被称作精子向卵母细胞胞质内的直接注射(DISCO)，该方法可被用于在人类患者中辅助受精。该技术将体外授精与显微注射技术结合在一起。收集并适当地制备雌性卵母细胞(卵子)，将单个精子从所制的样品分离到显微注射针中，然后将该精子注射到卵母细胞的卵质中。在胞质内精子注射法(ICSI)中，用专用的维持吸管(specialized holding pipette)维持(holding)成熟卵子。然后采用非常微细、尖利的空心针固定并吸取单个精子。然后将该针小心地穿透卵子的带区并进入卵子的胞质内。将该精子注射到胞质中并小心取出针。第二天早晨检测卵子正常受精的迹象。
未成熟的猴卵母细胞中胞质控制对发育能力的重要性已有记载。采用显微操作法，从MF-II卵母细胞中取出卵质并将其注射到前期I卵母细胞中。与未采用卵质注射的卵母细胞相比通过胞质转移而接受了卵母细胞的猴的受孕率增加了7倍。
在本发明的一个实施方案中，通过ICSI受精的卵母细胞是在氧压低于20％，诸如低于15％、例如低于13％、诸如低于11％、例如低于10％、诸如低于9％、例如低于8％、诸如低于7％、例如低于6％、诸如低于5％、例如低于4％、诸如低于3％、例如低于2％、诸如低于1％下进行培养。
胚胎阶段
本发明的一个实施方案是将受精卵母细胞培养到胚胎阶段(该阶段是可以转移到雌性动物的子宫内的阶段)。这可以通过在卵母细胞受精后培养至少0.5天，诸如至少1天。例如至少2天，诸如至少3天，例如至少4天，诸如至少5天，诸如至少6天，例如至少7天，诸如至少8天，例如至少9天而实现。
可以转移到子宫中的胚胎处于两细胞阶段、四细胞阶段、六细胞阶段、八细胞阶段、桑椹胚阶段，或胚泡阶段，透明带消失的胚泡阶段，或所述胚胎的透明带(胚壳体)打开以帮助在植入子宫前孵化胚胎的阶段。在这每一阶段中，由所述胚胎中取出细胞碎片，由此提高胚胎的质量。
存在三种类型胚胎细胞，这三种类型细胞最终产生完整的胚胎及其相关组织，存在于植入前或植入时的极早期胚胎中的这三种细胞是：
·外胚层细胞，能够自我更新或分化成胚胎的所有细胞类型，
·内胚层细胞，在胚胎周围产生保护膜(卵黄囊)，和
·滋养外胚层细胞，其首先发育成一群细胞，这些细胞能进行自我复制并产生一系列特化细胞，它们形成胎盘的主要部分。
在一个优选的实施方案中，按照上述方法将所述受精卵母细胞培养到胚胎阶段以备转移到雌性动物的子宫中，所述培养是在氧压低于20％，诸如低于15％、例如低于13％、诸如低于11％、例如低于10％、诸如低于9％、例如低于8％、诸如低于7％、例如低于6％、诸如低于5％、例如低于4％、诸如低于3％、例如低于2％、诸如低于1％时进行的。
在一个优选的实施方案中，所述受精卵母细胞在氧压低于13％或氧压在1％至21％之间的条件下培养2-3天从而达到4细胞阶段，然后被转移到雌性动物的子宫中。
在本发明的一个实施方案中，用激光、机械力或酸性蒂罗德溶液(tyrode)辅助孵化使透明带打开。
胚胎的“质量”可以根据不同的评价体系进行评估。评价等级通过内细胞群的大小确定。所述等级也可以由诸如细胞数目、细胞匀整性(尺寸的匀整性)和裂殖(fragmentation)程度等因素决定的。还存在其它影响胚胎外观的因素，诸如多核化、液泡的出现、颗粒度、胚胎周围的壳厚度等。尤其，胚泡中的细胞总数也是质量等级。
在一种评价体系中，卵子受精后约48小时(或以后)才确定“质量”。经过48小时(“2天”)，优选至少一些胚胎是至少3个细胞，优选是4个细胞或更多。到那时它们必须至少是两细胞-否则它们基本上是“停滞的”。经过72小时(“3天”)，优选一些胚胎是至少6个细胞，且优选至少少数胚胎具有至少7个或更多个细胞。快速发育对于成功而言并不是必需的，已经观察到由慢至第3天才4个细胞的胚胎发育成的婴儿，但是妊娠的机会随着细胞数目的增加而增加。
细胞数多以及细胞外观均匀(裂球)并且几乎不或完全不发生裂殖的胚胎与其细胞数目少、细胞均匀性较差以及更容易发生裂殖的对应物相比植入的总几率较高。
在IVF实验室中于显微镜下观察到的胚胎质量能够比较合理地预测通过移入胚胎而导致妊娠的机会。然而，由于存在着许多其它无法测量的影响因素，所以这些概括并不是总能适用。一些循环在转移3个外观完好的胚胎后中断，但在转移低级胚胎后却也生出了漂亮的婴儿。胚胎继续发育的真正遗传性能和子宫内壁(lining)的质量与接受力实际上是不可能测量的。
可被检测的另一个重要变量是胚胎转移技术本身。向子宫内膜内壁的无创顺利转移对于为胚胎提供继续正常发育的最好机会是必要的。
最后，胚胎质量的唯一真实检验为胚胎是否正常植入和发育并最终能够随妈妈离开医院回家。换句话说，胚胎评价体系非常不完善，而且对于质量来说，怀孕测试一般需要更多的“质量”信息，而显微镜能够显示的“质量”信息要少些。
大多数IVF临床单位利用众多评价体系中的一种对每个胚胎进行“分级”，其中只有少数评价体系可用于本发明。
由于不同发育阶段可用于不同过程等事实，所以重要的是在高级(advanced)生育治疗过程中要对人卵母细胞、受精卵和卵裂胚胎进行评价和分类。一种可被用于本发明的胚胎评价体系与Van Abbel等(1992)和Ziebe等(1997)的评价体系一致：
在该评价体系中，根据卵裂期(＝裂球数)对胚胎进行评价，并且无核裂片的数量用形态标准进行评价。两细胞阶段至桑椹胚阶段的胚胎可以按照下列形态标准获得评价等级：
1.0级：大小相同的对称裂球，没有无核裂片。
2.0级：大小不均等的裂球，没有无核裂片。
2.1级：裂殖度小于10％的胚胎。
2.2级：裂球裂殖度为10-20％的胚胎。
3.0级：裂球裂殖度为20-50％的胚胎。
3.2级：裂球裂殖度大于50％的胚胎。
4.0级：完全裂殖。
5.0级：授精的，未分离的。
6.0级：未授精的，未分离的。
M：桑椹胚
B1：早期胚泡。
B2：正在膨胀的胚泡。
B3：经过膨胀的胚泡。
Bn1：正常腔，正常细胞。
Bn2：正常腔，粒状细胞或暗细胞。
Bn3：异常腔。
HB1：正在孵化的胚泡。
HB2：经过孵化的胚泡。
在本发明的一个实施方案中，将胚胎经过培养使得胚胎的裂球数为3-5个，且评价等级定为1.0；2.0；2.1和2.2。
在本发明的一个实施方案中，将胚胎经过培养使得胚胎的裂球数为4个，且评价等级为1.0；2.0和2.1。
已经表明，不仅是胚胎阶段而且裂殖度对于选择胚胎也是重要的。还要考虑以下因素：1)透明带的厚度和可变性。不仅因为透明带在体外条件中变硬对胚胎造成问题。透明带的稀薄度或可变稀薄度可能与更好的受孕机会有关。这大概是由于在孵化过程中滋养层细胞能更好地穿透稀薄带而不是厚硬带。2)裂片的类型和分布。裂片在胚胎中的均匀分布可能会干扰所有裂球之间的多处连接，因此危及胚胎的功能。如果裂片分布在一个区域，胚胎所受到的这种干扰就不那么严重了。3)胚胎卵裂的时间。胚胎的最快正常分裂也可能具有繁衍后代的最好机会。由此可知，用于移植的最好胚胎将是Van Abbel等级最低的胚胎，胚胎随着移植的时间(即受精后2天时用于转移的4-细胞)、透明带的可变厚度而正常分裂，并且如果有裂片存在，则选择具有局部裂片的胚胎。
在另一个评价体系中，被移植到雌性动物子宫中的胚胎获得了累积胚胎级分(cumulative embryo score，CES)(Joesbury等，1998)。在该评价体系中，在授精后的第二天并且就在移植前对胚胎进行等级评价。评级是基于裂球的颗粒度(granularity)和对称性、裂殖以及发育速率。一个理想完美的胚胎被定的级分为最大值4.0分，根据偏离每个形态参数的最适值的程度扣除0.5或0.1分。
受精卵的级分被定为1分。
大小均匀并具有对称裂球的胚胎的级分被定为4分。
具有大小不等裂球且裂殖度小于10％的胚胎的级分被定为3分。
裂殖度为10-50％的胚胎的级分被定为2分。
裂殖度大于50％的胚胎的级分被定为1分。
每个胚胎的级分是通过将选用于移植的每个胚胎的等级乘以该胚胎的裂球数而获得的。发育速率比‘理想’生长速率快的胚胎比具有‘正常’生长模式的胚胎更不容易导致怀孕。为了说明快速发育胚胎的潜在缺点，给5-细胞阶段的胚胎计3分，并给6-，7-或8-细胞胚胎计2分，然后计算CES。选出最高得分的胚胎用于子宫移植。选用于移植的胚胎的总体质量基于累积胚胎级分(CES)，该累积级分是每个选用胚胎的级分的乘积。
在本发明的一个实施方案中，将胚胎培养到裂殖度为10-50％的3-5个细胞的阶段，由此该胚胎的级分为6-7。
在本发明的另一个实施方案中，将胚胎培养到裂殖度小于10％的3-5个细胞的阶段，由此该胚胎的级分为7-8。
在本发明的一个优选实施方案中，将胚胎培养到裂殖度小于10％的4个细胞的阶段，由此该胚胎的级分为8。
在第三个评价体系中，得到每个胚胎的定级胚胎级分(GraduatedEmbryos Score，GES)(Fisch等，2001)。GES体系可能的总分是100分，它基于受精后16-18，25-27和64-67小时时进行的三次评价。
第一次评价，16-18h：
核仁沿着原核轴排成一行，级分计为20。
第二次评价，25-27h：
有序和对称卵裂，级分计为30。
不发生裂殖，级分为30。
裂殖率小于20％，级分计为25。
裂殖率大于20％，级分计为0。
第三次评价，64-67h：
7个I级细胞或8个I级细胞或8个II级细胞或9个I级细胞，级分计为20。
7个II级细胞或9个II级细胞或10个I级细胞或11个I级细胞或致密的I级细胞，级分计为10。
其中I级是对称的裂球并且未发生裂殖，II级则是不太均匀的裂球而且裂殖率小于20％。将胚胎每次评价的级分相乘从而得到所述胚胎的总级分。胚胎的最大级分是100。
在本发明的一个实施方案中，胚胎经过培养，在授精的64-67个小时后产生7-9个细胞的胚胎并根据GES评分系统获得60-100的级分。
在本发明的另一个实施方案中，胚胎经过培养，在授精的64-67个小时后产生7个I级细胞或8个I级细胞或8个II级细胞或9个I级细胞并根据GES评分系统获得70-100的级分。
在本发明的一个优选实施方案中，胚胎经过培养，在授精的64-67个小时后产生7个I级细胞或8个I级细胞或8个II级细胞或9个I级细胞并根据GES评分系统获得80-100的级分。
任何将胚胎质量与受孕关联的评分系统都可用来确定胚胎质量。
在胚胎的发育过程中，到达胚泡期。胚泡是一种受精后发育5-7天的胚胎。该阶段的胚胎具有两种不同类型的细胞和中央腔。其刚开始分化。被称作滋养外胚层(trophectoderm)的表面细胞将变成胎盘，被称作内细胞团的内细胞将变成胎儿。一个健康的胚泡应当在第6天结束时从被称为透明带的外壳开始孵化。孵化后的约24小时内，应当将其植入母亲子宫的内壁上。
通过显微镜镜检卵母细胞可以检测到异常情况如空泡的形成、胞质包涵体和细胞器的聚簇。这些卵母细胞产生正常胚胎的可能性很小。已知卵母细胞可能出现细胞核或细胞质异常，这种异常在临床条件下难以通过光学显微镜观测到。最常见的卵母细胞遗传变异导致在第一次减数分裂中染色单体分离的错误。弃去质量差的卵母细胞，培养质量好的卵母细胞。
