ES2284542T3 - Tratamiento de infertilidad humana. - Google Patents
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Abstract
Proceso comprendiendo: a) someter ex vivo un ovocito humano a condiciones que causen la interrupción del ovocito bloqueando la maduración del ovocito cultivando los ovocitos incluidos en el cumulus solos o juntos en cocultivo con células de cumulus, células tecales, células de granulosa, células somáticas, o en medios acondicionados con auto-factores y factores endocrinos que las células indicadas anteriormente producen o por cultivo en presencia de un inhibidor cualquiera de meiosis químico, y el período de tiempo durante el que las condiciones que llevan el ovocito a mantener una interrupción meiótica es de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 48 horas, y b) someter el ovocito a condiciones en las que el estado de interrupción es invertido por la adición de MAS, el período de tiempo en el que el ovocito es sometido a condiciones en las que el estado de interrupción es invertido es de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 48 horas, con la condición de que, desde el momentoen el que el ovocito es extraído de la paciente o de la donante, y durante la hora siguiente, ninguna maduración espontánea tenga lugar, visualizada como GVB precoz, antes de que una reactivación de meiosis sea activamente inducida por MAS.
Description
Tratamiento de infertilidad humana.
La presente invención se refiere a un método de
laboratorio embrionario y a una composición farmacéutica y su
utilización para tratar la infertilidad humana. De manera más
específica, la presente invención se refiere al tratamiento de la
infertilidad humana por métodos in vitro que detienen
activamente el ovocito humano en la profase de la primera división
meiótica e invierten después activamente este bloqueo meiótico
mediante la adición de al menos un compuesto de estimulación de
meiosis o por unas condiciones de cultivo que producen una
formación endógena de moléculas estimulantes de la meiosis en el
complejo ovocito-cumulus. En resumen, la presente
invención se refiere a un método mejorado de fecundación in
vitro (definido a continuación FIV).
La meiosis es el único y último acontecimiento
de las células germinales en el que se basa la reproducción sexual.
La meiosis incluye dos divisiones meióticas. Durante la primera
división, el intercambio entre los genes maternos y paternos tiene
lugar antes que los pares de cromosomas se separen en dos células
hijas. Éstas contienen únicamente la mitad del número (1n) de
cromosomas y 2c de ADN. La segunda división meiótica se desarrolla
sin síntesis de ADN. En consecuencia, esta división tiene como
resultado la formación de células germinales haploides con sólo 1c
de ADN.
Los acontecimientos meióticos son similares en
las células germinales macho y hembra, pero la planificación y los
procesos de diferenciación que producen los óvulos y los
espermatozoides difieren profundamente. Todas las células
germinales hembras entran en la profase de la primera división
meiótica de forma temprana, a menudo antes del nacimiento, pero son
todas bloqueadas en forma de ovocitos más tarde durante la profase
(estado dictioteno) hasta la ovulación después de la pubertad. De
este modo, desde el inicio de su vida, la hembra tiene una reserva
de ovocitos que es utilizada hasta que dicha reserva se agote. La
meiosis en las hembras no se termina hasta después de la
fecundación, y el resultado consiste en un solo óvulo y dos cuerpos
polares abortivos por célula germinal. Por el contrario, sólo una
parte de las células germinales machos entra en meiosis a partir de
la pubertad y abandona una población troncal de células germinales
a lo largo de la vida. Una vez iniciada, la meiosis en la célula
masculina se desarrolla sin retraso significativo y produce 4
espermatozoides.
No se sabe mucho de los mecanismos que controlan
la meiosis en el macho y en la hembra. En el ovocito, unos estudios
recientes indican que las purinas foliculares, tales como la
hipoxantina, y la adenosina, pueden ser responsables de una
interrupción meiótica (Downs, S.M., et al. (1985) en Dev.
Biol. 82: 454 a 458; Eppig, J.J., et al. (1986) en Dev. Biol.
119: 313 a 321; y Downs, S.M., et al. (1993) en Mol. Reprod.
Dev. 35: 82 a 94). Esas bases purinas han sido encontradas siempre
en el fluido folicular, la suspensión inducida por las bases
purinas era reversible. Esto fue demostrado a través de
experimentos en los que ovocitos múridos y humanos fueron mantenidos
durante la interrupción meiótica de 24 horas con hipoxantina
seguido de un cultivo de 16-30 horas en un medio
desprovisto de inhibidor (Downs, S.M., et al. (1986) en
Gamet Res. 15: 305 a 316; y Cha, K.Y. et al. (1992) en
Reprod. Fertil. Dev. 4: 695 a 701). Prácticamente el 100% de los
ovocitos múridos bloqueados volvieron a tener una maduración y,
además, los ovocitos maduros fueron fecundados con éxito y
demostraron un desarrollo de preimplantación y postimplantación
completo. Estos datos soportan colectivamente la idea de que las
purinas tales como la hipoxantina y la adenosina son
fisiológicamente importantes en los mecanismos que controlan la
interrupción meiótica in vivo.
