JP2007267742A - アルツハイマー病のトランスジェニック動物モデル - Google Patents

アルツハイマー病のトランスジェニック動物モデル Download PDF

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【課題】アルツハイマー病に対する可能な治療をテストするためのアルツハイマー病を引き起こす天然に存在する条件に非常に類似するトランスジェニク動物、および治療に有用な化合物を試験方法する方法の提供。
【解決手段】βアミロイド前駆体タンパク質（APP）の全ての3つの型、APP695、APP751、およびAPP770の発現、そして、ロンドンおよびインディアナ家系性アルツハイマー病（FAD）のようなアミノ酸717位での変異およびAPP遺伝子中で予測された変異のような天然に生じる変異に基づく特徴を有するトランスジェニック動物を提供し、該トランスジェニク動物はアルツハイマー病の病理学的経過を変える化合物についてのスクリーニングに使用できる。
【選択図】なし

Description

トランスジェニック技術が、アルツハイマー前駆体タンパク質あるいはその改変型の発現を介して、ヒトアルツハイマー病の徴候を示す動物の生産について、記載されている。
アルツハイマー病（AD）は、アリオスアルツハイマー（Alios Alzheimer）が1907年に、認識能力が激烈に減退し、普遍的な痴呆を有する彼の患者の1人を診察後に、初めて記載された（Bick K., Amaducci L.およびPepeu G.編の「The earlystory of Alzheimer's Disease」（Raven Press, New York 1987））脳の萎縮異常である。これは、初老のヒトに痴呆を引き起こす。AD患者は、記憶の喪失および健常個人として機能し得ないほどに進行する知性機能の喪失の増大された問題を有する。知性技能を喪失した患者は、性格変化、社会不適合行動、および精神分裂を示す（Jorm AF.編の「A guide to the understanding of Alzheimer's Disease and related disorders」（New York University Press, New York 1987））。ADは、不可避な神経萎縮を一時的にやわらげ、予防する有効な治療がないため、罹病者および家族を破滅させる。アルツハイマー患者の最も一般的な問題は、自力での衣服の着用能力がないこと、日中の落ち着きのなさ、尿失禁、および睡眠障害である。家族は、困惑、不安、憂うつ、および社会生活の減退を報告している。
ADの社会および国家経済に対する衝撃は莫大である。合衆国における痴呆症の初老の人口は、2000年までに41％に増加する。制度上および補助介護を患者に対して提供すべき、健康管理機構には、年間見積400億ドルの経費がかかる（Jorm, 1987；Fisher, LM：New York Times, 1989年8月23日、D1, Reisberg, B.編の「Alzheimer's Disease」（The Free Press, New York and London 1983））。これらの要素は、AD研究に財源を割り当てることによる、AD発生を減少させるために取られるべき予防行動を暗示する。
顕微鏡レベルでは、AD患者の脳は通常小さく、時には1,000グラム未満の重さである。顕微鏡レベルでは、ADの組織病理学的徴候には、神経細線維のもつれ（neurofibrillary tangles）（NFT）、神経炎によるプラーク（neuritic plaques）、およびニューロンの萎縮が含まれる。AD患者は、大脳皮質の前頭および側頭皮質の神経細胞、海馬三角骨ニューロン、内側のニューロン、へん桃の内側、中枢および皮質核、青斑（locus coeruleus）のノルアドレナリン作動性ニューロン、および基底前脳コリン作動性系のニューロンにおける、萎縮を示す。コリン作動性系のニューロンの喪失は、ADにおけるコリン作動性前シナプス性マーカーの欠損に一致する（Reisberg, 1983；「Alzheimer's Disease and related disorders, resarch and development」Kelly WE編；（Charles C. Thomas, Springfield, IL. 1984））。
ADは、皮質、海馬、鉤状回、海馬回、およびへん桃の、直径200μmまでの大きさの神経炎によるプラークに関連する。神経炎プラークの本質的な成分はアミロイドであり、これは、コンゴーレッドに染色される（Reisberg, 1983；Kelly, 1984）。アミロイドプラークは、細胞外で、明視野でピンクあるいはさび色であり、偏光で複屈折する。プラークは、ポリペプチド原線維から構成され、しばしば血管周囲に存在し、脳中の種々のニューロンへの血液の供給を減少させる。
遺伝的素因、感染因子、トキシン、金属、および脳腫瘍のような種々の因子がすべて、AD神経病の可能な機構として挙げられる。しかし、明白な証拠が、ADに対する2つの異なる型の遺伝的素因を強く示す。第一に、分子分析で、あるAD罹病家族の、アミロイド前駆体タンパク質（APP）遺伝子中の変異の証拠を明らかにした（Goateら、Nature349：704-706（1991）；Murrell, Jら、Science 254；97-99, 1991；Chartier-Harlin, M-Cら、Nature 353, 844-846（1991））。第二に、ADに対して明白な遺伝子素因を有する他の家族では、染色体21に変異が存在するが、APP遺伝子座とは異なる（Tanzi, R.E.ら、Nature, 331；528-530（1988））。
アミロイドプラークは、AD患者および40才まで生存しているダウン症患者に多量に存在する。プラークはまた、少量であるが、健常な老化した脳にも存在する。これらのプラークは、アミロイドβペプチドからなり（βペプチド）（GlennerおよびWongら、Biochem. Biophys. Res. Comm. 120：885-890（1984））、これもまた、脳血管沈着物および神経原繊維濃縮体中のタンパク質成分である。βペプチドは、βシート構造に配列されたフィラメント状物質であり、4.2〜4.5 kdの分子量を有する。これは、39〜42アミノ酸を有する疎水性ペプチドである。そのアミノ酸配列決定は、APP cDNAのクローニングを導いた（Kangら、Nature325：733-735（1987）；Goldgaberら、Science 235：877-880（1987）；Robakisら、Proc. Natl. Acad. Sci. 84：4190-4194（1987）；Tanziら、Nature 331：528-530（1988））および、ゲノムAPP DNA（Lemaireら、Nucl. Acids Res. 17：517-522（1989）；Yoshikaiら、Gene 87, 257-263（1990））。APP cDNAの3つの型（APP695、APP751およびAPP770）が単離され、代替スプライシングにより1つの前駆体RNAからつくられる。遺伝子の全長は、18エキソンを含み、175 Kbを超える（Yoshikaiら、1990）。APPは、3つの細胞外ドメイン、トランスメンブレン領域、および細胞質ドメインを有する。βペプチドは、膜外の28アミノ酸、および疎水性トランスメンブレンドメインの14残基からなる。従って、βペプチドは、通常、脳、および、心臓、腎臓ならびに脾臓のようなその他の臓器中に認められるAPPの切断産物である。Joachimら、Nature 341：226-228（1989）では、βペプチド沈着物は、AD患者の脳外で、皮膚、腸および皮下組織に認められることを報告してるが、しかし、βペプチド沈着物は、通常は脳のみに認められる。
APPのより大きな代替型（APP751、APP770）は、全APP695と1つあるいは2つのその他のドメインとからなる。APP751は、全APP695と、セリンプロテアーゼ阻害剤Kunitzファミリー（KP1）に相同性を有するその他の56アミノ酸とからなる（Tanziら、1988；Weidemannら、Cell57：115-126（1989）；Kitaguchiら、Nature 331：530-532（1988）；Tanziら、Nature329, 156（1987））。APP770は、APP751と、ニューロン細胞表面抗原OX-2と相同である他の19アミノ酸ドメインとからなる（Weidemannら、Cell57：115-126（1989）；Kitaguchiら、1988）。APPは、リーダー配列の除去および硫酸基および糖鎖の付加により、翻訳後に改変される。
Van Broeckhavenら、Science 248：1120-1122（1990）では、オランダ人の2家族において、APP遺伝子が、アミロイドーシス（HCHWA-D）をともなう遺伝性脳出血に強く結び付くことを実証した。このことは、オランダ人の2患者のAPPコード領域中に重要な変異が認められたことにより確証された（Levyら、Science248：1124-1128（1990））。変異は、βペプチドの22位で、グルタミンがグルタミン酸に置換されていた（APP695の618位）。さらに、ある家族は、全長タンパク質の717位でのアミノ酸置換による変異を介して、遺伝的にアルツハイマー病にかかりやすい、家系性アルツハイマー病（FAD）と呼ばれる状態である（Goateら、（1991）；Murrellら、（1991）；Chartier-Harlinら、（1991））。これらの変異は、家族内で疾患と同時分離し、遅延徴候ADの家族には存在しない。