胚胎移植(embryo transferr)
在大多数体外授精过程中，授精后第2天(4-8个细胞)将胚胎移植到子宫。一种观点是早期胚胎的利用可以明显降低IVF方法的受孕结果，而且更理想地是利用培养了5-7天胚泡期的胚胎。潜在的优点包括胚胎和子宫之间更加一致性和在较长的培养周期中选择质量更好的胚胎的能力。由于每次移植选择更少数目的高效胚胎，胚泡移植还有助于减少由IVF导致的多胞胎的数目。
受精后第2-10天将胚胎植入子宫壁。在植入过程中，所述胚胎与母体供血系统相连从而能够生长。在植入时，妇女的身体第一次怀孕。植入前，身体不能辨别未受精卵(即将消亡)与正在发育的胚胎之间的差别。
将悬浮在培养基液滴中的一个或多个前期胚胎吸入到移液管中，所述前期胚胎被引入子宫颈中并将液体沉着到子宫腔中。在该过程中植入了一个或多个胚胎。
体外授精的胚泡培养和移植方法是另一种将胚胎转移到母体子宫的方法。通过胚泡胚胎转移，被转移的胚胎数目更少从而减少了多次受孕的风险，使得总的受孕几率很高。
体外授精(IVF)和胚胎培养的最终目的是提供能够继续正常发育并正常出生的高质量胚胎。然而，在标准的IVF培养条件下，仅有约20-40％的人体胚胎能在培养的第5天发展到胚泡期。这种低速率的胚胎发育是由次佳胚胎培养环境导致的结果。正由于这个原因，通常在培养的第2-3天才将胚胎转移到子宫中。
这种方法所存在的一个问题是通常在输卵管而不是子宫中发现2-3天龄的胚胎。排卵后约80天该胚胎被首次移入子宫中。植入过程在胚泡形成后约3天开始并开始孵化。因此，如果改进体外培养条件，胚泡形成的速率则非常高，那么就可以在胚泡期和更“自然”的时间将胚胎放置到子宫当中，并且是刚一到胚泡期就开始植入。
IVF后转移胚泡还能提供另一种降低多次受孕几率的有益方法。一些2或3天龄的胚胎不具备称为高质量胚泡和活胎的能力。然而，在培养的第2或第3天，我们没有可靠的方法来检测哪些胚胎能长期成活。通过将胚胎培养到胚泡期我们有更多的机会来选择最适于移植的胚胎。然后我们移植更少的胚胎并能获得很高的受孕率而多次怀孕(三胞胎或更多胞胎)的风险却很低。
在一个实施方案中，步骤a)是在氧压低于15％的条件中进行的，其它条件如上文所述。
在一个实施方案中，步骤b)是在氧压低于15％的条件中进行的，其它条件如上文所述。
在一个实施方案中，步骤a)和b)是在氧压低于15％的条件中进行的，其它条件如上文所述。
在一个实施方案中，步骤a)和c)是在氧压低于15％的条件中进行的，其它条件如上文所述。
在一个实施方案中，步骤a)和d)是在氧压低于15％的条件中进行的，其它条件如上文所述。
在一个实施方案中，步骤b)和c)是在氧压低于15％的条件中进行的，其它条件如上文所述。
在一个实施方案中，步骤b)和d)是在氧压低于15％的条件中进行的，其它条件如上文所述。
在一个实施方案中，步骤a)、b)和c)是在氧压低于15％的条件中进行的，其它条件如上文所述。
在一个实施方案中，步骤a)、b)和d)是在氧压低于15％的条件中进行的，其它条件如上文所述。
在一个实施方案中，步骤a)、c)和d)是在氧压低于15％的条件中进行的，其它条件如上文所述。
在一个实施方案中，步骤b)，c)和d)是在氧压低于15％的条件中进行的，其它条件如上文所述。
在一个实施方案中，步骤a)，b)，c)和d)是在氧压低于15％的条件中进行的，其它条件如上文所述。
在一个实施方案中，步骤b)，c)和d)是在氧压低于15％的条件中进行的，其它条件如上文所述。
培养条件
上述包括步骤a)，b)，c)和d)或e)的体外培养方法和胚胎向子宫内的植入是在无菌条件中进行的。在使用前对培养基和仪器消毒。
按照上述方式降低氧压，其中所述培养可以在氧压低于20％，诸如低于15％、诸如低于13％、诸如低于11％、诸如低于10％、诸如低于9％、诸如低于8％、诸如低于7％、诸如低于6％、诸如低于5％、诸如低于4％、诸如低于3％、诸如低于2％、诸如低于1％下进行。氧压是通过向体外培养环境中充入氧气、氮气、二氧化碳、氦气或其它惰性气体或这些气体中的两种或多种气体的混合物来调节的。
本发明的一个优选实施方案是卵母细胞、精细胞和胚胎的培养条件包括30-45℃，诸如32-42℃，诸如34-40℃，诸如36-38℃，诸如36,5-37,5℃，诸如约37℃的温度。在一个优选实施方案中，卵母细胞、精细胞和胚胎的培养条件包括约37℃的温度。
不幸地是标准培养基中的大多数胚胎(约75％)到了4-8细胞阶段不能继续发育。然而一些临床征兆表明尽管发育成胚泡的胚胎比例很低但还是应在胚泡期植入人胚胎。一些研究已经使用了共培养技术，该技术是将胚胎与滋养细胞如非洲绿猴肾细胞进行共培养，该技术能使胚泡形成的数量翻倍。已有一些利用这些培养技术的研究结果表明胚泡转移后的植入速率提高了，尤其是对于以前的植入反复遭受失败的妇女来说植入速率提高了。
通过将精细胞、卵母细胞和胚胎与滋养细胞层进行共培养来克服辅助繁殖技术中的一些困难。然而，共培养具有质量不稳定以及可靠性差的特性而且增加了病原体由滋养细胞向合子或胚胎转移的危险性，所述合子或胚胎将被植回到有动物或人的活体内。在一个优选的实施方案中，卵母细胞和精子在没有滋养细胞层的条件下进行共培养。
小规模的敏感细胞和组织的体外生产，即成熟、授精、生长、繁殖等通常是在装有培养基和必要的初始细胞或组织的象小培养烧瓶、培养皿或平皿这样的容器中进行。然后将所述容器放置在温育箱，该温育箱能够提供可选的恒定温度并且环境大气中含有特定细胞或组织发育和/或维持所必需的气体。具体地是所述气体包括一定比例和浓度的湿气(即水蒸气)、游离氧气(O2)和二氧化碳(CO2)。
通过控制环境温度以及CO2含量，可以使培养基的Ph稳定一段时间。稳定的温度与稳定的CO2含量导致稳定的pH。
在本发明的一个实施方案中，在本技术领域技术人员已知的培养基中培养卵母细胞和精子。根据卵母细胞或精子所处阶段培养基可以单一的或不同的。卵母细胞和精子还可以在经改良适于低氧压条件的培养基中进行培养。所述改良可以是物理的或化学的方法，后者例如是通过利用氧分子载体或过氧化氢酶的方法。
本发明的一个实施方案是将培养条件用于卵母细胞和胚胎从而使胚胎的内细胞的数目增加。增加的内细胞数目构成质量较好的胚胎。
本发明的另一个实施方案是培养卵母细胞核精子并将所产生的胚胎转移到雌性哺乳动物的子宫，更精确地说是雌性动物的输卵管。所述转移可以在雌激素处理后进行。所述转移所述转移非常有希望导致雌性动物怀孕。
所记载的方法提高了胚胎向雌性动物子宫转移的成功率从而提高了受孕率。以这种方式，优化了不孕症的治疗。
当在氧压低于15％的条件下对卵母细胞和精子进行共培养能够产生质量较好的配子和前期胚胎。当低于15％的可变氧压下对卵母细胞和精子进行共培养也能产生质量较好的配子和前期胚胎。质量较好的配子和前期胚胎提高了不孕症的治疗效率。
当在可变的氧压下对卵母细胞和精子进行共培养能够产生质量较好的配子和前期胚胎。
利用该方法的可能性是在任选低于15％的可变氧压下对卵母细胞和精子进行共培养从而产生质量较好的配子和前期胚胎并且增加了内细胞的数目和优化了干细胞的培养。
在一个实施方案中，细胞培养物是在氧压增大的条件下进行培养的，开始以最低的氧压培养配子以及在培养胚胎和胚泡的过程中逐渐增加氧压。组成单一结构诸如胚泡的细胞数目愈多，所需要的氧压愈高。
在一个实施方案中，所述细胞培养物是在氧压升高的条件下进行培养的，开始以最低的氧压培养配子以及在培养胚胎和胚泡的过程中逐渐增加氧压以及针对卵母细胞迅速将氧压升到10-12％以便加快成熟过程。
按照上述方法而提高胚胎的质量可以将胚胎转移的成功率由约20％提高到至少25％，诸如至少30％，例如至少35％，诸如至少40％。
温育箱
如上文所述的卵母细胞、精子和胚胎或其它生物材料诸如细胞培养物或组织的培养可以在温育箱中进行。
本发明的温育箱在体外培养、检测和操作过程中为维持细胞培养物诸如卵母细胞、精子和胚胎提供了可控的环境。更具体地说，所述温育箱可以消除对细胞培养系统可能有害或起阻碍作用的条件。
本发明的一个实施例包括能够体外生产哺乳动物前期胚胎的系统，该系统包括用于获得哺乳动物卵母细胞的装置和用于获得哺乳动物精子的装置和具有至少两个分离气密室的设备，其中一个气密室的氧压变化不影响另一个气密室的氧压，其中一个气密室构成一个主腔室以及另一个所述的气密室构成至少一个驻留室，所述设备包括至少一个能够与获得哺乳动物卵母细胞和/或哺乳动物精子的装置相通的进口，和一个取出前期胚胎的出口以及一个所述至少室之间的通口以便使卵母细胞，精子和/或前期胚胎于室之间进行转移。
主腔室包括一个用于处理细胞培养物的工作区域。主腔室包括用于处理细胞培养物的设备，例如含有培养基的容器。主腔室还可包括另一个用于处理细胞培养物的设备，例如显微镜，ICSI设备。从主腔室到进口或出口有一个连接件。具体地是所述主腔室不是一个进口。具体地是所述主腔室不是一个驻留室。
驻留室是一个用于容纳一个或多个培养器的室，培养器本身可以是一个驻留室。所述驻留室与主腔室相连或被置于主腔室内。具体地说所述驻留室不是进口或出口。
在本发明的一个实施方案中，所述温育箱提供了用于控制温度、湿度和O2浓度的装置。如果需要就利用层流空气将微生物从环境中清除从而使温育箱内达到无菌条件。
室内的氧压或氧浓度可以得到控制。氧压可通过测定装置来确定。而且室内的氧压可以通过充入气体如氧气、氮气、二氧化碳、氦气或另一种惰性气体或这些气体中的两种或多种气体的混合物来维持或改变。因此所述温育箱提供了用于充入所述气体的装置。在调控、维持和改变氧压的过程中，每个室的室内氧压可以独立地是0.1到至少21％的水平。一个优选的氧压可以是0.5到15％的水平。室内的温度和湿度可以通过测量装置和供给装置按照预定的每种气体、温度和湿度的最小和最大值来测定和调控。所述供给装置可构成流入气体或含水气体(湿度)的装置而且所述供给装置还可构成加热器或冷藏器。
在所述系统的一个实施方案中，直接进入温育箱任意一个室的气体在进入温育箱的室之前通过循环流经增湿器而被加湿。所述气体在进入温育箱的室内之前还可被加热或冷藏。
一个实施方案是这样一个系统，该系统中用于获取卵母细胞的装置是一个带有针管的系统，所述针管在气密的条件下与用于从针管向所述设备转移的装置相通，该装置包括任选地连接于针管的注射器。
本发明的另一个实施方案是这样一个系统，该系统中用于获取哺乳动物精子的装置是一个其中氧压为可控的系统。所述系统可以是一个任选地气密性的而且任选地与针管连接的注射器。
利用上述针管并结合氧压的控制来实施本发明，可以在包括上文所述的低氧压条件下收集卵母细胞。
在所述系统的实施方案中，每个室中的温度都是可独立调节的。
在所述系统的另一个实施方案中，每个室的氧压独立地通过充入氧气、氮气、二氧化碳、氦气或其它惰性气体，或这些气体中的两种或多种气体的混合物并且同时从室中抽出所述气体来调节，以这种方式使得室内的气压与温育箱外面的大气压一致。
在所述系统的另一个实施方案中，室内的气压略高于主腔室周围的大气压。