La adenosina cíclica
5'-monofosfato (definida a continuación AMPc)
desempeña un papel de crucial importancia como segundo mensajero en
la vía de transducción de señales durante la meiosis en el ovocito.
La AMPc es generada por la acción de la adenilata ciclasa (definida
a continuación AC). La AMPc es degradada por la familia de las
enzimas fosfodiesterasa (definida a continuación PDE), que produce
segundos productos mensajeros inactivos. La hipoxantina (definida a
continuación Hx) es un inhibidor de AMPc PDE (Eppig, J.J., et
al (1985) en Biol. Reprod. 33: 1041 a 1049). De esta forma, Hx
puede prevenir la hidrolisis de AMPc en el ovocito y mantener así
los niveles elevados de AMPc en el ovocito. Además de la
hipoxantina, hay agentes que actúan corriente arriba o corriente
abajo del AMPc que pueden aumentar los niveles de AMPc. De esta
manera, la activación de AC con forscolina, la inhibición de PDE
con
3-isobutil-1-metilxantina
no selectiva (definida a continuación IBMX) o la inhibición del
isoforme específico a los ovocitos PDE3 por un inhibidor específico
de PDE3, por ejemplo milrinona, produce una interrupción meiótica
manteniendo unos niveles elevados de AMPc en los ovocitos (Downs,
S.M., y Hunzicker-Dunn, M., (1995) en Dev Biol.
172: 72 a 85; y Tsafiri, A., et al. (1996) en Dev Biol. 178:
393 a 402).
Un inhibidor específico de PDE3 ha sido descrito
como agente anticonceptivo (documento WO98/10765).
En la solicitud de patente internacional N°
WO99/61016, se describe una composición farmacéutica comprendiendo
un compuesto de aumento de AMPc en pequeñas dosis de manera que
cuando se utilice para el tratamiento de la infertilidad de
mamíferos, ésta produzca una maduración meiótica sin inducir una
interrupción meiótica.
La presencia de una sustancia reguladora de
meiosis difundible fue descrita primero (Byskov, A.G., et
al. (1976) en Dev. Biol. 52: 193 a 200) en las gónadas de
ratones fetales. Una sustancia activadora de meiosis (MAS) fue
secretada en el ovario de ratones fetales en el que la meiosis
estaba desarrollándose, y una sustancia de prevención de meiosis
(definida a continuación MPS) fue liberada de los testículos
diferenciados morfológicamente con células germinales en reposo, no
meióticas. Se ha sugerido por consiguiente, que las concentraciones
relativas de MAS y de MPS regulaban el inicio, la interrupción y la
reactivación de la meiosis en las células germinales machos y
hembras (Byskov, A.G., y Høyer, P.E., (1994) en The Physiology of
Reproduction, Knobil, E., y Neill, J.D., (Editores), Raven Press,
New York, 487 a 540). Un artículo reciente (Byskov, A.G., et
al., (1995) en Nature 374: 559 a 562) describe el aislamiento
de ciertos esteroles del fluido folicular ovárico preovulatorio,
definido como FF-MAS, y de testículos de toro,
definidos como T- MAS, que activan la meiosis en el ovocito. Esto ha
sido confirmado recientemente (Grøndahl et al. (1998) en
Biol. Reprod. 1998, 58: 1297 a 1302) mostrando que una nueva
FF-MAS sintetizada es capaz de regular la
reactivación de meiosis en ovocitos múridos.
La solicitud de patente canadiense N° 2 199 663
describe un método de cultivo de ovocitos mamíferos inmaduros,
durante 5 a 7 días, para hacerlos crecer y desarrollar para que sean
posteriormente competentes con respecto a su desarrollo.
Desde el primer embarazo por FIV realizado en
1978, este método ha producido miles de embarazos y ha abierto un
campo nuevo y amplio de búsqueda y de tratamiento para parejas
infértiles. Sin embargo, en la actualidad existe una necesidad
importante de mejorar las modalidades de tratamiento contra la
infertilidad. Se supone que aproximadamente una de siete parejas
tiene problemas de fertilidad baja o de infertilidad.