ヒト以外の老齢霊長動物は、脳実質ならびに、ある随膜および皮質血管壁に、βペプチドのアミロイドプラークを進展させるようであるが、AD研究のために実証された動物モデルは存在しない。老齢霊長動物およびイヌは動物モデルとして使用し得るが、それらは維持するのに費用がかかり、長期の研究期間を必要とする。実験モデルとして有用であるためにADに十分な類似性を有する、自発的動物変異体は存在しない。AD様徴候が、電気分解、AD脳試料の移植、塩化アルミニウム、カイニン酸、あるいはコリン類似体により誘発され得る、種々のモデルが報告された（Kisnerら、Neurobiol. Aging 7；287-292（1986）；Mistry, J.S.ら、J Med Chem 29；337-343（1986））。Floodら（Proc. Natl. Acad. Sci. 88：3363-3366（1986））には、βペプチドに相同な4つの合成ペプチドに、マウスにおける健忘症効果が報告されている。これらのどれもが、ADの一般的徴候、生化学あるいは病原論のいずれにも貢献しないので、病因学あるいは治療に多大の有用な情報を与えないようである。
E. coli β-ガラクトシダーゼに結合されたヒトAPPプロモーターによるトランスジェニックマウス（Wirak, D.O.ら、The EMBO J 10；289-296（1991））および、ヒトAPP751 cDNA（Quon, Dら、Nature 352, 239-241（1991））あるいは、βペプチドを含むcDNAのサブフラグメント（Wirak, D.O.ら、Science 253, 323-325（1991）；Sandhu, F.A.ら、J. Biol. Chem. 266, 21331-21334（1991）；Kawabata, S. Nature 354, 476-478（1991））を発現するトランスジェニックマウスが、生産された。個々の研究で得られた結果は、プロモーターのソーおよび使用されたタンパク質コード配列に依存すると思われる。例えば、Wirakらは（1991）、βペプチド型を発現するトランスジェニックマウスには、APPに対して調製された抗体と反応する「ミエロイド様」物質の細胞内沈着物が観察されたが、その他の組織病理学的疾患徴候は認められなかったことを見い出した。抗体反応物質の細胞内特性およびその他の徴候がないことは、この特定のトランスジェニック動物は、アルツハイマー病の正確なモデル系でないことを示唆する。Kawabataらは（1991）、トランスジェニック動物でのアミロイドプラークの産生、神経細線維のもつれ、およびニューロン細胞壊死を報告している。これらの各研究では、同じペプチドフラグメント、すなわちβペプチドにAPPのC末端56アミノ酸を加えたものが発現された。Kawabataらは（1991）ヒトthy-1プロモーターを使用したが、Wirakらは（1991）、ヒトAPPプロモーターを使用した。Quon, D.ら、Nature 352, 239-241（1991）のニューロン特異的エノラーゼプロモーター由来のAPP751 cDNAを発現するトランスジェニックマウスでは、APPに対して調製された抗体に反応する物質の細胞外沈着物が観察された。沈着物が、APP751全長あるいはβペプチド、または両方を含むか否かは示さなかった。従って、このことは、アルツハイマー病でのこれらの存在と沈着物とのあらゆる相関性を除外する。Quonら（1991）はまた、ニューロン特異的エノラーゼプロモーターから発現されたAPP695 cDNAにコードされるタンパク質は、細胞外免疫反応性沈着物を形成しないと述べている。これらの結果は、βペプチドはAPP695前駆体内に含まれるが、APP695 cDNAとの結合でのニューロン特異的エノラーゼプロモーターの使用は、有効なアルツハイマー病モデルを提供し得ないことを示す。さらに、APP免疫反応性沈着物の存在は、年齢、あるいは特定のトランスジェニックモデルでの遺伝子使用量とは相関しない。
アルツハイマー病は、病理学的な面および行動面に関連する、複合症候群である。有用な疾患モデルは、これらの複合性を考慮に入れなければならない。提供された組織中で優勢なある型の遺伝子から多数のタンパク質が発現する。脳では、695型が優勢であるが、他の型のmRNAもまた存在する（Goldeら、Neuron 4；253-267（1990））。異なる型の割合が、個人の年齢とともに変化するかどうかは知られていない。種々のタンパク質型は、KIドメインおよび／またはOX-2ドメインが成熟タンパク質に存在し得るかまたは存在し得ないような、代替スプライシングにより得られる。さらに、βペプチドは、前駆体タンパク質の翻訳後プロセシングにより得られる。このプロセスは、個人の年齢のような時間で変化し得、βペプチドの構造に直接影響しない変異により影響され得る：例えば、全長タンパク質中のアミノ酸717位での、家系性アルツハイマー病（FAD）変異（Groateら、1991；Murrellら、1991；Chartier-Harlinら、1991）。これらの考察を得て、アルツハイマー病の普遍的な動物モデルの生産が、これらの型の発現から得られる表現型の周知の変異効果、および、動物の生涯中の異なる型の割合の可能性を考慮する、動物モデルの構築を必要とする。
Bick K., Amaducci L.およびPepeu G.編の「The earlystory of Alzheimer's Disease」（Raven Press, New York 1987） Jorm AF.編の「A guide to the understanding of Alzheimer's Disease and related disorders」（New York University Press, New York 1987） Fisher, LM：New York Times, 1989年8月23日、D1, Reisberg, B.編の「Alzheimer's Disease」（The Free Press, New York and London 1983） Reisberg, 1983；「Alzheimer's Disease and related disorders, resarch and development」Kelly WE編；（Charles C. Thomas, Springfield, IL. 1984） Goateら、Nature 349：704-706（1991） Murrell, Jら、Science 254；97-99, 1991 Chartier-Harlin, M-Cら、Nature 353, 844-846（1991） Tanzi, R.E.ら、Nature, 331；528-530（1988） GlennerおよびWongら、Biochem. Biophys. Res. Comm. 120：885-890（1984） Kangら、Nature 325：733-735（1987） Goldgaberら、Science 235：877-880（1987） Robakisら、Proc. Natl. Acad. Sci. 84：4190-4194（1987） Lemaireら、Nucl. Acids Res. 17：517-522（1989）； Yoshikaiら、Gene 87, 257-263（1990） Joachimら、Nature 341：226-228（1989） Weidemannら、Cell 57：115-126（1989） Kitaguchiら、Nature 331：530-532（1988） Tanziら、Nature 329, 156（1987） Van Broeckhavenら、Science 248：1120-1122（1990） Levyら、Science 248：1124-1128（1990） Kisnerら、Neurobiol. Aging 7；287-292（1986） Mistry, J.S.ら、J Med Chem 29；337-343（1986） Floodら（Proc. Natl. Acad. Sci. 88：3363-3366（1986）） Wirak, D.O.ら、The EMBO J 10；289-296（1991） Quon, Dら、Nature 352, 239-241（1991） Wirak, D.O.ら、Science 253, 323-325（1991） Sandhu, F.A.ら、J. Biol. Chem. 266, 21331-21334（1991） Kawabata, S. Nature 354, 476-478（1991） Goldeら、Neuron 4；253-267（1990）
従って、本発明の目的は、トランスジェニック技術により構築される、アルツハイマー病用の動物モデルの提供である。
本発明のさらなる目的は、アミロイド前駆体タンパク質の異なる型の発現を正確に反映する、トランスジェニック動物の提供である。
さらに、本発明の目的は、アミロイド前駆体タンパク質の発現における、ある種の遺伝子異常に特徴付けられる、トランスジェニック動物の提供である。
発明の要旨
アルツハイマー病に対する可能な治療をテストするためのトランスジェニック動物モデルの構築が記載されている。このモデルは、アルツハイマー病を引き起こす天然に存在する条件に非常に類似することで特徴付けられる。すなわち、βアミロイド前駆体タンパク質（APP）の3つの型、APP695、APP751、およびAPP770、あるいはそのサブフラグメントのうちの1つ以上の発現を制御する能力に加えて、アミノ酸717位でのFAD変異およびAPP遺伝子中で予測された変異のような天然に生じる変異に基づいた種々の位置での変異に基づく。APP遺伝子構築物は、ヒト、マウス、またはラット起源の天然に生じるAPPプロモーターに加えて、マウスメタロチオネイン（metallothionine）プロモーターのような誘導プロモーターを使用して調製され、動物の水あるいは食餌に亜鉛のような重金属を添加することにより調節され得る。構築物のニューロン特異的発現は、ラットニューロン特異的エノラーゼプロモーターを使用して調製される。