在室内保持高湿度是避免其中培养和供养着细胞培养物如卵母细胞、精子、胚胎的培养基过量蒸发所必需的。所述系统的一个优选实施方案是一种温育箱，该温育箱的每个室中的湿度被独立地调节到50％至100％，诸如60％至99％，例如70％至98％，更优选80％至97％，诸如70％至96％，例如80％至95.5％，更优选90％至95％水平。
大多数生物材料培养物是在10-50℃的温度下保存的。在本发明一个优选的实施方案中，温育箱中的温度被调到适于培养卵母细胞，精子，胚胎和包括干细胞系在内的干细胞的温度，包括将温度预选到30-45℃，诸如32-42℃，诸如34-40℃，诸如36-38℃，诸如36,5-37,5℃，诸如约37℃。在一个优选的实施方案中，卵母细胞，精子，胚胎和包括干细胞系在内的干细胞的培养条件包括约37℃的温度。
在另一个实施方案中，温育箱的每个室的温度是可控的并且按照上述温度可独立地进行调节，调节的方式是如果温度比预选温度低例如0.2度，就打开加热器。如果温度比预选温度高例如0.2度，就打开冷藏器。当室内实际温度达到预选温度则关闭加热器或冷藏器。
在所述系统的一个优选实施方案中，进口和出口与一个单独开口装置，诸如门相通。
在所述系统的一个更优选的实施方案中，出口和进口是以将用于细胞培养物的装置和设备转移到室内和室外的方式进行组合的。优选是其中所述进口和出口的组合是一种气密舱的系统。更优选是其中所述进口构成气闸(air-lock)的内门而出口构成气闸的外门的系统。另外优选是这样一个系统，该系统中所述气闸包括构成气密室的内门和外门之间从而构成一个气密小室。
在所述系统的一个实施方案中，所述气闸的内门和外门每次只能打开一个以便每次只有一个门被打开，并且当一个门被完全关闭时另一个门才能被打开。当外门打开时气闸中没有气体进入。
在所述系统的一个实施方案中，气闸的气压是可控的并且氧气、氮气、二氧化碳、氦气或其它气体的量、温度和湿度都是可调的。通过调节氧气、氮气、二氧化碳、氦气或其它气体或这些气体中的两种或多种气体的混合气体的充入量可以调节气闸的气压。气闸的所述温度和湿度还可通过打开加热器或冷藏器或通过补充湿气的调节方式来进行调节。可以按照置于气闸中的测量装置所提供的测量值来调节气体浓度、温度和湿度。所述气体的补充可以按照预定水平来进行，温度和湿度还可按照预定水平来进行调节。在一个优选的实施方案中，根据气体浓度、温度和湿度，将气闸中的气压调到与主腔室的气压相似的水平。
在所述系统的一个实施方案中，气闸的内门只有当包括温度、湿度和气量在内的条件与其中安置着气闸的室内条件相同时才打开。
在所述系统的一个实施方案中，将一个盘子置于气闸内。该盘易于容器、处理物和其它设备的进出。
在温育箱的工作区和温育箱外侧之间放置着一个气闸，从而降低了造成工作区和贮藏区条件(温度、湿度、氧气浓度)发生改变的风险。在气密舱与温育箱外侧之间是气闸的外门。从外面转入工作区的所有物体和培养基可以通过气密舱，此时气闸的内门是关闭的，气闸的外门是打开的，所述物体被放置在气闸中，气闸关闭。气密舱内的环境被调节成与工作区的环境类似，当达到所述条件时，可以打开气闸的内门，所述物体可以被转移到工作区。将物体从工作区转移到温育箱的外面是按照以下方式进行的：关闭气闸的外门，将气闸的条件调节到与工作区的条件相似，当达到所述条件时打开气闸的内门，可以将所述物体从工作区转移到气闸，关闭气闸的内门，打开气闸的外门并将所述物体转移到温育箱的外面。一种控制方式只允许每次打开气闸的一个门。包括灯忽开忽关或发声响的报警表明气闸的内部大概需要打开以及气闸内的条件与工作区的条件有区别了。
在本系统的另一个实施方案中，当处理卵母细胞、精子、胚胎和包括干细胞系在内的干细胞时，可以放置和使用一台显微镜。所述显微镜可以是双目显微镜。其中放置着需要监测培养皿的显微镜的工作区位于主腔室内部。显微镜通过主腔室顶部的孔延伸，其延伸的方式能够更好地使操作者舒适地处理温育箱内部的细胞培养物并且任选地连接到一个监控屏幕。所述孔包括密封主腔室边缘与显微镜之间的环形缝隙的密封装置以便降低或避免主腔室与温育箱外部之间发生泄漏。所述密封装置可以是易变形的塑料管头。
所述显微镜可以连接一个照相机，可以对所述照相机进行调节从而获取细胞或细胞培养物的图像，在预定的时间间隔内通过手控或自控来取得图像。将该图像保存起来，优选是电子保存在计算机里。可以按照以下方式来利用所述图像。
在所述系统的一个优选技术方案中，在主腔室内获得工作区，所述工作区包括一块用于放置装有细胞培养组织的培养装置的空间，所述细胞培养组织通过显微镜可以观察到，并且所述工作区包括用于放置处理装置的空间。
在所述系统的另一个优选技术方案中，主腔室包括开口装置或孔或允许操作者的手进入以便操作室内的细胞培养物或设备的手口。
在所述系统的一个优选技术方案中，所述开口装置或孔或手口连着手套或无手指的手套。这些手套或无指手套以适于操作者的手进入手套或无指手套的方式和操作室内的细胞培养物或设备的方式来进行安装。手套或温育箱与手套或无指手套之间的固紧区域不允许任何微生物如病毒、真菌和细菌从温育的外面进入到温育箱内部或者反之亦然，或者至少通过在手套与主腔室壁之间安放密封装置而将透过这些开口或孔的气体量最小化。通过将手伸到手套或无指手套中来操作培养皿。如果需要，在使用前对放置在温育箱内部的所述手套表面进行消毒。
在另一个实施方案中，所述开口装置包括若干个孔，从该孔可以获得直接流出温育箱的气流或平行指向具有开口的装置的壁的气流。所述气体可以是空气、氮气等。所述气体可以在不使用孔的时候关闭以及所述孔可以用锁关闭。气流防止空气进入温育箱。
可以将棍、棒或仪器连接到所述开口装置上，所述棍、棒或仪器可以通过光纤来操纵，而且需要进行处理的细胞培养物或设备可以通过所述的棍、棒或仪器来操作。
在所述系统的一个实施方案中，所述温育箱在主腔室后面有个允许插入大体积物体的门，所述大体积物体是诸如插入主腔室中的显微镜。至少一个驻留室是单独控制的从而使得主腔室的开口不影响至少一个驻留室内的培养条件。
在本系统的一个实施方案中，所述主腔室表面的至少一小部分被膜取代，该膜具有这样一种膜结构，就是针可以穿透该膜结构，当取出针时，膜上针孔部分又恢复到原来的形状，并且无论膜是否经过针穿透，气体或颗粒都不会透过膜进行扩散。
在所述系统的一个实施方案中，至少两个分离的室被安排成一个主腔室和一个或多个小气密驻留室。优选是一个较小的驻留室位于主腔室内或与主腔室相连的系统。另外优选是一个其中驻留室是气密性的并在温度、湿度和氧气、氮气和二氧化碳的含量方面是可控的而且彼此独立以及独立于主腔室的系统。更优选是一个其中由驻留室构成适用于培养器的箱体的系统，所述箱体装有卵母细胞，精子，胚胎，和包括干细胞系在内的干细胞的细胞培养物。所述箱体构成用于细胞培养物的培养室或贮存室。另外优选是一个其中所述每个箱体适于容纳一个含有细胞培养物的培养器的系统。另一个优选的系统是其中箱体的数目对应于细胞培养物发育期的数目。
在所述系统的一个实施方案中，其中所述细胞培养包括至少未成熟卵母细胞、成熟卵母细胞、未成熟精细胞、成熟精细胞、受精卵母细胞、2细胞胚胎、4细胞胚胎、8细胞胚胎、干细胞和干细胞系的发育阶段。
在所述系统的一个实施方案中，每个驻留室的氧压和压力可以通过计算机扫描所述室或所述气密箱体中的胚胎图像来进行控制。所述图像是通过照相机摄取的。通过人工可以将所述照相机连结到每个气密箱体，或者照相机可以自动地从一个箱体移向另一个箱体或着照相机永久性地与每个箱体连接，或者气密箱体以这样一种方式移向照相机，该方式是将箱体安装在carousel中或将箱体安装在其中沿着例如轨道系统移动箱体的系统上。与每个细胞培养器永久性连接的照相机可以是例如芯片、CCD照相机或箔中小相机。
在另一个实施方案中，所述培养物的图像以至少1分钟、诸如至少5分钟、诸如至少10分钟，诸如至少20分钟、诸如至少40分钟、诸如至少1小时、诸如至少2小时、诸如至少4小时、诸如至少6小时、诸如至少8小时、诸如至少12小时、诸如至少18小时、诸如至少24小时的间隔被传送到计算机。
可以将所述图像与预先贮存的一系列图像进行比较，所述预先贮存的图像几乎共同构成了一部由不同发育途径组成的电影，所述途径包括产生质量好的、质量适中的、质量差的胚泡和/或干细胞和/或干细胞和/或干细胞系的途径和导致细胞死亡的途径。预先贮存的图像通过计算机程序连接成包括培养条件的信息。通过将培养物中的配子或细胞的图像与预先贮存起来的图像进行比较可以由计算机程序确定是否需要调整培养条件以便获得最好质量或预定质量的胚泡、干细胞或干细胞系。
可以手工或自动调整包括例如温度和氧压在内的培养条件。为了手工调整培养条件，监控屏上的诸如闪烁或高亮度划线的指示器可以显示何时计算机程序发现了其中培养条件应当进行调整的驻留室。例如氧压的变化可以是短期的氧压降低或增加从而引起细胞的发育或氧压的持续改变从而达到特定的培养条件。
在本发明的一个实施方案中，当如上所述将培养中的细胞的图像与预先贮存的图像结合后，为了作出响应可以对进一步包括培养基组分在内的培养条件进行手工或自动调节。
优选是在由配子到胚泡的发育过程中培养基改变1-4次。更优选是改变1-3次培养基。最优选是改变1-2次培养基。
在本发明的一个实施方案中，如上所述预先贮存的图像和不同的发育途径包括计算机的环境控制程序。该程序通过结合培养中的细胞的图像和预先贮存的图像来控制包括本文其它部分所记载的温度、气体和/或培养基在内的环境条件。
在一个实施方案中，当细胞培养开始后启动所述环境控制程序。所述环境控制程序既可以通过手功键入细胞的发育阶段来启动，也可以通过细胞图像来启动所述环境控制程序。
在一个实施方案中，培养器的培养室是碗形的，底比口小，这样在所述较小的底部要进行培养的细胞处于一个有限的区域内从而使相机的聚焦最佳化，得到图像后按照本文其它部分所描述的方法对该图像加以利用。
在一个实施方案中，所述培养器包括至少一个安装到碗形培养室的管子。通过所述至少一个管子，气体和培养基可以得到改变，可以连接仪器如温度计或用于获得其它测量值如培养基的化合物浓度或摩尔渗透压浓度的仪器。用于每个培养室的罩可以是相机或所述相机可以被插入或直接安装到罩上。所述罩还可以包括用于使相机准确定位的操纵工具。所述操纵工具可以是但不局限于至少一个任选地带有刻度的垂直杆或任选地带有刻度的水平杆，该水平杆用以固定相机或相机的附件。
在一个实施方案中，所述培养器和/或培养室由使细胞避光的材料组成。如果所述材料驱光，那么所述罩子则可以由光-感材料制成从而确保能够利用显微镜或相机观察细胞。如果材料不驱光，所述培养器则可以通过驱光的驻留室来避光，或者所述培养器可以任何隐匿方法来避开温育箱的光或避开来自温育箱外面的光。
在一个实施方案中，所述培养器包括驻留室并且包括驻留室的特征和本文其它部分所记载的气密箱。
在一个实施方案中，所述温育箱包括一个按照本文其它部分所记载进行ICSI的ICSI系统。