La FIV de ovocitos humanos es utilizada
comúnmente para el tratamiento de una fertilidad baja en hembras y
machos. El tratamiento de FIV estándar incluye una larga fase de
estímulo hormonal de la paciente hembra, por ejemplo de 30 días,
que se inicia eliminando la propia hormona de estimulación
folicular de la paciente (definida a continuación FSH) y la hormona
luteinizante (definida a continuación LH) por la hormona de
liberación de gonadotrofinas (definida a continuación GnRH), y esto
es seguido de inyecciones de gonadotrofinas exógenas, por ejemplo
FSH y/o LH, con el fin de garantizar un desarrollo de múltiples
folículos preovulatorios y la aspiración de múltiples ovocitos
maduros in vivo inmediatamente antes de la ovulación. El
ovocito aspirado es posteriormente fertilizado in vitro y
cultivado, normalmente durante tres días antes de trasladarlos de
nuevo dentro del útero en el estadio de 4-8
células. Se han realizado esfuerzos continuos para optimizar y
simplificar este procedimiento. Sin embargo, el índice de embarazo
global no puede ser aumentado de forma significativa de más de
aproximadamente el 20% con las modalidades de tratamiento
habituales. En una gran investigación a nivel europeo de pacientes
de FIV, se ha descubierto que 7,2 ovocitos de 11,5 ovocitos
aspirados por paciente habían sufrido una reactivación de meiosis
inmediatamente antes de la fertilización, sólo 4,3 ovocitos fueron
fecundados y sólo 2,2 ovocitos alcanzaron el nivel embrionario de 8
células después de una fecundación y de un cultivo in vitro
(ESHRE, Edimburgo, 1997).
Debido a la calidad muy imprevisible de los
embriones del estado de la técnica, actualmente, más de un embrión
ha sido transferido únicamente con el fin de proporcionar una
oportunidad de éxito razonable. Por lo que es común transferir
2-3 embriones (hasta 5 embriones en ciertos países),
lo que produce como efecto secundario muy importante los embarazos
múltiples de gran incomodidad y riesgo tanto para la paciente como
para los niños. Además, se ha estimado que los costes de salud
elevados debidos a un nacimiento múltiple (gemelos, trillizos,
etc.) sobrepasan el coste total de la FIV.
En consecuencia, existen varios inconvenientes
asociados al tratamiento habitual, los cuatro más notables
siendo:
- 1.
- Riesgo de hiperestimulación ovárica por inyección de gonadotrofinas que es una condición fatal potencial que requiere hospitalización,
- 2.
- embarazos múltiples (50-1 000 veces la frecuencia normal de gemelos y trillizos, respectivamente),
- 3.
- la existencia de segmentos de pacientes considerables que no toleran el procedimiento corriente debido, por ejemplo, al síndrome de ovarios poliquísticos y muchas diabéticas, y
- 4.
- riesgo de cáncer potencial a largo plazo.
Además, se indican como inconvenientes el
aumento de peso, hinchazón, nauseas, vómito, humor lábil y otras
molestias de la paciente junto con una aversión de la paciente a
inyectarse ella misma.
En la actualidad, se ha comprobado que la
maduración in vitro en seres humanos es altamente
infructuosa a pesar del interés y de los esfuerzos clínicos
substanciales.
Recientemente, se ha descubierto que la
maduración espontánea y la maduración inducida por MAS utilizan un
mecanismo de señalización diferente. La maduración espontánea no
utiliza el mecanismo de señalización sensible a la toxina colérica
al contrario de un mecanismo de señalización inducido por MAS. Esto
implica que diferentes receptores, es decir receptores acoplados a
la proteína G, están implicados en los dos mecanismos de
señalización. Además, se ha observado que la cinética de una
maduración de ovocito inducida por FF-MAS y
espontánea es totalmente diferente. El ovocito de ratón desnudo es
llevado a maduración espontáneamente en 4 horas mientras que el
ovocito de ratón bloqueado desde un punto de vista meiótico
(bloqueado por aislamiento de células de cumulus masivas o por
purinas diversas) durante la activación por FF-MAS
o FSH, madura después de 16-20 horas.
También se ha observado que
FF-MAS en los ovocitos humanos incluidos en el
cumulus mejora no sólo la maduración nuclear sino también
citoplásmica (Grøndahl et al.; 1999 Alfa abstract,
Copenhague).
Aunque la utilización de FF-MAS
mejore el grado de fecundidad en comparación con los procedimientos
aplicados actualmente, siempre es necesario aumentar todavía más
este índice.