構築物は、マイクロインジェクションのような標準的な技術を用いて動物の胚に、または胚性幹細胞に導入される。モデルに基づく細胞培養物もまた、2つの方法により調製され得る。細胞培養物は、トランスジェニック動物から単離され得るか、あるいは、標準細胞トランスフェクション技術で、同様の構築物を用いて樹立細胞培養物から調製され得る。
上記の特異的な構築物は、以下のタンパク質コード配列を使用する：APP770 cDNA；アミノ酸717位での変異を有するAPP770 cDNA；構築物中にOX2ドメインではなくKIプロテアーゼインヒビタードメインを有する、APP751 cDNA；アミノ酸717位での変異を有するAPP751 cDNA；APP695 cDNA；アミノ酸717位での変異を有するAPP695 cDNA；βペプチド領域がそれに続くAPPリーダー配列およびAPPのカルボキシ末端の残余の56個のアミノ酸；βペプチド領域がそれに続くAPPリーダー配列およびアミノ酸717位での変異が加えられたカルボキシ末端の残余の56個のアミノ酸；βペプチド領域がそれに続くAPPリーダー配列；βペプチド領域およびAPPのカルボキシ末端の残余の56個のアミノ酸；βペプチド領域、およびアミノ酸717位での変異が加えられたAPPのカルボキシ末端の残余の56個のアミノ酸；ゲノム-cDNA APP遺伝子組合せ構築物；および、プロモーターに作動可能に連結し、アミノ酸717位での変異が加えられたゲノム-cDNA APP遺伝子組合せ構築物であって、該プロモーターが、ヒトAPP遺伝子プロモーター、マウスAPP遺伝子プロモーター、ラットAPP遺伝子プロモーター、メタロチオネイン遺伝子プロモーター、ラットニューロン特異的エノラーゼ遺伝子プロモーター、ヒトβアクチン遺伝子プロモーター、ヒト血小板由来成長因子B（PDGF-B）鎖遺伝子プロモーター、ラットナトリウムチャンネル遺伝子プロモーター、マウスミエリン塩基性タンパク質遺伝子プロモーター、ヒト銅-亜鉛スーパーオキサイドジスムターゼ遺伝子プロモーター、および哺乳類のPOUドメイン調節遺伝子プロモーターから選択されるゲノム-cDNA APP遺伝子組合せ構築物である。さらなる構築物には、ヒトAPPプロモーターにより制御されるヒト酵母人工染色体構築物；アミノ酸717位での変異が加えられたヒトAPPプロモーターにより制御されるヒト酵母人工染色体構築物；マウスまたはラット胚性幹（ES）細胞内のAPP遺伝子と野生型ヒトAPP cDNAを有するベクターとの間の相同組換えプロセスを介して、組換え位置（好ましい組換え部位は、APPエキソン9内である）を越える常在性げっ歯動物の染色体APP遺伝子中のその配列が、類似のヒト配列で置換されるように改変された、内生マウスあるいはラットAPP遺伝子；マウスまたはラットES細胞内のAPP遺伝子とアミノ酸717位での変異を有するヒトAPP cDNAを有するベクターとの間の相同組換えプロセスを介して、組換え位置（好ましい組換え部位は、APPエキソン9内である）を越える常在性げっ歯動物の染色体APP遺伝子中のその配列が、アミノ酸717位での変異を有する類似のヒト配列で置換されるように改変された、内生マウスあるいはラットAPP遺伝子。これらの構築物は、トランスジェニック動物に導入され得、次いで、別の構築物を発現する動物の交配により組み合わされる。
トランスジェニック動物または動物細胞は、アルツハイマー病の病理学的経過を変える化合物についてスクリーニングするために使用される。この変化は、動物中のAPPおよびβペプチドの総量および組織病理学に対する影響、そして行動変化により測定される。
発明の実施の形態
発明の詳細な説明
構築物ならびにトランスジェニック動物および動物細胞が、下記の方法および材料を用いて調製される。
材料のソース
制限エンドヌクレアーゼは、New England Biolabs（Beverly, MA.）、Promega Biological Research Products（Madison, WI.）およびStratagene（LaJolla CA.）などの、従来の市販のソースから得られる。放射性材料は、Dupont／NENまたはAmershamのような従来の市販のソースから得られる。部位特異的変異誘起用のために注文設計されたオリゴヌクレオチドは、BioSynthesis Inc., Lewisville, TX.のような、数社の材料販売業者から入手可能である。部位特異変異誘起を行うためのキットは、Promega Biological Research Products、Stratageneなどの販売業者から入手可能である。APP mRNAのAPP695、APP751、およびAPP770型を含むcDNAクローンは、Dr. Dmitry Goldgaber、NIHから直接得た。DNAライブラリーは、Stratagene, La Jolla, CA.またはClontech, Palo Alto, CA.ような販売業者から入手可能である。PC12および3T3細胞は、ATCCから得た（それぞれ、＃CRL1721および＃CCL92）。さらにPC12細胞系は、Harvard Medical SchoolのDr. Charles Marotta、Massachusetts General Hospital、およびMcLean Hospitalから得た。細胞系に適した標準細胞培養培地は、Gibco／BRLのような従来の市販のソースから得られる。マウス幹細胞、株D3は、Dr. Rolf Kemlerから得られた（Doetschmanら、J. Embryol. Exp. Morphol. 87, 27（1985））。DNAトランスフェクション用のリポフェクチン、および安定な形質転換体の選択試薬G418は、Gibco／BRLから入手可能である。
ヒトAPPプロモーターの単離
pWE15コスミドベクターにヒト胎盤DNAから構築されたコスミドライブラリーは、APP770 cDNAクローンのニックトランスレーション（Maniatisら、Molecular Cloning：a laboratory manual（Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY 1989））により調製された32P標識プローブとのハイブリダイゼーションによってスクリーニングした。プローブとハイブリダイズされたクローンを、取り出して精製し、制限マッピング、ハイブリダイゼーション、およびDNA塩基配列決定により特徴付けた。長い5'フランキング領域を含むこのようなクローンの1つから、約25 kbのNotIからNruIの制限DNAフラグメントを単離した。このフラグメントは、アルツハイマータンパク質コード領域の開始メチオニンコドンの2つ前のヌクレオチドで終わる。このフラグメントまたはそのサブフラグメントは、本明細書に記載の構築物のためのヒトAPPプロモーターのソースである。マウスまたはラットゲノムライブラリーから同じ方法を用いて単離された類似のDNAフラグメントは、マウスまたはラットプロモーターのソースである。
APP cDNAクローンの定義
cDNAクローンAPP-695は、Kangら、Nature325：733-735（1987）に記載のcDNAの型であり、脳中のアルツハイマータンパク質の最も優勢な型を示す。cDNAクローンAPP-751は、Ponte, P, Nature 331, 525-527（1988）に記載された型である。cDNAクローンAPP-770は、Kitaguchiら、Nature331：530-532（1988）に記載された型である。この型には、695型に関連する225ヌクレチド挿入断片が含まれる。225ヌクレオチド挿入断片は、KIドメインに加えて、OX-2ドメインもコードする。
APPゲノム遺伝子座の定義
以下の表に示すように、ヒトゲノムDNAクローンのファージおよびコスミドクローンにより、アルツハイマー遺伝子の最小の大きさが本来少なくとも100 kbであることが特徴付けられた。APP遺伝子中には、合計18個のエキソンが存在する（Lemaireら、Nucl. Acid Res, 17；517-522, 1989；Yoshikaiら、1990）。これらの結果を併せて、アルツハイマー遺伝子の最小の大きさは175 kbであることが示される。
Figure 2007267742
 トランスジーンの構築
図1〜図5に示すヒトAPP遺伝子配列の種々の部分を有するクローンを、同様の方法で構築する。まず、253塩基対のBclIからBamHIのフラグメントとして、SV40ウイルス由来のポリA付加シグナル（Reddyら、Science200；494-502（1978））を、一連のpUCからの改変されたベクター内にクローン化する。次に、cDNAコード配列（770、751、または695）を挿入する。挿入されたフラグメントの正確な方向および構成を、制限エンドヌクレアーゼマッピングおよび限定的配列決定により、決定する。
図4および図5に示すヒトAPP遺伝子配列の種々のカルボキシ末端部分を有するクローンを、上記の工程に加えて数工程を経て構築する。まず、APP770 cDNAクローンを、56位（Kangら（1987）の番号付けシステム）の後で切断するAsp718で消化する。得られる5'延長部分をクレノウ酵素（Maniatisら、1989）で満たし、次の配列のヘキサヌクレオチドに連結する：AGATCT、BglIIの認識部位。BglII（これもまた1769位の後で切断する）による切断および再連結後に、タンパク質の翻訳読み取り枠は保存される。このコードした切形型タンパク質は、リーダー配列、その後に、βペプチドの前の約6個のアミノ酸、その後に、βペプチド、そして、APPの56個の末端アミノ酸を含む。図5のクローンは、図4aのクローン中のヌクレオチド1913位の部位特異的変異誘起（Kangら（1987）の番号付けシステム）を介して、Tへ導入することにより造り出され、それによりβペプチドの最後のアミノ酸コドンのすぐ後に終止コドンが作り出される。図1〜図5に示す各APP cDNA配列クローンは、各構築物を完成するために使用される異なるプロモーターの結合に用いられる、開始メチオニンコドンから2ヌクレオチド上流に1つのNruI部位を有する。