在本系统的一个实施方案中，所述驻留室是可移动的气密箱。优选是一个具有气密箱的系统，所述气密箱被从设备移开后可以被连接到用于控制温度、湿度和氧气、氮气和二氧化碳浓度的装置上。更优选是一个其中用于控制温度、湿度和氧气、氮气和二氧化碳浓度的装置是可移动的系统。更优选是一个其中气密箱的壁含有膜的系统。更优选是一个气密箱包括一个用于紧固一个或多个细胞培养器的紧固件的系统。更优选是一个其中细胞培养器的壁含有无菌膜的系统。在所述系统的一个实施方案中，气密箱可以进行至少6天的运输。
在所述系统的一个实施方案中，主腔室的直径尺寸介于1cm和2m之间，诸如介于20和50cm之间，诸如在50和70cm之间，诸如在70和90cm之间，诸如在90和110cm之间，诸如在110和130cm之间，诸如在130和150cm之间，诸如在150和170cm之间，诸如在170和200cm之间。优选是纵向腔室具有的深度在50和110cm之间，诸如在50和70cm之间，诸如在70和90cm之间，诸如在90和110cm之间，长度在50和200cm之间，诸如在50和70cm之间，诸如在70和90cm之间，诸如在90和110cm之间，诸如在110和130cm之间，诸如在130和150cm之间，诸如在150和170cm之间，诸如在170和200cm之间，高度50和110cm之间，诸如在50和70cm之间，诸如在70和90cm之间，诸如在90和110cm之间。
干细胞
本发明的另一个方面涉及一种胚胎干细胞组合物。所述方法增加了胚泡内细胞团的数目和质量，从而进一步提高了从内细胞团衍生的干细胞的数目和质量。
在一个实施方案中，所述干细胞比常规干细胞更稳定。在未分化阶段可以在一段时间内持续得到干细胞。在一个实施方案中，干细胞的所述未分化阶段是通过包括氧压低于15％在内的培养条件来维持的。
一个实施方案涉及产生干细胞的方法，所述方法包括：
a)按照本文其它部分所记载的内容提供多细胞前期胚胎，
b)分离a)中的多细胞前期胚胎，
c)从b)中的前期胚胎的内细胞团分离细胞，
d)在基质胶(matrix gel)中培养从内细胞团分离的所述细胞，
e)获得干细胞。
在一个实施方案中，b)，c)，d)和e)中的至少一个步骤是在氧压低于15％的条件中进行的。在另一个实施方案中，b)，c)，d)和e)中的至少两个步骤是在氧压低于15％的条件中进行的。在另一个实施方案中，b)，c)，d)和e)中的至少三个步骤是在氧压低于15％的条件中进行的。在另一个实施方案中，b)，c)，d)和e)中的所有步骤是在氧压低于15％的条件中进行的。
另一方面是按照上文所定义的得自细胞培养物的干细胞。从所述干细胞可以得到干细胞系。
在一个实施方案中，干细胞被维持在未分化阶段的时间是至少4小时，诸如至少8小时，例如至少12小时，诸如至少24小时，例如至少2天，诸如至少3天，例如至少4天，诸如至少5天，例如至少7天，诸如至少9天，例如至少11天，诸如至少13天，例如至少15天，诸如至少20天，例如至少25天，诸如至少30。
在一个实施方案中，干细胞被维持在未分化阶段的时间是至少1个月，诸如至少1.5个月，例如至少2个月，诸如至少3个月，例如至少4个月，诸如至少5个月，例如至少6个月，诸如至少7个月，例如至少8个月，诸如至少9个月，例如至少10个月，诸如至少11个月，例如至少12个月。
在一个实施方案中，干细胞被维持在未分化阶段的时间是至少1年，诸如至少1.5年，例如至少2年，诸如至少2.5年，例如至少3年，诸如至少3.5年，例如至少4年，诸如至少4.5年，例如至少5年，诸如至少6年，例如至少7年，诸如至少8年，例如至少9年，诸如至少10年，例如至少11年，诸如至少12年，例如至少13年，诸如至少14年，例如至少15年，诸如至少20年。
在被维持在未分化阶段的时间内所述干细胞是稳定的，也就是说在染色体内或细胞表面抗原性方面没有发生突变或其它遗传变化。所述干细胞系不含病原体，它们很好鉴定，因为人类来源是已知的，并且配子和/或胚胎和/或胚泡的培养条件是已知的。
在一个实施方案中，干细胞和/或干细胞系在基质凝胶上和/或具有滋养细胞的条件下繁殖。胞外基质可以是合成的或得自动物/人材料，目的是根据基质内的添加物或成分来支持干细胞锚着、卵裂和确保去分化、分化或使它们处于未分化状态。
由干细胞产生的干细胞系是稳定的，也就是说在染色体内或细胞表面抗原性方面没有发生突变或其它遗传变化。所述干细胞系不含病原体，它们很好鉴定，因为人类来源是已知的，并且配子和/或胚胎和/或胚泡的培养条件是已知的。
每个干细胞系都被提供了说明书(certificate)，该说明书表明该细胞系的来源、包括细胞表面抗原类型在内的该细胞系特征和控制该细胞系进一步发育成分化细胞的处方(recipe)。
另一方面是干细胞包装(package)，该包装含有：
°上文所定义的干细胞，
°说明书，记载干细胞和从中获得干细胞的细胞培养物的培养条件。
具体地，所述说明书记载了所述细胞是在氧压低于15％的条件下和上述用于生产多细胞前期胚胎的a)至e)中的至少一部分步骤中培养的。优选是在上述低氧压中培养的。所述说明书中可以包括用于控制细胞系进一步发育成分化细胞的处方。
附图说明
图1表示一种胚胎评价系统。胚胎的发育过程从顶部开始。分级或发育如下所示：
1.0级：大小相同的对称裂球，没有无核裂片。
2.0级：大小不均等的裂球，没有无核裂片。
2.1级：裂殖度小于10％的胚胎。
2.2级：裂球裂殖度为10-20％的胚胎。
3.0级：裂球裂殖度为20-50％的胚胎。
3.2级：裂球裂殖度大于50％的胚胎。
4.0级：完全分裂。
5.0级：授精的，未分离的。
6.0级：未授精的，未分离的。
M：桑椹胚
B1：早期胚泡。
B2：正在膨胀中的胚泡。
B3：经过膨胀后的胚泡。
Bn1：正常腔，正常细胞。
Bn2：正常腔，粒状细胞或暗细胞。
Bn3：异常腔。
HB1：正在孵化中的胚泡。
HB2：经过孵化后的胚泡。
图2表示累积胚胎分级(CES)系统。这是一个给不同发育阶段的胚胎打分的实例。图2a是一种形成了相同数目的裂球且没有裂片的胚胎，级分计为4分。图2b是一种裂球数目不等且裂片少于10％的胚胎，级分计为3分。图2c是一种不同裂球的数目不等且裂殖度为10-50％的胚胎。图2d是一种具有几乎不可识别的裂球且裂殖度＞50％的胚胎，级分计为1分。
图3表示一种温育箱。该温育箱配备了气闸，调节氧气、氮气、二氧化碳和其它气体以及温度的调节器。在该温育箱中放置了显微镜和气密箱。
实施例
低氧压对卵母细胞质量、人卵的体外成熟、体外授精和胚胎发育过程中胚胎发育的影响
以下实施例是在Section for reproductive biology，Herlev UniversityHospital进行的，在这里目前每年实施多于500个IVF循环和200个IVM循环。所进行的研究涉及人的体外授精治疗的两个方面。
1)低氧压是否有利于常规IVF
2)低氧压是否有利于IVM治疗。
从收集卵母细胞到胚胎转移期间，所有配子和胚胎的培养和处理在普通实验室和温育箱中进行或者在处于培养箱内的阶段中进行(见以下说明)。
培养箱：
该培养箱包括一个密封的培养箱，它配有用于操作体外培养物的多功能窥视孔系统。气体环境应当是，5％CO2和5％O2，潮湿环境。温度为37.2℃，所述环境和箱应当是无菌的。应当连接一个气闸。
通过利用这种系统可以避免氧压和二氧化碳的变化，而且根据已经公开的数据可以期望得到一个较好的培养结果。
研究方案
研究1：
将200个常规IVF循环随机分配给在5％CO2中具有5％氧压的培养箱中的每一培养物或具有20％O2和5％CO2的普通温育箱中的每一培养物。
给每组约600个胚胎提供上述条件并收集以下数据：
受精卵的数目，
卵裂卵的数目，
胚胎质量，
可转移的胚胎的数目，
经过冷冻后的胚胎的数目，
妊娠的数目，
移植率。
研究2：
将100个IVM循环随机分配给在5％CO2中具有5％氧压的培养箱中的每一培养物或具有20％O2和5％CO2的普通温育箱中的每一培养物。
给每组约100个胚胎提供上述条件并收集以下数据：
具有GVBD的卵的数目，
MFII卵母细胞的数目，
受精卵的数目，
卵裂卵的数目，
胚胎质量，
可转移的胚胎的数目，
经过冷冻后的胚胎的数目，
妊娠的数目，
移植率。
结果
在对所有满足试验条件的患者进行不孕症临床治疗的过程中征得了他们的同意。
征得同意后，将患者随机分组：在传统方案中，将胚胎在20％O2水平培养；在测试方案中，将胚胎在5％O2水平培养。卵母细胞用注射器从卵巢中取出，以便获得卵巢的正常氧压。
胚胎的5％培养：
在选取胚胎的前一天，通过在低氧压环境中保温来制备培养基。
在选取胚胎的当天，制备精子并立即保温以便与后续的授精平衡。
选取胚胎后，确认胚胎并立即放入经过保温的培养基中，并在5％O2环境中保温。
下午，使胚胎授精，然后移到另一个培养皿中。
受精的胚胎继续维持在低氧环境中直到打算转移回来。在转移前，对所有胚胎进行分级打分以便选出适于转移的最好胚胎。
结果：
吸出的卵母细胞的数目 已卵裂的卵母细胞的数目 用于转移的合格卵母细胞的数目 妊娠的数目(移植妊娠)
温育箱 86  58(67.4％) 43(50％) 9个中有4个(44.4％)
对照 122  81(66.4％) 64(52.5％) 13个中有3个(23.1％)
参考文献
 Fisch，J.D.，H.Rodriguez，R.Ross，G.Overgy & G.Sher. The Graduatedembryo score (GES) predicts blastocyst formation and pregnancy rate fromcleavage-stage embryos.Human Reproduction vol 16，no.9，pp.1970-1975，2001.
 Joesbury，K.A.，W.R.Edirisinghe，M.R.Philips & J.L.Yovich. Evidencethat male smoking affects the likelihood of a pregnancy following IVF treatment：application of the modified cumulative embryo score.Human Reproduction vol13 no.6，pp.1506-1513，1998.
 Van Abbel et al.Human Reproduction，vol 7，no.1，pp.117-119，1992.
 Ziebe，S.，K.Petersen，S.Lindenberg，A.-G.Andersen，A.Gabrielsen & A.Nyboe Andersen.embryo morphology or cleavage stage：how to select the bestembryos for transfer after in-vitro fertilisation.Human Reproduction vol.12，no.7，pp.1545-1549，1997.