La presente invención se refiere a la mejora del
tratamiento contra la infertilidad evitando que una maduración
espontánea se produzca in vitro y favoreciendo una inducción
activa de maduración.
Esto se obtiene mediante métodos por los cuales
se bloquea la maduración del ovocito. Posteriormente, este bloqueo
de meiosis es invertido activamente.
Uno de los procesos inventados y reivindicados
aquí es aplicado a un ovocito retirado o extraído de una mujer, por
ejemplo, procedente de una paciente humana hembra o de una donante
humana hembra. Dicho proceso incluye las etapas siguientes:
- 1)
- someter un ovocito retirado de una mujer a condiciones que provoquen la interrupción del ovocito (definida a continuación como etapa de interrupción) mediante el bloqueo de la maduración del ovocito cultivando ovocitos encerrados por cumulus solos o juntos en un cocultivo con células de cumulus, células tecales, células de granulosa, células somáticas, o en medios acondicionados con concentración de auto-factores y endocrinas que las células indicadas anteriormente pueden producir en el cultivo o mediante la adición de cualquier inhibidor de meiosis químico en el medio, por ejemplo, purinas, y el período de tiempo durante el cual las condiciones que hacen que el ovocito mantenga una interrupción meiótica es de aproximadamente 1 hora,
- 2)
- someter el ovocito a condiciones en las que el estado bloqueado es invertido (definido a continuación como la etapa de inversión) por la adición de MAS, el período de tiempo en el que el ovocito es sometido a condiciones en las que el estado bloqueado es invertido, siendo de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 48 horas, de preferencia de aproximadamente 4 horas a aproximadamente 36 horas, y
- 3)
- fecundar el ovocito (definido a continuación como etapa de fecundación),
- con la condición de que, desde el momento en el que el ovocito es retirado de la paciente o de la donante, y durante las 16 horas siguientes, de preferencia las 8 horas siguientes, de manera más preferida las 4 horas siguientes, de manera aún más preferida las 2 horas siguientes, y de manera todavía más preferida la hora siguiente, ninguna, o esencialmente ninguna maduración espontánea se produzca.
Alternativamente, la condición del proceso
anteriormente mencionado es designada de la siguiente manera:
"con la condición de que, desde que el ovocito es retirado de la
paciente o de la donante y en las 16 horas siguientes, de
preferencia las 8 horas siguientes, de manera más preferida las 4
horas siguientes, no aparezca ninguna o esencialmente ninguna
ruptura de vesícula germinal antes de inducir activamente la
reactivación de meiosis".
Antes de efectuar el proceso anteriormente
mencionado, al menos un ovocito es retirado de una mujer, por
ejemplo, una paciente o una donante hembra. Esta extracción puede
ser efectuada de manera conocida, por ejemplo tal como ha sido
descrito por Itskovitz-Eldor & Thaler (en
Reproductive, Endocrinology, Surgery and Technology Capítulo 107;
páginas 1991 a 2030; Editores: Adashi, Rock y Rosenwaks; 1995;
Editoriales Lipencott-Raven). Habitualmente se
retiran 5-15 ovocitos. Todos los ovocitos retirados
o sólo algunos de éstos pueden ser sometidos al método de la
presente invención. Los ovocitos utilizados para la presente
invención, deben haber acabado su fase de crecimiento durante la
cual adquieren una competencia total para recuperar la maduración
meiótica. La finalización de dicha fase de crecimiento ocurre
durante las dinámicas foliculares. De preferencia, los folículos
tienen un diámetro de al menos aproxi-
madamente 5 mm y, de preferencia, los folículos tienen un diámetro de un máximo de aproximadamente 10 mm.
madamente 5 mm y, de preferencia, los folículos tienen un diámetro de un máximo de aproximadamente 10 mm.
La paciente hembra es una mujer que ha decidido
realizar una FIV. De manera alternativa, se puede utilizar una
donante de óvulos.
Después de extraer un ovocito del medio
inhibidor de meiosis, un folículo de la paciente o de la donante,
el ovocito es sometido a condiciones que llevan al ovocito a
mantener una interrupción meiótica o, en otras palabras, es
sometido a condiciones a través de las cuales se impide la
maduración espontánea del ovocito, es decir la etapa de
interrupción. La condición que lleva al ovocito a bloquearse, puede
ser obtenida de cualquier manera conocida. Por ejemplo, esta
condición de interrupción de meiosis puede ser obtenida bloqueando
la maduración del ovocito con cualquier método, por ejemplo,
cultivando ovocitos incluidos en un cumulus, solos o juntos en
cocultivo con células de cumulus, células tecales, células de
granulosa, células somáticas, o en medios acondicionados con una
concentración de auto- factores y endocrinas que pueden ser
producidas por las células antes mencionadas en el cultivo o
mediante la adición de un inhibidor cualquiera de meiosis química
en el medio, por ejemplo purinas.