これらは同一であるが、全長タンパク質のアミノ酸717位での変異（FAD変異部位）を有する発現クローンもまた、構築される。アミノ酸717位での変異は、部位特異的変異誘起（Vincentら、Genes and Devel. 3, 334-347（1989））により造られ、次のコドンの1つに対応する野生型valコドンの変異を含む：ile、phe、gly、tyr、leu、ala、pro、trp、met、ser、thr、asn、gln。
図6の組み合せcDNA／ゲノム発現クローンの好ましい構築方法は、次の通りである。APP770 cDNAクローンの860位のTaqI部位（Kangら（1987）の番号付けシステム）は、部位特異的変異誘起によりXhoIに変換される。XhoIを有する得られるプラスミドの切断は、新規のXhoI部位および930位の予め存在する部位でなされ、KIおよびOX-2コード配列を放出する。
この産生されたプラスミドは、KIおよびOX-2の代替スプライシングカセットの受容体として機能する。代替スプライシングカセットは、一連のクローニング工程を介して造られる。まず、エキソン6および隣接下流イントロンを含む、ゲノムクローン中の860位のTaqI部位（Kangら（1987）の番号付けシステム）は、部位特異的変異誘起によりXhoIに変換される。XhoIを有する得られるプラスミドの切断は、新規のXhoI部位および隣接イントロン内のXhoI部位でなされる。このフラグメントは、プラスミドベクター中のXhoI部位にクローン化される。第二に、エキソン9および隣接上流イントロンを含むゲノムクローンは、XhoI（930位）で切断され、プラスミドベクターのXhoI部位にクローン化される。これらの2つの連結エキソン／イントロンフラグメントは、それらの個々のプラスミド骨格からXhoIおよびBamHIまたはBglIIのいずれかでの切断で放出され、プラスミドベクターのXhoI部位にクローン化される。得られるXhoIフラグメントは、BamHIまたはBglIIのいずれかで切断され、フランキングイントロン配列を伴ったKIおよびOX-2コード領域を含むゲノム6.6 kb BamHIセグメント（Kitaguchiら、1988）が、挿入される。XhoIでの切断後に、このDNAセグメントは、上記で構築された改変APP770 cDNAのXhoI部位に挿入される。これらのクローニング工程は、トランスジェンニック動物中の細胞が、天然の代替スプライシング機構によりKIおよびOX-2ドメインの含有物を調節し得る、組み合せcDNA／ゲノム発現クローンを産生する。アミノ酸717位での変異を有する類似の遺伝子は、上記のAPP770 cDNAの変異型を使用して構築される。
遺伝子プロモーターの活性
種々のプロモーター配列は、APPコード配列の発現を制御するために用いられる。トランスジェニック動物におけるAPP遺伝子の発現を調節する能力は、ADにおいて種々のAPP遺伝子産物のはたらきを評価するのに有用であると考えられている。培養された細胞におけるAPP遺伝子の発現を調節する能力は、種々のAPP遺伝子産物の発現およびプロセシングを評価するのに有用であると考えられており、そして細胞培養された薬剤スクリーンの基準を提供し得る。
メタロチオネイン（MT）プロモーターは、よく特徴付られており、トランスジェニック動物において用いられた。そしてその発現は亜鉛およびグルココルチコイドホルモンレベルの調整によって調節され得る（Palmiterら、Nature300, 611-615（1982））。
ヒトAPPプロモーターはまた、CNSにおける発現に関して特徴付けられる（Wirakら、1991）。このプロモーターは、トランスジェニックげっ歯動物のCNSにおけるヒトAPP配列の時間的なおよび空間的な発現の正確な再生に有用であると考えられている。ヒトAPPプロモーターに加えて、マウスおよびラット由来のAPPプロモーターは、種々の野生型および変異APPコード配列と共に用いられる。ヒトAPPプロモーターは、トランスジェニックマウスの脳の適切な領域において活性を有することが示されている（Wirakら、1991）が、トランスジェニックマウスにおけるマウスAPPプロモーターまたはトランスジェニックラットにおけるラットAPPプロモーターの使用は、トランスジェニック動物のCNSにおける発現のより正確なパターンを提供すると考えられている。
ニューロンにおけるヒトAPP発現の制御の代替物として、ラットニューロン特異的エノラーゼ遺伝子プロモーターが用いられる。このプロモーターは、ニューロンにおけるコード配列を発現させることが知られている（Forss-Petterら、Neuron 5；197-197（1990））。
ニューロンにおけるヒトAPP発現を制御するのに用いられる他の代替物には、ヒトβアクチン遺伝子プロモーター（Rayら、Genes and Development 5：2265-2273（1991））、ヒト血小板由来成長因子B（PDGF-B）鎖遺伝子プロモーター（Sasaharaら、Cell64：217-227（1991））、ラットナトリウムチャンネル遺伝子プロモーター（Maueら、Neuron 4：223-231（1990））、ヒト銅-亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ遺伝子プロモーター（Ceballos-Picotら、Brain Res. 552：198-214（1991））、および哺乳類のPOUドメイン調節遺伝子ファミリーのメンバーのプロモーター（Xiら、Nature340：35-42（1989））が含まれる。POUドメインは、4つの哺乳類転写因子Pit-1、Oct-1、Oct-2、およびunc-86の間の類似の領域であり、そしてDNA結合ドメインの一部を表す。これらのプロモーターは、トランスジェニック動物のニューロン内で特異的な発現を生じさせることが知られているかまたは考えられている。
非ニューロンの脳細胞におけるヒトAPPの発現は、マウスミエリン塩基性タンパク質のプロモーターによってなされ得る（Readheadら、Cell48：703-712（1987））。
酵母人工染色体
図7に示される構築物は、以下のように構築されている。ヒトゲノムDNAの大きなセグメントは、ある種のベクター内にクローン化される場合、酵母細胞内で自律複製単位として増殖され得る。このようなベクター産生（vector-borne）セグメントは、酵母人工染色体と呼ばれている（YAC；Burkeら、Science236, 806（1987））。ヒトYACライブラリーは、市販され入手可能で（Clontech, Palo Alto, CA）、平均挿入断片サイズ250,000塩基対（180,000塩基対〜500,000塩基対の範囲）を有している。アルツハイマーの遺伝子のYACクローンは、ヒトAPP770 cDNAを有するライブラリーをスクリーニングすることによって直接単離され得る。クローンにおける本質的な遺伝子領域のすべての含有物は、PCR解析によって確認され得る。
図7aに示されるYAC-APPクローンは、YACベクターによってコードされるネオマイシン耐性に対して選択することによって、胚幹（ES）細胞において、確立される。YAC-APPクローンを有するES細胞は、以下に記載の確立された方法（「トランスジェニックマウス」および「胚幹細胞の方法」）によって、トランスジェニックマウスを産生するために用いられる。717位のアミノ酸での変異を有するYAC-APP遺伝子（図7b）は、717位のアミノ酸での変異によって作用を及ぼされるヒト由来のゲノムDNAを用いたYACライブラリーの生成によって産生される。クローンは、上記のようにして同定され、そしてES細胞内で確立される。
マウスAPP遺伝子の遺伝子改変
ヒトのアルツハイマータンパク質遺伝子とネズミのアルツハイマータンパク質遺伝子との間のヌクレオチド配列の相同性は、およそ85％である。βペプチドのコード領域内には、この2つの配列の間に3つのアミノ酸の相違がある。717位のアミノ酸で変異しているval残基は、マウス、ラット、およびヒトの間で保存される。野生型のげっ歯動物は、アルツハイマー病を起こさないか、またはヒトアルツハイマー患者において存在するものに類似のそれらのCNSにおける堆積物またはプラークを生じない。従って、βペプチドのげっ歯動物形態ではなく、ヒトの形態は、疾患を引き起こし得る。相同組換え（Capecchi, MR Science 244. 1288-1292（1989））は、インサイチューでマウスのアルツハイマー遺伝子をヒトβペプチドをコードする遺伝子に変換するのに用いられ得る。この組換えは、KIおよびOX-2ドメイン由来の下流部位、例えば、エキソン9内でなされる。その結果、トランスジェニック動物内の全ての細胞に適切な自然選択的なスプライシング機構は、最終遺伝子産物を発現するのに用いられ得る。
ヒトcDNAの野生型（図8の概略図「a」）および変異型（図8の概略図「b」）の両方の形態は、APPの野生型または変異型のいずれかの形態を発現するトランスジェニックモデルを産生するのに用いられる。組換えベクターは、ヒトAPP cDNA（695または770型）から構築され、それは、717位のアミノ酸が野生型または変異型のいずれかである。組換えベクターの切断（例えば、エキソン9内のXhoI部位において）は、直接的な隣接配列内において相同組換えを促進する（Capecchi, 1989）。このことから生じる内生APP遺伝子は、組換えの時点まで正常であり（この例におけるエキソン9内で）、そしてこの遺伝子は、その後、ヒトcDNA配列からなる。
APPタンパク質の変異型