Claims (226)

1.一种用于体外制备哺乳动物前期胚胎的系统，所述系统包括
用于获得哺乳动物卵母细胞的装置，和
用于获得哺乳动物精子的装置，和
具有至少两个独立的气密腔室的设备，其中一个腔室中的氧压可以独立于另一个腔室的氧压而发生变化，所述至少两个独立的气密腔室构成了主腔室和至少一个驻留室，
所述设备包含至少一个入口，该入口能够与用于获得哺乳动物卵母细胞和/或哺乳动物精子的装置互通，
用于取出前期胚胎的出口，以及
所述至少两个腔室之间的接口，该接口可以使卵母细胞、精子和/或前期胚胎在两个腔室之间进行转移。
2.权利要求1的系统，其中用于获得哺乳动物卵母细胞的装置是带有针的系统，它在气密条件下与从针向所述设备转移的装置互通，这种转移装置包括注射器和管。
3.权利要求1的系统，其中所述用于获得哺乳动物精子的装置是可以调控内部氧压的系统。
4.权利要求1的系统，其中所述腔室内的环境被维持在无菌状态。
5.权利要求1的系统，其中每个腔室的温度可以独立调节。
6.权利要求1的系统，其中每个腔室的氧压独立地通过充入氧气、氮气、二氧化碳、氦气或另一种惰性气体，或这些气体中的两种或多种气体的混合物并且同时从室中抽出气体来调节，以这种方式使得空气与大气压一致。
7.权利要求6的系统，其中室内的气压略高于主腔室周围的大气压。
8.权利要求1-7之一的系统，其中每个腔室的湿度可以被调控到50至100％的水平。
9.权利要求1的系统，其中所述入口和出口与单个开口装置，诸如门组合。
10.权利要求1的系统，其中所述入口和出口在装置中组合，以便将细胞培养装置和设备转移到外腔室中以及从外腔室中移出。
11.权利要求10的系统，其中所述入口和所述出口的组合是气闸。
12.权利要求11的系统，其中所述入口构成气闸的内门而出口构成气闸的外门。
13.权利要求12的系统，其中所述气闸包括位于所述内门与所述外门间的壁从而构成一个气密小室。
14.权利要求13的系统，其中所述内门和外门以每次只可以打开一个门的方式一次打开一个，并且当一个门被完全关闭时另一个门才能被打开。
15.权利要求14的系统，其中所述气闸的环境是可调控的，所述环境包括气体含量、温度和湿度，所述气体是氧气、氮气、二氧化碳、氦气或另一种惰性气体。
16.权利要求15的系统，其中所述气闸的内门只可以在包括温度、湿度和含氧量在内的条件与内部设置了气闸的室的内部条件相同时打开。
17.权利要求1的系统，其中当处理卵母细胞、精子和胚胎时可以放置并使用一台显微镜。
18.权利要求1-17之一的系统，其中在主腔室内获得工作区，所述工作区包括放置含有经培养的细胞结构的培养装置的空间，其中所述经培养的细胞结构通过显微镜观察，且所述工作区包括用于放置处理装置的空间。
19.权利要求1-17之一的系统，其中主腔室内放置了一台显微授精设备。
20.权利要求1-19之一的系统，其中主腔室包括允许人操作室内细胞培养物或设备的开口装置。
21.权利要求20的系统，其中所述开口装置是连接的手套，这些手套以适合人手戴入并在室内操作细胞培养物或设备的方式安装。
22.权利要求20所述的系统，其中所述开口装置与由光纤操纵的棍、棒或仪器连接，用所述棍、棒或仪器对细胞培养物或设备进行操作。
23.权利要求1的系统，其中所述主腔室表面的至少一小部分被膜取代，该膜是无菌的且具有可以被针刺穿的结构，当取出针时，膜上针刺部位被填补，并且无论膜是否被针穿刺，气体或颗粒都不会透过膜进行扩散。
24.权利要求1-23之一的系统，其中所述至少两个独立的室被布置成一个主腔室和一个或多个较小的气密驻留室。
25.权利要求24的系统，其中所述较小的驻留室位于主腔室内或与主腔室相连。
26.权利要求25的系统，其中所述驻留室是气密的且彼此独立的，它可以独立于主腔室来调控温度、湿度以及氧气含量、氮气含量和二氧化碳含量。
27.权利要求26的系统，其中所述驻留室构成适于培养容器的箱体，所述培养容器含有下列的细胞培养物：卵母细胞，精子，胚胎和包括干细胞系在内的干细胞。
28.权利要求27所述的系统，每个箱体适于放置含有下列的细胞培养物的培养容器：卵母细胞，精子，胚胎和包括干细胞系在内的干细胞。
29.权利要求28所述的系统，其中箱体的数目对应于卵母细胞，精子，胚胎和包括干细胞系在内的干细胞的发育阶段数目。
30.权利要求29所述的系统，其中所述发育阶段至少包括未成熟卵母细胞、成熟卵母细胞、精子、受精卵母细胞、4细胞胚胎、8细胞胚胎、桑椹胚、胚泡和包括干细胞系在内的干细胞。
31.权利要求1-30之一的系统，其中每个室或气密箱体的氧压和压力可以通过用计算机获取所述室或所述气密箱体中胚胎的图像来控制。
32.权利要求24所述的系统，其中所述气密箱体是可移动的。
33.权利要求32所述的系统，其中所述气密箱体从所述设备移开后，可以被连接到用于控制温度、湿度以及氧气、氮气和二氧化碳的含量的装置上。
34.权利要求33所述的系统，其中所述用于控制温度、湿度以及氧气、氮气和二氧化碳的含量的装置是可移动的。
35.权利要求32-34之一的系统，其中所述箱体的壁含有膜。
36.权利要求32-35之一的系统，其中所述小箱体包括用于固紧一个或多个细胞培养容器的固紧装置。
37.权利要求36所述的系统，其中所述细胞培养容器的壁包含无菌膜。
38.权利要求32-37之一的系统，其中所述小箱体可以运输至少6天。
39.权利要求1所述的系统，其中所述主腔室的大小构成每个壁的1cm至2m的空间。
40.权利要求1-39所述系统用于培养细胞培养物的用途。
41.权利要求1-39所述系统用于培养配子、胚胎、胚泡、干细胞、干细胞系的用途。
42.一种用于体外制备哺乳动物前期胚胎的方法，包括下列步骤：
a1)提供哺乳动物卵母细胞，
a2)提供哺乳动物精子，
b)培养卵母细胞和精子，
c)用精子使卵母细胞受精从而获得受精卵母细胞，和
d)使受精卵母细胞发生细胞分裂从而获得多细胞前期胚胎，
其中a1)或a2)中的至少一个步骤是在氧压低于15％的条件中进行的。
43.权利要求42的方法，其中哺乳动物卵母细胞和哺乳动物精子是分别从雌性哺乳动物或雄性哺乳动物获得的配子，诸如选自由牛、猪、马、山羊、绵羊、狗、猫、兔、大鼠、小鼠、老虎、狮子、熊猫、大猩猩、鲸和人组成的组中的哺乳动物。
44.权利要求1的方法，其中哺乳动物卵母细胞和哺乳动物精子是从牛获得的配子。
45.权利要求1的方法，其中哺乳动物卵母细胞和哺乳动物精子是从猪获得的配子。
46.权利要求1的方法，其中哺乳动物卵母细胞和哺乳动物精子是从马获得的配子。
47.权利要求1的方法，其中哺乳动物卵母细胞和哺乳动物精子是从人体获得的配子。
48.权利要求1-47之一的方法，其中所述卵母细胞从卵巢获得。
49.权利要求48的方法，其中所述卵母细胞从初级卵泡，次级卵泡、原囊状卵泡、早期囊状卵泡或囊状卵泡获得。
50.权利要求48至49的方法，其中所述卵母细胞通过用针吸从卵巢获得。
51.权利要求48至50的方法，其中通过取出含有初级卵泡，次级卵泡或囊状卵泡的部分或全部卵巢组织并从所述卵巢组织中获取初级卵泡，次级卵泡或囊状卵泡来获得所述卵母细胞。
52.权利要求51的方法，其中所取出的部分或全部卵巢组织已经被冷冻。
53.权利要求50的方法，其中所述针是注射器的一部分并且所述针和注射器中的氧压低于15％。
54.权利要求1-53之一的方法，其中在用能使卵母细胞成熟的激素处理所述哺乳动物后，从哺乳动物获得卵母细胞。
55.权利要求54的方法，其中所述激素是促卵泡激素(FSH)。
56.权利要求54的方法，其中所述激素是促黄体激素(LH)。
57.权利要求1-56的方法，其中卵母细胞已经被冷藏。
58.权利要求1-56的方法，其中卵母细胞已经被冷冻。
59.权利要求1-47的方法，其中精子是未成熟精子或成熟精子，包括精子细胞或精母细胞。
60.权利要求59的方法，其中所述未成熟或成熟精子是在氧压低于15％的条件下从雄性动物获得的。
61.权利要求59-60的方法，其中所述精子是从取自雄性动物的睾丸组织中获得的。
62.权利要求61的方法，其中所述睾丸组织已被冷冻。
63.权利要求59-62的方法，其中精子从精液或睾丸组织获得。
64.权利要求59-63的方法，其中所述精子已被冷藏。
65.权利要求59-63的方法，其中所述精子已被冷冻。
66.权利要求1-58的方法，其中所述卵母细胞是未成熟卵母细胞。
67.权利要求66的方法，其中所述未成熟卵母细胞从卵泡获得。
68.权利要求67的方法，其中所述卵泡的直径为1-25mm，诸如2-18，诸如3-13mm，诸如5-12mm，诸如7-11mm，诸如8-10mm。
69.权利要求66的方法，其中所述未成熟卵母细胞是初级卵母细胞。
70.权利要求66的方法，其中所述未成熟配子处于第一次减数分裂前期。
71.权利要求66的方法，其中所述未成熟配子处于第一次减数分裂核网期。
72.权利要求66的方法，其中所述未成熟配子处于第一次减数分裂中期的后期。
73.权利要求66-72的方法，其中将所述未成熟配子培养到中期II，伴有卵丘、细胞质和细胞核的同步成熟。
74.权利要求66-73的方法，其中在20至30小时期间内完成所述未成熟配子到中期II的培养过程。
75.权利要求66-74的方法，其中步骤b)包括在能使所述未成熟卵母细胞成熟的条件下培养该卵母细胞的步骤。
76.权利要求75的方法，其中所述条件包括氧压低于15％。
77.权利要求1-76之一的方法，其中氧压低于13％、诸如低于11％、诸如低于10％、诸如低于9％、诸如低于8％、诸如低于7％、诸如低于6％、诸如低于5％、诸如低于4％、诸如低于3％、诸如低于2％、诸如低于1％。
78.权利要求1的方法，其中步骤b)包括将卵母细胞和精子共培养。
79.权利要求78的方法，其中将所述卵母细胞和精子共培养至少1分钟，诸如至少2分钟，诸如至少5分钟，诸如至少10分钟，诸如至少30分钟，诸如至少1小时，诸如至少2小时，诸如至少3小时，诸如至少4小时，诸如至少5小时，诸如至少10小时，诸如至少1 5小时，诸如至少20小时，诸如至少25小时，诸如至少30小时，诸如至少35小时，诸如至少40小时，诸如至少45小时，诸如至少50小时。
80.权利要求78-79的方法，其中所述卵母细胞和精子与滋养细胞进行共培养。
81.权利要求78-80的方法，其中卵母细胞与精子共培养导致卵母细胞被精子受精。
82.权利要求1-77的方法，其中卵母细胞通过胞质内精子注射(ICSI)而被精子受精。
83.权利要求1-82之一的方法，其中将受精的卵母细胞培养到胚胎阶段，该阶段是可以转移到雌性动物子宫的阶段。
84.权利要求83的方法，其中适于胚胎转移的阶段通过在卵母细胞受精后培养至少0.5天，诸如至少1天，例如至少2天，诸如至少3天，例如至少4天，诸如至少5天，诸如至少6天，例如至少7天，诸如至少8天，例如至少9天来获得。
85.权利要求83-84的方法，其中胚胎阶段是两细胞阶段。
86.权利要求83-84的方法，其中胚胎阶段是四细胞阶段。