El estado meiótico de los ovocitos puede ser
observado y seguido por la progresión de la maduración nuclear, por
ejemplo, la presencia o la ausencia de una membrana nuclear
intacta. Los ovocitos inmaduros (suspendidos meióticamente)
presentan una vesícula germinal esférica (definida a continuación
GV) que va a sufrir una ruptura de membrana durante la reactivación
de la meiosis (ruptura de vesícula germinal (definida a
continuación GV)) que puede ser determinada por exámenes
microscópicos ópticos de los ovocitos vivos usando un microscopio
invertido con ópticas de Nomarksi u Hoffamann.
El período de tiempo en el que las condiciones
hacen que el ovocito mantenga una interrupción meiótica es de
aproximadamente 1 hora a aproximadamente 48 horas, de preferencia
de aproximadamente 8 horas y de aproximadamente 22 horas.
Aunque el ovocito ha sido sometido a condiciones
que producen una inhibición meiótica (también definida como
interrupción de ovocito), puede ser deseable cultivar el ovocito
durante cierto período de tiempo. De manera adecuada, el período de
tiempo para este cultivo es de aproximadamente 44 horas, de
preferencia en el intervalo de aproximadamente 4 horas a
aproximadamente 36 horas. De preferencia, el ovocito es cultivado en
un medio como el TCM-199 o una solución salina
equilibrada sencilla de Earle, véase Bavister o Gardner. El
almacenamiento es efectuado de preferencia a una temperatura en la
gama desde aproximadamente 36°C y aproximadamente 39°C, de
preferencia en la gama desde aproximadamente 37°C y aproximadamente
37,5°C.
El período de tiempo a partir del cual el
ovocito es sometido a condiciones que le llevan a mantener una
interrupción meiótica y hasta que el ovocito sea sometido a
condiciones en las que el estado bloqueado es invertido es inferior
a aproximadamente 24 horas, de preferencia de aproximadamente 1
hora a aproximadamente 4 horas.
Aunque el ovocito es sometido a condiciones que
producen una interrupción meiótica, el ovocito es sometido a
condiciones en las que el estado bloqueado es invertido o, en otras
palabras, el bloqueo de meiosis es invertido. De este modo, en la
etapa durante la cual el estado bloqueado es invertido, el
componente que produce la interrupción durante la etapa precedente
puede estar siempre presente. De preferencia, el estado bloqueado
es invertido por la adición de una o varias sustancias de
activación de meiosis (definidas a continuación MAS) o por una
composición de medios que lleva las células cultivadas a producir o
a secretar sustancias de estimulación de una reactivación de
meiosis.
Se sabe por WO 96/00235 que ciertos derivados de
esteroles pueden ser utilizados para regular la meiosis. Un ejemplo
de tal esterol es el compuesto
4,4-dimetil-5\alpha-colesta-8,14,24-trien-3(\beta-ol
(definido a continuación FF-MAS).
Aquí, el término MAS designa compuestos que
regulan la meiosis de ovocitos. Más específicamente, MAS es un
compuesto que, en el ensayo descrito en el ejemplo 1 siguiente,
tiene una ruptura de vesícula germinal en un porcentaje (definida a
continuación GVB) que es claramente superior a la muestra. Un MAS
preferido es un compuesto que posee un porcentaje de GVB de al menos
50%, de preferencia al menos 80%.
Se mencionan ejemplos de MAS en WO 96/00235,
96/27658, 97/00884, 98/28323, 98/54965 y 98/55498; de manera más
específica en su reivindicación 1.
En WO 95/000265, algunas MAS potenciales fueron
ensayadas en ratones hembras inmaduros. 48 horas antes de matar a
los animales de ensayo por dislocación cervical, éstos recibieron
una inyección única de gonadotrofina menopáusica humana
comprendiendo 20 IU de FSH y 20 IU de LH. Los ovarios fueron
extraídos, colocados en un medio de hipoxantina y liberados de
tejido extraño. A continuación, los ovocitos fueron puncionados
fuera de los folículos, liberados de las células de cumulus y
cultivados en un medio comprendiendo un derivado de regulación de
la meiosis.
El período de tiempo en el que el ovocito es
sometido a condiciones en las que el estado suspendido es invertido
es de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 48 horas, de
preferencia de aproximadamente 4 horas a aproximadamente 36
horas.