FAD変異部位である、タンパク質全長のアミノ酸717位での変異を有すること以外はこれらと同一の発現クローンもまた、構築される。アミノ酸717位での変異は、部位特異的変異誘発によってつくられ（Vincentら、1989）、野生型valコドンの以下のコドンの1種への変異を包含する；ile、phe、gly、tyr、leu、ala、pro、trp、met、ser、thr、asn、gln。val-717からile、phe、およびglyへの変異は、記載されている（Goateら、1991；Murrellら、1991；Chartier-harlinら、1991）。これらの天然に生じる変異は、荷電されたアミノ酸でもバルキーアミノ酸でもない。従って、val-717と列挙された他のアミノ酸との置換はまた、FAD症候群を促進し得、そして動物のADモデルに有用な特性を有し得ると考えられている。
トランスフェクションおよびマイクロインジェクションのための構築物の調製
マイクロインジェクションのためのDNAクローンを、適切な酵素（例えば、SalI、NotIなど）で切断し、そしてこのDNAフラグメントをTBE緩衝液中の1％アガロースゲルで電気泳動する（Maniatisら、1989）。DNAバンドを、エチジウムブロマイドで染色することにより可視化し、切り出し、そして0.3 Mの酢酸ナトリウム、pH7.0を入れた透析バッグ中に入れる。DNAを透析バッグ中で電気溶離し、フェノール-クロロホルム（1：1）で抽出し、そして2容量のエタノールによって沈澱させる。このDNAを低塩緩衝液（0.2 M NaCl、20 mMトリスTM、pH7.4、および1 mM EDTA）1 mlに再溶解し、そしてElutip-DTMカラムで精製する。このカラムを、まず、高塩緩衝液（1 M NaCl、20 mMトリスTM、pH7.4、および1 mM EDTA）3 mlで満たし、次いで、低塩緩衝液5 mlで洗浄する。DNA溶液をこのカラムに3回通し、DNAをカラムマトリックスに結合させる。低塩緩衝液3 mlで1回洗浄した後、このDNAを高塩緩衝液0.4 mlで溶出し、そして2容量のエタノールによって沈澱させる。DNAの濃度をUV分光光度計における260 nmでの吸光度によって測定する。マイクロインジェクションのために、DNAの濃度を、5 mMトリスTM、pH7.4および0.1 mM EDTAで3μg／mlに調整する。マイクロインジェクションのためのDNAの精製の他の方法はまた、Hoganら、Manipulating the mouse embryo（Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY（1986）、Palmiterら、Nature 300, 611（1982）、“The Qiagenologist. Application Protocols”、第3版（これはQiagen, Inc., Chatsworth. CAにより出版された）、およびManiatisら、Molecular Cloning：a laboratory manual（Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, NY 1989）に記載されている。
トランスジェニック動物の構築
動物のソース
トランスジェニック試験に適切な動物は、標準的な市販のソース、例えば、Charles River（Wilmington, MA）、Taconic（Germantown, NY）、Harlan Sprague Dawley（Indianapolis, IN）などから得られ得る。Swiss Webster雌マウスは、胚の回収（embryo retrieval）および胚移植に好ましい。B6D2F1雄は、交配に用いられ得、そして精管切除されたSwiss Webster種ウマは、偽妊娠を刺激するのに用いられ得る。精管切除されたマウスおよびラットは、供給業者から得られ得る。
マイクロインジェクションの手順
げっ歯動物の胚のマニピュレーションのための手順およびDNAのマイクロインジェクションのための手順は、Hoganら、Manipulating the mouse embryo, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY（1986）に詳細に記載されており、その教示は本明細書中に参考のために援用されている。
トランスジェニックマウス
6週齢の雌マウスに、過剰排卵を誘発するため、妊娠ウマ血清ゴナドトロピン（PMSG；Sigma）5 IU（0.1 cc、ip）を注入し、48時間後にヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG；Sigma）5 IU（0.1 cc、ip）を注入する。雌は、hCG注入後直ちに雄と共に置かれる。hCG注入から21時間後、交配した雌をCO2で窒息させるか、または頸部を脱臼させて屠殺し、そして切り出した輸卵管から胚を回収し、さらにこれを0.5％ウシ血清アルブミン（BSA；Sigma）が入ったダルベッコリン酸緩衝生理食塩水中に入れる。周辺の丘細胞をヒアルロニダーゼ（1 mg／ml）で取り除く。次いで、前核胚を洗浄し、そしてこれをCO2 5％、空気95％の加湿雰囲気下の37.5℃のインキュイベーター中で、0.5％BSA（EBSS）を含有するアール調節塩溶液（Earle's balanced salt solution）に注入時間まで入れておく。
不定周期の成熟雌マウスを、精管切除した雄と対にする。Swiss Websterまたは他の類似する系統がこの目的のために用いられ得る。同時に、受容雌をドナー雌として交配させる。胚移植の際に、この受容雌に、体重1グラムあたり2.5％のアベルチン0.015 mlを腹腔内注入して麻酔する。一本の正中背側切開により輸卵管を露出させる。そして体壁から直接輸卵管への切開を行う。次いで卵巣嚢を時計工鉗子（watchmakers forceps）で引き裂く。移植する胚をDPBSに入れ、さらに移植ピペットのチップに（約10〜12の胚）入れる。ピペットのチップを卵管漏斗（infundibulum）に挿入し、そして胚を移植する。移植後、2箇所縫合して切り口を閉じる。
トランスジェニックラット
トランスジェニックラットを生産するための手順は、マウスに対する手順と同様である（Hammerら、Cell 63；1099-112（1990））。30日齢の雌ラットにPMSG 20 IU（0.1 cc）を皮下注入し、そして48時間後に、個々の雌を試験に供した雄と共にする。同時に、40〜80日齢の雌を精管切除した雄と共にケージの中に入れる。これらは胚移植の仮親（foster mothers）を提供する。翌朝、雌の膣栓をチェックする。精管切除した雄と交配した雌は、移植のときまで別に置いておく。交配した雌のドナーを屠殺し（CO2による窒息）、そしてそれらの輸卵管を取り出し、これを0.5％BSAが入ったDPBS（ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水）に入れ、そして胚を集める。胚周辺の丘細胞をヒアルロニダーゼ（1 mg／ml）で取り除く。次いで、胚を洗浄し、そしてこれを37.5℃のインキュベーター中で、0.5％BSAを含有するEBSS（アール調節塩溶液）にマイクロインジェクションの時間まで入れておく。
胚を一度注入し、生存胚を、仮親への移植のためにDPBSへ移す。ケタミン（40 mg／kg、ip）およびキシラジン（xylazine）（5 mg／kg、ip）で仮親を麻酔する。皮膚から背側正中切開を行い、そして、筋肉層から直接卵巣への切開を行い、卵巣および輸卵管を露出させる。卵巣嚢を引き裂き、胚を移植ピペットで吸引し、そして移植ピペットのチップを卵管漏斗に挿入する。次いで、切り口を縫合して閉じ、そして仮親を個々に収容する。
胚幹（ES）細胞方法
cDNAのES細胞への導入
ES細胞の培養方法およびそれに続くトランスジェニック動物の生産、種々の方法によるDNAのES細胞への導入（例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム／DNA沈降、および直接注入（direct injection））が、Teratocarcinomas and embryonic stem cells, a practical approach, E.J. Robertson編（IRL Press 1987）に詳細に記載されており、その教示は本明細書中に援用される。トランスジーン（transgene）含有ES細胞の望ましいクローンの選択は、いくつかの手法の1つにより達成される。ランダムな遺伝子組込みを含む場合には、APPクローンは、ネオマイシン耐性をコードする遺伝子と共沈する。トランスフェクションは、Lovell-Badge、Teratocarcinomas and embryonic stem cells, a practical approach, E.J. Robertson編（IRL Press 1987）またはPotterら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 7161（1984）で詳細に記載されるいくつかの方法のいずれかにより達成される。リン酸カルシウム／DNA沈降、直接注入、およびエレクトロポレーションは好ましい方法である。これらの手順においては、0.5×106個のES細胞を組織培養皿にプレートし、そして、最終的に100μlの体積になるようにして50 mgのリポフェクチン（lipofectin）の存在下で沈澱させた、線状化したAPPクローンと1 mgのpSV2neo DNAとの混合物によりトランスフェクトした（SouthernおよびBerg、J. Mol. Appl. Gen. 1：327-341（1982））。この細胞を、10％胎仔ウシ血清のG418で補足した（200と500μg／mlとの間）DMEM溶液を含有する選択培地で培養する。G418耐性の細胞のコロニーをクローニングリングを利用して単離し、そして増大させた。薬剤耐性のクローンからDNAを抽出し、そしてAPP配列を有するこれらのクローンを同定するために用いられるAPP770 cDNAプローブを用いて、サザーンブロッティング実験を行う。いくつかの実験では、重要なクローンを同定するのにPCR法を用いる。