87.权利要求83-84的方法，其中胚胎阶段是六细胞阶段。
88.权利要求83-84的方法，其中胚胎阶段是八细胞阶段。
89.权利要求83-84的方法，其中胚胎阶段是桑椹胚阶段。
90.权利要求83-84的方法，其中胚胎阶段是胚泡阶段。
91.权利要求83-84的方法，其中胚胎阶段是胚泡阶段，该阶段中透明带消失。
92.权利要求85-91的方法，其中所述胚胎的透明带打开以便帮助在植入子宫前孵化胚胎。
93.权利要求92的方法，其中通过用激光、机械力或酸性蒂罗德溶液辅助孵化来使透明带打开。
94.权利要求83-93的方法，其中从所述胚胎中去除细胞碎片。
95.权利要求1-94之一的方法，其中步骤a)的至少一部分以及至少一个其它步骤是在氧压低于15％时进行的。
96.权利要求1-95之一的方法，其中步骤a)，b)，c)和d)中的至少三个步骤是在氧压低于15％时进行的。
97.权利要求1-96之一的方法，其中步骤a)，b)，c)和d)中的所有步骤是在氧压低于15％时进行的。
98.权利要求1-97之一的方法，其中步骤d)的氧压比步骤b)和c)中任一个的氧压高。
99.权利要求66-76的方法，其中使卵母细胞成熟的条件包括将氧压升高后再降低氧压。
100.权利要求99的方法，其中氧压升高了至少1个单位，诸如至少2个单位，例如至少3个单位，诸如至少4个单位，例如至少5个单位，例如至少6个单位，诸如至少7个单位，例如至少8个单位，诸如至少9个单位，例如至少10个单位。
101.权利要求1-100之一的方法，其中氧压至少是0.5％，最大为21％。
102.权利要求99-100的方法，其中氧压的升高被维持至少5分钟，例如至少10分钟，诸如至少20分钟，例如至少30分钟，诸如至少45分钟，例如至少1小时，诸如至少1.5小时，例如至少2小时，诸如至少2.5小时，例如至少3小时，诸如至少4小时，例如至少5小时，诸如至少6小时，例如至少7小时，诸如至少8小时，例如至少9小时，诸如至少10小时。
103.权利要求1-102之一的方法，其中氧压根据卵母细胞或胚胎所处的阶段和条件来进行调控。
104.权利要求1-103之一的方法，其中卵母细胞，精子和胚胎的培养条件包括30-45℃，诸如32-42℃，诸如34-40℃，诸如36-38℃，诸如36.5-37.5℃，诸如约37℃的温度。
105.权利要求1-104之一的方法，其中卵母细胞，精子和胚胎的培养条件包括约37℃的温度。
106.权利要求1-105之一的方法，其中培养物的氧压是通过向体外培养物的环境中充入氧气、氮气、二氧化碳、氦气或其它惰性气体或这些气体中的两种或多种气体的混合物来调节的。
107.权利要求1-107之一的方法，其中步骤a)，b)，c)和d)中的所有步骤和胚胎向子宫的转移都是在氧压低于20％，诸如低于15％、诸如低于13％、诸如低于11％、诸如低于10％、诸如低于9％、诸如低于8％、诸如低于7％、诸如低于6％、诸如低于5％、诸如低于4％、诸如低于3％、诸如低于2％、诸如低于1％时进行的。
108.权利要求1-108之一的方法，其中步骤a)，b)，c)和d)中的所有步骤和胚胎向子宫的转移都是在无菌条件中进行的。
109.权利要求1-108之一的方法，其中所述培养基含有脂质或脂质前体，诸如甾醇或其功能等价的衍生物。
110.权利要求1-109之一的方法，其中所述培养基含有ATA(金精三羧酸)。
111.权利要求1-110之一的方法，其中所述添加剂是Medi-Cult SSR 4x、Medi-Cult SSR 4xa、Medi-Cult SSR 4xb、Medi-Cult SSR2或Medi-Cult SSR3。
112.权利要求1-111之一的方法，其中用于卵母细胞或精子发育的每个阶段的培养基包括本技术领域的技术人员已知的培养基。
113.权利要求1-112之一的方法，其中所述培养基被调整到低氧压的条件，所述调整可以是物理的或化学的方法，后者例如是通过利用氧分子载体或过氧化氢酶的方法。
114.权利要求1-113之一的方法，其中所述培养条件使得形成的胚胎内细胞的数目增多了。
115.权利要求1-114之一的方法，其中胚胎经过培养使得胚胎的裂球数为3-5个并且评价等级为1.0；2.0；2.1和2.2。
116.权利要求1-114之一的方法，其中胚胎经过培养使得胚胎的裂球数为4个并且评价等级为1.0；2.0和2.1。
117.权利要求1-114之一的方法，其中胚胎经过培养使3-5个细胞阶段的胚胎具有10-50％的裂殖度，因此依据CES分级系统该胚胎的级分为6-7。
118.权利要求1-114之一的方法，其中胚胎经过培养导致3-5个细胞阶段的胚胎具有小于10％的裂殖度，因此依据CES分级系统该胚胎的级分为7-8。
119.权利要求1-114之一的方法，其中胚胎经过培养导致4个细胞阶段的胚胎具有小于10％的裂殖度，因此依据CES分级系统该胚胎的级分为8。
120.权利要求1-114之一的方法，其中胚胎经过培养，在受精后64-67小时产生7-9个细胞的胚胎，并依据GES分级系统获得了60-100的级分。
121.权利要求1-114之一的方法，其中胚胎经过培养，导致在受精后64-67小时，产生具有7个等级I的细胞或8个等级I的细胞或8个等级II的细胞或9个等级I的细胞的胚胎，且依据GES分级系统获得了70-100的级分。
122.权利要求1-114之一的方法，其中胚胎经过培养，导致在受精后64-67小时，产生具有7个等级I的细胞或8个等级I的细胞或8个等级II的细胞或9个等级I的细胞的胚胎，且依据GES分级系统获得了80-100的级分。
123.植入前期胚胎的方法，包括培养权利要求1至122之一的卵母细胞和精子并且将得到的前期胚胎移入雌性哺乳动物的子宫内。
124.权利要求123的方法，其中所述胚胎被移入雌性动物子宫的输卵管内。
125.权利要求123-124的方法，其中在雌性动物经过激素处理后将所述胚胎移入该雌性动物的子宫内。
126.一种用于体外制备哺乳动物前期胚胎的方法，包括下列步骤：
a)提供选自哺乳动物卵母细胞和哺乳动物精子的配子，
b)培养所述卵母细胞和精子，
c)用精子使卵母细胞受精从而获得受精卵母细胞，和
e)使受精卵母细胞发生细胞分裂从而获得多细胞前期胚胎，
其中所述培养是在能够进行细胞培养的氧压中进行且其中至少一个步骤包括氧压的变化。
127.权利要求126的方法，其中哺乳动物卵母细胞和哺乳动物精子是分别从雌性哺乳动物或雄性哺乳动物获得的配子，所述哺乳动物是诸如选自由牛、猪、马、山羊、绵羊、狗、猫、兔、大鼠、小鼠、老虎、狮子、熊猫、大猩猩、鲸和人组成的组中的哺乳动物。
128.权利要求126的方法，其中哺乳动物卵母细胞和哺乳动物精子是得自牛的配子。
129.权利要求126的方法，其中哺乳动物卵母细胞和哺乳动物精子是得自猪的配子。
130.权利要求126的方法，其中哺乳动物卵母细胞和哺乳动物精子是得自马的配子。
131.权利要求126的方法，其中哺乳动物卵母细胞和哺乳动物精子是得自人的配子。
132.权利要求126-131之一的方法，其中卵母细胞获自于卵巢。
133.权利要求132的方法，其中卵母细胞获自于初级卵泡，次级卵泡、原囊状卵泡、早期囊状卵泡或囊状卵泡。
134.权利要求132-133之一的方法，其中所述卵母细胞通过用针吸从卵巢获得。
135.权利要求132-134之一的方法，其中通过取出含有初级卵泡，次级卵泡或囊状卵泡的部分或全部卵巢组织并从所述卵巢组织中获取初级卵泡，次级卵泡或囊状卵泡来获得所述卵母细胞。
136.权利要求135的方法，其中所取出的部分或全部卵巢组织已经被冷冻。
137.权利要求134的方法，其中所述针是注射器的一部分并且所述针和注射器中的氧压低于15％。
138.权利要求126-137之一的方法，其中在用能使卵母细胞成熟的激素处理哺乳动物后，从该哺乳动物获得卵母细胞。
139.权利要求138的方法，其中所述激素是促卵泡激素(FSH)。
140.权利要求138的方法，其中所述激素是促黄体激素(LH)。
141.权利要求126-140的方法，其中卵母细胞已经被冷藏。
142.权利要求126-140的方法，其中卵母细胞已经被冷冻。
143.权利要求126-131的方法，其中精子是未成熟精子或成熟精子，包括精子细胞或精母细胞。
144.权利要求143的方法，其中所述未成熟或成熟精子是在氧压低于15％的条件下从雄性动物获得的。
145.权利要求143-144的方法，其中所述精子是从取自雄性动物的睾丸组织中获得的。
146.权利要求145的方法，其中所述睾丸组织已被冷冻。
147.权利要求143-146的方法，其中精子从精液或睾丸组织获得。
148.权利要求143-147的方法，其中所述精子已被冷
149.权利要求143-147的方法，其中所述精子已被冷藏。
150.权利要求126-142的方法，其中所述卵母细胞是未成熟卵母细胞。
151.如权利要150的方法，其中所述未成熟卵母细胞从卵泡获得。
152.权利要求151的方法，其中所述卵泡的直径为1-25mm，诸如2-18，诸如3-13mm，诸如5-12mm，诸如7-11mm，诸如8-10mm。
153.权利要求150的方法，其中所述未成熟卵母细胞是初级卵母细胞。
154.权利要求150的方法，其中所述未成熟配子处于第一次减数分裂前期。
155.权利要求150的方法，其中所述未成熟配子处于第一次减数分裂核网期。
156.权利要求150的方法，其中所述未成熟配子处于第一次减数分裂中期的后期。
157.权利要求150-156的方法，其中将所述未成熟配子培养到中期II，并伴有卵丘、细胞质和细胞核的同步成熟。
158.权利要求150-157的方法，其中在20至30小时期间内完成所述未成熟配子到中期II的培养过程。
159.权利要求126-158的方法，其中所述氧压的降低是在步骤a)，b)，c)或e)中的一个步骤中于使卵母细胞或精子成熟的条件中进行的。
160.权利要求126-158的方法，其中所述氧压的降低是在步骤a)，b)，c)或e)中的两个步骤中于使卵母细胞或精子成熟的条件中进行的。
161.权利要求126-158的方法，其中所述氧压的降低是在步骤a)，b)，c)或e)中的三个步骤中于使卵母细胞或精子成熟的条件中进行的。
162.权利要求126-158的方法，其中所述氧压的降低是在步骤a)，b)，c)或e)中的所有步骤中于使卵母细胞或精子成熟的条件中进行的。
163.权利要求126-158的方法，其中所述氧压的升高是在步骤a)，b)，c)或e)中的一个步骤中于使卵母细胞或精子成熟的条件中进行的。
164.权利要求126-158的方法，其中所述氧压的升高是在步骤a)，b)，c)或e)中的两个步骤中于使卵母细胞或精子成熟的条件中进行的。
165.权利要求126-158的方法，其中所述氧压的升高是在步骤a)，b)，c)或e)中的三个步骤中于使卵母细胞或精子成熟的条件中进行的。
166.权利要求126-158的方法，其中所述氧压的升高是在步骤a)，b)，c)或e)中的所有步骤中于使卵母细胞或精子成熟的条件中进行的。