Después de haber sometido el ovocito a
condiciones en las que el estado bloqueado es invertido, el ovocito
es fecundado. La fecundación es efectuada de una manera conocida
per se por fecundación in vitro estándar (FIV) o por
inyección intracitoplasmica de esperma (ICSI), por ejemplo, como se
describe en un artículo de Davis y Rosenwaks (en Reproductive,
Endocrinology, Surgery and Technology Capítulo 124; páginas 2319 a
2334; Editores: Adashi, Rock y Rosenwaks; 1995; editoriales
Lippencott-Raven).
Una vez fecundado el ovocito, se deja
desarrollar unos días el cigoto en cultivo y éste se transfiere
después al útero de la paciente o es crioconservado. De
preferencia, esto se realiza de manera conocida per se.
La mayoría de las etapas del tratamiento
anteriormente mencionado son efectuadas de manera conocida y las
etapas restantes son efectuadas de manera conocida per
se.
En un modo preferido de realización de la
presente invención, el método incluye las etapas siguientes:
- (a)
- extraer un ovocito de una paciente o de una donante hembra,
- (b)
- someter el ovocito a condiciones que originen una interrupción meiótica,
- (c)
- someter el ovocito a condiciones en las que el estado bloqueado es invertido,
- (d)
- fecundar el ovocito, y
permitir el desarrollo del cigoto
antes de la transferencia o
crioconservación.
La presente invención es ilustrada también por
los ejemplos siguientes, los cuales, no obstante, no están
destinados a limitar el alcance de protección. Las propiedades
descritas en la descripción anterior y en los ejemplos siguientes
pueden, según cualquier combinación de éstas, servir para la
realización de la presente invención en sus formas diversas.
Se obtuvieron de ratones hembras inmaduros
(C57BL/6J x DBA/2JF1, Bomholtgaard, Dinamarca) con un peso de
13-16 gramos, que se mantuvieron en niveles
controlados de temperatura (20-22°C), luz
(iluminaciones de 06h00-18h00) y humedad relativa
(50-70%). Los ratones recibieron una inyección
intraperitoneal de 0,2 ml de gonadotrofinas
(Gonal-F, Serono) conteniendo 20 IU de FSH y 48
horas después, se mataron los animales por dislocación cervical.
Los ovarios fueron disecados y los ovocitos fueron aislados en un
medio Hx (véase más abajo) en un estereomicroscopio por ruptura
manual de los folículos usando un par de agujas de calibre 27. Los
ovocitos esféricos mostrando una vesícula germinal intacta
(designada más abajo GV) fueron divididos en ovocitos incluidos en
el cumulus (definidos a continuación CEO) y ovocitos desnudos
(definidos a continuación NO) y dispuestos en un medio esencial
\alpha-mínimo (\alpha-MEM sin
ribonucleósidos, Gibco BRL, Cat. N° 22561) completado con 3 mg/ml
de seroalbúmina bovina (BSA, Sigma Cat. N° A-7030);
5 mg/ml de seroalbúmina humana (HSA, State Serum Institute,
Dinamarca), piruvato 0,23 mM (Sigma, Cat. N°
S-8636), glutamina 2 mM (Flow Cat. N°
16-801); 100 IU/ml de penicilina y 100 \mug/ml de
estreptomicina (Flow, Cat. N° 16-700). Este medio
fue completado con hipoxantina 3 mM (Sigma Cat. N°
H-9377) y definido medio Hx.
Los ovocitos fueron lavados tres veces en un
medio Hx y los ovocitos de tamaño uniforme fueron divididos en
grupos de CEO y NO. Los CEO y NO fueron cultivados en bandejas
múltiples de 4 pocillos (Nunclon, Dinamarca) en las que cada
pocillo contenía 0,4 ml de medio Hx y el compuesto de ensayo en una
concentración de 10 \muM. Un pocillo de control (es decir
35-45 ovocitos cultivados en un medio idéntico sin
adición de compuesto de ensayo) fue cultivado siempre
simultáneamente con 3 pocillos de ensayo (35-45
ovocitos por pocillo completado con un compuesto de ensayo).
Los ovocitos fueron cultivados en una atmósfera
humedecida con 5% de CO_{2} en el aire durante 24 horas a 37°C.
Al final del período de cultivo, el número de ovocitos con GV, GVB
y cuerpo polares (definidos a continuación PB), respectivamente,
fue contado usando un estereomicroscopio (Wildt, Leica MZ 12). El
porcentaje de GVB, definido como el porcentaje de ovocitos que
sufren una GVB por número total de ovocitos en ese pozo, fue
calculado de la manera siguiente:
% GVB =
((número de GVB + número de PB)/número total de ovocitos) X
100.
La paciente hembra es una mujer que ha decidido
realizar una FIV o una ICSI. La paciente, después de un examen
ginecológico, será sometida al tratamiento hormonal previo
siguiente: disminución de los niveles hormonales con la ayuda de
una hormona de liberación de gonadotrofinas, estímulo de
crecimiento folicular con FSH humana de base urinaria o recombinante
exógeno y maduración final de ovocitos inducida por gonadotrofina
chorionica humana (definida a continuación hCG) exponiendo una
actividad LH. Los ovocitos son aspirados bajo sedación a través de
una aspiración de folículos transvaginal guiada por ultrasonidos de
los folículos de tamaño medio a grande (folículos de
12-20 mm de diámetro).
Después de la extracción de un ovocito del medio
inhibidor de meiosis de un folículo de paciente, el ovocito es
sometido a unas condiciones que llevan al ovocito a mantener una
interrupción meiótica, o en otras palabras, que impiden la
maduración espontánea del ovocito. Esta condición de interrupción de
meiosis es obtenida bloqueando la maduración del ovocito cultivando
los ovocitos incluidos en el cumulus juntos en cocultivo con
células de cumulus/células de granulosa o por adición de
hipoxantina inhibidora de PDE fisiológica en el medio, por ejemplo
en una concentración de 3 mM.
Después de una duración de 1 hora en el medio
TCM-199 incluyendo las células de granulosa y la
hipoxantina para asegurar la interrupción meiótica, 20 \muM de
FF-MAS fueron añadidos al medio, el cual fue
posteriormente cultivado durante 24 horas a una temperatura de
aproximadamente 37,4°C para superar la interrupción meiótica.
La paciente hembra es una mujer que ha decidido
realizar una FIV o una ICSI. La paciente, después de un examen
ginecológico, será sometida al tratamiento hormonal previo
siguiente: el día 6 del ciclo (el día 0 es el primer día de las
menstruaciones), un corto estímulo de pequeños folículos es
inducido con una inyección durante 3 días de 225 IE de FSH humana de
base urinaria o recombinante exógeno. Los ovocitos inmaduros son
aspirados bajo sedación a través de una aspiración de folículos
transvaginal guiada por ultrasonidos de folículos de tamaño pequeño
a medio de 6 a 12 mm de diámetro. Después de la extracción de un
ovocito del medio inhibidor de meiosis de un folículo de la
paciente, el ovocito es sometido a unas condiciones que llevan al
ovocito a mantener una interrupción meiótica, o en otras palabras,
que impiden la maduración espontánea del ovocito. Esta condición de
interrupción de meiosis es obtenida bloqueando la maduración de
ovocitos cultivando los ovocitos incluidos en el cumulus juntos en
cocultivo con células de cumulus/células de granulosa o por adición
de la hipoxantina inhibidora de PDE fisiológica en el medio, por
ejemplo en una concentración de 3 mM.
Después de la duración de 1 hora en el medio
TCM-199 incluyendo células de granulosa e
hipoxantina para asegurar una interrupción meiótica, 20 \muM de
FF-MAS fueron añadidos al medio, el cual fue
cultivado de esta manera durante 36 horas para superar la
interrupción meiótica.
Optimizar las condiciones de cultivo para
ovocitos de mamíferos mediante la detención de la maduración
espontánea durante 4 horas antes de iniciar la maduración de
ovocitos mediante la adición de una concentración adecuada de
FF-MAS.
Se obtuvieron ovocitos de ratones hembras
inmaduros (de 21 a 24 días) (C57BI/6J x DBA/2J
F1-híbridos, M&B, Dinamarca) con un peso de 13 a
16 gramos, que fueron mantenidos en niveles controlados de
iluminación y temperatura. Los ratones recibieron una inyección
intraperitoneal de 0,2 ml de gonadotrofinas
(Gonal-F, Serono) conteniendo 20 IU de FSH y 48
horas después los animales fueron matados por dislocación cervical.
Los ovarios fueron disecados y los ovocitos fueron aislados en un
medio Hx (véase más abajo) en un estereomicroscopio por ruptura
manual de los folículos utilizando un par de agujas de calibre 27.
Los ovocitos esféricos mostrando una vesícula germinal intacta (GV)
fueron seleccionados y colocados en un medio esencial
\alpha-mínimo (\alpha-MEM sin
ribonucleósidos, Gibco BRL, Cat. N° 22561) completado con
hipoxantina 3 mM (Sigma Cat. N° H-9377); 8 mg/ml de
seroalbúmina humana (HSA, State Serum Institute, Dinamarca),
piruvato 0,23 mM (Sigma, Cat. N° S-8636), glutamina
2 mM (Flow Cat. N° 16-801); 100 IU/ml de penicilina
y 100 \mug/ml de estreptomicina (Flow, Cat. N°
16-700). Este medio fue definido medio Hx.
Exactamente el mismo medio sin Hx fue definido medio sin Hx.
De esta manera, se cultivaron los ovocitos en
varias placas de 4 pocillos (Nunclon, Dinamarca) en las que cada
pocillo contenía 0,4 ml de un medio Hx o de un medio sin Hx (para
permitir una maduración espontánea) y 35-45
ovocitos.
- 1.
- Controles: Ninguna inhibición, ningún FF-MAS
- 2.
- MAS: Ninguna inhibición y FF-MAS 10 \muM
- 3.
- Inhibición y a continuación maduración espontánea: medio Hx durante 4 horas, después transferencia a un medio sin Hx
- 4.
- Inhibición e inducción de FF-MAS: medio Hx durante 4 horas y adición de FF-MAS en el medio Hx
- 5.
- Inhibición y eliminación de inhibición y después inducción de FF-MAS: medio Hx durante 4 horas, lavado, transferencia en el medio sin Hx y adición de FF-MAS.
- Fertilización in vitro después de 16-20 horas de maduración.
Uno de los 5 tratamientos fue superior a los
otros en cuestiones de calidad de ovocitos evaluada en forma de
índice de fecundación y capacidad de desarrollo embrionario.
La modalidad del 4° tratamiento, es decir, la
inhibición e inducción de FF-MAS, era claramente
superior a los otras alternativas de tratamiento.
Claims (8)
1. Proceso comprendiendo:
- a)
- someter ex vivo un ovocito humano a condiciones que causen la interrupción del ovocito bloqueando la maduración del ovocito cultivando los ovocitos incluidos en el cumulus solos o juntos en cocultivo con células de cumulus, células tecales, células de granulosa, células somáticas, o en medios acondicionados con auto-factores y factores endocrinos que las células indicadas anteriormente producen o por cultivo en presencia de un inhibidor cualquiera de meiosis químico, y el período de tiempo durante el que las condiciones que llevan el ovocito a mantener una interrupción meiótica es de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 48 horas, y
- b)
- someter el ovocito a condiciones en las que el estado de interrupción es invertido por la adición de MAS, el período de tiempo en el que el ovocito es sometido a condiciones en las que el estado de interrupción es invertido es de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 48 horas,
con la condición de que, desde el
momento en el que el ovocito es extraído de la paciente o de la
donante, y durante la hora siguiente, ninguna maduración espontánea
tenga lugar, visualizada como GVB precoz, antes de que una
reactivación de meiosis sea activamente inducida por
MAS.
2. Proceso según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que desde el momento en el que
el ovocito es extraído de la paciente o de la donante y en las 2
horas siguientes, ninguna maduración espontánea tiene lugar,
visualizada como una GVB precoz, antes de que una reactivación de
meiosis sea activamente inducida por MAS.
3. Proceso según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que desde el momento en el que
el ovocito es extraído de la paciente o de la donante y durante las
4 horas siguientes, ninguna maduración espontánea tiene lugar,
visualizada como una GVB precoz, antes de que una reactivación de
meiosis sea activamente inducida por MAS.
4. Proceso según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que desde el momento en el que
el ovocito es extraído de la paciente o de la donante y en las 8
horas siguientes, ninguna maduración espontánea tiene lugar,
visualizada como una GVB precoz antes de que una reactivación de
meiosis sea inducida activamente por MAS.
5. Proceso según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que desde el momento en el que
el ovocito es extraído de la paciente o de la donante y durante las
16 horas siguientes, ninguna maduración espontánea tiene lugar,
visualizada como una GVB precoz, antes de que una reactivación de
meiosis sea inducida activamente por MAS.
6. Proceso según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el período de tiempo
durante el cual las condiciones que llevan al ovocito a mantener
una interrupción meiótica es de aproximadamente 8 horas a
aproximadamente 22 horas.
7. Proceso según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el período de tiempo
durante el cual el ovocito es sometido a condiciones en las que el
estado de interrupción es invertido es de aproximadamente 4 horas a
aproximadamente 36 horas.
8. Proceso según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el inhibidor de meiosis
químico es una purina.
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