ES細胞へ導入されたDNA分子はまた、Capecchi（1989）に記載されるように、相同組換えのプロセスにより染色体へ組込まれ得る。直接注入は組込みの効果が高い。所望のクローンは、注入されたES細胞のプールから調製されるDNAのPCRにより同定される。プール内の陽性の細胞は、細胞クローニングに続くPCRにより同定される（ZimmerおよびGruss、Nature338, 150-153（1989））。エレクトロポレーションによるDNAの導入はあまり効果的ではなく、そして選択工程を必要とする。組換え時の陽性物の選択の方法（つまり、neo耐性）および2重陽陰選択の方法（つまり、neo耐性およびガンシクロビル（gancyclovir）耐性）、およびそれに続く所望のクローンのPCRによる同定についてが、Joynerら、Nature338, 153-156（1989）およびCapecchi（1989）に記載されており、それらの教示は本明細書中に援用される。
胚の回収およびES細胞注入
雄と交配した自然周期または過剰排卵の雌マウスが、ES細胞移植のための胚を採取するのに用いられる。この目的にマウスを用いるときは、C57株を用いることが望ましい。交配が成功して約3.5日後に適齢の胚を回収する。交配した雌をCO2で窒息させるか、または頸部を脱臼させて屠殺し、そして切開した子宮角から胚を取り出して洗浄し、そしてES細胞注入のため、ダルベッコの10％ウシ血清を加えた修正必須培地にこれを入れる。約20μmの内径を有するガラス製顕微針を用いて、約10〜20のES細胞を胚盤胞へ注入する。
偽妊娠した雌への胚の移植
不定周期の成熟雌マウスを精管切除した雄と対にする。Swiss Webster、ICRまたはその他のマウス系統がこの目的のために用いられ得る。ES細胞を含有する胚盤胞の移植に要求される、交配してから2.5〜3.5日となるように受容雌を交配させる。胚移植の際に、体重1グラムあたり2.5％アベルチンの0.015 mlを腹腔内注入して、受容雌を麻酔する。体壁から直接輸卵管への切開により卵巣を露出させ、そして卵巣および子宮を外にさらす。25ゲージ針を用いて子宮角に穴をあけ、そこから胚盤胞を移植する。移植後、卵巣および子宮を体内へ押し戻し、そして2箇所縫合して切り口を閉じる。さらに移植をするときは、反対側でこの手順を繰り返す。
トランスジェニックマウスおよびラットの同定
3週齢の動物から尾のサンプル（1〜2 cm）を取り出す。DNAを調製し、サザーンブロットおよびPCRの両方法により分析し、トランスジェニック親（F0）動物およびそれらの子孫（F1およびF2）を検出する。
病理学的研究
マイクロインジェクションを行ったトランスジーンを有する種々のF0、F1およびF2動物をCO2で窒息させて屠殺し、そして脳内の神経炎によるプラーク（neuritic plaques）および神経細線維のもつれ（NFT）を免疫組織学的に分析する。各トランスジェニックラインからのマウスおよびラットの脳を4％パラフォルムアルデヒド中で固定し、そしてクリオスタット上で分割する。APPおよび／またはβペプチドと反応性の抗体で切片を染色する。フルオレセイン、ローダミン、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリ性ホスファターゼと結合した二次抗体が、一次抗体を検出するために用いられる。これらの実験は、アミロイドプラークの同定、および脳の特定の領域へそれらのプラークを局所化させることを可能にする。9〜50μmの範囲の大きさを有するプラークが、大脳皮質中においてAD患者の脳内に特徴的に生じるだけでなく、へん桃核、線条体および間脳を含むさらに奥の灰白質にも観察され得る。切片は、アルツハイマープラーク診断用の他の抗体でもまた染色され、抗原（例えば、Alz-50、tau、A2B5、神経フィラメント、ニューロン特異的エノラーゼ、およびアルツハイマープラークに特有の他の抗原）を認識する（Wolozinら、Science232, 648（1986）；HardyおよびAllsop、Trends in Pharm. Sci. 12, 383-388（1991）；Selkoe、Ann. Rev. Neurosci. 12, 463-490（1989）；Araiら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 2249-2253（1990）；Majochaら、Amer. Assoc. Neuropathology Abs；99, 22（1988）；Mastersら、Proc. Natl. Acad. Sci. 82, 4245-4249；Majochaら、Can J Biochem Cell Biol 63；577-584（1985））。また、チオフラビン類およびコンゴーレッドによる染色も、神経炎によるプラークおよびNFT内のβペプチド沈着物の位置を共に確認するのに行われる。
APPペプチドおよびβペプチドの発現の分析：
mRNA： 酸グアニジニウムチオシアネート-フェノール／クロロホルム抽出法によりトランスジェニック動物の細胞系および細胞組織から、mRNAを単離し（ChomczynskiおよびSacchi, Anal Biochem 162, 156-159（1987））、ノーザンブロット法により発現レベルを決定する。
タンパク質： 細胞質外ドメイン、βペプチド領域、およびC末端に特異的なポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を用いることによって、APPペプチドおよびβペプチドを検出する。
ウェスタンブロット分析： タンパク質画分を組織ホモジェネートおよび細胞溶解産物から単離し、Harlowら、Antibodies：A laboratory manual, （Cold Spring Harbor, NY, 1988）；Brownら、J. Neurochem. 40；299-308（1983）；およびTate-Ostroffら、Proc Natl Acad Sci 86；745-749（1989）に記載のように、ウェスタンブロット分析にかける。以下にごく簡単な説明をする。
タンパク質画分をラエムリサンプル緩衝液中で変性し、SDSポリアクリルアミドゲル上で電気泳動する。その後、エレクトロブロッティングによりタンパク質をニトロセルロースフィルターに移す。フィルターをブロックし、一次抗体と共にインキュベートし、最終的に酵素を結合した二次抗体と反応させる。続いて、適当な発色性基質を用いてインキュベートすることにより、APPタンパク質の位置が示される。
病理学的・行動的研究
病理学的研究
免疫組織的手法（Immunohistology）およびチオフラビンS染色は、本明細書の別項に記載のように行われる。
インサイチューハイブリダイゼーション： 放射性プローブまたは酵素標識されたプローブを用いてmRNAをインサイチューで検出する。これらのプローブを、よりよく細胞透過させるために長さおよそ100ヌクレオチドに分解する。固定され、パラフィン包埋されたサンプル用のChouら、J. Psych. Res. 24, 27-50（1990）に記載の手順を以下に簡潔に記載するが、同様の手順は凍結材料として切開されたサンプルに対しても用いることができる。インサイチューハイブリダイゼーション用のパラフィン切片をキシレンで脱脂し、エタノールで段階的・連続的に再水和し、最後にリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄する。切開片を新鮮な4％パラフォルムアルデヒド中で後固定（post-fixed）する。切片をPBSで5分間2回洗浄して、パラフォルムアルデヒドを除去する。その後、20μg／mlのプロテイナーゼK溶液による処理によって切開片を浸透性にする。切開片を4％パラフォルムアルデヒドで再固定し、バックグランドのプローブ結合を生じさせうる塩基性分子を0.1 Mトリエタノールアミン、0.3 M無水酢酸溶液中で10分間アセチル化する。切片をPBSで洗浄してから、エタノールで段階的・連続的に脱水し、空気乾燥する。センスプローブをコントロールとして用いて、アンチセンスプローブで切開片をハイブリダイズする。適切な洗浄後、結合した放射性プローブをオートラジオグラフィによって検出する。あるいは、適切な発色性基質との反応を通じて酵素的に標識されたプローブを検出する。
行動的研究
学習および記憶の欠損を評価するように考案された行動試験を用いる。このような試験には、例えばMorris Water迷路（Morris、Learn Motivat.12；239-260（1981））がある。この手順によれば、水で満たした円形のプールの中に動物が入れられ、水面のすぐ下にはエスケーププラットフォームが沈められている。その動物が近位の視覚的手がかりに向かって泳いでいくことによって見つけられるように、視覚的マーカーがプラットフォームの上に置かれている。あるいは、プラットフォームの位置を示す形式的手がかりがないより複雑な形式の試験をその動物に課すこともできる。その形式の場合、動物は遠位の視覚的手がかりに関連してプラットフォームの位置を学習しなければならない。
トランスジェニックマウスに適用される手順は、トランスジェニックラット用の手法と同様である。
アルツハイマー病治療用の化合物のスクリーニング
標準的な方法論によってアルツハイマー病の治療をする時に潜在的な効果をもたらす化合物をスクリーニングするために、トランスジェニック動物と動物細胞を用いる。この化合物を一定期間の間に投与量を変化させて動物に投与するか、培地に導入する。次いで、その動物あるいは動物細胞は、上記の手順を用いてAPP発現、組織病理学、および／または行動における変化を調べた。
実施例1：NIH3T3およびPC12細胞におけるpMTAPP-1の発現
クローンpMTAPP-1は、図1aに示される発現ベクターの一例である。ここで使用されているプロモーターは、メタロチオネインプロモーターである。NIH3T3およびPC12細胞系（ATCC＃CCL92およびCRL1721）をトランスフェクトすることによって安定な細胞系を得た。0.5×106個のNIH3T3またはPC12細胞を100 mm皿にプレートし、そして、50 mgのリポフェクチン（Gibco, BRL）の存在下で沈澱させた5 mgのSalIフラグメントおよび1 mgのpSV2neo DNA（46）の混合物を最終容積が100μlになるようにしてトランスフェクトした。PC12細胞には、ポリリジンでコートしたプレートを用いた。この細胞は通常、組織培養皿にあまり付着しないためである。DMEMまたはRPMI中10％のウシ胎児血清を含有し、G418を補給した選択培地を細胞に与えた。500 mg／ml（生物学的重量）および250 mg／mlのG418を用いて、NIH3T3およびPC12細胞由来のコロニーをそれぞれ選択した。トランスフェクションの15日後、G418に対して耐性を有する細胞のコロニーをクローニングリングで単離し、Tフラスコ内で増した。細胞内のAPP cDNAの存在は、MullisおよびFaloona, Methods Enzymol. 155；335-350（1987）の手法を用いたPCRで検出した。本明細書中に上記教示するところを援用する。
各細胞系からの25個のコロニー内のAPPの発現を、免疫染色（Majochaら、1988）によって分析した。細胞を集密培養し、4％のパラフォルムアルデヒド、0.12 MのNaCl、および20 mmのNa3PO4、pH7.0を含む溶液中で固定した。これらの増殖細胞を、Dr. Ronald Majocha, Massachusetts General Hospital, Boston, MAによって提供される合成βペプチド配列（Mastersら、1985）に対する初代モノクローナル抗体、次いでビオチンに結合した汎化抗マウス抗体（Jackson ImmunoResearch Labs, PA）と一晩インキュベートした。次に、アビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）（Vector Labs, Burlingame, CA）および色素体としてジアミノベンジジン（Majochaら、1985）を加えることにより免疫染色を行った。その結果、pMTAPP-1ベクターはNIH3T3およびPC12細胞の両方においてAPPを発現していることが示された。
実施例2：PC12細胞におけるpEAPP-1の発現
pEAPP-1は、図1Aの構築物と同様なヒトAPP770 cDNAに結合し、その発現を制御する25 kbヒトAPP遺伝子プロモーターの一例である。この構築物からのDNAを上記のようにしてPC12細胞にトランスフェクトした。pEAPP-1トランスフェクト細胞の特定のクローンは、神経成長因子（NGF）で処理されたPC12細胞によって示されるのと形態的に同様な分化表現型を示した。PC12細胞は通常、ほぼ円形および平坦な細胞である。pEAPP-1でトランスフェクトされた細胞は、神経突起に類似した細胞質伸長部を有する。PC12細胞をNGFで処理すると、神経突起伸長が非常に長く伸長する。pEAPP-1でトランスフェクトされた13個のPC12細胞クローンを選択し、増殖させた。これらの細胞クローンのうち8個が自発分化表現型を示し、クローン1-8、1-1および1-4が最も強力な表現型を示した。上記のようにβペプチドに対する抗体でpEAPP-1トランスフェクトPC12細胞を染色したところ、分化を示す細胞もAPPを発現していることが示された。APP770 cDNAは発現されるが、pMTAPP1クローンでトランスフェクトされたPC12細胞はこの表現型を示さなかったので、これらの結果により、ヒトプロモーター由来のAPP770の発現が、細胞生理学に関する新規な特徴を有することが示唆される。
実施例3：PC12細胞におけるpMTA4の発現
pMTA4は、図4Aに示される構築物のタイプの一例である。ここで使用されているプロモーターは、メタロチオネインプロモーターである。この構築物でコードされるタンパク質は、図4に示されるタンパク質とはわずかに異なる。APP770 cDNAクローンを、56位（Kangらの番号付けシステムによる、1987年）より後を切断するAsp718で消化した。その結果得られた5'エクステンションをクレノウ酵素（Maniatis）を用いてうめた。同一のDNA調製物もまた、1795位より後を切断するEcoRIで切断し、その結果得られた5'エクステンションをクレノウ酵素（Maniatis）を用いてうめた。この分子が自己連結することにより発現クローンとなる。この発現クローンでは、このようにしてコードされた欠失タンパク質は、リーダー配列、βペプチドのphe-arg-val-gly-ser配列で開始する短縮βペプチド、そしてAPPの56末端アミノ酸をこの順で含んでいる。この構築部からのDNAを上記のようにPC12細胞にトランスフェクトした。
実施例4：MT-1プロモーターのコントロール下でのAPP発現トランスジェニックマウスの発生。
トランスジェニックマウスを、前核胚にpMTAPP1ベクターDNAをマイクロインジェクションすることによりつくった。pMTAPP1は、図1aに示した構築物の一例であり、それはメタロチオネインプロモーターに操作可能に連結する。マウスの胚へのマイクロインジェクションの手順は、B. Hoganらによる「Manipulating the mouse embryo」（1986）に記載されている。手順の簡単な説明のみを下に記載する。
マウスをTaconic Laboratories（German Town, New York）から入手した。Swiss Webster雌マウスを、胚の回収および移植に用いた。B6D2F1雄を交配に用い、そして精管切除したSwiss Webster種ウマを、偽妊娠をシミュレートするのに用いた。
胚の回収： 4〜8週齢の雌マウスを、5 IUの妊娠ウマ血清ゴナドトロピン（PMSG；Sigma）、続いて48時間後5 IUのヒト繊毛性ゴナドトロピン（hCG；Sigma）を用いて、過剰排卵を誘発した。hCG注入後、ただちに雌を雄と一緒に置いた。hCGの21時間後に、0.5％ウシ血清アルブミン（BSA；Sigma）の入ったダルベッコリン酸緩衝生理食塩水中で交配した雌から切除した輸卵管から胚を回収した。周囲の丘細胞を、ヒアルロニダーゼ（1 mg／ml）を用いて除去した。次いで前核胚を洗浄し、そして7％ CO2、5％ O2、および88％ N2からなる加湿雰囲気下の37.5℃のインキュベーター中の0.4％BSA（EBSS）を含有するアール調節塩溶液中に注入時間まで入れておいた。
マイクロインジェクション： Elutip-DTMで精製したSalI DNAを、マイクロインジェクションのために5 mMトリス（pH7.4）および0.1 mM EDTAに溶解して、3μl／ml濃度にした。微小針およびホールディングピペットを、DKIモデル720 pipette pullerを用いてFisher凝集（coagulation）チューブ（Fisher）から曵いて作製した。次いで、ホールディングピペットを約70μm（O.D.）で壊し、そしてナリシゲマイクロフォージ（モデルMF-83）で約30μmのI.D.にまで炎でなめらかにした。Nikon Diaphot顕微鏡に取り付けたナリシゲマイクロマニピュレーターにピペットを備え付けた。空気の詰まったインジェクションピペットを、ホールディングピペットに対してチップを破壊した後、チップを通してDNA溶液で満たした。マイクロマニピュレーションのためにパラフィンオイル下で、30〜40の群の胚を、EBBSの滴量100μlに入れた。胚を配向させ、そしてホールディングピペットで保持した。次いで、インジェクションピペットを、雄の前核（通常は、より大きい前核）に挿入した。ピペットが膜を突き破らなかった場合は、直ちに台を軽く叩いて貫通を助けた。次いで、細胞核を注入し、この注入を細胞核の膨張によってモニターした。注入後、胚群を受容雌に移すまで、EBSS中に入れて置いた。
移植：不定周期の成熟雌マウスを、精管切除したSwiss Websterの雄と対にした。受容雌を、ドナー雌として同時に交配した。移植する時に、雌をアベルチンで麻酔した。一本の正中背側切開により、輸卵管を露出した。次いで、体壁から直接輸卵管への切開を行った。次いで、卵巣嚢を、時計工鉗子で引き裂いた。移植すべき胚を、DPBS中に入れ、そしてトランスファーピペットのチップに入れた（約10〜12個の胚）。ピペットのチップを、卵管漏斗に挿入し、そして胚を移植した。移植後、2箇所縫合して切り口を閉じた。
トランスジーン組込みのためのマウスの分析： 3週齢の1 cmの長さの尾のサンプルを、DNA分析について実験した。0.7 mlの5 mMトリス（pH8.0）、100 mM EDTA、0.5％SDSおよび350μgプロテイナーゼKの存在下、55℃で一晩振とうしながらインキュベートすることにより、尾のサンプルを消化した。消化物を、等量のフェノールで一回、そして等量のフェノール：クロロホルム（1：1混合液）で一回抽出した。上清を、70μlの3 M酢酸ナトリウム（pH6.0）と混合し、そして等量の100％エタノールを添加することによりDNAを沈澱させた。DNAを微量遠心で沈澱させ、70％エタノールで一回洗浄し、乾燥させ、そして100μlのTE緩衝液（10 mMトリスpH8.0および1 mM EDTA）に溶解した。
10〜20μlのDNAを、BamHIで制限切断し、1％アガロースゲル上で電気泳動し、ニトロセルロースペーパーにブロットし、そして32Pで標識したAPP cDNAフラグメントでハイブリダイズした。トランスジェニック動物を、ハイブリダイズしたヒトロセルロースフィルターのオートラジオグラフィーにより同定した。DNAもまた、800 bpフラグメントを生み出す合成プライマーによって実行されるPCRにより分析した。
全部で671個の前核胚をマイクロインジェクションして、73匹が生きて生まれ、そして6匹が死産であった。F1およびF2トランスジェニックを生み出した9匹のトランスジェニックマウス（雌5匹および雄4匹）を、DNA分析により同定した。これらの動物は、mRNAの発現および異なる組織におけるAPPのタンパク質、および上記のような行動的および診断的異常の分析について解析され得る。
図の枠で囲んだ部分は、構築物のアミノ酸コード部分を示す。模様部分（filled portion）は、図の註訳部分に示されているように、タンパク質の種々の領域を示す。線は、ゲノム配列に隣接する、5'あるいは3'非翻訳配列、フランキングゲノム配列またはイントロンである、クローン中の配列を示す。図7および8において、構築物の左側の先の省略部分は、長いDNA配列が存在することを示す。
図1aは、APP 770 cDNAコード配列の図である。図1bは、717位での変異を有する、APP 770 cDNAコード配列の図である。 図2aは、APP 751 cDNAコード配列の図である。図2bは、717位での変異を有する、APP 751 cDNAコード配列の図である。 図3aは、APP 695コード配列の図である。図3bは、717位での変異を有する、APP 695 cDNAコード配列の図である。 図4aは、APPのカルボキシ末端部分のコード配列の図である。図4bは、717位での変異を有する、APPのカルボキシ末端部分のコード配列の図である。 図5は、APPのβペプチド部分のコード配列の図である。 図6aは、KIおよびOX2エキソンの代替スプライシングを可能にする、組み合せゲノム／cDNAコード配列の図である。図6bは、717位での変異を有し、KIおよびOX2エキソンの代替スプライシングを可能にする、組み合せゲノム／cDNAコード配列の図である。 図7aは、ヒトAPP YACコード配列の図である。図7bは、717位での変異を有する、ヒトAPP YACコード配列の図である。 図8は、マウスES細胞中のマウスAPP遺伝子と、遺伝子のエキソン9部分に対するヒトAPP cDNA（野生型あるいはFAD変異型のいずれか）を有するベクターとの相同組換えによる、マウスAPP遺伝子の遺伝子改変の図である。この組換えの結果として、エキソン9中の組換え位置を越える、常在性マウス染色体APP遺伝子中の配列は、類似のヒト配列で置換される。

Claims (11)

  1. 組み合わせcDNA／ゲノム発現クローンに対して作動可能に連結したプロモーターを含む遺伝子構築物を含有するトランスジェニックげっ歯動物であって、
    前記発現クローンはAPP770をコードするcDNA配列または天然に存在する変異を有するAPP770をコードするcDNA配列を含有し、
    エキソン6およびスプライシングのために十分な領域を有する隣接する下流イントロン、KIコード領域およびOX-2コード領域およびスプライシングのために十分な領域を有するそれぞれのそれらの上流および下流イントロン、そしてエキソン9およびスプライシングのために十分な領域を有する隣接する上流イントロンからなるゲノムAPP DNA配列を、APP770をコードするcDNA配列または天然に存在する変異を有するAPP770をコードするcDNAの対応する領域に置換し、そして
    前記構築物は、トランスジェニックげっ歯動物中で、転写され、そして選択的にスプライシングされて、APP695、APP751およびAPP770をコードしそしてAPP695、APP751およびAPP770に翻訳されるmRNA分子を形成する、
    前記トランスジェニックげっ歯動物。
  2. プロモーターが、ヒトAPPプロモーター、マウスAPPプロモーター、ラットAPPプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ラットニューロン特異的エノラーゼプロモーター、ヒトβアクチン遺伝子プロモーター、ヒト血小板由来成長因子B（PDGF-B）鎖遺伝子プロモーター、ラットナトリウムチャンネル遺伝子プロモーター、マウスミエリン塩基性タンパク質遺伝子プロモーター、ヒト銅-亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ遺伝子プロモーター、および哺乳類POU-ドメイン調節遺伝子プロモーターからなる群から選択される、請求項1に記載のトランスジェニックげっ歯動物。
  3. 構築物が、げっ歯動物の染色体中に組み込まれる、請求項1に記載のトランスジェニックげっ歯動物。
  4. 請求項3に記載のトランスジェニックげっ歯動物から培養された細胞。
  5. 野生型APP770タンパク質の717位でバリン残基をコードするコドンが、Ile、Phe、Gly、Tyr、Leu、Ala、Pro、Trp、Met、Ser、Thr、Asn、およびGlnからなる群から選択されるアミノ酸をコードするように変異している、請求項1に記載のトランスジェニックげっ歯動物。
  6. 請求項1に記載のトランスジェニックげっ歯動物であって、前記プロモーターが、そのトランスジェニックげっ歯動物の起源であるげっ歯動物と同一種のAPPプロモーターである、請求項1に記載のトランスジェニックげっ歯動物。
  7. 組み合わせcDNA／ゲノム発現クローンに対して作動可能に連結したプロモーターを含む遺伝子構築物を、げっ歯動物細胞またはげっ歯動物胚に導入することを含む、アルツハイマー病のトランスジェニックモデルを形成するための方法であって；
    前記発現クローンはAPP770をコードするcDNA配列または天然に存在する変異を有するAPP770をコードするcDNA配列を含有し、
    エキソン6およびスプライシングのために十分な領域を有する隣接する下流イントロン、KIコード領域およびOX-2コード領域およびスプライシングのために十分な領域を有するそれぞれのそれらの上流および下流イントロン、そしてエキソン9およびスプライシングのために十分な領域を有する隣接する上流イントロンからなるゲノムAPP DNA配列を、APP770をコードするcDNA配列または天然に存在する変異を有するAPP770をコードするcDNAの対応する領域に置換し、
    前記構築物は、哺乳類細胞中で、転写され、そして選択的にスプライシングされて、APP695、APP751およびAPP770をコードしそしてAPP695、APP751およびAPP770に翻訳されるmRNA分子を形成する、
    前記方法。
  8. トランスジェニックモデルが、行動の変化を示すげっ歯動物である、請求項7に記載の方法。
  9. 化合物がアルツハイマー病の治療に有用であるかどうかを試験する方法であって、以下の工程；
    試験すべき化合物を、遺伝子構築物をその染色体中に組み込んだトランスジェニックげっ歯動物に対してさらす工程、
    ここで、前記構築物は、組み合わせcDNA／ゲノム発現クローンに対して作動可能に連結したプロモーターを含み、前記発現クローンは、APP770をコードするcDNA配列または天然に存在する変異を有するAPP770をコードするcDNAを含有し、
    エキソン6およびスプライシングのために十分な領域を有する隣接する下流イントロン、KIコード領域およびOX-2コード領域およびスプライシングのために十分な領域を有するそれぞれのそれらの上流および下流イントロン、そしてエキソン9およびスプライシングのために十分な領域を有する隣接する上流イントロンからなるゲノムAPP DNA配列を、APP770をコードするcDNA配列または天然に存在する変異を有するAPP770をコードするcDNA配列中に置換し、そして
    前記構築物は、トランスジェニックげっ歯動物中で、転写され、そして選択的にスプライシングされて、APP695、APP751およびAPP770に翻訳されるmRNAを形成する、
    そして、化合物のアルツハイマー病に対する効果の指標となる、APPの発現またはプロセッシングの変化が、存在するかどうかを決定する工程、
    を含む、前記試験する方法。
  10. 化合物を投与した後、トランスジェニックげっ歯動物の組織病理学または行動が変化したかどうかを決定する工程、をさらに含む、トランスジェニックげっ歯動物を使用する請求項9に記載の方法。
  11. 組み合わせcDNA／ゲノム発現クローンに対して作動可能に連結したプロモーターを含む遺伝子構築物を含有する非ヒトトランスジェニック哺乳類細胞であって、
    前記発現クローンは、APP770をコードするcDNA配列または天然に存在する変異を有するAPP770をコードするcDNA配列を含有し、
    エキソン6およびスプライシングのために十分な領域を有する隣接する下流イントロン、KIコード領域およびOX-2コード領域およびスプライシングのために十分な領域を有するそれぞれのそれらの上流および下流イントロン、そしてエキソン9およびスプライシングのために十分な領域を有する隣接する上流イントロンからなるゲノムAPP DNA配列を、APP770をコードするcDNA配列または天然に存在する変異を有するAPP770をコードするcDNAの対応する領域に置換し、そして
    前記構築物は、哺乳類細胞中で、転写され、そして選択的にスプライシングされて、APP695、APP751およびAPP770をコードし、そしてAPP695、APP751およびAPP770に翻訳されるmRNA分子を形成する、
    前記トランスジェニック哺乳類細胞。
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