167.权利要求126-166之一的方法，其中将培养的初始氧压选定在1％至21％之间。
168.权利要求126-167之一的方法，其中氧压的变化是将氧压改变到低于20％，例如低于19％，诸如低于18％，例如低于17％，诸如低于16％，例如低于15％，诸如低于14％，例如低于13％，诸如低于12％，例如低于11％，诸如低于10％，例如低于9％，诸如低于8％，例如低于7％，诸如低于6％，例如低于5％，诸如低于4％，例如低于3％，诸如低于2％，例如低于1％。
169.权利要求126-168之一的方法，其中氧压的变化是将氧压降低至少1个单位，诸如至少2个单位，例如至少3个单位，诸如至少4个单位，例如至少5个单位，例如至少6个单位，诸如至少7个单位，例如至少8个单位，诸如至少9个单位，例如至少10个单位，诸如至少11个单位，例如至少12个单位，诸如至少13个单位，例如至少14个单位，诸如至少15个单位，例如至少16个单位，诸如至少17个单位，例如至少18个单位，诸如至少19个单位。
170.权利要求126-169之一的方法，其中氧压的变化是将氧压降低1-19个单位，诸如1-18个单位，例如1-17个单位，诸如1-16个单位，例如1-15个单位，诸如1-14个单位，例如1-13个单位，诸如1-12个单位，例如1-11个单位，诸如1-10个单位，例如1-9个单位，诸如1-8个单位，例如1-7个单位，诸如1-6个单位，例如1-5个单位，诸如1-4个单位，例如1-3个单位，诸如1-2个单位。
171.权利要求126-170之一的方法，其中氧压的变化是将氧压改变到高于2％，例如高于3％，诸如高于4％，例如高于5％，诸如高于6％，例如高于7％，诸如高于8％，例如高于9％，诸如高于10％，例如高于11％，诸如高于12％，例如高于13％，诸如高于14％，例如高于15％，诸如高于16％，例如高于17％，诸如高于18％，例如高于19％，诸如高于20％，例如高于21％。
172.权利要求126-171之一的方法，其中氧压的变化是将氧压升高至少1个单位，诸如至少2个单位，例如至少3个单位，诸如至少4个单位，例如至少5个单位，例如至少6个单位，诸如至少7个单位，例如至少8个单位，诸如至少9个单位，例如至少10个单位，诸如至少11个单位，例如至少12个单位，诸如至少13个单位，例如至少14个单位，诸如至少15个单位，例如至少16个单位，诸如至少17个单位，例如至少18个单位，诸如至少19个单位。
173.权利要求126-172之一的方法，氧压的变化是氧压升高了1-3个单位，诸如2-5个单位，例如3-7个单位，诸如4-9个单位，例如5-11个单位，诸如6-13个单位，例如8-15个单位，诸如10-18个单位，例如12-20个单位。
174.权利要求126-173之一的方法，其中变化后的氧压被调节到高于或低于初始氧压的水平。
175.权利要求174的方法，其中变化后的氧压被调节到1％至21％的水平。
176.权利要求126-175之一的方法，其中氧压的变化进行至少1分钟，例如至少2分钟，诸如至少3分钟，例如至少4分钟，诸如至少5分钟，例如至少6分钟，诸如至少7分钟，例如至少8分钟，诸如至少9分钟，例如至少10分钟，诸如至少11分钟，例如至少12分钟，诸如至少13分钟，例如至少14分钟，诸如至少15分钟，例如至少16分钟，诸如至少20分钟，例如至少30分钟，诸如至少45分钟，例如至少1小时，诸如至少1.5小时，例如至少2小时，诸如至少2.5小时，例如至少3小时，诸如至少4小时，例如至少5小时，诸如至少6小时，例如至少7小时，诸如至少8小时，例如至少9小时，诸如至少10小时。
177.权利要求126-176之一的方法，其中步骤b)包括卵母细胞与精子的共培养。
178.权利要求177的方法，其中卵母细胞与精子被共培养至少1分钟，诸如至少2分钟，诸如至少5分钟，诸如至少10分钟，诸如至少30分钟，诸如至少1小时，诸如至少2小时，诸如至少3小时，诸如至少4小时，诸如至少5小时，诸如至少10小时，诸如至少15小时，诸如至少20小时，诸如至少25小时，诸如至少30小时，诸如至少35小时，诸如至少40小时，诸如至少45小时，诸如至少50小时。
179.权利要求177-178之一的方法，其中卵母细胞和精子与滋养细胞共培养。
180.权利要求177-179的方法，其中卵母细胞与精子的共培养导致卵母细胞被精子受精。
181.权利要求126-176的方法，其中卵母细胞通过胞质内注射精子(ICSI)而被精子受精。
182.权利要求126-181之一的方法，其中受精的卵母细胞被培养到胚胎阶段以备转移到雌性动物的子宫内。
183.权利要求182的方法，其中适于胚胎转移的阶段通过将卵母细胞在受精后培养至少0.5天，诸如至少1天。例如至少2天，诸如至少3天，例如至少4天，诸如至少5天，诸如至少6天，例如至少7天，诸如至少8天，例如至少9天而获得。
184.权利要求182-183的方法，其中所述胚胎阶段是两细胞阶段。
185.权利要求182-183的方法，其中所述胚胎阶段是四细胞阶段。
186.权利要求182-183的方法，其中所述胚胎阶段是六细胞阶段。
187.权利要求182-183的方法，其中所述胚胎阶段是八细胞阶段。
188.权利要求182-183的方法，其中所述胚胎阶段是桑椹胚阶段。
189.权利要求182-183的方法，其中所述胚胎阶段是胚泡阶段。
190.权利要求182-183的方法，其中胚胎阶段是胚泡阶段，该阶段中透明带消失。
191.权利要求184-190的方法，其中所述胚胎的透明带打开以帮助在植入子宫前孵化胚胎。
192.权利要求191的方法，其中通过用激光、机械力或酸性蒂罗德溶液辅助孵化使透明带打开。
193.权利要求182-192的方法，其中从所述胚胎中去除细胞碎片。
194.权利要求126-193之一的方法，其中氧压至少是0.5％，最大为21％。
195.权利要求126-194之一的方法，其中氧压根据卵母细胞或胚胎所处的阶段和条件来进行调控。
196.权利要求126-195之一的方法，其中卵母细胞、精子和胚胎的培养条件包括30-45℃，诸如32-42℃，诸如34-40℃，诸如36-38℃，诸如36.5-37.5℃，诸如约37℃的温度。
197.权利要求126-196之一的方法，其中卵母细胞，精子和胚胎的培养条件包括约37℃的温度。
198.权利要求126-197之一的方法，其中培养物的氧压是通过向体外培养物的环境中充入氧气、氮气、二氧化碳、氦气或其它惰性气体或这些气体中的两种或多种气体的混合物来调节的。
199.权利要求126-198之一的方法，其中步骤a)，b)，c)和e)中的所有步骤以及胚胎向子宫的转移都是在无菌条件中进行的。
200.权利要求126-199之一的方法，其中所述培养基含有脂质或脂质前体，诸如甾醇或其功能等价的衍生物。
201.权利要求126-200之一的方法，其中所述培养基含有ATA(金精三羧酸)。
202.权利要求126-201之一的方法，其中所述添加剂是Medi-Cult SSR4x、Medi-Cult SSR 4xa、Medi-Cult SSR 4xb、Medi-Cult SSR2或Medi-CultSSR3。
203.权利要求126-202之一的方法，其中用于卵母细胞或精子发育的每个阶段的培养基包括本技术领域的技术人员已知的培养基。
204.权利要求203的方法，其中所述培养基被调整到低氧压的条件，所述调整可以是物理的或化学的方法，后者例如是通过利用氧分子载体或过氧化氢酶的方法。
205.权利要求126-204之一的方法，其中所述培养条件使得形成的胚胎内细胞的数目增多了。
206.权利要求126-205之一的方法，其中胚胎经过培养使得胚胎的裂球数为3-5个并且评价等级为1.0；2.0；2.1和2.2。
207.权利要求126-205之一的方法，其中胚胎经过培养使得胚胎的裂球数为4个并且评价等级为1.0；2.0和2.1。
208.权利要求126-205之一的方法，其中胚胎经过培养导致3-5个细胞阶段的胚胎具有10-50％的裂殖度，因此依据CES分级系统该胚胎的级分为6-7。
209.权利要求126-205之一的方法，其中胚胎经过培养导致3-5个细胞阶段的胚胎具有小于10％的裂殖度，因此依据CES分级系统该胚胎的级分为7-8。
210.权利要求126-205之一的方法，其中胚胎经过培养导致4个细胞阶段的胚胎具有小于10％的裂殖度，因此依据CES分级系统该胚胎的级分为8。
211.权利要求126-205之一的方法，其中胚胎经过培养，在受精后64-67小时产生7-9个细胞的胚胎，并依据GES分级系统获得了60-100的级分。
212.权利要求126-205之一的方法，其中胚胎经过培养在受精后64-67小时产生7个等级I的细胞或8个等级I的细胞或8个等级II的细胞或9个等级I的细胞并且依据GES分级系统获得了70-100的级分。
213.权利要求126-205之一的方法，其中胚胎经过培养在受精后64-67小时产生7个等级I的细胞或8个等级I的细胞或8个等级II的细胞或9个等级I的细胞并且依据GES分级系统获得了80-100的级分。
214.植入前期胚胎的方法，包括培养权利要求126至213之一的卵母细胞和精子并且将得到的前期胚胎移入雌性哺乳动物的子宫内。
215.权利要求215的方法，其中所述胚胎被移入雌性动物子宫的输卵管内。
216.权利要求215-216的方法，其中在雌性动物经过激素处理后将所述胚胎移入该雌性动物的子宫内。
217.一种制备干细胞的方法，该方法包括：
a)提供权利要求42-213之一的多细胞前期胚胎，
b)分离出a)中的多细胞前期胚胎，
c)从b)的前期胚胎的内细胞团中分离出细胞，
d)在基质胶中培养从所述内细胞团中分离出的细胞，
e)获得干细胞。
218.权利要求217的方法，其中其中步骤b)，c)，d)和e)中的至少一个步骤是在氧压低于15％时进行的。
219.权利要求217的方法，其中其中步骤b)，c)，d)和e)中的至少两个步骤是在氧压低于15％时进行的
220.权利要求217的方法，其中其中步骤b)，c)，d)和e)中的至少三个步骤是在氧压低于15％时进行的
221.权利要求217的方法，其中其中步骤b)，c)，d)和e)中的所有步骤是在氧压低于15％时进行的
222.由权利要求217-221之一方法得到的干细胞。
223.权利要求222所述的干细胞，其中所述干细胞是稳定的，也就是说染色体内或细胞表面抗原性不发生突变或其它遗传改变。
224.由权利要求217-221的干细胞得到的干细胞系。
225.使用由权利要求217-221的方法获得的干细胞制备干细胞系的用途。
226.一种干细胞包装产品，该包装产品含有：
权利要求217-221之一的干细胞
说明书，其中记载了适于干细胞和由该干细胞获得的细胞培养物的培养条件。
CNA038195372A 2002-06-17 2003-06-17 体外受精 Pending CN1675354A (zh)

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA200200924 2002-06-01
DKPA200200925 2002-06-01
DKPA200200925 2002-06-17
DKPA200200924 2002-06-17
US40768502P 2002-09-04 2002-09-04
US40768602P 2002-09-04 2002-09-04
US60/407,686 2002-09-04
US60/407,685 2002-09-04

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1675354A true CN1675354A (zh) 2005-09-28

Family

ID=29740899

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA038195372A Pending CN1675354A (zh) 2002-06-17 2003-06-17 体外受精

Country Status (8)

Country Link
US (2) US7547541B2 (zh)
EP (1) EP1539932A1 (zh)
JP (1) JP2005529609A (zh)
CN (1) CN1675354A (zh)
AU (1) AU2003232183B2 (zh)
CA (1) CA2529724A1 (zh)
IL (1) IL165804A0 (zh)
WO (1) WO2003106662A1 (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103013908A (zh) * 2013-01-08 2013-04-03 内蒙古赛科星繁育生物技术股份有限公司 牛混合羊精液体外受精新方法
CN104755608A (zh) * 2012-08-30 2015-07-01 尤尼森斯繁殖技术公司 体外培养胚胎的自动化监控
CN105160152A (zh) * 2015-07-31 2015-12-16 广州优阳信息技术有限公司 一种人工授精、体外受精与胚胎移植的安全操作方法
CN107177501A (zh) * 2017-06-30 2017-09-19 胡蓉 胚胎培养实验室数据交互方法及系统
CN110859178A (zh) * 2019-12-23 2020-03-06 张嘉 一种mri兼容的离体肾脏灌注系统
CN111549125A (zh) * 2013-06-18 2020-08-18 国家医疗保健研究所 用于测定胚胎质量的方法

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070249052A1 (en) * 2003-10-10 2007-10-25 Kw2 Implantattechnologie Gmbh Cartilage Regeneration By Generation Of Chondrons Under High Concentrations Of Magnesium
JP4855778B2 (ja) * 2005-01-31 2012-01-18 知 藤澤 卵観察装置
CN1757718A (zh) * 2005-08-11 2006-04-12 王金华 各类生物、酶、细胞、器官的生产及其技术
US20070162992A1 (en) * 2006-01-09 2007-07-12 Mcgill University Metabolomic determination in assisted reproductive technology
WO2007103177A2 (en) * 2006-03-03 2007-09-13 O2Cyte, Llc Manipulation of oxygen tension during in vitro follicle culture
JP2008054647A (ja) * 2006-09-04 2008-03-13 Hitachi Ltd 培養装置
JP2009005584A (ja) * 2007-06-26 2009-01-15 Miyazaki Prefecture ゲル化剤、凍結保存剤、細胞保存用容器、細胞の凍結保存方法、細胞の融解方法、哺乳動物の細胞
GB0719037D0 (en) * 2007-09-28 2007-11-07 Vitrolife Sweden Ab Sampling needle
WO2009079474A1 (en) * 2007-12-14 2009-06-25 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods, systems, and computer readable media for facilitating automation of blastocyst microinjection
GB2461707B (en) * 2008-07-08 2013-06-26 Ruskinn Life Sciences Ltd Laboratory apparatus for a controlled environment
WO2010056755A2 (en) * 2008-11-11 2010-05-20 Craig H Randall Microfluidic embryo and gamete culture systems
US8251887B2 (en) * 2009-01-24 2012-08-28 Xihe Li Reproductive technology of low dose semen production and in vitro/in vitro fertilization in domestic animals
US20120196316A1 (en) * 2009-06-25 2012-08-02 Phase Holographic Imaging Phi Ab Analysis of ova or embryos with digital holographic imaging
HUP0900431A2 (en) * 2009-07-10 2011-01-28 Cryo Innovation Kft Sample imaging system and pocedure for transmitting imager of cells or tissues located in breeder space towards a data processing device
KR101081278B1 (ko) * 2009-10-28 2011-11-08 엘지이노텍 주식회사 발광 소자 및 그 제조방법
WO2013018545A1 (ja) * 2011-08-03 2013-02-07 扶桑薬品工業株式会社 胚培養用組成物
US10271876B2 (en) 2011-11-23 2019-04-30 Mezadata Medical Ip Holding Llc Method of in vitro fertilization with delay of embryo transfer and use of peripheral blood mononuclear cells
JP6291429B2 (ja) 2015-01-20 2018-03-14 富士フイルム株式会社 細胞培養装置および細胞培養方法
CN107949835B (zh) * 2015-03-31 2021-11-09 兴盛生物科技股份有限公司 具有集成成像系统的细胞培养培殖器
WO2016161169A2 (en) 2015-03-31 2016-10-06 Thrive Bioscience, Inc. Cell culture incubators with integrated cell manipulation systems
CN107734965A (zh) * 2015-04-08 2018-02-23 全国农业协同组合连合会 生产来自不同个体的配子的非人大型哺乳动物或鱼类的制作方法
CN114958601A (zh) * 2021-02-25 2022-08-30 株式会社岛津制作所 共培养装置、共培养系统及共培养方法
KR102629328B1 (ko) * 2021-11-25 2024-01-25 연세대학교 원주산학협력단 항온조를 통한 고압산소챔버 내부 온도 유지 시스템

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4262091A (en) * 1979-04-27 1981-04-14 Anaerobe Systems Preparation of contaminant free containers of culture medium
US4892830A (en) * 1987-04-02 1990-01-09 Baylor College Of Medicine Environmentally controlled in vitro incubator
US5169217A (en) * 1991-04-10 1992-12-08 International Portland Corporation Controlled environment chamber apparatus
US5219215A (en) * 1991-12-03 1993-06-15 Intelmatec Corporation Modular clean bench system
DK85093D0 (da) * 1993-07-16 1993-07-16 Landsforeningen Til Kraeftens Method and apparatus for performing operations
US5882926A (en) * 1993-10-20 1999-03-16 Oregon Health Sciences University Excitatory amino acid transporter gene and uses
WO1996030496A1 (en) * 1995-03-24 1996-10-03 University Of Alabama At Birmingham Research Foundation Human embryo co-culture system and uses thereof
US6140121A (en) * 1995-10-19 2000-10-31 Advanced Reproduction Technologies, Inc. Methods and compositions to improve germ cell and embryo survival and function
US5824548A (en) * 1996-05-29 1998-10-20 Wisconsin Alumni Research Foundation Method of increasing survival of cultured primate embryos in medium containing exogenous gonadotrophin releasor hormone
US6399375B2 (en) * 1997-01-08 2002-06-04 Demtek A/S Method and apparatus for culturing cells and tissues
AU1540197A (en) * 1997-01-08 1998-08-03 Demtek A/S Method and apparatus for culturing cells and tissues
CA2199663C (en) * 1997-03-11 2004-08-10 Ruth Miriam Moses In vitro maturation and fertilization of mammalian oocytes
US6050935A (en) * 1997-05-09 2000-04-18 Biofertec Container assembly for intravaginal fertilization and culture and embryo transfer and method of intravaginal fertilization and culture employing such a container
US20020068358A1 (en) * 1998-04-28 2002-06-06 Campbell Michael J. In vitro embryo culture device
AUPP421298A0 (en) 1998-06-19 1998-07-09 Fertilitescentrum Ab Method and medium for in vitro culture of human embryos
ID27197A (id) * 1998-06-22 2001-03-08 Medi Cult As Uji coba untuk indikasi adanya ova yang tidak mampu subur
AU6218899A (en) * 1998-10-12 2000-05-01 Geron Bio-Med Limited Porcine oocytes with improved developmental competence
US6184035B1 (en) * 1998-11-18 2001-02-06 California Institute Of Technology Methods for isolation and activation of, and control of differentiation from, skeletal muscle stem or progenitor cells
TR200101538T2 (tr) 1998-11-30 2001-12-21 Ivf Sciences Colorado, Inc. In vitro dölleme sistemi ve sıralı kültür ortamı.
WO2000038583A1 (en) 1998-12-24 2000-07-06 New Zealand Pastoral Agriculture Research Institute Limited Methods and compositions for improving the developmental ability and quality of pre-implantation embryos
JP3856422B2 (ja) 1999-01-05 2006-12-13 ニプロ株式会社 動物胚培養用培地
IT1317859B1 (it) 2000-02-29 2003-07-15 Univ Pavia Metodo per la selezione e la crescita di oociti competenti per losviluppo embrionale.
US6762053B2 (en) 2000-06-09 2004-07-13 Vitrolife, Inc. Mammalian gamete and embryo culture media and culture media supplements
CA2822983C (en) * 2000-11-29 2017-05-09 Xy, Llc System to separate frozen-thawed spermatozoa into x-chromosome bearing and y-chromosome bearing populations
EP1372916A2 (en) * 2001-03-21 2004-01-02 Vitrox APS Method and housing for performing operations on a material

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104755608A (zh) * 2012-08-30 2015-07-01 尤尼森斯繁殖技术公司 体外培养胚胎的自动化监控
CN110688985A (zh) * 2012-08-30 2020-01-14 尤尼森斯繁殖技术公司 体外培养胚胎的自动化监控
CN103013908A (zh) * 2013-01-08 2013-04-03 内蒙古赛科星繁育生物技术股份有限公司 牛混合羊精液体外受精新方法
CN111549125A (zh) * 2013-06-18 2020-08-18 国家医疗保健研究所 用于测定胚胎质量的方法
CN105160152A (zh) * 2015-07-31 2015-12-16 广州优阳信息技术有限公司 一种人工授精、体外受精与胚胎移植的安全操作方法
CN107177501A (zh) * 2017-06-30 2017-09-19 胡蓉 胚胎培养实验室数据交互方法及系统
CN110859178A (zh) * 2019-12-23 2020-03-06 张嘉 一种mri兼容的离体肾脏灌注系统
CN110859178B (zh) * 2019-12-23 2022-04-22 张嘉 一种mri兼容的离体肾脏灌注系统

Also Published As

Publication number Publication date
IL165804A0 (en) 2006-01-15
US20090281370A1 (en) 2009-11-12
CA2529724A1 (en) 2003-12-24
US7781207B2 (en) 2010-08-24
EP1539932A1 (en) 2005-06-15
JP2005529609A (ja) 2005-10-06
AU2003232183B2 (en) 2008-08-14
US20050239040A1 (en) 2005-10-27
AU2003232183A1 (en) 2003-12-31
US7547541B2 (en) 2009-06-16
WO2003106662A1 (en) 2003-12-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1675354A (zh) 体外受精
Bongso et al. Improved quality of human embryos when co-cultured with human ampullary cells
CN1524121A (zh) 一种核转移的方法
CN103562378B (zh) 用于自体种系线粒体能量转移的组合物和方法
US6107543A (en) Culture of totipotent embryonic inner cells mass cells and production of bovine animals
Pirestani et al. Effect of ovarian cyclic status on in vitro embryo production in cattle
KR100666595B1 (ko) 사람 난자의 체외성숙 및 체외수정을 위한연속합성배양액의 조성물 및 이를 이용한 배양방법
Asa et al. Relationship between meiotic spindles visualization and intracytoplasmic sperm injection outcomes in human oocytes
Nation et al. The production of mature oocytes from adult ovaries following primary follicle culture in a marsupial
Seshagiri et al. Enabling hamster embryo culture system: development of preimplantation embryos
Gwazdauskas et al. In vitro preimplantation mouse embryo development with incubation temperatures of 37 and 39 C
CN1161615C (zh) 预测取出用于体外受精的卵细胞的时间的方法和应用
Bongso et al. Human blastocyst culture and derivation of embryonic stem cell lines
Mitalipov et al. Nuclear transfer in nonhuman primates
Rienzi et al. Oocyte denuding
Gardner et al. Introduction to the in vitro fertilization laboratory: management of sperm, oocytes, and embryos
WO2014137733A1 (en) Unique buffering system for cell culture media and gamete and embryo culture media and methods
Khalili et al. The effect of in vitro culture on cleavage rates and morphology of the in vivo-developed embryos in mice
Ohta et al. Long-term preservation of mouse spermatozoa as frozen testicular sections
Chang et al. Production of live offspring from vitrified-warmed oocytes collected at metaphase I stage
Hozyen DOES TROPHECTODERM BIOPSY AFFECT BLASTOCYST’S EXPANSION RATE POST THAWING?
Zhang et al. CO2 concentration affects in vitro pig embryo developmental capacity
Lee et al. Effect of Transfer Temperature of Epididymis on Survival Rate of Semen and B6D2F1 Mice Developmental Capacity
Khezli et al. Alpha Lipoic Acid Impact on Apoptosis-Related Gene Expression in Mature Mouse Oocyte.
Joan Development of In vitro maturation Protocol in Rat Oocytes

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication