CN108884158A - 抗死亡受体抗体及其使用方法 - Google Patents

抗死亡受体抗体及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及特异性结合死亡受体(其为具有细胞内死亡结构域的肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族(TNFR‑SF)的成员)的抗原的单特异性或双特异性抗体分子。本发明具体涉及在Fc区中具有增强靶标结合后的IgG分子聚簇的突变的IgG1同种型的抗体分子。本发明进一步涉及结合一种或多种特定死亡受体上的不同表位的抗体分子的组合。本发明还涉及含有这些分子的药物组合物以及使用这些组合物治疗癌症。

Description

抗死亡受体抗体及其使用方法
发明领域
本发明涉及特异性结合死亡受体(其为具有细胞内死亡结构域的肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族(TNFR-SF)的成员)的抗原的单特异性或双特异性抗体。本发明尤其涉及在Fc区中具有增强靶标结合后的IgG分子聚簇的突变的IgG1同种型的抗体分子。本发明进一步涉及结合一种或多种特定死亡受体上的不同表位的抗体分子的组合。本发明还涉及含有这些分子的药物组合物以及使用这些组合物治疗癌症。
发明背景
死亡受体(DR)是TNFR-SF的子集，其为质膜质受体，其特征在于被称为死亡结构域(DD)的~80个氨基酸的胞质序列(Nagata等人, Cell. 1997 Feb 7;88(3):355-65; Ashkenzai等人, Science. 1998 Aug 28;281(5381):1305-8; Locksley等人, Cell. 2001 Feb 23;104(4):487-501; Wajant Cell Death Differ. 2015 Nov;22(11):1727-41)。已知肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族(TNFR-SF)的细胞内死亡结构域活化两个主要的信号传导级联：导致NF-κB和JNK活化的激酶级联和导致细胞死亡的胱天蛋白酶级联(Ashkenazi等人,Science. 1998 Aug 28;281(5381):1305-8)。已经显示配体介导的死亡受体活化在多种转化的细胞系中触发凋亡。因此，为了开发包括激动性抗体的各种疾病的死亡受体靶向治疗剂已经作出了相当大的努力。然而，这些努力仅导致有限的临床效力。
因此，需要提供结合具有细胞内死亡结构域的肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族(TNFR-SF)的死亡受体的改进的抗体，诸如改进的抗死亡受体抗体，用于治疗癌症、传染病、自身免疫性疾病、心血管异常和其他疾病。
发明概述
令人惊讶地，本发明的发明人已经发现，在特异性结合死亡受体(其为包含细胞内死亡结构域的TNFR-SF的成员)的抗原的抗体的Fc区中引入特异性点突变体外和体内通过抗体结合细胞表面上的靶标后的FcγR-非依赖性聚簇而显著增强抗体的功效。甚至更令人惊讶地，本发明人还发现，在Fc区中具有突变的两种抗死亡受体抗体的组合有利于细胞表面抗原结合条件性的抗体聚簇，导致形成异源六聚体并且与两种没有突变的抗死亡受体抗体的组合相比功效增强。
本发明的目标是提供改进的抗死亡受体抗体，诸如抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR和抗NGFR抗体，例如用于治疗癌症。这种改进的抗死亡受体抗体在Fc结构域中包含突变。本发明的一个进一步目标是提供用于治疗癌症的改进的组合物，其包含一种或多种结合死亡受体上的不同表位的抗死亡受体抗体，诸如抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR和抗NGFR抗体。如本文所述的这种改进的组合物包含至少一种抗死亡受体抗体，或所述组合物包含两种结合一种或多种死亡受体上的不同区域、诸如以下死亡受体中的一种或多种上的不同表位的抗死亡受体抗体，所述死亡受体选自：FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR和NGFR。
本发明提供了包含人免疫球蛋白IgG的Fc区和结合死亡受体的抗原结合区的抗体，诸如抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR和抗NGFR抗体，其中所述Fc区在对应于根据EU编号的人IgG1中的位置E430、E345或S440的氨基酸处包含突变(Edelman等人, Proc Natl Acad Sci U S A. 1969 May;63(1):78-85; Kabat等人, Sequences ofProteins of Immunological Interest, Fifth Edition. 1991 NIH Publication No.91-3242)。除非与上下文矛盾，否则免疫球蛋白IgG具有与IgG相同的含义。
在一个方面，本发明提供了包含人免疫球蛋白IgG的Fc区和结合包含细胞内死亡结构域的死亡受体的抗原结合区的抗体，其中所述Fc区在对应于人IgG1中的位置E430、E345或S440 (EU编号)的氨基酸处包含突变。
也就是说，本发明的发明人在本发明的第一个方面发现，与在对应于人IgG1的E430、E345或S440 (EU编号)的氨基酸位置处没有突变的抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR和抗NGFR抗体相比，本发明的抗死亡受体抗体、诸如抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR和抗NGFR抗体增加了表达FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR或NGFR的细胞、诸如肿瘤细胞的凋亡。也就是说，本发明的抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR和抗NGFR抗体适用于治疗FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR或NGFR阳性肿瘤或表达FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR或NGFR的肿瘤。因此，根据本发明的抗体适用于治疗一种或多种抗原阳性或表达一种或多种抗原的肿瘤，所述抗原选自：FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR和NGFR。
在本发明的一个实施方案中，抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR和抗NGFR抗体包含人免疫球蛋白IgG的Fc区和结合死亡受体的抗原结合区，其中所述Fc区包含对应于根据EU编号的人IgG1中的位置E430G或E345K的突变。因此，在本发明的一个实施方案中，抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR和抗NGFR抗体包含人免疫球蛋白IgG的Fc区和结合死亡受体的抗原结合区，其中所述Fc区包含E430G或E345K突变处的突变。
在本发明的一个实施方案中，抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR和抗NGFR抗体包含人免疫球蛋白IgG的Fc区，其中所述Fc区包含E430G突变。
在本发明的一个实施方案中，抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR和抗NGFR抗体包含人免疫球蛋白IgG的Fc区，其中所述Fc区包含E345K突变。
在一个方面，本发明提供了组合物，其包含一种或多种选自以下的抗死亡受体抗体：抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR和抗NGFR。在一个实施方案中，所述组合物包含一种或多种结合FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR和NGFR上的不同表位的抗体。在一个实施方案中，所述组合物至少包含第一和第二抗体，其选自：抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR和抗NGFR，其中所述第一抗体不阻断所述第二抗体的抗原结合。
在另一个方面，本发明提供了包含一个或多个结合FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR和NGFR的抗原结合区的双特异性抗体。在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含第一和第二重链，其中第一重链包含F405L突变且第二重链包含K409R突变，或反之亦然。因此，在根据本发明的双特异性抗体的一个实施方案中，所述双特异性抗体包含第一和第二重链，其中第一和第二重链在对应于人IgG1中的E430、E345或S440 (EU编号)的氨基酸位置处包含突变，且其中第一重链包含F405L突变，且第二重链包含K409R突变。因此，在根据本发明的双特异性抗体的一个实施方案中，所述双特异性抗体包含第一和第二重链，其中第一和第二重链在对应于人IgG1中的E430、E345或S440 (EU编号)的氨基酸位置处包含突变，且其中第一重链包含K409R突变，且第二重链包含F405L突变。
在又另一个方面，本发明提供了治疗疾病的方法，其包括向有需要的个体施用有效量的如本文所述的抗体或组合物。在本发明的一个实施方案中，所述疾病是癌症。
在本发明的另一个方面，根据本发明的抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR或抗NGFR抗体、双特异性抗体或组合物用作药物。在一个实施方案中，抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR或抗NGFR抗体、双特异性抗体或组合物用于治疗疾病。在一个实施方案中，所述疾病是癌症或肿瘤。
在又另一个方面，本发明提供了治疗具有癌症的个体的方法，其包括向所述个体施用有效量的如本文所述的所述抗体或组合物。
在另一个方面，本发明提供了包含根据前述权利要求中任一项所述的抗体或组合物的部件试剂盒(kit of parts)，其中所述抗体或组合物在一个或多个容器诸如小瓶中。
在另一个方面，本发明提供了如本文所述的抗体或组合物用于制备用于治疗疾病的药物的用途。在一个实施方案中，本发明提供了如本文所述的抗体或组合物用于制备用于治疗癌症的药物的用途。
本文所述的抗体和组合物针对或特异于人FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR或NGFR。所述的抗体和组合物与恒河猴和食蟹猴FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR或NGFR交叉反应。具体而言，在一个实施方案中，所述抗体和组合物特异性结合FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR或NGFR的细胞外结构域。在一个具体实施方案中，所述抗体和组合物例如在非重叠表位处结合选自以下的相同死亡受体：FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR和NGFR。也就是说，本文所述的第一抗体不阻断本文所述的第二抗体的结合。在一个具体实施方案中，本文所述的组合物包含结合FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR或NGFR的第一和第二抗体，且第一抗体不阻断第二抗体与FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR或NGFR的结合。
本发明的抗体和组合物通常可用于调节死亡受体诸如FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR或NGFR的活性。在一个实施方案中，所述抗体或组合物可以触发、活化和/或增加或增强由死亡受体诸如FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR或NGFR介导的信号传导。在一个实施方案中，所述抗体或组合物可以对死亡受体诸如FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR或NGFR具有激动作用，特别是触发或增加与FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR或NGFR相关的生物学机制、反应和作用，它们的涉及FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR或NGFR的信号传导和/或途径。也就是说，本发明的抗体或组合物可以诱导表达FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR或NGFR的细胞或组织、诸如癌细胞或肿瘤细胞中的凋亡或细胞死亡。
在一个实施方案中，本文所述的抗体或组合物诱导、触发、增加或增强表达FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR或NGFR的细胞或组织、诸如癌细胞或肿瘤细胞中的凋亡、细胞死亡或生长停滞。在一个实施方案中，本文所述的抗体或组合物能够结合细胞表面上的FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR或NGFR，特别是以使得诱导、触发、增加或增强由FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR或NGFR介导的信号传导的方式结合FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR或NGFR。在一个实施方案中，本文所述的抗体或组合物可以使得它们能够以在表达FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR或NGFR的癌细胞或肿瘤细胞中诱导凋亡或细胞死亡的方式结合FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR或NGFR。
在一个实施方案中，本发明的抗体或组合物在表达FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR或NGFR的癌细胞或肿瘤细胞中诱导、触发、增加或增强凋亡或细胞死亡。可以通过暴露于一种或多种本发明的抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR和抗NGFR抗体或用一种或多种本发明的抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR和抗NGFR抗体处理的细胞上的磷脂酰丝氨酸暴露的增加或增强的水平来测量增加或增强的凋亡或细胞死亡。或者，可以通过测量已暴露于一种或多种本发明的抗DR5抗体或用一种或多种本发明的抗DR5抗体处理的细胞中的胱天蛋白酶3或胱天蛋白酶7的活化来测量增加或增强的凋亡或细胞死亡。或者，可以通过已暴露于一种或多种本发明的抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR和抗NGFR抗体或用一种或多种本发明的抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR和抗NGFR抗体处理的细胞培养物中与未处理的细胞培养物相比活力的损失来测量增加或增强的凋亡或细胞死亡。可以通过证明通过胱天蛋白酶-抑制剂例如ZVAD抑制暴露于DR5抗体后的活力的损失来评价胱天蛋白酶介导的凋亡的诱导。
附图简要说明
图1显示迄今为止鉴定的四种不同的人IgG1 Fc同种异型的氨基酸比对。IgG1m(f)(SEQ ID NO 1)、IgG1m(z) (SEQ ID NO 2)、IgG1m(a) (SEQ ID NO 3)、IgG1m(x) (SEQ IDNO 4)的Fc序列。
图2显示有和没有六聚化增强突变E430G或E345K的DR5抗体与DR5阳性COLO 205细胞的结合。在FACS分析中测试人-小鼠嵌合抗体(A) IgG1-DR5-01、(B) IgG1-DR5-05和(C)双特异性抗体IgG1-DR5-01-K409R x IgG1-DR5-05-F405L (BsAb DR5-01-K409R x DR5-05-F405L)的变体与COLO 205细胞的结合。结合表示为荧光强度的几何平均值。使用抗gp120抗体IgG1-b12作为阴性对照。误差条表明标准偏差。
图3显示DR4抗体与包被的sTRAIL-R1的结合ELISA。图代表有和没有E430G六聚化增强突变的抗体IgG1-DR4-T1014G03-K409R与包被的sTRAIL-R1的结合。
图4显示用不同DR5抗体的变体的活力测定。E345K (C-D)、E430G (A-B, E-J)或E345R/E430G/S440Y (RGY) (E,J)六聚化增强突变的引入导致COLO 205(A-E)和HCT116(F-J)结肠癌细胞上不同DR5抗体的增强杀伤。误差条表明标准偏差。数据表示为发光(RLU=相对发光单位)或者从发光相对于不与抗体孵育的样品(无杀伤)和与星形孢菌素孵育的样品(最大杀伤)计算的％活细胞。
图5显示用DR4抗体的变体IgG1-DR4-T1014G03的活力测定。E430G六聚化增强突变的引入导致BxPC-3人胰腺癌细胞的增强的杀伤。误差条表明标准偏差。
图6显示用FAS抗体的变体IgG1-FAS-E09的活力测定。六聚化增强三重突变E345R/E430G/S440Y (RGY)的引入导致Jurkat人T淋巴细胞的剂量依赖性杀伤。
图7显示六聚化增强突变的引入导致COLO 205 (A-B)和HCT116 (C-D-E)结肠癌细胞上的通过抗体组合IgG1-DR5-01-K409R + IgG1-DR5-05-F405 (A和C)和BsAb DR5-01-K409R x DR5-05-F405 (B和D)的杀伤的增强诱导。误差条表明标准偏差。
图8显示抗体组合IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G的组合与没有E430G突变的组合相比的效力，如在BxPC-3胰腺(A)和HCT15结肠癌细胞(B)上的活力测定中所测量。图代表重复样品的平均值+/-标准偏差。
图9显示用IgG1-hDR5-01-G56T-E430G和IgG1-hDR5-05-E430G的排斥和互补变体的活力测定。在两种抗体中引入相同的排斥突变(K439E或S440K)导致BxPC-3胰腺(A)和HCT-15结肠癌细胞(B)的杀伤的诱导减少。通过在两种抗体中组合两种突变(K439E和S440K)，排斥被中和且杀伤得到恢复。误差条表明标准偏差。
图10显示Fc相互作用参与具有六聚化增强突变的抗体组合IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G诱导细胞表面上的受体集簇和诱导凋亡的能力中。Fc结合肽DCAWHLGELVWCT抑制凋亡的诱导，如在BxPC-3人癌细胞上的3天活力测定中所示。
图11显示IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G的组合降低不同人癌细胞系的活力，如在3天活力测定中所测定。图显示来自重复样品的平均值+/-标准偏差。* p<0.05，** p<0.01，*** p<0.001，**** p<0.001 (用Tukey氏多重比较检验的单因素ANOVA)。01是IgG1-DR5-01-K409R，05是IgG1-DR5-05-F405L，01-E430G是IgG1-DR5-01-K409R-E430G，05-E430G是IgG1-DR5-05-F405L-E430G。
图12显示，六聚化增强突变的引入导致抗体组合IgG1-DR5-05-F405L-E345K +IgG1-CONA-K409R-E430G和BsAb CONA-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E345K对HCT 116结肠癌细胞的杀伤的诱导增强，如3天活力测定中所测定。误差条表明标准偏差。RLU：相对发光单位。
图13显示在3天活力测定中在贴壁COLO 205(A)结肠直肠和PANC-1 (B)和BxPC-3(C)胰腺癌细胞上在通过抗人IgG F(ab’)2的二级Fc交联存在或不存在的情况下抗体组合IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G和BsAb DR5-01-K409R-E430G xDR5-05-F405L-E430G与DR5抗体IgG1-DR5-CONA和IgG1-DR5-chTRA8-F405L相比的效力。包括非靶标结合抗体IgG1-b12作为阴性对照。图显示来自重复样品的平均值+/-标准偏差。
图14显示通过人源化IgG1-hDR5-01-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G (01-E430G +05-E430G)抗体的组合的胱天蛋白酶依赖性程序性细胞死亡，如活力测定中在PANC-1(A和B)和BxPC-3(C)胰腺癌细胞上所测量。ZVAD，Z-VAD-FMK。
图15显示在COLO 205结肠癌细胞上结合DR5抗体组合后的细胞死亡诱导。将COLO205细胞与抗体样品孵育5小时(A-C)和24小时(D-E)。通过膜联蛋白V/PI双重染色和活性胱天蛋白酶-3染色分析细胞死亡诱导的不同阶段。误差条表明2个重复样品的标准偏差。01是IgG1-DR5-01-K409R，05是IgG1-DR5-05-F405L，01-E430G是IgG1-DR5-01-K409R-E430G，05-E430G是IgG1-DR5-05-F405L-E430G，01x05是BsAb DR5-01-K409R x DR5-05-F405L，01-E430G x 05-E430G是BsAb DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G。
图16显示抗体组合IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G (A)和BsAb DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G (B)在COLO 205结肠癌细胞上结合后的胱天蛋白酶-3/7活化的动力学。将COLO 205细胞与抗体一起孵育1、2、5和24小时。在均质发光测定中分析胱天蛋白酶-3/7活化。AU，任意单位。误差条表明重复样品的标准偏差。
图17显示抗体组合IgG1-hDR5-01-K409R-E430G + IgG1-hDR5-05-F405L-E430G和抗体组合IgG1-hDR5-01-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G的功效，如活力测定中在BxPC-3胰腺癌细胞上所测量。图代表重复样品的平均值+/-标准偏差。
图18显示不同比率的IgG1-DR5-01-K409R-E430G和IgG1-DR5-05-F405L-E430G(DR5-01-E430G:DR5-05-E430G)在贴壁BxPC-3人癌细胞上的效力，如在3天活力测定中所测定。
图19显示不同比率的IgG1-hDR5-01-G56T- E430G和IgG1-hDR5-05-E430G (DR5-01-E430G:DR5-05-E430G)在贴壁BxPC-3 (A)和HCT-15 (B)人癌细胞上的效力，如在3天活力测定中所测定。
图20显示在具有COLO 205人结肠癌细胞的皮下异种移植模型中评估有和没有六聚化增强突变E430G的嵌合IgG1-DR5-05-F405L的体内效力。在时间(A)显示用所示抗体(5mg/kg)治疗的小鼠中的肿瘤发展(平均值& SEM)。在(B)中，在Kaplan-Meier图中显示肿瘤大小小于750 mm3的小鼠的百分比。
图21显示在Jurkat人T淋巴细胞上用FAS抗体的变体IgG1-FAS-E09的活力测定。在Fc-Fc排斥突变K439E或S440K存在的情况下，通过具有六聚化增强突变E345R/E430G/S440Y (RGY)或E345R/E430G/Y436I (RGI)的IgG1-FAS-E09变体的杀伤被抑制。RGEY：E345R/E430G/K439E/S440Y；RGIK：E345R/E430G/Y436I/S440K。
图22显示在贴壁COLO 205人结肠癌细胞上用DR5抗体IgG1-DR5-CONA和IgG1-DR5-CONA-E430G的活力测定。六聚化增强突变E430G的引入导致杀伤的诱导。数据表示为从发光相对于不与抗体孵育的样品(无杀伤)和与星形孢菌素孵育的样品(最大杀伤)计算的％活细胞。误差条表明标准偏差。
图23显示在COLO 205人结肠癌细胞上用DR5抗体的活力测定。六聚化增强突变S440Y的引入导致单一抗体IgG1-hDR5-01-G56T和IgG1-hDR5-05(A)的杀伤的诱导以及抗体组合IgG1-hDR5-01-G56T + IgG1-hDR5-05 (B)的增加效力。数据表示为从发光相对于不与抗体孵育的样品(无杀伤)和与星形孢菌素孵育的样品(最大杀伤)计算的％活细胞。误差条表明标准偏差。
图24A显示IgG1-DR5-CONA-K409R和IgG1-DR5-chTRA8-F405L之间的交叉阻断ELISA。(B)E430G六聚化增强突变的引入导致通过非交叉阻断抗体IgG1-DR5-CONA-E430G +IgG1-DR5-chTRA8-E430G的组合对BxPC-3人胰腺癌细胞的杀伤的增强诱导，如3天活力测定中所测定。误差条表明标准偏差。
图25显示在具有HCT15人结肠癌细胞的皮下异种移植模型中评估有和没有六聚化增强突变E430G的抗DR5抗体浓度IgG1-hDR5-01-G56T + IgG1-hDR5-05的体内效力。在时间(A)和开始治疗后第21天(B)显示用0.5 mg/kg抗体治疗的小鼠中的肿瘤发展(平均值&SEM)。**P < 0.0011 (Mann Whitney检验)。在(C)中，在Kaplan-Meier图中显示肿瘤大小小于750 mm3的小鼠的百分比。
图26显示在具有COLO 205人结肠癌细胞的皮下异种移植模型中评估抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430G和IgG1-hDR5-05-E430G作为单一试剂以及作为组合与没有E430G突变的亲本抗体相比的体内效力。(A)如以时间显示用所示抗体(0.5mg/kg)治疗的小鼠中的肿瘤大小(平均值& SEM)。(B)肿瘤进展的Kaplan-Meier图，其中截止值设定在肿瘤体积>500mm3。
发明详述
在描述本发明的实施方案时，为了清楚起见将采用特定术语。然而，本发明不意欲限于如此选择的特定术语，并且应该理解，每个特定术语包括以类似方式操作以实现类似目的的所有技术等同物。
如本文所述，令人惊讶地发现，与在上面提及的位置之一中没有所述突变的抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR或抗NGFR抗体相比，结合死亡受体诸如FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR或NGFR且在对应于根据EU编号的人IgG1中的位置E430、E345或S440的Fc区中的氨基酸处包含突变的抗体被发现在诱导表达FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR或NGFR的癌细胞中的凋亡方面是优异的。此外，包含本发明的两种或更多种抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR和抗NGFR抗体(其结合FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR或NGFR上的不同表位)的组合物被发现优于包含没有所述突变的相同抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR或抗NGFR抗体的组合物。也就是说，与包含两种相同的在Fc区中没有所述突变的抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR或抗NGFR抗体的组合物相比，具有两种或更多种本发明的抗体的组合物在诱导表达FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR或NGFR的癌细胞的凋亡和/或抑制其细胞生长方面是优异的。应理解，在本发明的上下文中，相同的抗体是具有相同抗原结合区的抗体。因此，相同的抗体具有与本发明的抗体相同的氨基酸序列，但在Fc区中不具有所述突变。通过在Fc区中引入特定突变，可以增强细胞表面上结合靶标后的寡聚化，诸如六聚化，而抗体分子在溶液保持为单体，WO2013/004842、WO2014/108198。
定义
如本文所用的术语“免疫球蛋白”，意欲是指一类结构上相关的糖蛋白，其由两对多肽链组成：一对轻(L)低分子量链和一对重(H)链，全部四条链均可能通过二硫键互相连接。免疫球蛋白的结构已经得到充分表征。参见例如Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul,W.,编, 第2版 Raven Press, N.Y. (1989))。简言之，每条重链通常由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区构成。IgG抗体的重链恒定区通常由三个结构域CH1、CH2和CH3构成。所述重链在所谓“铰链区”中经由二硫键互相连接。各轻链通常由以下构成：轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区。所述轻链恒定区通常由一个结构域CL构成。VH和VL区可被进一步细分为高变化性的区域(或高变区，其可在序列和/或结构上限定的环形式上高度可变)，也被称为互补决定区(CDR)，散布在被称为框架区(FR)的更保守的区域中。每个VH和VL均通常由三个CDR和四个FR构成，从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4(还参见Chothia和Lesk J. Mol. Biol. 196, 901 917 (1987))。除非另有说明或与上下文矛盾，否则本发明中对氨基酸位置的提及是根据EU编号(Edelman等人, Proc Natl Acad Sci U S A. 1969 May;63(1):78-85; Kabat等人, Sequences ofProteins of Immunological Interest, 第五版. 1991 NIH Publication No. 91-3242)。
如本文所用的术语“铰链区”，意欲是指免疫球蛋白重链的铰链区。因此，例如，人IgG1抗体的铰链区对应于根据EU编号的氨基酸216-230。
如本文所用的术语“CH2区”或“CH2结构域”，意欲是指免疫球蛋白重链的CH2区。因此，例如，人IgG1抗体的CH2区对应于根据EU编号的氨基酸231-340。然而，所述CH2区也可以是如本文所述的任何其他同种型或同种异型。
如本文所用的术语“CH3区”或“CH3结构域”，意欲是指免疫球蛋白重链的CH3区。因此，例如，人IgG1抗体的CH3区对应于根据EU编号的氨基酸341-447。然而，所述CH3区也可以是如本文所述的任何其他同种型或同种异型。
本文可互换使用的术语“片段可结晶区”、“Fc区”、“Fc片段”或“Fc结构域”是指包含从氨基末端至羧基末端排列的至少一个铰链区、CH2结构域和CH3结构域的抗体区。例如，可以通过用木瓜蛋白酶消化IgG1抗体来生成IgG1抗体的Fc区。抗体的Fc区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(诸如效应子细胞)和补体系统的组分诸如C1q(其为补体活化的经典途径中的第一组分)。
在本发明的上下文中，术语“Fab片段”是指免疫球蛋白分子的片段，其包含免疫球蛋白的重链和轻链的可变区以及轻链的恒定区和重链的CH1区。“CH1区域”是指例如根据EU编号对应于氨基酸118-215的人IgG1抗体的区域。因此，Fab片段包含免疫球蛋白的结合区。
如本文所用的术语“抗体”(Ab)是指免疫球蛋白分子，免疫球蛋白分子的片段，或其任一者的衍生物。本发明的抗体包含免疫球蛋白的Fc区和抗原结合区。Fc区通常含有两个CH2-CH3区和连接区，例如铰链区。免疫球蛋白分子的重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。除非另外指明或与上下文相矛盾，否则如本文所用的术语“抗体”还指多克隆抗体、寡克隆抗体、单克隆抗体(诸如人单克隆抗体)、抗体混合物、重组多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。所生成的抗体可能具有任何类别或同种型。
如本文所用的术语“人抗体”，是指具有源自人类种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可包括不是由人类种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，由体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变所引入的突变、插入或缺失)。然而，如本文所用的术语“人抗体”，不意欲包括这样的抗体，其中源自另一物种(诸如小鼠)种系的CDR序列已经被移植到人框架序列上。
如本文所用的术语“嵌合抗体”是指其中两种链类型由于抗体工程改造而嵌合的抗体。嵌合链是含有与人来源的恒定区连接的外源可变结构域(源自非人物种，或合成的或从包括人的任何物种工程改造的)的链。
如本文所用的术语“人源化抗体”是指其中两种链类型由于抗体工程改造而人源化的抗体。人源化链通常是其中可变结构域的互补决定区(CDR)是外来的(源自除了人以外的物种，或合成的)、而链的剩余部分是人来源的链。人源化评价基于所得氨基酸序列，而不基于方法学本身，这允许使用除了移植以外的方案。
如本文所用的术语“同种型”是指由重链恒定区基因编码的免疫球蛋白类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA1、IgA2、IgE或IgM)。为了产生规范抗体，每种重链同种型应与κ(λ)或λ(λ)轻链组合。
如本文所用的术语“同种异型”是指相同物种中的一种同种型内的氨基酸变异。抗体同种型的主要同种异型在种族个体之间不同。如图1所说明，重链的IgG1同种型内的已知同种异型变异由抗体框架中的4个氨基酸取代导致。在一个实施方案中，本发明的抗体是如SEQ ID NO 1中所定义的IgG1m(f)同种异型的。在本发明的一个实施方案中，所述抗体具有如SEQ ID NO 2中所定义的IgG1m(z)同种异型，如SEQ ID NO 3中所定义的IgG1m(a)同种异型，如SEQ ID NO 4中所定义的IgG1m(x)同种异型或任何同种异型组合，诸如IgG1m(z,a)、IgG1m(z,a,x)、IgG1m(f,a)(de lange Exp Clin Immunogenet. 1989;6(1):7-17)。
如本文所用的术语“单克隆抗体”、“单克隆Ab”、“单克隆抗体组合物”、“mAb”等，是指具有单分子组成的Ab分子的制备物。单克隆抗体组合物针对特定表位展现单一结合特异性和亲和力。因此，术语“人单克隆抗体”是指展现单一结合特异性的Abs，其具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。人mAbs可由杂交瘤产生，所述杂交瘤包含获得自转基因或转染色体的非-人动物(诸如转基因小鼠)的B细胞，其基因组包含人重链转基因库和人轻链转基因库，其经重排以产生功能性人抗体并被融合至永生化细胞。或者，人mAb可以重组生成。
如本文所用的术语“抗体模拟物”是指与抗体一样可以特异性结合抗原、但与抗体结构不相关的化合物。它们通常是人工肽、蛋白、核酸或小分子。
术语“双特异性抗体”是指对至少两种不同的(通常不重叠的)表位具有特异性的抗体。此类表位可以是在相同或不同靶标上。包含Fc区的不同类别的双特异性抗体的实例包括但不限于：不对称双特异性分子，例如具有互补CH3结构域的IgG样分子和对称双特异性分子，例如重组IgG样双重靶向分子，其中分子的每个抗原结合区结合至少两个不同的表位。
双特异性分子的实例包括但不限于Triomab® (Trion Pharma/FreseniusBiotech, WO/2002/020039)、Knobs-into-Holes (Genentech，WO9850431)、CrossMAbs(Roche，WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253)、静电匹配的Fc-异源二聚分子(Amgen，EP1870459和WO2009089004；Chugai，US201000155133；Oncomed，WO2010129304)、LUZ-Y (Genentech)、DIG-体、PIG-体和TIG-体(Pharmabcine)、链交换工程改造的结构域体(SEED体) (EMD Serono，WO2007110205)、双特异性IgG1和IgG2 (Pfizer/Rinat，WO11143545)、不对称支架(Zymeworks/Merck，WO2012058768)、mAb-Fv (Xencor，WO2011028952)、XmAb (Xencor)、二价双特异性抗体(Roche，WO2009/080254)、双特异性IgG(Eli Lilly)、DuoBody®分子(Genmab A/S，WO 2011/131746)、DuetMab (Medimmune，US2014/0348839)、Biclonics (Merus，WO 2013/157953)、NovImmune (κλ体，WO 2012/023053)、FcΔAdp (Regeneron，WO 2010/151792)、(DT)-Ig (GSK/Domantis)、二合一抗体或双重作用Fabs (Genentech，Adimab)、mAb2 (F-Star，WO2008003116)、Zybodies™(Zyngenia)、CovX-体(CovX/Pfizer)、FynomAbs (Covagen/Janssen Cilag)、DutaMab(Dutalys/Roche)、iMab (MedImmune)、双重可变结构域(DVD)-IgTM (Abbott，US 7,612,18)、双重结构域双头抗体(Unilever；Sanofi Aventis，WO20100226923)、Ts2Ab(MedImmune/AZ)、BsAb (Zymogenetics)、HERCULES (Biogen Idec，US007951918)、scFv-融合体(Genentech/Roche、Novartis、Immunomedics、Changzhou Adam Biotech Inc、CN102250246)、TvAb (Roche，WO2012025525、WO2012025530)、ScFv/Fc融合体、SCORPION(Emergent BioSolutions/Trubion、Zymogenetics/BMS)、Interceptor (Emergent)、双重亲和力重新靶向技术(Fc-DARTTM) (MacroGenics，WO2008/157379、WO2010/080538)、 BEAT(Glenmark)、二-双体(Imclone/Eli Lilly)和化学交联的mAbs (Karmanos CancerCenter)以及共价融合的mAbs (AIMM therapeutics)。
术语“全长抗体”，当用于本文中时，是指这样的抗体(例如，亲本或变体抗体)，其含有对应于通常存在于该类别或同种型的野生型抗体中的那些的所有重链和轻链恒定结构域和可变结构域。
如本文所用的术语“寡聚体”是指与至少原则上由无限数量的单体组成的聚合物相比，由多于一个、但有限数量的单体单元(例如抗体)组成的分子。示例性寡聚体是二聚体、三聚体、四聚体、五聚体和六聚体。希腊语前缀通常用于表示寡聚体中单体单元的数目，例如由四个单元和六个单元构成的六聚体。同样，如本文所用的术语“寡聚化”意欲表示将分子转化为有限聚合度的过程。在这里，观察到，根据本发明的抗体和/或包含靶标结合区的其他二聚体蛋白可以例如在细胞表面处在靶标结合后经由Fc-区的非共价缔合形成寡聚体，诸如六聚体。
如本文所用的术语“抗原-结合区”、“抗原结合区”、“结合区”或抗原结合结构域，是指能够结合抗原的抗体的区。该结合区通常由抗体的VH和VL结构域定义，所述抗体的VH和VL结构域可被进一步细分为高变化性的区域(或高变区，其可在序列和/或结构上限定的环形式上高度可变)，也被称为互补决定区(CDR)，散布在被称为框架区(FR)的更保守的区域中。抗原可以是任何分子，诸如存在于例如细胞、细菌或病毒粒子上或溶液中的多肽。除非与上下文矛盾，否则术语“抗原”和“靶标”在本发明的上下文中可互换使用。
如本文所用的术语“靶标”是指抗体的抗原结合区结合的分子。靶标包括产生的抗体针对的任何抗原。术语“抗原”和“靶标”关于抗体可互换使用并且关于本发明的任何方面或实施方案构成相同的含义和目的。
术语“表位”意指能够特异性结合抗体的蛋白决定簇。表位通常由构建块(诸如氨基酸、糖基侧链或其组合)的表面群组组成，并通常具有特定的三维结构特性以及特定的电荷特性。构象和非-构象表位的区别在于：在变性溶剂存在的情况下，与前者而非后者的结合损失。表位可包含直接参与结合的氨基酸残基和不直接参与结合的其他氨基酸残基，诸如被特定抗原结合肽有效阻断的氨基酸残基(换言之，该氨基酸残基位于所述特定抗原结合肽的足迹内)。
如本文所用的术语“结合”，是指抗体与预定的抗原或靶标结合，通常具有对应于如下KD的结合亲和力：约10-6 M或更低，例如10-7 M或更低，诸如约10-8 M或更低，诸如约10-9M或更低，约10-10 M或更低，或约10-11 M或甚至更低(当通过例如表面等离子体共振(SPR)技术在BIAcore 3000仪器中使用所述抗原作为配体而所述抗体作为分析物测定时或反之亦然)，并且相比其结合不同于所述预定的抗原或紧密相关的抗原的非特异性抗原(例如，BSA、酪蛋白)的亲和力，其结合所述预定的抗原的亲和力所对应的KD低至少十倍，诸如低至少100倍，例如低至少1,000倍，诸如低至少10,000倍，例如低至少100,000倍。亲和力较低的量取决于抗体的KD，使得当抗体的KD极低时(即，所述抗体高度特异)，则针对抗原的亲和力低于针对非特异性抗原的亲和力的程度可以是至少10,000倍。如本文所用的术语“KD”(M)，是指具体抗体-抗原相互作用的解离平衡常数, 并且通过kd除以ka获得。
如本文所用的术语“kd”(秒-1)，是指具体抗体-抗原相互作用的解离速率常数。所述值也被称为koff值或解离速率。
如本文所用的术语“ka”(M-1 x 秒-1)，是指具体抗体-抗原相互作用的结合速率常数。所述值也被称为kon值或结合速率。
如本文所用的术语“KA”(M-1)，是指具体抗体-抗原相互作用的结合平衡常数，并且通过ka除以kd获得。
如本文所用的术语“亲和力”是一种分子(例如，抗体)在单一位点处与另一种分子(例如，靶标或抗原)的结合、诸如抗体的单个抗原结合位点与抗原的单价结合的强度。
如本文所用的术语“亲和力”是指两个结构之间、诸如同时与靶标相互作用的抗体的多个抗原结合位点之间的多个结合位点的组合强度。当存在多于一种结合相互作用时，两个结构仅当所有结合位点解离时才解离，因此解离速率将比单个结合位点更慢，由此提供与单个结合位点的结合强度(亲和力)相比更大的有效的总结合强度(亲合力)。
如本文所用的术语“六聚化增强突变”是指对应于根据EU编号的人IgG1中的E430、E345或S440的氨基酸位置的突变。六聚化增强突变强化了与细胞表面靶标结合的相邻IgG抗体之间的Fc-Fc相互作用，导致靶标结合的抗体的六聚体形成增强，而抗体分子在溶液中保持为单体，如WO2013/004842; WO2014/108198中所述。
如本文所用的术语“排斥突变”或“自我排斥突变”或“六聚化抑制突变”是指人IgG1的氨基酸位置的突变，其可以导致Fc-Fc界面处的氨基酸之间的电荷排斥，导致两个相邻的含Fc区域的多肽之间的Fc-Fc相互作用减弱，因此抑制六聚化。人IgG1中的这种排斥突变的实例是K439E和S440K。可以通过在与携带第一突变的位置相互作用的氨基酸位置中引入第二突变(互补突变)来中和在排斥突变的位置处的两个相邻含Fc区域的多肽之间的Fc-Fc相互作用中的排斥。该第二突变可以存在于相同的抗体中或第二抗体中。第一和第二突变的组合导致中和Fc-Fc相互作用的排斥和恢复并因此导致六聚化。此类第一和第二突变的实例是K439E(排斥突变)和S440K(通过K439E中和排斥)，且反之亦然S440K(排斥突变)和K439E(通过S440K中和排斥)。
如本文所用的术语“互补突变”是指含Fc区的多肽中的氨基酸位置的突变，其涉及相邻的含Fc区的多肽中的第一突变，其优选与含有互补突变的含Fc区的多肽相互作用，所述互补突变由于两个相邻的含Fc区的多肽中的两个突变的组合而导致。互补突变和相关的第一突变可以存在于同一抗体(分子内)或第二抗体(分子间)中。分子内互补突变的实例是根据WO 2011/131746的介导双特异性抗体中的优先异源二聚化的组合K409R和F405L。导致排斥的中和和两个相邻含Fc区的多肽之间的Fc-Fc相互作用的恢复且因此导致六聚化的K439E和S440K突变的组合是可以分子间和分子内应用的互补突变的实例。
如本文所用的术语“凋亡”是指可以发生在细胞中的程序性细胞死亡(PCD)的过程。生物化学事件导致特征性细胞改变(形态学)和死亡。这些改变包括起泡、细胞收缩、磷脂酰丝氨酸暴露、线粒体功能丧失、核片段化、染色质凝聚、胱天蛋白酶活化和染色体DNA片段化。
如本文所用的术语“程序性细胞死亡”或“PCD”是指由细胞内信号传导介导的任何形式的细胞死亡，例如，凋亡、自噬或坏死性凋亡。
如本文所用的术语“膜联蛋白V”是指结合细胞表面上的磷脂酰丝氨酸(PS)的膜联蛋白组的蛋白。
如本文所用的术语“胱天蛋白酶活化”是指通过起始子胱天蛋白酶切割效应子胱天蛋白酶的无活性前体形式，导致其转化为效应子胱天蛋白酶，其进而切割细胞内的蛋白底物以触发凋亡。
如本文所用的术语“胱天蛋白酶依赖性程序性细胞死亡”是指由胱天蛋白酶介导的任何形式的程序性细胞死亡。在一个具体实施方案中，可以通过比较在泛-胱天蛋白酶(pan-caspase)抑制剂Z-Val-Ala-DL-Asp-氟甲基酮(Z-VAD-FMK)存在和不存在情况下的细胞培养物的活力测定通过一种或多种激动性抗DR5抗体的胱天蛋白酶依赖性程序性细胞死亡。可以将泛-胱天蛋白酶抑制剂Z-VAD-FMK (5μM终浓度)添加至96孔平底板中的贴壁细胞中并在37℃下孵育1小时。接下来，可以添加抗体浓度稀释系列(例如从例如20,000 ng/mL开始至0.05 ng/mL最终浓度，5倍稀释)，并在37℃下孵育3天。可以使用用于该目的的特殊试剂盒、诸如Promega (目录号G7571)的CellTiter-Glo发光细胞活力测定来定量细胞活力。
如本文所用的术语“细胞活力”是指代谢活性细胞的存在。在一个具体实施方案中，可以通过定量细胞中存在的ATP来定量与一种或多种激动性抗死亡受体抗体孵育后的细胞活力。可以将抗体浓度稀释系列(例如从例如20,000 ng/mL开始至0.05 ng/mL最终浓度，5倍稀释)添加至96孔平底板中的细胞中，培养基可以用作阴性对照，并且5μM星形孢菌素可用作用于诱导细胞死亡的阳性对照。孵育3天之后，可以使用用于该目的的特殊试剂盒、诸如Promega (目录号G7571)的CellTiter-Glo发光细胞活力测定来定量细胞活力。可以使用下式计算活细胞的百分比：%活细胞= [(抗体样品的发光 - 星形孢菌素样品的发光)/(无抗体样品的发光 - 星形孢菌素样品的发光)] *100。
如本文所用的术语“死亡受体”是指包含细胞内死亡结构域(DD)的肿瘤坏死因子受体超家族(TNFR-SF)的成员。
如本文所用的细胞内死亡结构域是指包含死亡结构域的TNFRSF的八个成员的细胞内部分中的死亡结构域。死亡结构域(DD)是属于死亡结构域超家族的众所周知蛋白相互作用模块(Park Apoptosis. 2011 Mar;16(3):209-20)。
如本文所用的术语DR1是指死亡受体1，也称为“TNFR1”、CD120a、p55和肿瘤坏死因子受体超家族成员1A (TNFRSF1A)，其为具有四个细胞外富含半胱氨酸的结构域(CRD's)、跨膜结构域(TM)和含有死亡结构域(DD)的胞质结构域的单程I型膜蛋白(Schall等人,Cell. 1990 Apr 20;61(2):361-70)。TNFR1的天然配体是肿瘤坏死因子α(TNF-α)和淋巴毒素-α(LT-α)。在人类中，DR1蛋白由编码氨基酸序列UniprotKB/Swissprot P19438的核酸序列编码。
如本文所用的术语“DR2”是指死亡受体2，也称为“FAS”、CD95、APO-1和肿瘤坏死因子受体超家族成员6(TNFRSF6)，其为具有三个细胞外富含半胱氨酸的结构域(CRD's)、跨膜结构域(TM)和含有死亡结构域(DD)的胞质结构域的单程I型膜蛋白(Lichter等人,Genomics. 1992 Sep;14(1):179-80; Inazawa等人, Genomics. 1992 Nov;14(3):821-2)。FAS的天然配体是FASL (CD95L)。在人类中，DR2蛋白由编码氨基酸序列UniprotKB/Swissprot P25445的核酸序列编码。
如本文所用的术语“DR3”是指死亡受体3，也称为APO3、凋亡诱导受体(AIR)、TRAMP、淋巴细胞相关的死亡受体(LARD)、APO-3和肿瘤坏死因子受体超家族成员25(TNFRSF25)，其为具有四个细胞外富含半胱氨酸的结构域(CRDs)、跨膜结构域(TM)和含有死亡结构域(DD)的胞质结构域的单程I型膜蛋白(Bodmer等人, Immunity. 1997 Jan;6(1):79-88)。DR3的天然配体是TWEAK。在人类中，DR3蛋白由编码氨基酸序列UniprotKB/Swissprot Q93038的核酸序列编码。
如本文所用的术语“DR4”是指死亡受体4，也称为CD261、TNF相关凋亡诱导配体受体1(TRAILR1)、APO-2和肿瘤坏死因子受体超家族成员10A(TNFRSF10A)，其为具有三个细胞外富含半胱氨酸的结构域(CRD's)、跨膜结构域(TM)和含有死亡结构域(DD)的胞质结构域的单程I型膜蛋白(Pan等人, Science. 1997 Apr 4;276(5309):111-3)。DR4的天然配体是TRAIL。在人类中，DR4蛋白由编码氨基酸序列UniprotKB/Swissprot O00220的核酸序列编码。
如本文所用的术语“DR5”是指死亡受体5，也称为CD262和TNF相关凋亡诱导配体受体2(TRAILR2)和肿瘤坏死因子受体超家族成员10B TNFRSF10B，其为具有三个细胞外富含半胱氨酸的结构域(CRD's)、跨膜结构域(TM)和含有死亡结构域(DD)的胞质结构域的单程I型膜蛋白(Walczak等人, EMBO J. 1997 Sep 1;16(17):5386-97)。DR5的天然配体是TRAIL。在人类中，DR5蛋白由编码氨基酸序列UniprotKB/Swissprot O14763)的核酸序列编码。
如本文所用的术语“DR6”是指死亡受体6，也称为CD358和肿瘤坏死因子受体超家族成员21(TNFRSF21)，其为具有四个细胞外富含半胱氨酸的结构域(CRD's)、跨膜结构域(TM)和含有死亡结构域(DD)的胞质结构域的单程I型膜蛋白(Pan等人, FEBS Lett. 1998Jul 24;431(3):351-6)。DR6通过过表达活化。DR6的天然配体是α-淀粉样前体蛋白(APP)。在人类中，DR6蛋白由编码氨基酸序列UniprotKB/Swissprot O75509的核酸序列编码。
如本文所用的术语“EDAR”是指外胚层发育异常蛋白-A受体，也称为外胚层发育异常受体、EDA-A1受体、Downless同系物、无汗性外胚层发育异常蛋白受体1和肿瘤坏死因子受体超家族成员EDAR，其为具有三个细胞外富含半胱氨酸的结构域(CRD's)、跨膜结构域(TM)和含有死亡结构域(DD)的胞质结构域的单程I型膜蛋白(Kumar等人, J Biol Chem.2001 Jan 26;276(4):2668-77)。EDAR的天然配体是外胚层发育异常蛋白A。在人类中，EDAR蛋白由编码氨基酸序列UniprotKB/Swissprot Q9UNE0的核酸序列编码。
如本文所用的“NGFR”是指神经生长因子受体，也称为低亲和力神经生长因子受体(LNGFR)、p75NTR、CD271和肿瘤坏死因子受体超家族成员16(TNFRSF16)，其为具有四个细胞外富含半胱氨酸的结构域(CRD's)、富含丝氨酸/苏氨酸的区域、跨膜结构域(TM)和含有死亡结构域(DD)的胞质结构域的单程I型膜蛋白(Johnson等人, Cell. 1986 Nov 21;47(4):545-54)。NGFR的天然配体是神经生长因子(NGF)，其结合NGFR中的富含丝氨酸/苏氨酸的结构域。在人类中，NGFR蛋白由编码氨基酸序列UniprotKB/Swissprot P08138的核酸序列编码。
本文可互换使用的术语“结合死亡受体的抗体”、“抗死亡受体抗体”、“死亡受体结合抗体”、“死亡受体特异性抗体”、“死亡受体抗体”是指结合死亡受体诸如FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR或NGFR的细胞外部分上的表位的任何抗体。
本文可互换使用的术语“结合FAS的抗体”、“抗FAS抗体”、“FAS-结合抗体”、“FAS-特异性抗体”、“FAS抗体”是指结合细胞外FAS上的表位的任何抗体。
本文可互换使用的术语“结合DR4的抗体”、“抗DR4抗体”、“DR4-结合抗体”、“DR4-特异性抗体”、“DR4抗体”是指结合DR4的细胞外部分上的表位的任何抗体。
本文可互换使用的术语“结合DR5的抗体”、“抗DR5抗体”、“DR5-结合抗体”、“DR5-特异性抗体”、“DR5抗体”是指结合DR5的细胞外部分上的表位的任何抗体。
本文可互换使用的术语“结合TNFR1的抗体”、“抗TNFR1抗体”、“TNFR1-结合抗体”、“TNFR1-特异性抗体”、“TNFR1抗体”是指结合TNFR1的细胞外部分上的表位的任何抗体。
本文可互换使用的术语“结合DR6的抗体”、“抗DR6抗体”、“DR6-结合抗体”、“DR6-特异性抗体”、“DR6抗体”是指结合DR6的细胞外部分上的表位的任何抗体。
本文可互换使用的术语“结合DR3的抗体”、“抗DR3抗体”、“DR3-结合抗体”、“DR3-特异性抗体”、“DR3抗体”是指结合DR3的细胞外部分上的表位的任何抗体。
本文可互换使用的术语“结合EDAR的抗体”、“抗EDAR抗体”、“EDAR-结合抗体”、“EDAR-特异性抗体”、“EDAR抗体”是指结合EDAR的细胞外部分上的表位的任何抗体。
本文可互换使用的术语“结合NGFR的抗体”、“抗NGFR抗体”、“NGFR-结合抗体”、“NGFR-特异性抗体”、“NGFR抗体”是指结合NGFR的细胞外部分上的表位的任何抗体。
如本文所用的术语“激动剂”是指当与死亡受体结合时触发细胞中的应答的分子，诸如抗死亡受体抗体，其中所述应答可以是死亡受体的活化。抗死亡受体抗体是激动性的应理解为所述抗体由于抗死亡受体结合所述死亡受体而刺激、活化或聚集死亡受体。也就是说，与死亡受体结合的本发明的激动性抗死亡受体抗体导致死亡受体刺激、聚集或活化下游细胞内信号传导途径，作为与死亡受体结合的天然配体。
本发明的“变体”或“抗体变体”是与“亲本”抗体相比包含一个或多个突变的抗体分子。示例性亲本抗体形式包括但不限于野生型抗体、全长抗体或含Fc的抗体片段、双特异性抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体或其任何组合。
示例性突变包括亲本氨基酸序列中氨基酸的氨基酸缺失、插入和取代。氨基酸取代可以将天然氨基酸交换为另一种天然存在的氨基酸或非天然存在的氨基酸衍生物。氨基酸取代可以是保守的或非保守的。在本发明的上下文中，保守取代可以通过在以下三个表中的一个或多个中反映的氨基酸类别内的取代来定义：
保守取代的氨基酸残基类别
酸性残基 Asp (D)和Glu (E)
碱性残基 Lys (K)、Arg (R)和His (H)
亲水性不带电残基 Ser (S)、Thr (T)、Asn (N)和Gln (Q)
脂族不带电残基 Gly (G)、Ala (A)、Val (V)、Leu (L)和Ile (I)
非极性不带电残基 Cys (C)、Met (M)和Pro (P)
芳族残基 Phe (F)、Tyr (Y)和Trp (W)
可替代的保守氨基酸残基取代类别
1 A S T
2 D E
3 N Q
4 R K
5 I L M
6 F Y W
可替代的物理和功能类氨基酸残基
在本发明的上下文中，变体中的取代被表示为：
原始氨基酸–位置–取代氨基酸；
使用三字母代码或单字母代码，包括代码Xaa和X以指示氨基酸残基。因此，符号“E345R”或“Glu345Arg”意指该变体包含在对应于亲本抗体中的位置345的氨基酸的变体氨基酸位置中用精氨酸取代谷氨酸。
在位置本身不存在于抗体中、但该变体包含氨基酸的插入的情况下，例如：使用位置 - 取代的氨基酸；符号，例如“448E”。这种符号与一系列同源多肽或抗体中的修饰特别相关。类似地，当取代氨基酸残基的身份不重要时：原始氨基酸 - 位置；或“E345”。
对于其中原始氨基酸和/或取代的氨基酸可以包含多于一个(但不是全部)氨基酸的修饰，将在位置345的谷氨酸取代为精氨酸、赖氨酸或色氨酸：“Glu345Arg、Lys、Trp”或“E345R、K、W”或“E345R/K/W”或“E345至R、K或W”可以在本发明的上下文中互换使用。此外，术语“取代”包括取代成其他十九种天然氨基酸中的任一种，或取代成其他氨基酸诸如非天然氨基酸。例如，位置345的氨基酸E的取代包括下列取代中的每一者：345A、345C、345D、345G、345H、345F、345I、345K、345L、345M、345N、345Q、345R、345S、345T、345V、345W和345Y。顺便一提，这等同于标号345X，其中X代表任何氨基酸。这些取代还可标记为E345A、E345C等，或E345A、C等，或E345A/C/等。这同样适用于本文提及的每个和所有位置，以在本文中特别包括此类取代中的任一者。
出于本发明的目的，两个氨基酸序列之间的序列同一性使用如在EMBOSS包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice等人, 2000,Trends Genet.16:276-277)、优选版本5.0.0或更晚版本的Needle程序中所实施的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453)进行测定。使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5和EBLOSUM62 (BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。Needle标记为“最长同一性”的输出(使用-nobrief选项获得)用作百分比同一性，并且如下计算：
(相同的残基x 100)/(比对的长度 – 比对中的空位的总数)。
出于本发明的目的，两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同一性使用如在EMBOSS包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice等人, 2000,同上)、优选版本5.0.0或更晚版本的Needle程序中所实施的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch, 1970, 同上)进行测定。使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5和EDNAFULL (NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。Needle标记为“最长同一性”的输出(使用-nobrief选项获得)用作百分比同一性，并且如下计算：
(相同的脱氧核糖核苷酸 x 100)/(比对的长度 – 比对中的空位的总数)。
CDR变体的序列与亲本抗体序列的CDR的序列的区别可在于，大部分保守、物理或功能性氨基酸取代，总共跨越抗体结合区的六个CDR序列的最多达5个选自保守、物理或功能性氨基酸的突变或取代，诸如总共跨越抗体结合区的六个CDR序列的最多达4个选自保守、物理或功能性氨基酸的突变或取代，诸如最多达3个选自保守、物理或功能性氨基酸的突变或取代，诸如最多达2个选自保守、物理或功能性氨基酸的突变或取代，诸如最多达1个选自保守、物理或功能性氨基酸的突变或取代。所述保守、物理或功能性氨基酸选自20个发现的天然氨基酸，即，Arg (R)、His (H)、Lys (K)、Asp (D)、Glu (E)、Ser (S)、Thr (T)、Asn(N)、Gln (Q)、Cys (C)、Gly (G)、Pro (P)、Ala (A)、Ile (I)、Leu (L)、Met (M)、Phe (F)、Trp (W)、Tyr (Y)和Val (V)。
CDR变体的序列与亲本抗体序列的CDR的序列的区别可在于，大部分保守、物理或功能性氨基酸取代；变体中的例如至少约75％、约80％或更多、约85％或更多、约90％或更多(例如约75-95％、诸如约92％、93％或94％)的取代是选自保守、物理或功能性氨基酸残基替换的突变或取代。
所述保守、物理或功能性氨基酸选自20个发现的天然氨基酸，即，Arg (R)、His(H)、Lys (K)、Asp (D)、Glu (E)、Ser (S)、Thr (T)、Asn (N)、Gln (Q)、Cys (C)、Gly (G)、Pro (P)、Ala (A)、Ile (I)、Leu (L)、Met (M)、Phe (F)、Trp (W)、Tyr (Y)和Val (V)。
一个序列中的氨基酸或区段“对应于”另一序列中的氨基酸或区段，是指使用标准序列比对程序(诸如ALIGN、ClustalW之类)通常在默认设置下其与另一氨基酸或区段对齐。因此，可以使用标准序列比对程序来鉴定例如免疫球蛋白序列中的哪一氨基酸对应于例如人IgG1中的特定氨基酸。此外，可以使用标准序列比对程序来鉴定序列同一性，例如与SEQID NO:1至少80％或85％、90％或至少95％的序列同一性。例如，可以使用图1中所示的序列比对来鉴定对应于IgG1 Fc序列的另一种同种异型中的特定氨基酸的一种IgG1同种异型的Fc区中的任何氨基酸。
如本文所用的术语“载体”是指能够诱导连接至载体中的核酸片段的转录的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其为环形双链DNA环的形式。另一种类型的载体是病毒载体，其中核酸区段可以连接至病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(诸如非附加型哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞后整合至宿主细胞的基因组中，并因此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与它们可操作连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。通常，用于重组DNA技术中的表达载体通常呈质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明意欲包括此类其他形式的表达载体，诸如发挥等同功能的病毒载体(诸如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。
如本文所用的术语“重组宿主细胞”(或简称“宿主细胞”)，意欲是指其中已经引入表达载体的细胞。应该理解，此类术语意欲不仅是指具体主题细胞，还是指此类细胞的子代。因为某些修饰可能由于突变或环境影响而出现在后续世代中，所以此类子代可能事实上与亲本细胞不同，但仍然被包括在如本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。重组宿主细胞包括例如：转染瘤，诸如CHO-S细胞、HEK-293F细胞、Expi293F细胞、PER.C6、NS0细胞；和淋巴细胞；以及原核细胞诸如大肠杆菌和其他真核宿主诸如植物细胞和真菌以及原核细胞诸如大肠杆菌。
本发明的具体实施方案
本发明至少部分基于以下发现：靶向包含细胞内死亡结构域的TNFR-SF的成员的抗体、诸如抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR或抗NGFR抗体在表达FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR或NGFR的靶细胞中诱导细胞死亡的的能力可以通过在对应于根据EU编号的人IgG1中的氨基酸位置E430、E345或S440的Fc区中的氨基酸处引入突变来大大增强。本发明进一步基于以下令人惊讶的发现：与在Fc区中没有突变的两种抗体的组合相比，结合FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR或NGFR上的第一和第二表位且各自在Fc区中包含突变的两种抗体的组合显示靶细胞中的细胞死亡的优异诱导。
在一个方面，本发明涉及包含人免疫球蛋白IgG的Fc区和结合FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR或NGFR的抗原结合区的抗体，其中所述Fc区在对应于根据EU编号的人IgG1中的E430、E345或S440的氨基酸位置处包含突变。
对应于根据EU编号的人IgG1中的E430、E345和S440的位置位于Fc区的CH3结构域中。
通过在对应于人IgG1中的以下位置E430、E345和S440中的至少一个在Fc结构域中引入特定突变，在细胞表面上结合靶标后的寡聚化、诸如六聚化得到增强，而抗体分子在溶液中保持单体(WO2013/004842；WO2014/108198)。六聚化增强突变强化了与细胞表面靶标结合的相邻IgG抗体之间的Fc-Fc相互作用，导致靶标结合的抗体的六聚体形成增强。
在本发明的一个实施方案中，抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR和抗NGFR抗体的Fc区包含对应于人IgG1中的E430G、E430S、E430F、E430T、E345K、E345Q、E345R、E345Y、S440Y或S440W (EU编号)的突变。由此提供了允许在细胞表面上结合靶标后的抗体的六聚化增强的实施方案。
在本发明的一个实施方案中，抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR和抗NGFR抗体在对应于根据EU编号的人IgG1中的E430的氨基酸位置处包含突变，其中所述突变选自：E430G、E430S、E430F和E430T。
在本发明的一个实施方案中，抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR和抗NGFR抗体在Fc区中包含E430G突变。
在本发明的一个优选实施方案中，所述Fc区包含对应于人IgG1中的E430G或E345K(EU编号)的突变。
在本发明的一个实施方案中，抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR和抗NGFR抗体在对应于根据EU编号的人IgG1中的E345的氨基酸位置处包含突变，其中所述突变选自：E345K、E345Q、E345R和E345Y。
在本发明的一个实施方案中，抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR和抗NGFR抗体在Fc区中包含E345K突变。
在本发明的一个实施方案中，所述Fc区在对应于人IgG1中的位置S440 (EU编号)的氨基酸位置处包含突变，其中所述突变是S440Y或S440W。
在本发明的一个实施方案中，抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR和抗NGFR抗体在对应于根据EU编号的人IgG1中的S440的氨基酸位置处包含突变，其中所述突变选自：S440Y和S440W。
在本发明的一个实施方案中，所述Fc区包含对应于S440Y的突变。在本发明的一个实施方案中，所述Fc区包含对应于E430G的突变。在本发明的一个实施方案中，所述Fc区包含对应于E345K的突变。
在本发明的一个实施方案中，所述Fc区在对应于人IgG1中的E430和E345 (EU编号)的氨基酸位置处包含至少第一和第二突变。
在本发明的一个实施方案中，所述Fc区在选自以下的氨基酸位置处进一步包含第三突变：Y436和S440.由此提供了包含允许溶液中增强的Fc-Fc相互作用的第一、第二和第三突变的实施方案。
在本发明的一个实施方案中，所述抗体在对应于人IgG1中的E430、E345和S440(EU编号)的氨基酸位置处包含第一、第二和第三突变。
在本发明的一个实施方案中，所述抗体包含Fc区，其中第一、第二和第三突变在对应于人IgG1中的E430、E345和S440 (EU编号)的氨基酸位置处，其中所述突变是E430G、E345R、S440Y。
在本发明的一个实施方案中，所述抗体在对应于人IgG1中的E430、E345和Y436(EU编号)的氨基酸位置处包含第一、第二和第三突变。
在本发明的一个实施方案中，所述抗体包含Fc区，其中第一、第二和第三突变在对应于人IgG1中的E430、E345和Y436 (EU编号)的氨基酸位置处，其中所述突变是E430G、E345R、Y436I。
在本发明的一个实施方案中，所述Fc区在对应于E430和/或E345的氨基酸位置处包含突变，且其中所述Fc区在对应于S440的氨基酸位置处包含进一步突变，条件是所述突变不是S440Y或S440W。
在本发明的一个实施方案中，所述抗体在对应于人IgG1中的以下位置S440或K439(EU编号)之一的氨基酸位置处包含进一步突变。在本发明的一个实施方案中，所述Fc区在对应于S440或K439的位置处包含进一步突变，条件是如果六聚化增强突变在S440中，则进一步突变不在位置S440。在本发明的一个实施方案中，在对应于以下位置S440或K439之一的氨基酸位置处的进一步突变可以是六聚化抑制突变。
在一个实施方案中，所述Fc区在对应于人IgG1中的K439 (EU编号)的氨基酸位置处包含进一步突变，其中所述进一步突变选自：K439E和K439D。在一个实施方案中，所述进一步突变是K439E。
在一个实施方案中，所述Fc区在对应于人IgG1中的S440 (EU编号)的氨基酸位置处包含进一步突变，其中所述进一步突变选自：S440K、S440R和S440H。在一个实施方案中，所述进一步突变是S440K。
在本发明的一个实施方案中，所述Fc区包含人IgG1中的进一步六聚化抑制突变、诸如K439E或S440K (EU编号)。六聚化抑制突变诸如K439E或S440K阻止Fc-Fc与包含相同六聚化抑制突变的抗体的相互作用，但通过组合具有K439E突变的抗体和具有S440K突变的抗体，抑制作用被中和并且Fc-Fc相互作用得到恢复。
包含对应于根据本发明的E430、E345或S440的位置中的突变和对应于K439的氨基酸位置处的进一步突变(诸如K439E突变)的抗体不与包含对应于K439的氨基酸位置处的进一步突变(诸如K439E突变)的抗体形成寡聚体。然而，包含E430、E345或S440中的六聚化增强突变和K439中的进一步突变(诸如K439E)的抗体的确与包含E430或E345中的六聚化增强突变和S440中的进一步突变(诸如S440K)的抗体形成寡聚体。包含对应于根据本发明的E430或E345的位置中的突变和对应于S440的氨基酸位置处的进一步突变(诸如S440K突变)的抗体不与包含对应于S440的氨基酸位置处的进一步突变(诸如S440K突变)的抗体形成寡聚体。然而，包含E430或E345中的六聚化增强突变和S440中的进一步突变(诸如S440K)的抗体的确与包含E430或E345中的六聚化增强突变和K439中的进一步突变(诸如K439)的抗体形成寡聚体。在本发明的一个实施方案中，所述Fc区包含六聚化增强突变(诸如E430G)和六聚化抑制突变(诸如K439E)。在本发明的一个实施方案中，所述Fc区包含六聚化增强突变(诸如E345K)和六聚化抑制突变(诸如K439E)。在本发明的另一个实施方案中，所述Fc区包含六聚化增强突变(诸如E430G)和六聚化抑制突变(诸如S440K)。在本发明的一个实施方案中，所述Fc区包含六聚化增强突变(诸如E345K)和六聚化抑制突变(诸如S440K)。在本发明的一个实施方案中，所述Fc区包含六聚化增强突变(诸如S440Y)和六聚化抑制突变(诸如K439E)。因此提供了允许包含K439E突变的抗体和包含S440K突变的抗体的组合之间的排他性六聚化的实施方案。
在一个实施方案中，所述Fc区包含进一步突变，其中所述进一步突变选自：K439E和K439D。在一个实施方案中，所述进一步突变是K439E。
在一个实施方案中，所述Fc区包含进一步突变，其中所述进一步突变选自：S440K、S440R和S440H。在一个实施方案中，所述进一步突变是S440K。
人FAS分子由335个氨基酸构成，包括前1-25位置处的信号传导肽，随后为位置26-173处的细胞外结构域，位置174-190处的跨膜结构域和位置191-335处的胞质结构域。所述细胞外结构域由148氨基酸序列构成。
在一个实施方案中，包含细胞内死亡结构域的死亡受体的成员是FAS。
在本发明的一个实施方案中，抗FAS抗体包含结合FAS的细胞外结构域内的表位的抗原结合区。
在本发明的一个实施方案中，抗FAS抗体包含抗原结合区，所述抗原结合区包含可变重链(VH)区和可变轻链(VL)区，所述可变重链(VH)区和可变轻链(VL)区包含以下氨基酸序列：(VH) SEQ ID NO 15: 和(VL) SEQ ID NO:16。
在本发明的一个实施方案中，抗FAS抗体包含Fc区，所述Fc区包含对应于人IgG1中的E430G或E345K (EU编号)的突变。
在本发明的一个实施方案中，抗FAS抗体在对应于人IgG1中的E430、E345和S440(EU编号)的氨基酸位置处包含第一、第二和第三突变。
在本发明的一个实施方案中，抗FAS抗体包含Fc区，其中第一、第二和第三突变在对应于人IgG1中的E430、E345和S440 (EU编号)的氨基酸位置处，其中所述突变是E430G、E345R、S440Y。
在本发明的一个实施方案中，抗FAS抗体包含Fc区，其中第一、第二和第三突变在对应于人IgG1中的E430、E345和S440 (EU编号)的氨基酸位置处，其中所述突变是第一、第二、第三E430G、E345R、S440Y和进一步S440K突变。
在本发明的一个实施方案中，抗FAS抗体在对应于人IgG1中的E430、E345和Y436(EU编号)的氨基酸位置处包含第一、第二和第三突变。
在本发明的一个实施方案中，抗FAS抗体包含Fc区，其中第一、第二和第三突变在对应于人IgG1中的E430、E345和Y436 (EU编号)的氨基酸位置处，其中所述突变是E430G、E345R、Y436I。
在本发明的一个实施方案中，抗FAS抗体包含Fc区，其中第一、第二和第三突变在对应于人IgG1中的E430、E345和Y436 (EU编号)的氨基酸位置处，其中第一、第二、第三突变是E430G、E345R、Y436I和进一步S440K突变。
人TNFR1分子由455个氨基酸构成，包括前1-21位置处的信号传导肽，随后为位置22-211处的细胞外结构域，位置212-234处的跨膜结构域和位置235-455处的胞质结构域。所述细胞外结构域由190氨基酸序列构成。
在本发明的一个实施方案中，抗TNFR1抗体包含结合TNFR1的细胞外结构域内的表位的抗原结合区。
在本发明的一个实施方案中，抗TNFR1抗体包含Fc区，所述Fc区包含对应于人IgG1中的E430G或E345K (EU编号)的突变。
人EDAR分子由448个氨基酸构成，包括前1-26位置处的信号传导肽，随后为位置27-187处的细胞外结构域，位置188-208处的跨膜结构域和位置209-448处的胞质结构域。所述细胞外结构域由161氨基酸序列构成。
在本发明的一个实施方案中，抗EDAR抗体包含结合EDAR的细胞外结构域内的表位的抗原结合区。
在本发明的一个实施方案中，抗EDAR抗体包含Fc区，所述Fc区包含对应于人IgG1中的E430G或E345K (EU编号)的突变。
人NGFR分子由427个氨基酸构成，包括前1-28位置处的信号传导肽，随后为位置29-250处的细胞外结构域，位置251-272处的跨膜结构域和位置273-427处的胞质结构域。所述细胞外结构域由222氨基酸序列构成。
在本发明的一个实施方案中，抗NGFR抗体包含结合NGFR的细胞外结构域内的表位的抗原结合区。
在本发明的一个实施方案中，抗NGFR抗体包含Fc区，所述Fc区包含对应于人IgG1中的E430G或E345K (EU编号)的突变。
人DR3分子由417个氨基酸构成，包括前1-24位置处的信号传导肽，随后为位置25-199处的细胞外结构域，位置200-220处的跨膜结构域和位置221-417处的胞质结构域。所述细胞外结构域由175氨基酸序列构成。
在本发明的一个实施方案中，抗DR3抗体包含结合DR3的细胞外结构域内的表位的抗原结合区。
在本发明的一个实施方案中，抗DR3抗体包含Fc区，所述Fc区包含对应于人IgG1中的E430G或E345K (EU编号)的突变。
人DR4分子由468个氨基酸构成，包括前1-23位置处的信号传导肽，随后为位置24-239处的细胞外结构域，位置240-262处的跨膜结构域和位置263-468处的胞质结构域。所述细胞外结构域由216氨基酸序列构成。
在本发明的一个实施方案中，抗DR4抗体包含结合DR4的细胞外结构域内的表位的抗原结合区。
在本发明的一个实施方案中，包含细胞内死亡结构域的死亡受体的成员是DR4。
在本发明的一个实施方案中，抗DR4抗体包含抗原结合区，所述抗原结合区包含可变重链(VH)区和可变轻链(VL)区，所述可变重链(VH)区和可变轻链(VL)区包含以下氨基酸序列：(VH) SEQ ID NO 13:和(VL) SEQ ID NO:14。
在本发明的一个实施方案中，抗DR4抗体在对应于人IgG1中的E430 (EU编号)的氨基酸位置处包含突变，其中所述突变选自：E430G、E430S、E40F和E430T。在本发明的一个实施方案中，抗DR4抗体包含E430G突变。
在本发明的一个实施方案中，抗DR4抗体在对应于人IgG1中的E345 (EU编号)的氨基酸位置处包含突变，其中所述突变选自：E345K、E345Q、E345R和E345Y。在本发明的一个实施方案中，抗DR4抗体包含E345K突变。
在本发明的一个实施方案中，抗DR4抗体包含Fc区，所述Fc区包含对应于人IgG1中的E430G或E345K (EU编号)的突变。
人DR5分子由440个氨基酸构成，包括前1-55位置处的信号传导肽，随后为位置56-210处的细胞外结构域，位置211-231处的跨膜结构域和位置232-440处的胞质结构域。所述细胞外结构域由155氨基酸序列构成。DR5的短同种型从细胞外结构域缺失185-213。
在本发明的一个实施方案中，抗DR5抗体包含结合DR5的细胞外结构域内的表位的抗原结合区。
在本发明的一个实施方案中，抗DR5抗体包含抗原结合区，所述抗原结合区包含可变重链(VH)区和可变轻链(VL)区，所述可变重链(VH)区和可变轻链(VL)区包含选自以下的氨基酸序列：
a) (VH) SEQ ID NO 19: 和(VL) SEQ ID NO:23,
b) (VH) SEQ ID NO 26: 和(VL) SEQ ID NO:23,
c) (VH) SEQ ID NO 31: 和(VL) SEQ ID NO:35和
d) (VH) SEQ ID NO 40: 和(VL) SEQ ID NO:43。
在本发明的一个实施方案中，抗DR5抗体在对应于人IgG1中的E430 (EU编号)的氨基酸位置处包含突变，其中所述突变选自：E430G、E430S、E40F和E430T。在本发明的一个实施方案中，抗DR5抗体包含E430G突变。
在本发明的一个实施方案中，抗DR5抗体在对应于人IgG1中的E345 (EU编号)的氨基酸位置处包含突变，其中所述突变选自：E345K、E345Q、E345R和E345Y。在本发明的一个实施方案中，抗DR5抗体包含E345K突变。
在本发明的一个实施方案中，抗DR5抗体包含Fc区，所述Fc区包含对应于人IgG1中的E430G或E345K (EU编号)的突变。
在本发明的一个实施方案中，所述抗体包含结合与TRAIL相同的结合位点或与TRAIL的结合位点重叠的结合位点的抗原结合区。基于与DR5胞外结构域复合的TRAIL的晶体结构，TRAIL结合基序位于CRD2和CRD3中(Hymowitz等人, Mol Cell. 1999 Oct;4(4):563-71)。也就是说，在本发明的一个实施方案中，所述抗体包含结合DR5上与TRAIL相同的结合区的抗原结合区。在本发明的一个实施方案中，所述抗体包含与TRAIL竞争结合DR5的抗原结合区。在本发明的一个实施方案中，所述抗体阻断TRAIL诱导介导的杀伤，诸如TRAIL诱导的凋亡。
在本发明的另一个实施方案中，所述抗体包含结合DR5上不同于TRAIL的结合位点的表位的抗原结合区。在本发明的一个实施方案中，所述抗体包含结合DR5上与TRAIL不同的结合区的抗原结合区。在本发明的一个实施方案中，所述抗体不阻断TRAIL诱导介导的杀伤，诸如TRAIL诱导的凋亡。
人DR6分子由655个氨基酸构成，包括前1-41位置处的信号传导肽，随后为位置42-349处的细胞外结构域，位置350-370处的跨膜结构域和位置371-655处的胞质结构域。所述细胞外结构域由308氨基酸序列构成。
在本发明的一个实施方案中，抗DR6抗体包含结合DR6的细胞外结构域内的表位的抗原结合区。
在本发明的一个实施方案中，抗DR6抗体包含Fc区，所述Fc区包含对应于人IgG1中的E430G或E345K (EU编号)的突变。
在本发明的一个实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。在本发明的一个实施方案中，所述抗体是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgD或IgM同种型的。
在本发明的一个优选实施方案中，所述抗体是IgG1抗体。
在本发明的一个实施方案中，所述抗体是IgG1m(f)、IgG1m(z)、IgG1m(a)或IgG1m(x)同种异型，或任何同种异型组合，诸如IgG1m(z,a)、IgG1m(z,a,x)、IgG1m(f,a)。
在一个实施方案中，所述抗体是人抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
在本发明的一个实施方案中，选自抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR和抗NGFR的抗死亡受体抗体是激动性的。所述抗体是激动性的应理解为抗体聚集、刺激或活化其结合的死亡受体，其至少与通过死亡受体和结合死亡受体的天然配体之间的相互作用或者通过过表达死亡受体发现的效果一样好。与FAS结合的本发明的激动性抗FAS抗体活化和与FAS结合的FAS-配体相同的细胞内途径。本发明的激动性抗FAS抗体能够在表达FAS的细胞中诱导凋亡。
与DR4结合的本发明的激动性抗DR4抗体活化和与DR4结合的TRAIL相同的细胞内途径。
与DR5结合的本发明的激动性抗DR5抗体活化和与DR5结合的TRAIL相同的细胞内途径。
与TNFR1结合的本发明的激动性抗TNFR1抗体活化和与TNFR1结合的LTα或TNF相同的细胞内途径。
与DR6结合的本发明的激动性抗DR6抗体活化和DR6过表达或与DR6结合的APP相同的细胞内途径。
与DR3结合的本发明的激动性抗DR3抗体活化和与DR3结合的TWEAK相同的细胞内途径。
与EDAR结合的本发明的激动性抗EDAR抗体活化和与EDAR结合的外胚层发育异常蛋白A相同的细胞内途径。
与NGFR结合的本发明的激动性抗NGFR抗体活化和与NGFR结合的NGF相同的细胞内途径。
在本发明的一个实施方案中，抗死亡受体抗体，诸如抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR或抗NGFR抗体具有增强的激动活性。抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR或抗NGFR抗体具有增强的激动活性应理解为所述抗体能够聚集FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR或NGFR受体，或活化和与FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR或NGFR结合的天然配体相同的细胞内途径，但水平增强。也就是说，与天然配体或结合受体的没有所述突变的相同抗体相比，具有增强的激动活性的本发明的抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR或抗NGFR抗体(即在根据本发明的Fc区中具有突变)能够在表达FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR或NGFR受体的细胞或组织中诱导增加水平的凋亡或程序性细胞死亡。
因此，在本发明的上下文中应理解的是，可以通过比较根据本发明的抗体与没有所述突变的相同抗体来评估根据本发明的抗体(即在对应于人IgG1中的E430、E345或S440(EU1编号)的位置处包含氨基酸突变)的增强的激动活性。在本发明的上下文中，相同的抗体应理解为与根据本发明的抗体具有相同的氨基酸序列、但没有所述突变的抗体。
在本发明的一个实施方案中，抗死亡受体受体抗体，诸如抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR或抗NGFR抗体诱导靶细胞中的程序性细胞死亡。在本发明的一个实施方案中，抗DR5抗体诱导胱天蛋白酶依赖性细胞死亡。胱天蛋白酶依赖性细胞死亡可以通过胱天蛋白酶-3和/或胱天蛋白酶-7的活化来诱导。在本发明的一个实施方案中，所述抗体诱导凋亡。
在本发明的一个实施方案中，抗死亡受体抗体，诸如抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR或抗NGFR抗体诱导磷脂酰丝氨酸(PS)暴露，其可以通过膜联蛋白-V结合来测量。因此，膜联蛋白-V结合与程序性细胞死亡相关并且可用于测量抗死亡受体抗体，诸如抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR或抗NGFR抗体诱导导致程序性细胞死亡的细胞事件的能力。
在本发明的一个优选实施方案中，抗死亡受体抗体，诸如抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR或抗NGFR抗体诱导表达死亡受体诸如FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR或NGFR的靶细胞、诸如肿瘤细胞中的凋亡。
在本发明的一个实施方案中，抗死亡受体抗体，诸如抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR或抗NGFR抗体降低细胞活力。
在本发明的一个实施方案中，抗死亡受体抗体，诸如抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR或抗NGFR抗体诱导死亡受体、诸如FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR或NGFR的聚簇。所述抗体可以诱导聚簇且甚至增强聚簇导致和与以下靶标组之一结合的天然配体相同的细胞内信号传导途径的活化：FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR或NGFR。
在一个实施方案中，本发明的抗体或组合物在表达一种或多种死亡受体诸如FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR和/或NGFR的癌细胞或癌组织中诱导、触发、增加或增强凋亡或细胞死亡。可以通过暴露于一种或多种本发明的抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR和/或抗NGFR抗体或用一种或多种本发明的抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR和/或抗NGFR抗体处理的细胞上的磷脂酰丝氨酸暴露的增加或增强的水平来测量增加或增强的凋亡或细胞死亡。因此，在本发明的上下文中应理解的是，可以通过比较根据本发明的抗体与没有所述突变的相同抗体来评估根据本发明的抗体(即在对应于人IgG1中的E430、E345或S440 (EU编号)的位置处包含氨基酸突变)的诱导、触发、增加或增强的凋亡或细胞死亡。在本发明的上下文中，相同的抗体应理解为与根据本发明的抗体具有相同的氨基酸序列、但没有所述突变的抗体。
或者，可以通过测量已暴露于一种或多种本发明的抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR和/或抗NGFR抗体或用一种或多种本发明的抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR和/或抗NGFR抗体处理的细胞中胱天蛋白酶3或胱天蛋白酶7的活化来测量增加或增强的凋亡或细胞死亡。或者，可以通过已暴露于一种或多种本发明的抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR和/或抗NGFR抗体或用一种或多种本发明的抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR和/或抗NGFR抗体处理的细胞培养物中与未处理的细胞培养物(其中活力的损失可以被胱天蛋白酶抑制剂例如ZVAD抑制)相比活力的损失来测量增加或增强的凋亡或细胞死亡。
在本发明的一个实施方案中，抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR或抗NGFR抗体诱导表达FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR或NGFR的靶细胞上的抗体的六聚化。
双特异性抗体
在另一个方面，本发明涉及包含至少一个结合如本文所述的死亡受体、例如FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR或NGFR的抗原结合区的双特异性抗体。
在另一个方面，本发明包括包含一个或多个结合如本文所述的死亡受体、例如FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR或NGFR的抗原结合区的双特异性抗体。
在本发明的一个实施方案中，所述双特异性抗体包含结合如本文所定义的死亡受体的第一抗原结合区和第二抗原结合区。
在本发明的一个实施方案中，所述双特异性抗体包含第一和第二抗原结合区，其中所述第一抗原结合区和所述第二抗原结合区结合相同死亡受体上的不同表位。
在本发明的一个实施方案中，双特异性抗体包含第一和第二Fc区，其中所述第一和/或第二Fc区包含对应于根据本发明的人IgG1中的E430、E345或S440 (EU编号)的氨基酸位置的突变。在本发明的一个实施方案中，双特异性抗DR5抗体包含第一和第二Fc区，其中所述第一和第二Fc区包含对应于人IgG1中的E430、E345或S440 (EU编号)的氨基酸位置的突变。在本发明的一个实施方案中，所述双特异性抗体包含第一和第二Fc区，其中所述第一Fc区包含对应于人IgG1中的E430、E345或S440 (EU编号)的氨基酸位置的突变。在本发明的一个实施方案中，所述双特异性抗体包含第一和第二Fc区，其中所述第二Fc区包含对应于人IgG1中的E430、E345或S440 (EU编号)的氨基酸位置的突变。
在本发明的一个实施方案中，所述双特异性抗体包含第一和第二抗原结合区，其中结合选自以下组FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR和NGFR的死亡受体的所述第一抗原结合区不阻断结合选自以下组FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR和NGFR的死亡受体的所述第二抗原结合区的结合，其中所述第一和第二抗原结合区不结合相同的死亡受体。
在一个具体实施方案中，所述抗体可以是双特异性抗体，诸如WO 11/131746(其在此通过引用并入)中描述的异二聚蛋白。
在一个实施方案中，所述抗体是包含第一重链和第二重链的双特异性抗体，所述第一重链包含免疫球蛋白的第一Fc区和第一抗原结合区，且所述第二重链包含免疫球蛋白的第二Fc区和第二抗原结合区，其中第一和第二抗原结合区结合相同抗原或不同抗原上的不同表位。
在一个进一步实施方案中，包含第一Fc区的所述第一重链在选自对应于人IgG1重链的Fc区中的K409、T366、L368、K370、D399、F405和Y407的那些的位置处包含进一步氨基酸取代；并且其中包含第二Fc区的所述第二重链在选自对应于人IgG1重链的Fc区中的F405、T366、L368、K370、D399、Y407和K409的那些的位置处包含进一步氨基酸取代，并且其中包含第一Fc区的第一重链中的所述进一步氨基酸取代不同于包含第二Fc区的第二重链中的所述进一步氨基酸取代。
在一个进一步实施方案中，包含第一Fc区的所述第一重链在对应于人IgG1重链的Fc区中的K409的位置处包含氨基酸取代；并且包含第二Fc区的所述第二重链在对应于人IgG1重链的Fc区中的F405的位置处包含氨基酸取代。
在本发明的一个实施方案中，双特异性抗体包括引入在至少一个选自对应于人IgG1重链的Fc区中的E345、E430、S440、Q386、P247、I253、S254、Q311、D/E356、T359、E382、Y436和K447的那些的氨基酸残基中包含突变的第一和第二Fc区，条件是S440中的突变是S440Y或S440W。
在一个进一步实施方案中，第一和第二Fc区中的至少一个选自对应于人IgG1重链的Fc区中的E345、E430、S440、Q386、P247、I253、S254、Q311、D/E356、T359、E382、Y436和K447的那些的氨基酸残基处的突变(条件是S440中的突变是S440Y或S440W)可以在相同的氨基酸残基位置或不同的位置。在一个进一步实施方案中，其可以是第一和第二Fc区中相同氨基酸残基位置中的相同或不同的突变。
在另一个实施方案中，双特异性抗体包含在至少一个选自对应于人IgG1重链的Fc区中的E345、E430、S440、Q386、P247、I253、S254、Q311、D/E356、T359、E382、Y436和K447的那些的氨基酸残基中包含突变的第一或第二CH2-CH3区，条件是S440中的突变是S440Y或S440W。
在本发明的一个实施方案中，所述双特异性抗体包含第一和第二重链，其中所述第一重链包含对应于根据EU编号的人IgG1中的F405L的突变，且所述第二重链包含对应于根据EU编号的人IgG1中的K409R的突变。
在本发明的一个实施方案中，所述双特异性抗体包含在药物组合物中。
抗死亡受体抗体组合物
根据本发明的任何方面或实施方案的抗死亡受体抗体、即抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR或抗NGFR抗体、诸如单克隆抗体或双特异性抗体可以包含在组合物、诸如药物组合物、诊断组合物或任何其他组合物中。
在一个方面，本发明涉及包含至少一种根据本文所述的任一个实施方案的抗死亡受体抗体的组合物。在一个方面，本发明涉及包含一种或多种根据本文所述的任一个实施方案的抗死亡受体抗体的组合物。所述组合物可以包含一种、两种或更多种不同的如本文所述的根据本发明的抗死亡结构域受体抗体，诸如两种不同的单克隆抗死亡结构域受体抗体的组合。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含如本文所述的第一抗死亡受体抗体和第二抗死亡受体抗体。也就是说，在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含如本文所述的第一抗体和如本文所述的第二抗体，其中第一和第二抗体是不相同的。也就是说，在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含第一抗体和第二抗体，所述第一抗体选自如本文所述的抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR和抗NGFR抗体，且所述第二抗体选自：抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR和抗NGFR抗体，其中第一和第二抗体不结合相同的抗原或表位。由此描述了抗体组合物，其中第一和第二抗体是不相同的。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含如本文所述的第一抗死亡受体抗体和第二抗死亡受体抗体，即在对应于人IgG1中的位置E430、E345或S440 (EU编号)的氨基酸中具有突变。
在本发明的一个实施方案中，对应于人IgG1中的位置E430 (EU编号)的氨基酸中的突变选自：E430G、E430S、E430F和E430T。
在本发明的一个实施方案中，对应于人IgG1中的位置E345 (EU编号)的氨基酸中的突变选自：E345K、E345Q、E345R和E345Y。
在本发明的一个实施方案中，对应于人IgG1中的位置S440 (EU编号)的氨基酸中的突变选自：S440W和S440Y。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含第一抗FAS抗体和第二抗体，所述第一抗FAS抗体在对应于人IgG1中的E430、E345或S440 (EU编号)的氨基酸位置处包含突变，且所述第二抗体在对应于人IgG1中的E430、E345或S440 (EU编号)的氨基酸位置处包含突变，其中所述第二抗体选自：
a)抗DR4抗体；
b)抗DR5抗体；
c)抗TNFR1抗体；
d)抗DR6抗体；
c)抗DR3抗体；
d)抗EDAR抗体和
e)抗NGFR抗体。
在本发明的一个实施方案中，第一和第二抗体在氨基酸位置处包含突变，其中所述氨基酸位置是相同的。在本发明的一个实施方案中，第一和第二抗体在氨基酸位置处包含突变，其中所述氨基酸位置是不同的。因此，在本发明的一个实施方案中，第一和第二抗体在氨基酸位置处包含突变，其中所述第一和第二抗体中的所述氨基酸位置是不同的。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含第一抗FAS抗体和第二抗体，所述第一抗FAS抗体在对应于人IgG1中的E430 (EU编号)的氨基酸位置处包含突变，且所述第二抗体在对应于人IgG1中的E430 (EU编号)的氨基酸位置处包含突变，其中所述第二抗体选自：
a)抗DR4抗体；
b)抗DR5抗体；
c)抗TNFR1抗体；
d)抗DR6抗体；
c)抗DR3抗体；
d)抗EDAR抗体和
e)抗NGFR抗体。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含第一抗FAS抗体和第二抗体，所述第一抗FAS抗体包含E430G突变且所述第二抗体包含E430G突变，其中所述第二抗体选自：
a)抗DR4抗体；
b)抗DR5抗体；
c)抗TNFR1抗体；
d)抗DR6抗体；
c)抗DR3抗体；
d)抗EDAR抗体和
e]抗NGFR抗体。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含第一抗FAS抗体和第二抗体，所述第一抗FAS抗体在对应于人IgG1中的E345 (EU编号)的氨基酸位置处包含突变，且所述第二抗体在对应于人IgG1中的E345 (EU编号)的氨基酸位置处包含突变，其中所述第二抗体选自：
a)抗DR4抗体；
b)抗DR5抗体；
c)抗TNFR1抗体；
d)抗DR6抗体；
c)抗DR3抗体；
d)抗EDAR抗体和
e)抗NGFR抗体。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含第一抗FAS抗体和第二抗体，所述第一抗FAS抗体在Fc区中包含E345K突变且所述第二抗体在Fc区中包含E345K突变，其中所述第二抗体选自：
a)抗DR4抗体；
b)抗DR5抗体；
c)抗TNFR1抗体；
d)抗DR6抗体；
c)抗DR3抗体；
d)抗EDAR抗体和
e)抗NGFR抗体。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含第一抗DR4抗体和第二抗体，所述第一抗DR4抗体在对应于人IgG1中的E430、E345或S440 (EU编号)的氨基酸位置处包含突变，且所述第二抗体在对应于人IgG1中的E430、E345或S440 (EU编号)的氨基酸位置处包含突变，其中所述第二抗体选自：
a)抗FAS抗体；
b)抗DR5抗体；
c)抗TNFR1抗体；
d)抗DR6抗体；
c)抗DR3抗体；
d)抗EDAR抗体和
e)抗NGFR抗体。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含第一抗DR4抗体和第二抗体，所述第一抗DR4抗体在对应于人IgG1中的E430 (EU编号)的氨基酸位置处包含突变，且所述第二抗体在对应于人IgG1中的E430 (EU编号)的氨基酸位置处包含突变，其中所述第二抗体选自：
a)抗FAS抗体；
b)抗DR5抗体；
c)抗TNFR1抗体；
d)抗DR6抗体；
c)抗DR3抗体；
d)抗EDAR抗体和
e)抗NGFR抗体。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含第一抗DR4抗体和第二抗体，所述第一抗DR4抗体在对应于人IgG1中的E345 (EU编号)的氨基酸位置处包含突变，且所述第二抗体在对应于人IgG1中的E345 (EU编号)的氨基酸位置处包含突变，其中所述第二抗体选自：
a)抗FAS抗体；
b)抗DR5抗体；
c)抗TNFR1抗体；
d)抗DR6抗体；
c)抗DR3抗体；
d)抗EDAR抗体和
e)抗NGFR抗体。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含第一抗DR4抗体和第二抗体，所述第一抗DR4抗体在Fc区中包含E345K突变且所述第二抗体在Fc区中包含E345K突变，其中所述第二抗体选自：
a)抗FAS抗体；
b)抗DR5抗体；
c)抗TNFR1抗体；
d)抗DR6抗体；
c)抗DR3抗体；
d)抗EDAR抗体和
e)抗NGFR抗体。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含第一抗DR5抗体和第二抗体，所述第一抗DR5抗体在对应于人IgG1中的E430、E345或S440 (EU编号)的氨基酸位置处包含突变，且所述第二抗体在对应于人IgG1中的E430、E345或S440 (EU编号)的氨基酸位置处包含突变，其中所述第二抗体选自：
a)抗FAS抗体；
b)抗DR4抗体；
c)抗TNFR1抗体；
d)抗DR6抗体；
c)抗DR3抗体；
d)抗EDAR抗体和
e)抗NGFR抗体。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含第一抗DR5抗体和第二抗体，所述第一抗DR5抗体在对应于人IgG1中的E430 (EU编号)的氨基酸位置处包含突变，且所述第二抗体在对应于人IgG1中的E430 (EU编号)的氨基酸位置处包含突变，其中所述第二抗体选自：
a)抗FAS抗体；
b)抗DR4抗体；
c)抗TNFR1抗体；
d)抗DR6抗体；
c)抗DR3抗体；
d)抗EDAR抗体和
e)抗NGFR抗体。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含第一抗DR5抗体和第二抗体，所述第一抗DR5抗体在对应于人IgG1中的E345 (EU编号)的氨基酸位置处包含突变，且所述第二抗体在对应于人IgG1中的E345 (EU编号)的氨基酸位置处包含突变，其中所述第二抗体选自：
a)抗FAS抗体；
b)抗DR4抗体；
c)抗TNFR1抗体；
d)抗DR6抗体；
c)抗DR3抗体；
d)抗EDAR抗体和
e)抗NGFR抗体。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含第一抗DR5抗体和第二抗体，所述第一抗DR5抗体在Fc区中包含E430G突变且所述第二抗体在Fc区中包含E430G突变，其中所述第二抗体选自：
a)抗FAS抗体；
b)抗DR4抗体；
c)抗TNFR1抗体；
d)抗DR6抗体；
c)抗DR3抗体；
d)抗EDAR抗体和
e)抗NGFR抗体。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含第一抗DR5抗体和第二抗体，所述第一抗DR5抗体在Fc区中包含E345K突变且所述第二抗体在Fc区中包含E345K突变，其中所述第二抗体选自：
a)抗FAS抗体；
b)抗DR4抗体；
c)抗TNFR1抗体；
d)抗DR6抗体；
c)抗DR3抗体；
d)抗EDAR抗体和
e]抗NGFR抗体。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含第一抗TNFR1抗体和第二抗体，所述第一抗TNFR1抗体在对应于人IgG1中的E430、E345或S440 (EU编号)的氨基酸位置处包含突变，且所述第二抗体在对应于人IgG1中的E430、E345或S440 (EU编号)的氨基酸位置处包含突变，其中所述第二抗体选自：
a)抗FAS抗体；
b)抗DR4抗体；
c)抗DR5抗体；
d)抗DR6抗体；
c)抗DR3抗体；
d)抗EDAR抗体和
e)抗NGFR抗体。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含第一抗TNFR1抗体和第二抗体，所述第一抗TNFR1抗体在Fc区中包含E430G突变且所述第二抗体在Fc区中包含E430G突变，其中所述第二抗体选自：
a)抗FAS抗体；
b)抗DR4抗体；
c)抗DR5抗体；
d)抗DR6抗体；
c)抗DR3抗体；
d)抗EDAR抗体和
e]抗NGFR抗体。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含第一抗TNFR1抗体和第二抗体，所述第一抗TNFR1抗体在Fc区中包含E345K突变且所述第二抗体在Fc区中包含E345K突变，其中所述第二抗体选自：
a)抗FAS抗体；
b)抗DR4抗体；
c)抗DR5抗体；
d)抗DR6抗体；
c)抗DR3抗体；
d)抗EDAR抗体和
e]抗NGFR抗体。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含第一抗DR6抗体和第二抗体，所述第一抗DR6抗体在对应于人IgG1中的E430、E345或S440 (EU编号)的氨基酸位置处包含突变，且所述第二抗体在对应于人IgG1中的E430、E345或S440 (EU编号)的氨基酸位置处包含突变，其中所述第二抗体选自：
a)抗FAS抗体；
b)抗DR4抗体；
c)抗TNFR1抗体；
d)抗DR5抗体；
c)抗DR3抗体；
d)抗EDAR抗体和
e)抗NGFR抗体。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含第一抗DR6抗体和第二抗体，所述第一抗DR6抗体在Fc区中包含E430G突变且所述第二抗体在Fc区中包含E430G突变，其中所述第二抗体选自：
a)抗FAS抗体；
b)抗DR4抗体；
c)抗TNFR1抗体；
d)抗DR5抗体；
c)抗DR3抗体；
d)抗EDAR抗体和
e]抗NGFR抗体。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含第一抗DR6抗体和第二抗体，所述第一抗DR6抗体在Fc区中包含E345K突变且所述第二抗体在Fc区中包含E345K突变，其中所述第二抗体选自：
a)抗FAS抗体；
b)抗DR4抗体；
c)抗TNFR1抗体；
d)抗DR5抗体；
c)抗DR3抗体；
d)抗EDAR抗体和
e]抗NGFR抗体。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含第一抗DR3抗体和第二抗体，所述第一抗DR3抗体在对应于人IgG1中的E430、E345或S440 (EU编号)的氨基酸位置处包含突变，且所述第二抗体在对应于人IgG1中的E430、E345或S440 (EU编号)的氨基酸位置处包含突变，其中所述第二抗体选自：
a)抗FAS抗体；
b)抗DR4抗体；
c)抗TNFR1抗体；
d)抗DR5抗体；
c)抗DR6抗体；
d)抗EDAR抗体和
e)抗NGFR抗体。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含第一抗DR3抗体和第二抗体，所述第一抗DR3抗体在Fc区中包含E430G突变且所述第二抗体在Fc区中包含E430G突变，其中所述第二抗体选自：
a)抗FAS抗体；
b)抗DR4抗体；
c)抗TNFR1抗体；
d)抗DR5抗体；
c)抗DR6抗体；
d)抗EDAR抗体和
e]抗NGFR抗体。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含第一抗DR3抗体和第二抗体，所述第一抗DR3抗体在Fc区中包含E345K突变且所述第二抗体在Fc区中包含E345K突变，其中所述第二抗体选自：
a)抗FAS抗体；
b)抗DR4抗体；
c)抗TNFR1抗体；
d)抗DR5抗体；
c)抗DR6抗体；
d)抗EDAR抗体和
e]抗NGFR抗体。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含第一抗EDAR抗体和第二抗体，所述第一抗EDAR抗体在对应于人IgG1中的E430、E345或S440 (EU编号)的氨基酸位置处包含突变，且所述第二抗体在对应于人IgG1中的E430、E345或S440 (EU编号)的氨基酸位置处包含突变，其中所述第二抗体选自：
a)抗FAS抗体；
b)抗DR4抗体；
c)抗TNFR1抗体；
d)抗DR5抗体；
c)抗DR6抗体；
d)抗DR3抗体和
e]抗NGFR抗体。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含第一抗EDAR抗体和第二抗体，所述第一抗EDAR抗体在Fc区中包含E430G突变且所述第二抗体在Fc区中包含E430G突变，其中所述第二抗体选自：
a)抗FAS抗体；
b)抗DR4抗体；
c)抗TNFR1抗体；
d)抗DR5抗体；
c)抗DR6抗体；
d)抗DR3抗体和
e]抗NGFR抗体。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含第一抗EDAR抗体和第二抗体，所述第一抗EDAR抗体在Fc区中包含E345K突变且所述第二抗体在Fc区中包含E345K突变，其中所述第二抗体选自：
a)抗FAS抗体；
b)抗DR4抗体；
c)抗TNFR1抗体；
d)抗DR5抗体；
c)抗DR6抗体；
d)抗DR3抗体和
e)抗NGFR抗体。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含第一抗NGFR抗体和第二抗体，所述第一抗NGFR抗体在对应于人IgG1中的E430、E345或S440 (EU编号)的氨基酸位置处包含突变，且所述第二抗体在对应于人IgG1中的E430、E345或S440 (EU编号)的氨基酸位置处包含突变，其中所述第二抗体选自：
a)抗FAS抗体；
b)抗DR4抗体；
c)抗TNFR1抗体；
d)抗DR5抗体；
c)抗DR6抗体；
d)抗DR3抗体和
e]抗EDAR抗体。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含第一抗NGFR抗体和第二抗体，所述第一抗NGFR抗体在Fc区中包含E430G突变且所述第二抗体在Fc区中包含E430G突变，其中所述第二抗体选自：
a)抗FAS抗体；
b)抗DR4抗体；
c)抗TNFR1抗体；
d)抗DR5抗体；
c)抗DR6抗体；
d)抗DR3抗体和
e]抗EDAR抗体。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含第一抗NGFR抗体和第二抗体，所述第一抗NGFR抗体在Fc区中包含E345K突变且所述第二抗体在Fc区中包含E345K突变，其中所述第二抗体选自：
a)抗FAS抗体；
b)抗DR4抗体；
c)抗TNFR1抗体；
d)抗DR5抗体；
c)抗DR6抗体；
d)抗DR3抗体和
e]抗EDAR抗体。
六聚化抑制突变诸如K439E或S440K阻止Fc-Fc与包含相同六聚化抑制突变的抗体的相互作用，但通过组合具有K439E突变的抗体和具有S440K突变的抗体，抑制作用被中和并且Fc-Fc相互作用得到恢复。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含第一抗体和第二抗体，所述第一抗体选自：抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR和抗NGFR抗体，且所述第二抗体选自：抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR和抗NGFR抗体，其中第一和第二抗体包含对应于人IgG1 (EU编号)中的K439E或S440K的进一步六聚化抑制突变。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含选自以下的第一和第二抗体：抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR和抗NGFR抗体，其中所述第一抗体包含六聚化增强突变(诸如E430G)和六聚化抑制突变(诸如K439E)，且其中所述第二抗体包含六聚化增强突变(诸如E430G)和六聚化抑制突变(诸如S440K)。因此提供了允许其中包含K439E突变的抗体和包含S440K突变的抗体的组合之间排他地发生六聚化由此允许具有不同结合特异性的抗体之间的六聚化的组合物的实施方案。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含选自以下的第一和第二抗体：抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR和抗NGFR抗体，其中所述第一抗体包含六聚化增强突变(诸如E345K)和六聚化抑制突变(诸如K439E)，且其中所述第二抗体包含六聚化增强突变(诸如E345K)和六聚化抑制突变(诸如S440K)。因此提供了允许其中包含K439E突变的抗体和包含S440K突变的抗体的组合之间排他地发生六聚化由此允许具有不同结合特异性的抗体之间的六聚化的组合物的实施方案。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含第一抗FAS抗体和第二抗体，所述第一抗FAS抗体在Fc区中包含E430G和K439E突变且所述第二抗体在Fc区中包含E430G和S440K突变，其中所述第二抗体选自：
a)抗DR4抗体；
b)抗DR5抗体；
c)抗TNFR1抗体；
d)抗DR6抗体；
c)抗DR3抗体；
d)抗EDAR抗体和
e]抗NGFR抗体。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含第一抗FAS抗体和第二抗体，所述第一抗FAS抗体在Fc区中包含E345K和K439E突变且所述第二抗体在Fc区中包含E345K和S440K突变，其中所述第二抗体选自：
a)抗DR4抗体；
b)抗DR5抗体；
c)抗TNFR1抗体；
d)抗DR6抗体；
c)抗DR3抗体；
d)抗EDAR抗体和
e)抗NGFR抗体。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含第一抗DR4抗体和第二抗体，所述第一抗DR4抗体在Fc区中包含E430G和K439E突变且所述第二抗体在Fc区中包含E430G和S440K突变，其中所述第二抗体选自：
a)抗FAS抗体；
b)抗DR5抗体；
c)抗TNFR1抗体；
d)抗DR6抗体；
c)抗DR3抗体；
d)抗EDAR抗体和
e)抗NGFR抗体。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含第一抗DR4抗体和第二抗体，所述第一抗DR4抗体在Fc区中包含E345K和K439E突变且所述第二抗体在Fc区中包含E345K和S440K突变，其中所述第二抗体选自：
a)抗FAS抗体；
b)抗DR5抗体；
c)抗TNFR1抗体；
d)抗DR6抗体；
c)抗DR3抗体；
d)抗EDAR抗体和
e]抗NGFR抗体。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含第一抗DR5抗体和第二抗体，所述第一抗DR5抗体在Fc区中包含E430G和K439E突变且所述第二抗体在Fc区中包含E430G和S440K突变，其中所述第二抗体选自：
a)抗FAS抗体；
b)抗DR4抗体；
c)抗TNFR1抗体；
d)抗DR6抗体；
c)抗DR3抗体；
d)抗EDAR抗体和
e)抗NGFR抗体。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含第一抗DR5抗体和第二抗体，所述第一抗DR5抗体在Fc区中包含E345K和K439E突变且所述第二抗体在Fc区中包含E345K和S440K突变，其中所述第二抗体选自：
a)抗FAS抗体；
b)抗DR4抗体；
c)抗TNFR1抗体；
d)抗DR6抗体；
c)抗DR3抗体；
d)抗EDAR抗体和
e]抗NGFR抗体。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含第一抗TNFR1抗体和第二抗体，所述第一抗TNFR1抗体在Fc区中包含E430G和K439E突变且所述第二抗体在Fc区中包含E430G和S440K突变，其中所述第二抗体选自：
a)抗FAS抗体；
b)抗DR4抗体；
c)抗DR5抗体；
d)抗DR6抗体；
c)抗DR3抗体；
d)抗EDAR抗体和
e]抗NGFR抗体。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含第一抗TNFR1抗体和第二抗体，所述第一抗TNFR1抗体在Fc区中包含E345K和K439E突变且所述第二抗体在Fc区中包含E345K和S440K突变，其中所述第二抗体选自：
a)抗FAS抗体；
b)抗DR4抗体；
c)抗DR5抗体；
d)抗DR6抗体；
c)抗DR3抗体；
d)抗EDAR抗体和
e]抗NGFR抗体。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含第一抗DR6抗体和第二抗体，所述第一抗DR6抗体在Fc区中包含E430G和K439E突变且所述第二抗体在Fc区中包含E430G和S440K突变，其中所述第二抗体选自：
a)抗FAS抗体；
b)抗DR4抗体；
c)抗TNFR1抗体；
d)抗DR5抗体；
c)抗DR3抗体；
d)抗EDAR抗体和
e)抗NGFR抗体。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含第一抗DR6抗体和第二抗体，所述第一抗DR6抗体在Fc区中包含E345K和K439E突变且所述第二抗体在Fc区中包含E345K和S440K突变，其中所述第二抗体选自：
a)抗FAS抗体；
b)抗DR4抗体；
c)抗TNFR1抗体；
d)抗DR5抗体；
c)抗DR3抗体；
d)抗EDAR抗体和
e)抗NGFR抗体。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含第一抗DR3抗体和第二抗体，所述第一抗DR3抗体在Fc区中包含E430G和K439E突变且所述第二抗体在Fc区中包含E430G和S440K突变，其中所述第二抗体选自：
a)抗FAS抗体；
b)抗DR4抗体；
c)抗TNFR1抗体；
d)抗DR5抗体；
c)抗DR6抗体；
d)抗EDAR抗体和
e]抗NGFR抗体。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含第一抗DR3抗体和第二抗体，所述第一抗DR3抗体在Fc区中包含E345K和K439E突变且所述第二抗体在Fc区中包含E345K和S440K突变，其中所述第二抗体选自：
a)抗FAS抗体；
b)抗DR4抗体；
c)抗TNFR1抗体；
d)抗DR5抗体；
c)抗DR6抗体；
d)抗EDAR抗体和
e]抗NGFR抗体。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含第一抗EDAR抗体和第二抗体，所述第一抗EDAR抗体在Fc区中包含E430G和K439E突变且所述第二抗体在Fc区中包含E430G和S440K突变，其中所述第二抗体选自：
a)抗FAS抗体；
b)抗DR4抗体；
c)抗TNFR1抗体；
d)抗DR5抗体；
c)抗DR6抗体；
d)抗DR3抗体和
e)抗NGFR抗体。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含第一抗EDAR抗体和第二抗体，所述第一抗EDAR抗体在Fc区中包含E345K和K439E突变且所述第二抗体在Fc区中包含E345K和S440K突变，其中所述第二抗体选自：
a)抗FAS抗体；
b)抗DR4抗体；
c)抗TNFR1抗体；
d)抗DR5抗体；
c)抗DR6抗体；
d)抗DR3抗体和
e)抗NGFR抗体。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含第一抗NGFR抗体和第二抗体，所述第一抗NGFR抗体在Fc区中包含E430G和K439E突变且所述第二抗体在Fc区中包含E430G和S440K突变，其中所述第二抗体选自：
a)抗FAS抗体；
b)抗DR4抗体；
c)抗TNFR1抗体；
d)抗DR5抗体；
c)抗DR6抗体；
d)抗DR3抗体和
e)抗EDAR抗体。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含第一抗NGFR抗体和第二抗体，所述第一抗NGFR抗体在Fc区中包含E345K和K439E突变且所述第二抗体在Fc区中包含E345K和S440K突变，其中所述第二抗体选自：
a)抗FAS抗体；
b)抗DR4抗体；
c)抗TNFR1抗体；
d)抗DR5抗体；
c)抗DR6抗体；
d)抗DR3抗体和
e)抗EDAR抗体。
因此提供了允许其中包含K439E突变的抗体和包含S440K突变的抗体的组合之间排他地发生六聚化由此允许具有不同结合特异性的抗体之间的六聚化的组合物的实施方案。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含结合相同死亡受体上的不同表位的第一抗死亡受体抗体和第二抗死亡受体抗体。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含结合死亡受体的所述第一抗死亡受体抗体，当第一和第二抗死亡受体抗体结合相同靶标时，其不阻断所述第二抗死亡受体抗体的结合。也就是说，在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含第一抗死亡受体抗体和第二抗死亡受体抗体，其中第一和第二抗体不竞争结合死亡结构域受体。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含选自以下组的第一和第二抗死亡受体抗体：抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR和抗NGFR抗体，其中所述第一抗体和所述第二抗体以以下摩尔比存在于组合物中：1:49至49:1摩尔比，诸如1:1摩尔比、1:2摩尔比、1:3摩尔比、1:4摩尔比、1:5摩尔比、1:6摩尔比、1:7摩尔比、1:8摩尔比、1:9摩尔比、1:5摩尔比、1:5摩尔比、1:5摩尔比、1:10摩尔比、1:15摩尔比、1:20摩尔比、1:25摩尔比、1:30摩尔比、1:35摩尔比、1:40摩尔比、1:45摩尔比、1:50摩尔比、50:1摩尔比、45:1摩尔比、40:1摩尔比、35:1摩尔比、30:1摩尔比、25:1摩尔比、20:1摩尔比、15:1摩尔比、10:1摩尔比、9:1摩尔比、8:1摩尔比、7:1摩尔比、6:1摩尔比、5:1摩尔比、4:1摩尔比、3:1摩尔比、2:1摩尔比。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含第一和第二抗体，其中所述第一抗体和所述第二抗体以1:9至9:1摩尔比存在于组合物中。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含第一和第二抗死亡受体抗体，其中所述第一抗体和所述第二抗体以近似1:1摩尔比存在于组合物中。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含第一和第二抗死亡受体抗体，其中所述第一抗体和所述第二抗体以1:1摩尔比存在于组合物中。
在本发明的一个优选实施方案中，所述组合物包含第一和第二抗死亡受体抗体，其中所述第一抗体和第二抗体和/或任何额外抗体以等摩尔比存在于组合物中。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物是药物组合物。
在本发明的一个实施方案中，所述双特异性抗体包含在药物组合物中。
本发明的药物组合物可以包含根据本发明的任何方面或实施方案的抗体，诸如单克隆抗体或双特异性抗体。
所述药物组合物可以与药学上可接受的载体或稀释剂以及任何其他已知佐剂和赋形剂根据常规技术(诸如(Rowe等人, Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2012June, ISBN 9780857110275)中所公开的那些)一起配制。
所述药学上可接受的载体或稀释剂以及任何其他已知佐剂和赋形剂应当适用于本发明的抗体或双特异性抗体以及所选择的施用模式。载体及药物组合物的其他组分的适用性是基于对所选择的本发明的化合物或药物组合物的所需生物学特性缺乏显著负面影响(例如，在抗原结合后没有实质性影响(10%或更少的相对抑制、5%或更少的相对抑制，等))而确定的。
本发明的药物组合物还可包括稀释剂、填充剂、盐类、缓冲剂、洗涤剂(例如，非离子型洗涤剂，诸如Tween-20或Tween-80)、稳定剂(例如，糖类或不含蛋白的氨基酸)、防腐剂、组织固定剂、增溶剂和/或适合包括在药物组合物中的其他材料。
本发明的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可以变化，从而获得活性成分的量，所述量有效实现具体患者、组合物和施用模式的所需治疗反应，而对该患者没有毒性。所选剂量水平将取决于各种药代动力学因素，包括采用的本发明的具体组合物或其酰胺的活性、施用途径、施用时间、所采用的具体化合物的排泄率、治疗持续时间、与所采用的具体组合物联合使用的其他药物、化合物和/或材料、所治疗的患者的年龄、性别、重量、状况、一般健康和既往病史等医学领域众所周知的因素。
所述药物组合物可通过任何合适途径和模式施用。体内和体外施用本发明的化合物的合适途径是本领域众所周知的，并且可由本领域普通技术人员选择。
在一个实施方案中，胃肠外地施用本发明的药物组合物。
如本文所用的术语“胃肠外施用”和“胃肠外地施用”，是指除了肠内和局部施用之外的施用模式，通常是通过注射，并且包括表皮、静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹腔内、腱内、经气管、皮下、表皮下(subcuticular)、关节内、囊下、蛛网膜下腔、椎管内、颅内、胸内、硬膜外以及胸骨内注射和输注。
在一个实施方案中，本发明的药物组合物通过静脉内或皮下注射或输注施用。
在本发明的一个实施方案中，所述药物组合物包含一种或多种根据本发明的抗体，诸如单克隆抗体或双特异性抗体，以及药物载体。
药学上可接受的载体包括与本发明的化合物在生理上相容的任何及所有合适的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂、抗氧化剂和吸收延迟剂等。
可用于本发明的药物组合物中的合适的水性和非水性载体的实例包括水、盐水、磷酸盐-缓冲盐水、乙醇、葡萄糖、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物；植物油，诸如橄榄油、玉米油、花生油、棉籽油和芝麻油；羧甲基纤维素胶体溶液、黄蓍胶和可注射有机酯诸如油酸乙酯，和/或各种缓冲液。其他载体是药学领域中众所周知的。
药学上可接受的载体包括无菌水溶液或用于无菌注射溶液或分散剂的临时制备的分散剂和无菌粉末。对药物活性物质使用此类介质和试剂是本领域已知的。除非该常规介质或试剂与所述活性化合物不相容，否则设想了其在本发明的药物组合物中的使用。
可例如通过使用包衣材料(诸如卵磷脂)、通过在分散的情况下保持所需的粒径以及通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。
本发明的药物组合物还可包含药学上可接受的抗氧化剂例如：(1) 水溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠，亚硫酸钠等；(2) 油溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；以及(3) 金属螯合剂，诸如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
本发明的药物组合物还可在组合物中包含等渗剂，诸如糖类、多元醇(诸如甘露醇、山梨醇、甘油)或氯化钠。
本发明的药物组合物还可含有一种或多种适用于所选施用途径的佐剂，诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、防腐剂或缓冲剂，其可提高所述药物组合物的保质期或有效性。本发明的化合物可与载体一起制备成诸如受控释放制剂，包括植入物、透皮贴剂和微胶囊化递送系统，所述载体将保护所述化合物免于迅速释放。此类载体可包括：明胶、单硬脂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、可生物降解的生物相容性聚合物(诸如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚-原酸酯和聚乳酸)本身或与蜡一起，或本领域众所周知的其他材料。制备此类制剂的方法对于本领域技术人员是众所周知的。
在一个实施方案中，本发明的化合物可经配制以确保正确的体内分布。用于胃肠外施用的药学上可接受的载体包括无菌水溶液或用于无菌注射溶液或分散剂的临时制备的分散剂和无菌粉末。对药物活性物质使用此类介质和试剂是本领域已知的。除非任何常规介质或试剂与所述活性化合物不相容，否则设想了其在本发明的药物组合物中的使用。也可将其他活性或治疗性化合物掺入所述组合物中。
用于注射或输注的药物组合物通常必须是无菌的并且在生产和存储条件下是稳定的。所述组合物可被配制成溶液、微乳液、脂质体、或适合高药物浓度的其他有序结构。载体可以是水性或非水性溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物；植物油，诸如橄榄油；以及可注射有机酯，诸如油酸乙酯。可例如通过使用包衣(诸如卵磷脂)、通过在分散的情况下保持所需的粒径以及通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。在许多情况下，将优选在组合物中包含等渗剂，例如，糖类、多元醇(诸如甘油、甘露醇、山梨醇)或氯化钠。可通过在组合物中包含延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸盐和明胶)带来注射组合物的延长吸收。无菌注射溶液可通过如下制备：按照需要，将所需量的活性化合物掺入具有例如以上列举的成分之一或其组合的适当的溶剂中，后接灭菌微过滤。通常，通过将活性化合物掺入到无菌媒介物中来制备分散剂，所述无菌媒介物含有基础分散介质和所需的例如来自以上列举的那些的其他成分。就用于制备无菌注射溶液的无菌粉末而言，制备方法的实例是真空-干燥和冷冻干燥(冻干)，所述方法从其先前无菌过滤的溶液中得到活性成分的粉末加上任何另外的所需成分。
无菌注射溶液可通过如下制备：按照需要，将所需量的活性化合物掺入具有以上列举的成分之一或其组合的适当的溶剂中，后接灭菌微过滤。通常，通过将活性化合物掺入到无菌媒介物中来制备分散剂，所述无菌媒介物含有基础分散介质和所需的来自以上列举的那些的其他成分。就用于制备无菌注射溶液的无菌粉末而言，制备方法的实例是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，所述方法从其先前无菌过滤的溶液中得到活性成分的粉末加上任何另外的所需成分。
本发明的药物组合物可以含有一种或多种本发明的单克隆抗体或一种或多种本发明的双特异性抗体，根据本发明的抗体或双特异性抗体与另一种治疗性化合物的组合，或本发明的化合物的组合。
治疗应用
根据本发明的任何方面或实施方案的抗体、诸如单克隆抗体、双特异性抗体或组合物可以用作药物，即用于治疗应用。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含一种或多种根据本发明的抗体，诸如单克隆抗体或双特异性抗体，其用作药物。
在另一个方面，本发明提供了用于治疗或预防主体中的涉及表达死亡受体诸如FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR或NGFR的细胞的病症的方法，所述方法包括向有需要的主体施用治疗有效量的抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR和抗NGFR抗体、双特异性抗体或包含一种或多种本发明的抗体的组合物。所述方法通常涉及以有效治疗或预防所述病症的量向有需要的主体施用根据本发明的抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR和抗NGFR抗体、双特异性抗体或组合物。
本发明的抗死亡受体抗体可用于治疗或预防涉及表达死亡受体的细胞的病症。例如，可以将所述抗体例如体内施用于人主体以治疗或预防涉及表达FAS的细胞、表达DR4的细胞、表达DR5的细胞、表达TNFR1的细胞、表达DR6的细胞、表达DR3的细胞、表达EDAR的细胞或表达NGFR的细胞的病症。如本文所用的术语“主体”通常是对其施用抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR或抗NGFR抗体或双特异性抗体的人。主体可以例如包括具有病症的人患者，所述病症可以通过调节FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR或NGFR功能或通过杀死表达FAS的细胞、表达DR4的细胞、表达DR5的细胞、表达TNFR1的细胞、表达DR6的细胞、表达DR3的细胞、表达EDAR的细胞或表达NGFR的细胞而直接或间接校正或改善。
在一个方面，本发明涉及如本文的任何方面或实施方案中所定义的抗死亡受体抗体、双特异性抗体或组合物，其用于治疗或改善涉及表达一种或多种死亡受体的细胞(即表达FAS的细胞、表达DR4的细胞、表达DR5的细胞、表达TNFR1的细胞、表达DR6的细胞、表达DR3的细胞，表达EDAR的细胞或表达NGFR的细胞)的疾病或病症的症状。在一些疾病或病症中，所述细胞表达多于一种死亡受体。也就是说，在一些疾病或病症中，所述细胞表达以下组的死亡受体FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR和NGFR的任何组合。
在本发明的一个实施方案中，包含根据如本文公开的任何方面或实施方案的抗死亡受体，即抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR或抗NGFR抗体或双特异性抗体的组合物，用于治疗传染病、自身免疫性疾病或心血管异常。
在一个方面，本发明涉及如本文的任何方面或实施方案中所定义的抗死亡受体，即抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR或抗NGFR抗体、双特异性抗体或组合物，其用于治疗或改善癌症和/或肿瘤的症状。
在本发明的一个实施方案中，包含根据本发明的任何方面或实施方案的抗死亡受体，即抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR或抗NGFR抗体或双特异性抗体的组合物用于治疗癌症和/或肿瘤。
术语“癌症”是指或描述哺乳动物、诸如人的生理病况，其典型特征在于不受调节的生长。大多数癌症属于两大组癌症(即实体瘤和血液肿瘤)之一。
在具体方面，预防性地施用抗死亡受体(即抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR或抗NGFR抗体)、双特异性抗体或组合物以降低发展癌症的风险、推迟癌症进展事件的发作或当癌症处于缓解期和/或原发性肿瘤已经被手术移除时降低复发的风险。在后者情况下，所述抗死亡受体(即抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR或抗NGFR抗体)、双特异性抗体或组合物可以例如结合手术(即，之前、期间或之后)施用。预防性施用还可用于其中难以定位肿瘤的患者，所述肿瘤由于其他生物学因素而据信是存在的。
在一个实施方案中，包含一种或多种本发明的抗死亡受体，即抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR或抗NGFR抗体或双特异性抗体的组合物用于治疗实体瘤和/或血液肿瘤。
在一个实施方案中，包含一种或多种本发明的抗死亡受体，即抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR或抗NGFR抗体或双特异性抗体的组合物用于治疗实体瘤，诸如，结肠直肠癌，包括结肠直肠癌和结肠直肠腺癌，膀胱癌，骨肉瘤，软骨肉瘤，乳腺癌，包括三阴性乳腺癌，中枢神经系统的癌症，包括成胶质细胞瘤，星形细胞瘤，成神经细胞瘤，神经纤维肉瘤，神经内分泌肿瘤，宫颈癌，子宫内膜癌，胃癌，包括胃腺癌，头颈癌，肾癌，肝癌，包括肝细胞癌，肺癌，包括NSCLC和SCLC，卵巢癌，胰腺癌，包括胰腺导管癌和胰腺癌，肉瘤或皮肤癌，包括恶性黑素瘤和非黑素瘤皮肤癌。
在本发明的一个实施方案中，包含一种或多种抗死亡受体，即抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR或抗NGFR抗体或双特异性抗体的组合物用于治疗血液肿瘤，诸如，白血病，包括慢性淋巴细胞性白血病和骨髓性白血病，包括急性骨髓性白血病和慢性骨髓性白血病，淋巴瘤，包括非霍奇金淋巴瘤或多发性骨髓瘤，包括霍奇金淋巴瘤，且包括骨髓增生异常综合征。
在本发明的一个具体实施方案中，包含一种或多种抗死亡受体，即抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR或抗NGFR抗体或双特异性抗体的组合物用于治疗选自以下癌症组的癌症；膀胱癌、骨癌、结肠直肠癌、肉瘤、子宫内膜癌、成纤维细胞癌、胃癌、头颈癌、肾癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、肌肉癌、神经组织癌、卵巢癌、胰腺癌和皮肤癌。
在本发明的一个实施方案中，包含一种或多种抗死亡受体，即抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR或抗NGFR抗体或双特异性抗体的组合物用于抑制FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR或NGFR阳性或表达FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR或NGFR的肿瘤或癌症的生长。
在本发明中，FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR或NGFR阳性肿瘤或癌症应理解为在细胞表面上表达DR5的肿瘤细胞和/或癌细胞。这种FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR或NGFR表达可以通过免疫组织化学、流式细胞术或其他合适的诊断方法检测。
在本发明的一个实施方案中，包含一种或多种抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR或抗NGFR抗体或双特异性抗体的组合物用于抑制FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR或NGFR肿瘤或癌症的生长。显示FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR或NGFR的异源表达的肿瘤和癌组织也被认为是FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR或NGFR阳性肿瘤和癌症。
肿瘤和/或癌症可以在显示FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR或NGFR表达的一些肿瘤和/或癌细胞和/或组织上表达FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR或NGFR，一些肿瘤和/或癌症可以显示FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR或NGFR的过表达或异常表达，而其他肿瘤和/或癌症显示FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR或NGFR的异源表达。此类肿瘤和/或癌症可以都是用抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR或抗NGFR抗体、双特异性抗体和包含根据本发明的此类抗体的组合物治疗的合适靶标。
在本发明的一个实施方案中，包含一种或多种抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR或抗NGFR抗体或双特异性抗体的组合物用于诱导表达FAS的肿瘤、表达DR4的肿瘤、表达DR5的肿瘤、表达TNFR1的肿瘤、表达DR6的肿瘤、表达DR3的肿瘤、表达EDAR的肿瘤或表达NGFR的肿瘤中的凋亡。在一个实施方案中，所述肿瘤表达一种或多种死亡受体，也就是说两种死亡受体的组合、三种死亡受体的组合、四种死亡受体的组合、五种死亡受体的组合、六种死亡受体的组合、七种死亡受体的组合、八种死亡受体的组合。
本发明的另一个方面包括治疗具有癌症的个体的方法，其包括向所述个体施用有效量的根据本发明的抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR或抗NGFR抗体、双特异性抗体或组合物。
在本发明的一个实施方案中，包括向所述个体施用有效量的根据本发明的抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR或抗NGFR抗体、双特异性抗体或组合物的治疗具有癌症的个体的方法进一步包括将额外治疗剂施用于所述个体。
在本发明的一个实施方案中，所述额外治疗剂是单一药剂或包含药剂或方案的药剂的组合，所述药剂或方案选自化学治疗剂(包括但不限于紫杉醇、替莫唑胺、顺铂、卡铂、奥沙利铂、伊立替康、多柔比星、吉西他滨、5-氟尿嘧啶、培美曲塞)，激酶抑制剂(包括但不限于索拉非尼、舒尼替尼或依维莫司)，凋亡调节剂(包括但不限于重组人TRAIL或birinapant)，RAS抑制剂，蛋白酶体抑制剂(包括但不限于硼替佐米)，组蛋白脱乙酰酶抑制剂(包括但不限于伏立诺他)，营养药物，细胞因子(包括但不限于IFN-γ)，抗体或抗体模拟物(包括但不限于抗TF、抗AXL、抗EGFR、抗IGF-1R、抗VEGF、抗CD20、抗CD38、抗HER2、抗PD-1、抗PD-L1、抗CTLA4、抗CD40、抗CD137、抗GITR、抗VISTA(或其他免疫调节靶标)抗体和抗体模拟物)和抗体-药物缀合物诸如色瑞替尼(brentuximab vedotin)、曲妥珠单抗美坦新(trastuzumab emstansine)、HuMax-TF-ADC或HuMax-AXL-ADC。
在一个进一步方面，本发明包括包含根据本发明的抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR或抗NGFR抗体、双特异性抗体或组合物的部件试剂盒，其中所述抗体、双特异性抗体或组合物在一个或多个容器诸如一个或多个小瓶中。
在本发明的一个实施方案中，包含根据本发明的抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR或抗NGFR抗体、双特异性抗体或组合物的部件试剂盒用于在疗法中同时、分开或依次使用。
在一个进一步实施方案中，本发明是根据本发明的抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR或抗NGFR抗体、双特异性抗体或组合物用于制备用于治疗癌症的药物的用途。
当描述本发明的实施方案时，并未明确描述所有可能的实施方案的组合和排列。尽管如此，在相互不同的从属权利要求中记载或在不同的实施方案中描述某些措施的事实并不表示这些措施的组合不能有利地使用。本发明设想所述的实施方案的所有可能的组合和排列。
在本发明的另一个方面，本发明包括编码根据表1中列出的氨基酸序列的抗体的核酸构建体。也就是说，在一个实施方案中，本发明包括编码对应于表1中列出的氨基酸序列的抗体的核酸构建体。在本发明的一个实施方案中，所述核酸构建体编码根据本文公开的任何实施方案的抗体。
在一个进一步方面，本发明涉及编码根据本发明的抗体的核酸，其中所述Fc区包含对应于人IgG1中的E430、E345或S440 (EU编号)的氨基酸位置的突变。进一步考虑编码根据本发明的抗体的核酸在本文所述的特定氨基酸位置中包含氨基酸取代。因此，在一个实施方案中，所述核酸编码具有根据SEQ ID NO:1至50的序列的抗体。
在另一个方面，本发明涉及编码用于本发明中的人、人源化或嵌合抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR或抗NGFR抗体的序列的核酸，编码这种抗体的序列的表达载体，包含此类表达载体的宿主细胞，产生此类抗体的杂交瘤，和通过在由此产生且任选地回收抗体的适当条件下培养此类宿主细胞或杂交瘤产生这种抗体的方法。
在一个实施方案中，本发明提供了表达载体，其包含编码根据SEQ ID No:1至51的一个或多个氨基酸序列的核苷酸序列。
在另一个实施方案中，所述表达载体包含编码选自SEQ ID NO:18、22、19、30、39和46的任何一个或多个VH CDR3氨基酸序列的核苷酸序列。在另一个实施方案中，所述表达载体包含编码选自SEQ ID NO:13、15、19、26、31和40的VH氨基酸序列的核苷酸序列。在另一个实施方案中，所述表达载体包含编码选自SEQ ID NO:14、16、23、35、43和15的VL氨基酸序列的核苷酸序列。在另一个实施方案中，所述表达载体包含编码人抗体轻链恒定区、人抗体重链恒定区或两者的核苷酸序列。在另一个实施方案中，所述表达载体包含编码选自以下的人抗体重链恒定区的核苷酸序列：SEQ ID NO:20、27、32和47。
在一个具体实施方案中，所述表达载体包含编码一种或多种上述氨基酸序列的变体的核苷酸序列，所述变体具有至多25个氨基酸修饰，诸如至多20，诸如至多15、14、13、12或11个氨基酸修饰，诸如10、9、8、7、6、5、4、3、2个或1个氨基酸修饰，诸如缺失或插入，优选取代，诸如保守取代，或与任何所述序列具有至少80％同一性，诸如与任何上面提及的氨基酸序列具有至少85％同一性或90％同一性或95％同一性，诸如96％同一性或97％同一性或98％同一性或99％同一性。
本发明的上下文中的表达载体可以是任何合适的载体，包括染色体的、非染色体的以及合成的核酸载体(包含合适的表达控制元件组的核酸序列)。此类载体的实例包括：SV40的衍生物、细菌质粒、噬菌体DNA、杆状病毒、酵母质粒、源自质粒和噬菌体DNA的组合的载体、以及病毒核酸(RNA或DNA)载体。在一个实施方案中，编码人源化CD3抗体抗体的核酸被包含在裸DNA或RNA载体中，包括例如：线性表达元件(如例如Sykes和Johnston, NatBiotech 17, 355-59 (1997)中所述)、致密核酸载体(compacted nucleic acid vector)(如例如US 6,077,835和/或WO 00/70087中所述)、质粒载体诸如pBR322、pUC 19/18或pUC118/119、“侏儒(midge)”尺寸最小化的核酸载体(如例如Schakowski等人, Mol Ther 3,793-800 (2001)中所述)，或作为沉淀核酸载体构建体，诸如CaPO4 --沉淀构建体(如例如WO00/46147；Benvenisty和Reshef, PNAS USA 83, 9551-55 (1986), Wigler等人, Cell14, 725 (1978)以及Coraro和Pearson, Somatic Cell Genetics 7, 603 (1981)中所述)。此类核酸载体及其用法是本领域众所周知的(参见例如US 5,589,466和US 5,973,972)。
在一个实施方案中，所述载体适用于在细菌细胞中表达人源化抗DR5抗体。此类载体的实例包括表达载体诸如BlueScript (Stratagene)、pIN载体((Van Heeke &Schuster, J Biol Chem 264, 5503-5509 (1989))、pET载体(Novagen, Madison WI)等)。
表达载体还可或可替代地是适用于在酵母系统中表达的载体。可采用适用于在酵母系统中表达的任何载体。合适的载体包括，例如，包含组成型或诱导型启动子(诸如α因子、醇氧化酶和PGH)的载体(综述于：F. Ausubel等人编 Current Protocols inMolecular Biology, Greene Publishing and Wiley InterScience New York (1987),和Grant等人, Methods in Enzymol 153, 516-544 (1987)中)。
核酸和/或载体还可包含编码分泌/定位序列的核酸序列，其可以将多肽(诸如新生多肽链)靶向至周质空间或进入细胞培养液。此类序列是本领域已知的，并且包括分泌前导或信号肽、细胞器靶向序列(例如，细胞核定位序列、ER驻留信号、线粒体转运序列、叶绿体转运序列)、膜定位/锚定序列(例如，停止转移序列、GPI锚定序列)等。
在本发明的表达载体中，编码抗DR5抗体的核酸和第一和第二多肽核酸可包含任何合适的启动子、增强子以及其他有助于表达的元件，或与之相连。此类元件的实例包括：强表达启动子(例如，人CMV IE 启动子/增强子以及RSV、SV40、SL3-3、MMTV和HIV LTR启动子)、有效的聚(A)终止序列、大肠杆菌中质粒产物的复制起点、作为选择标志物的抗生素抗性基因和/或便利的克隆位点(例如，聚合接头)。核酸还可包含与组成型启动子相对的诱导型启动子，诸如CMV IE(技术人员将认识到此类术语是对特定条件下基因表达程度的实际说明)。
在一个实施方案中，所述编码抗DR5抗体的表达经由病毒载体而被定位到并且/或者被递送至宿主细胞或宿主动物。
此类表达载体可用于重组产生抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR或抗NGFR抗体。
在一个方面，本文所述的任何方面或实施方案的抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR或抗NGFR抗体通过使用产生抗体的重组真核或原核宿主细胞来提供。因此，本发明提供了重组真核或原核宿主细胞，诸如转染瘤，其生产如本文定义的抗DR5抗体。宿主细胞的实例包括酵母、细菌和哺乳动物细胞，诸如CHO或HEK 293细胞。例如，在一个实施方案中，所述宿主细胞包含稳定整合至细胞基因组中的核酸，所述核酸包含编码表达本文所述的抗DR5抗体的序列。在一个实施方案中，所述宿主细胞包含稳定整合至细胞基因组中的核酸，其包含编码本文所述的第一或第二多肽的表达的序列。在另一个实施方案中，所述宿主细胞包含非整合核酸(如质粒、粘粒、噬粒或线性表达元件)，所述核酸包含编码表达抗FAS、抗DR4、抗DR5、抗TNFR1、抗DR6、抗DR3、抗EDAR或抗NGFR抗体、本文所述的第一或第二多肽的序列。
如本文所用的术语“重组宿主细胞”(或简称“宿主细胞”)，意欲是指其中已经引入表达载体的细胞。应该理解，此类术语意欲不仅是指具体主题细胞，还是指此类细胞的子代。因为某些修饰可能由于突变或环境影响而出现在后续世代中，所以此类子代可能事实上与亲本细胞不同，但仍然被包括在如本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。重组宿主细胞包括例如：转染瘤，诸如CHO细胞、HEK-293细胞、PER.C6、NS0细胞；和淋巴细胞；以及原核细胞诸如大肠杆菌和其他真核宿主诸如植物细胞和真菌。
如本文所用的术语“转染瘤”，包括表达抗体或靶抗原的重组真核宿主细胞，诸如CHO细胞、PER.C6、NS0细胞、HEK-293细胞、植物细胞或真菌，包括酵母细胞。
在一个进一步方面，本发明涉及用于产生本发明的抗体的方法，所述方法包括以下步骤
a)培养如上文所述的本发明的杂交瘤或宿主细胞，和
b)从培养基中回收和/或纯化本发明的抗体。
在一个进一步方面，编码抗体的序列的核苷酸序列进一步编码第二部分，诸如治疗性多肽。示例性治疗性抗体在本文别处描述。在一个实施方案中，本发明涉及用于产生抗体融合蛋白的方法，所述方法包括以下步骤
a)培养包含含有这种核苷酸序列的表达载体的宿主细胞，和
b)从培养基中回收和/或纯化抗体融合蛋白。
在本发明的一个方面，本发明包括表达载体，其包含编码根据本文公开的任何实施方案的抗体的一种或多种核酸构建体。
在本发明的一个进一步方面，本发明包括包含表达载体的宿主细胞。
序列表1
实施例
实施例1：抗体和抗原
抗体的表达构建体
对于抗体表达，将可变重(VH)链和可变轻(VL)链序列克隆至含有IgG1重链(HC)和轻链(LC)恒定区的pcDNA3.3表达载体中。通过基因合成或定点诱变引入期望的突变。本申请中提及的抗体具有源自先前描述的嵌合人/小鼠DR5抗体DR5-01和DR5-05 (基于EP2684896A1)、人源化DR5抗体hDR5-01和hDR5-05 (基于WO2014/009358)、IgG1-CONA (基于US7521048 B2和WO2010/138725)、IgG1-chTRA8 (基于EP1506285B1和US7244429B2)、IgG1-DR5-H48-2 (基于US 2004 0214235 A1)、IgG1-DR4-T1014G03 (基于US7361341)和IgG1-FAS-E09 (基于Chodorge等人, Cell Death Differ.2012 Jul; 19(7):1187–1195)的VH和VL序列。在一些实施例中，使用人IgG1抗体b12，gp120特异性抗体用作阴性对照(Barbas等人, J Mol Biol. 1993 Apr 5;230(3):812-23)。
瞬时表达
抗体表达为IgG1,κ。基本上如Vink等人(Vink等人, Methods, 65 (1), 5-10 2014)所述，使用293fectin (Life technologies)在Expi293F细胞(Life technologies, USA)中瞬时转染编码抗体的重链和轻链两者的质粒DNA混合物。
蛋白的纯化和分析
通过固定化的蛋白G色谱纯化抗体。His-标记的重组蛋白通过固定化的金属亲和色谱纯化。通过多种生物分析测定法包括SDS-PAGE、大小排阻色谱和内毒素水平的测量来分析蛋白批次。
双特异性抗体的生成
在受控的还原条件下通过Fab臂交换生成双特异性IgG1抗体。如WO2011/131746(Labrijn等人, Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Mar 26;110(13):5145-50)所述，该方法的基础是使用互补的CH3结构域，其促进在特定测定条件下形成异源二聚体。为了产生具有互补CH3结构域的抗体对，在IgG1-DR5-05、IgG1-DR5-05-E430G和IgG1-DR5-05-E345K中引入F405L突变(EU编号)；且在IgG1-DR5-01、IgG1-DR5-01-E430G、IgG1-DR5-01-E345K和IgG1-CONA-E430G中引入K409R突变。为了生成双特异性抗体，将两种亲本互补抗体(最终浓度为0.5mg/mL的每种抗体)与75 mM 2-巯基乙胺-HCl (2-MEA)在总体积为100μL的TE中在31℃下孵育5小时。根据制造商的方案，通过使用离心柱(Microcon离心过滤器，30k，Millipore)除去还原剂2-MEA来终止还原反应。以该方式，生成双特异性抗体IgG1-DR5-01-K409R x IgG1-DR5-05-F405L (BsAb DR5-01-K409R x DR5-05-F405L)、IgG1-DR5-01-K409R-E430G x IgG1-DR5-05-F405L-E430G (BsAb DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G)、IgG1-DR5-01-K409R-E345K x IgG1-DR5-05-F405L-E345K (BsAb DR5-01-K409R-E345K x DR5-05-F405L-E345K)和IgG1-DR5-CONA-K409R-E430G x IgG1-DR5-05-F405L-E345K (BsAb DR5-CONA-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E345K)。
实施例2：六聚化增强突变的引入不影响IgG1-DR5-01-K409R、IgG1-DR5-05-F405L和双特异性抗体IgG1-DR5-01-K409R x DR5-05-F405L与DR5-阳性人结肠癌细胞的结合。
通过FACS分析法分析纯化的有和没有六聚化增强突变(E430G或E345K)的IgG1-DR5-01-K409R、IgG1-DR5-05-F405L和双特异性抗体IgG1-DR5-01-K409R x IgG1-DR5-05-F405L (BsAb DR5-01-K409R x DR5-05-F405L)的抗体变体与人结肠癌细胞COLO 205的结合。通过合并含有非贴壁细胞和胰蛋白酶化的贴壁COLO 205细胞的培养上清液来收集细胞。将细胞以1,200 rpm离心5分钟并重新悬浮于10 mL培养基[含有25mM Hepes和L-谷氨酰胺(Lonza目录号BE12-115F) +含铁的10％供体牛血清(Life Technologies 目录号10371-029) + 50单位青霉素/ 50单位链霉素(Lonza 目录号DE17-603E)的RPMI 1640]中。将细胞计数，再次离心并以0.3x106个细胞/mL的浓度重新悬浮于FACS缓冲液中。在4℃下进行下一步骤。将100μL细胞悬浮液样品(每孔30,000个细胞)接种在聚苯乙烯96孔圆底板中，并通过在4℃下以300xg离心3分钟来沉淀。将细胞重新悬浮于50μL系列稀释抗体制备系列样品(范围0至10μg/mL最终浓度，5倍稀释)中，并在4℃下孵育30分钟。将板在4℃下以300xg离心3分钟，并将细胞用150μL FACS缓冲液洗涤两次。将细胞与50μL二抗R-PE缀合的山羊抗人IgG F(ab’)2 (Jackson ImmunoResearch; 目录号109-116-098; 1/100)在4℃下避光孵育30分钟。细胞用150μL FACS缓冲液洗涤两次，重新悬浮于100μL FACS缓冲液中，并在FACS Cantoll (BD Biosciences)上通过记录5,000个事件分析抗体结合。使用GraphPad Prism软件，使用非线性回归分析(具有可变斜率的S形剂量-反应)分析结合曲线。
图2A显示抗体IgG1-DR5-01-K409R-E430G和IgG1-DR5-01-K409R-E345K显示与IgG1-DR5-01-K409R类似的与人结肠癌细胞COLO 205的剂量依赖性结合。图2B显示抗体IgG1-DR5-05-F405L-E430G和IgG1-DR5-05-F405L-E345K显示与IgG1-DR5-05-F405L类似的与COLO 205细胞的剂量依赖性结合。图2C显示BsAb DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G和BsAb DR5-01-K409R-E345K x DR5-05-F405L-E345K显示与BsAb DR5-01-K409R x DR5-05-F405L类似的与COLO 205细胞的剂量依赖性结合。这些数据表明，六聚化增强突变E430G或E345K的引入不影响DR5-阳性COLO 205细胞上的抗体IgG1-DR5-01-K409R、IgG1-DR5-05-F405L和BsAb DR5-01-K409R x DR5-05-F405L的结合。
实施例3：六聚化增强突变的引入不影响DR4抗体与可溶性人DR4的结合。
在夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)中分析纯化的有和没有六聚化增强突变E430G的IgG1-DR4-T1014G03的抗体变体与包被的人可溶性DR4的结合。96孔平底ELISA板(Greiner bio-one; 目录号655092)在4℃下用100μL PBS中的2 μg/mL sTRAIL-R1(Peprotech 目录号310-18)包被过夜。将孔用PBST [含有0.05％ Tween-20(Sigma-Aldrich; 目录号63158)的PBS]洗涤三次。将孔通过添加200μL PBSA [含有1％牛血清白蛋白(BSA; Roche目录号10735086001)的PBS]来封闭，并在室温下振荡的同时孵育1小时。将孔用PBST洗涤三次。接下来，在总体积为100μL的PBSTA (含有0.2% BSA的PBST)中添加IgG1-DR4-T1014G03-K409R或IgG1-DR4-T1014G03-K409R-E430G的抗体样品(范围0至2,000ng/mL最终浓度，3倍稀释)并在室温下振荡的同时孵育1.5小时。用PBST洗涤三次之后，将孔在ELISA振荡器上与100 μL在PBSTA中的辣根过氧化物酶(HRP)-缀合的山羊抗人IgG Fcγ抗体(Jackson ImmunoResearch; 目录号109-035-098; 1:10.000)在室温下孵育1.5小时。用PBST洗涤三次之后，通过与100 μL 2,2’-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[ABTS(Roche; 目录号11112597001)]在室温下避光孵育来显现反应。在ELISA读数器(BioTekELx808吸光度酶标仪)上测量405 nm处的荧光。
图3显示抗体IgG1-DR4-T1014G3-K409R和IgG1-DR4-T1014G3-K409R-E430G显示类似的与包被的可溶性受体的剂量依赖性结合，表明六聚化增强突变E430G的引入不影响抗体与其靶标的结合。
实施例4：六聚化增强突变的引入改善DR5抗体诱导细胞死亡的效力。
进行活性测定以研究在不同DR5抗体中引入六聚化增强突变E345K或E430G以诱导杀死人结肠癌细胞COLO 205或HCT116的作用。通过合并含有非贴壁细胞和胰蛋白酶化的贴壁细胞的培养上清液来收集COLO 205细胞。通过胰蛋白酶化收集HCT 116细胞。使细胞通过细胞过滤器，通过以1,200 rpm离心5分钟来沉淀并以0.5x105个细胞/mL的浓度重新悬浮于培养基[COLO 205：含有25mM Hepes和L-谷氨酰胺(Lonza目录号BE12-115F) +含铁的10％供体牛血清(DBSI; Life Technologies 目录号10371-029) + 50单位青霉素/ 50单位链霉素(Pen/Strep; Lonza 目录号DE17-603E)的RPMI 1640；HCT 116：含有L-谷氨酰胺和Hepes (Lonza，目录号BE12-168F)+ 10％ DBSI + Pen/Strep的McCoy'5A培养基]中。将100μL单细胞悬浮液(5,000个细胞/孔)接种在聚苯乙烯96孔平底板(Greiner Bio-One, 目录号655182)中。添加50μL系列稀释抗体制备系列(范围0.05至20,000ng/mL最终浓度，5倍稀释)并在37℃下孵育3天。在定量存在的ATP(其为代谢活性细胞的指示剂)的CellTiter-Glo发光细胞活力测定法(Promega，目录号G7571)中测定培养细胞的活力。从试剂盒中，每孔添加20μL荧光素溶液试剂并通过以500rpm摇动板2分钟来混合。接下来，将板在37℃下孵育1.5小时。将100μL上清液转移至白色OptiPlate-96 (Perkin Elmer，目录号6005299)，并在EnVision Multilabel Reader (PerkinElmer)上测量发光。使用GraphPad Prism软件，使用非线性回归(具有可变斜率的S形剂量-反应)分析数据和绘制曲线。当包括5μM星形孢菌素(Sigma Aldrich，目录号S6942)的样品作为阳性对照时，使用下式计算活细胞百分比：%活细胞= [(抗体样品的发光 - 星形孢菌素样品的发光)/(无抗体样品的发光 - 星形孢菌素样品的发光)] *100。对于未包括星形孢菌素对照样品的实验，数据表示为发光。
在COLO 205上测试IgG1-DR5-01-K409R和IgG1-DR5-05-F405L的E345K变体。在COLO 205和HCT116细胞上测试IgG1-DR5-01-K409R、IgG1-DR5-05-F405L和IgG1-CONA-K409R的E430G-变体。IgG1-CONA也作为RGY-变体(在溶液中作为六聚体存在的三重突变体E345K/E430G/S440Y)测试(Diebolder等人, Science. 2014 Mar 14;343(6176):1260-3)。在HCT116细胞上将IgG1-H48-2-F405L和IgG1-DR5-chTRA8-F405L作为E430G变体测试。图4显示六聚化增强突变的引入增强了COLO 205和HCT 116结肠癌细胞中不同DR5抗体的功效。
实施例5：六聚化增强突变的引入改善DR4抗体诱导细胞死亡的效力。
进行活力测定以研究在DR4抗体IgG1-DR4-T1014G03-K409R中引入六聚化增强突变E430G以诱导BxPC-3人胰腺癌细胞的杀伤的作用。通过胰蛋白酶化收获细胞并使其通过细胞过滤器。将细胞通过以1,200rpm离心5分钟来沉淀，并以0.5x105个细胞/mL的浓度重新悬浮浮于培养基[含有25mM Hepes和L-谷氨酰胺(Lonza目录号BE12-115F)+ 10％ DBSI +Pen/Strep的RPMI 1640]中。将100 μL单细胞悬浮液(5,000个细胞/孔)接种在聚苯乙烯96孔平底板(Greiner Bio-One, 目录号655182)中并在37℃下孵育过夜。添加50μL系列稀释抗体制备系列(范围0.0006至40 μg/mL最终浓度，4倍稀释)并在37℃下孵育3天。作为阴性和阳性对照，将细胞分别在没有抗体或有5μM星形孢菌素的情况下孵育。如实施例4中所述，在CellTiter-Glo发光细胞活力测定中测定培养细胞的活力。图5显示六聚化增强突变E430G的引入使得DR4抗体IgG1-DR4-T1014G03-K409R-E430G能够诱导BxPC-3胰腺癌细胞的剂量依赖性杀死，而没有E430G突变的抗体不能在测试的抗体浓度下诱导杀死。
实施例6：六聚化增强突变的引入改善FAS抗体诱导细胞死亡的效力。
进行活力测定以研究在FAS抗体IgG1-FAS-E09中引入六聚化增强突变E345K/E430G/S440Y (RGY)以诱导Jurkat人T淋巴细胞(ATTC TIB-152™)的杀伤的作用。收获Jurkat细胞并以0.3x106个细胞/mL的浓度重新悬浮于培养基(含有25mM Hepes和L-谷氨酰胺+ 10％Cosmic牛血清(CCS，Perbio目录号SH30087.03)+ Pen/Strep的RPMI 1640)中。将100 μL单细胞悬浮液(30,000个细胞/孔)接种在聚苯乙烯96孔平底板(Greiner Bio-One,目录号655182)中。添加50μL系列稀释抗体制备系列(范围0.005至10,000 ng/mL最终浓度，5倍稀释)并在37℃下孵育3天。培养细胞的活力通过TOPRO-3碘测定。TOPRO-3结合DNA，但不能通过完整的血浆和核膜，且因此将仅染色具有降低膜完整性的正在死亡的细胞。将细胞重新悬浮并转移至U形底96孔板(Greiner，目录号650101)。将细胞通过以300xg离心3分钟来沉淀，并用150μL FACS缓冲液洗涤。将细胞通过以300xg离心3分钟来沉淀，并重新悬浮于100μL FACS补充有TOPRO-3碘(1:1,000；最终浓度1μM; Life Technologies，目录号T3605)的缓冲液中。在FACS Canto ll (BD Biosciences)上通过记录20,000个事件来分析TOPRO-3染色。使用GraphPad Prism软件，使用非线性回归(具有可变斜率的S形剂量-反应)分析数据和绘制曲线。图6显示从TOPRO-3阴性细胞百分比计算的活细胞百分比。六聚化增强突变RGY的引入使得FAS抗体IgG1-FAS-E09能够诱导Jurkat人T淋巴细胞的剂量依赖性杀伤，而没有E345R/E430G/S440Y三重突变的抗体不能在测试抗体浓度下诱导杀死。
实施例7：六聚化增强突变的引入改善了抗体组合IgG1-DR5-01-K409R + IgG1-DR5-05-F405L和BsAb DR5-01-K409R x DR5-05-F405L诱导细胞死亡的效力。
在活力测定中研究六聚化增强突变E345K或E430G对抗体组合IgG1-DR5-01-K409R+ IgG1-DR5-05-F405L杀死人结肠癌细胞COLO 205和HCT116的能力的作用，如实施例4中所述。还在COLO 205或HCT116上测试在BsAb DR5-01-K409R x DR5-05-F405L中引入E345K或E430G突变的作用。图7显示，在COLO 205(图7A)和HCT116细胞(图7C)上，与没有E345K或E430G六聚化增强突变的抗体组合IgG1-DR5-01-K409R + IgG1-DR5-05-F405L相比，抗体组合IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G和IgG1-DR5-01-K409R-E345K+ IgG1-DR5-05-F405L-E345K显示出增强的功效。在COLO 205(图7 B)和HCT116细胞(图7D)上，与没有E430G六聚化增强突变的BsAb DR5-01-K409R x DR5-05-F405L相比，BsAb DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G也显示增强的功效。在HCT116细胞(图7E)上，与没有E430G六聚化增强突变的BsAb DR5-01-K409R x DR5-05-F405L相比，BsAb DR5-01-K409R-E345K x DR5-05-F405L-E345K显示增强的功效。
实施例8：六聚化增强突变的引入改善IgG1-hDR5-01-G56T + IgG1-hDR5-05抗体的组合诱导细胞死亡的效力。
在活力测定中研究六聚化增强突变E430G对抗体组合IgG1-hDR5-01-G56T +IgG1-hDR5-05杀死HCT15结肠和BxPC-3胰腺癌细胞的能力的影响。通过胰蛋白酶化收获细胞并使其通过细胞过滤器。将细胞通过以1,200rpm离心5分钟来沉淀，并以0.5x105个细胞/mL的浓度重新悬浮于培养基(含有25mM Hepes和L-谷氨酰胺(Lonza目录号BE12-115F)+10％ DBSI + Pen/Strep的RPMI 1640)中。将100 μL单细胞悬浮液(5,000个细胞/孔)接种在聚苯乙烯96孔平底板(Greiner Bio-One, 目录号655182)中并在37℃下孵育过夜。添加50μL系列稀释抗体制备系列的抗体样品(范围0.3至20,000ng/mL最终浓度，4倍稀释)并在37℃下孵育3天。作为阴性和阳性对照，将细胞分别在没有抗体和有5μM星形孢菌素的情况下孵育。如实施例4中所述，在CellTiter-Glo发光细胞活力测定中测定培养细胞的活力。图8显示抗体组合IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G在BxPC-3(图8A)和HCT15细胞(图8B)上显示剂量依赖性杀伤，而没有E430G六聚化增强突变的抗体组合在测试的抗体浓度下几乎不诱导杀死至不诱导杀死。
实施例9：抗体组合IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G诱导细胞死亡需要Fc-Fc相互作用以形成六聚体。
为了分析通过IgG1-hDR5-01-G56T-E430G和IgG1-hDR5-05-E430G形成抗体六聚体以诱导细胞死亡的需求，我们利用自我排斥突变K439E和S440K (Diebolder等人,Science. 2014 Mar 14;343(6176):1260-3)。通过在一种IgG1抗体或抗体组合中存在K439E或S440K引入的抗体之间的Fc排斥导致六聚化的抑制，甚至在六聚化增强突变诸如E345K或E430G存在的情况下(WO2013/0044842)。通过K439E和S440K突变的排斥通过在各自携带一种或另一种突变的两种抗体的混合物中组合两种突变而中和，导致Fc-Fc相互作用和六聚化的恢复。
对于IgG1-hDR5-01-G56T-E430G和IgG1-hDR5-05-E430G两者，以所有不同的组合生成和测试具有K439E或S440K突变的变体。如实施例4中所述，在BxPC-3胰腺癌和HCT-15结肠癌细胞上用范围为0.3至20,000 ng/mL总浓度(4倍稀释)的系列稀释抗体制备系列进行活力测定。
图9显示具有携带相同排斥突变(K439E或S440K)的IgG1-hDR5-01-G56T-E430G和IgG1-hDR5-05-E430G变体的抗体组合在BxPC-3(图9A)和HCT-15细胞(图9B)中显示强烈减弱的杀伤效力。当通过组合各自具有互补突变K439E或S440K之一的两种抗体来中和排斥时，杀伤效力得到恢复。这些数据表明，通过Fc-Fc相互作用的六聚化对于IgG1-hDR5-01-G56T-E430G和IgG1-hDR5-05-E430G对细胞死亡的诱导是必需的。
实施例10：抗体Fc-Fc相互作用参与DR5聚簇和具有六聚化增强突变的抗体组合IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G对凋亡的诱导。
为了测试抗体组合IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G对细胞死亡的诱导中Fc-Fc介导的抗体六聚化的参与，我们使用13残基肽DCAWHLGELVWCT (DeLano等人, Science 2000 Feb 18;287(5456):1279-83)，其结合在含有参与Fc-Fc相互作用的疏水斑块(hydrophobic patch)中的核心氨基酸的区域中的Fc (Diebolder等人, Science.2014 Mar 14;343(6176):1260-3)。如实施例4中所述，在DCAWHLGELVWCT肽存在或不存在的情况下，对抗体组合IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G进行BxPC-3细胞上的活力测定。简言之，在37℃下孵育细胞过夜之后，移除培养基并用100μL含有系列稀释的肽浓度(范围0至100μg/mL最终浓度)的结合Fc的DCAWHLGELVWCT肽、非特异性对照肽GWTVFQKRLDGSV或不含肽的培养基替代。接下来，添加50μL抗体样品(833 ng/mL最终浓度)并在37℃下孵育3天。抗体组合IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G诱导BxPC-3细胞的杀伤的能力被100μg/mL结合Fc的DCAWHLGELVWCT肽强烈抑制(图10)。这些数据表明，Fc相互作用参与具有六聚化增强突变的抗体组合IgG1-hDR5-01-G56T-E430G +IgG1-hDR5-05-E430G诱导癌细胞的细胞表面上的DR5成簇和诱导凋亡的能力中。
实施例11：抗体组合IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G在不同癌细胞系中诱导靶细胞杀伤的能力。
进行活力测定以研究具有和不具有六聚化增强突变E430G的抗体组合IgG1-DR5-01-K409R + IgG1-DR5-05-F405L诱导COLO 205、HCT-15、HCT 116、HT-29和SW480结肠癌、BxPC-3、HPAF-II和PANC-1胰腺癌、SNU-5胃癌、A549和SK-MES-1肺癌以及A375皮肤癌细胞的杀伤的能力。如实施例4中所述进行测定，除了此处使用10μg/mL的固定抗体浓度。先前未描述的细胞系的培养基组成如下：SW480：含有25mM Hepes和L-谷氨酰胺+ 10% DBSI + Pen/Strep的RPMI 1640；HT-29：含有L-谷氨酰胺和Hepes + 10% DBSI + Pen/Strep的McCoy'5A培养基；HPAF-II和SK-MES-1：Eagle氏最低必需培养基(EMEM，ATCC目录号30-2003) + 10%DBSI + Pen/Strep；PANC-1和A375: 不含L-Gln且含HEPES (Lonza目录号LO BE12-709F) +10% DBSI + 1 mM L-谷氨酰胺(Lonza目录号BE17-605E) + Pen/Strep的DMEM 4.5 g/L葡萄糖；SNU-5：IMDM (Lonza目录号BE12-722F) + 10% DBSI + Pen/Strep；A549: F-12K培养基(ATCC Cat nr 30-2004) + 10% DBSI + 1 mM L-谷氨酰胺 + Pen/Strep)。
对于所有测试的细胞系，与10μg/mL的抗体组合IgG1-DR5-01-K409R-E430G +IgG1-DR5-05-F405L-E430G孵育后的活细胞百分比显著低于与非靶标结合阴性对照抗体IgG1-b12孵育后(图11)。在除了两种以外的所有测试细胞系中，抗体组合IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G的效力显著优于没有六聚化增强突变的组合IgG1-DR5-01-K409R + IgG1-DR5-05-F405L。这些数据表明，具有六聚化增强突变的DR5抗体IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G的组合非常有效地杀死不同来源的癌靶细胞，包括结肠癌、胰腺癌、胃癌、肺癌和皮肤癌，而不需要第二种交联剂。
实施例12：六聚化增强突变的引入改善了抗体组合IgG1-CONA-K409R + IgG1-DR5-05-F405L和BsAb CONA-K409R x DR5-05-F405L诱导细胞死亡的效力。
在活力测定中研究六聚化增强突变对抗体组合IgG1-DR5-01-K409R + IgG1-CONA和BsAb CONA-K409R x DR5-05-F405L杀死HCT116结肠癌细胞的能力的作用，如实施例4中所述。图12显示，具有六聚化增强突变的抗体组合IgG1-CONA-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E345K和BsAb CONA-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E345K显示与没有六聚化增强突变E430G或E345K的组合和双特异性抗体相比，在杀死HCT116细胞方面的效力增强。
实施例13：具有六聚化增强突变的抗体组合IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G和BsAb DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G的效力不依赖于第二交联剂结合FcγR。
进行活力测定以比较具有六聚化突变的抗体组合在二级抗体交联剂存在和不存在的情况下诱导COLO 205结肠直肠癌和BxPC-3和PANC-1胰腺癌细胞的杀伤的能力。为了比较，在相同设置下测试已知需要二级抗体交联剂诱导杀伤的DR5抗体IgG1-CONA和IgG1-chTRA8-F405L。在山羊抗人IgG F(ab’)2 (1/150; Jackson ImmunoResearch; 目录号109-006-098)存在或不存在的情况下，如实施例4所述进行活力测定。在Fc交联剂不存在的情况下，DR5抗体IgG1-CONA和IgG1-chTRA8-F405L不诱导靶细胞杀伤(图13)。在COLO 205和BxPC-3细胞中，Fc交联诱导通过IgG1-DR5-CONA和IgG1-DR5-chTRA8-F405L的杀伤。在二级Fc交联剂存在或不存在的情况下，抗体组合IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G和BsAb DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G与阴性对照相比诱导显著的杀伤。这些数据表明，抗体组合IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G和BsAb DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G对COLO 205、BxPC-3和PANC-1癌细胞的杀伤不依赖于FcγR介导的二级Fc交联剂的结合，并且该交联剂非依赖性杀伤比FcγR交联的IgG1-DR5-CONA和IgG1-DR5-chTRA8-F405L更有效。
实施例14：具有E430G六聚化增强突变的抗体组合IgG1-hDR5-01-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G诱导胱天蛋白酶依赖性细胞毒性。
进行活力测定以比较人源化抗体IgG1-hDR5-01-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G的组合在胱天蛋白酶抑制剂存在和不存在的情况下的细胞毒性。通过胰蛋白酶化收获PANC-1和BxPC3胰腺癌细胞并使其通过细胞过滤器。将细胞通过以1,200rpm离心5分钟来沉淀，并以0.5x105个细胞/mL的浓度重新悬浮于培养基中。将100 μL单细胞悬浮液(5,000个细胞/孔)接种在聚苯乙烯96孔平底板(Greiner Bio-One, 目录号655182)中并在37℃下孵育过夜。将25μL泛-胱天蛋白酶抑制剂Z-Val-Ala-DL-Asp-氟甲基酮(Z-VAD-FMK，150μL中的5μM终浓度，Bachem，目录号4026865.0005)添加至细胞培养物中，并在37℃下孵育1小时，然后添加25μL系列稀释抗体制备系列的抗体样品(范围1至20μg/mL最终浓度，4倍稀释)，并在37℃下进一步孵育3天。作为阳性对照，将细胞与5μM星形孢菌素(Sigma Aldrich，目录号S6942)一起孵育。以6μg/mL最终浓度使用重组人TRAIL/APO-2L (eBioscience, 目录号BMS356)。如实施例4中所述，在CellTiter-Glo发光细胞活力测定中测定培养细胞的活力。在泛-胱天蛋白酶抑制剂Z-VAD-FMK存在的情况下，具有六聚化增强突变的抗体组合IgG1-hDR5-01-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G不能减少PANC-1和BxPC3胰腺癌细胞的活力，表明IgG1-hDR5-01-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G的组合诱导胱天蛋白酶依赖性程序化细胞死亡(图14)。对于天然DR5配体TRAIL也显示这一点。
实施例15：抗体组合IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G和BsAb DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G在COLO 205结肠癌细胞上结合后的细胞死亡诱导，如通过膜联蛋白V/碘化丙啶和活性胱天蛋白酶-3染色所评价。
通过膜联蛋白V/碘化丙锭(PI)双重染色和活性胱天蛋白酶-3染色分析细胞死亡诱导的动力学。膜联蛋白-V结合在程序性细胞死亡开始后暴露于细胞表面上的磷脂酰丝氨酸，这是可逆过程。PI是当其进入细胞时插入双链DNA和RNA的染料。因为PI不能通过完整的血浆和核膜，所以它不会染色活细胞，而仅进入并染色具有降低的膜完整性的正在死亡的细胞。由于这些特征，膜联蛋白V/PI双重染色可以用于区分起始(膜联蛋白V阳性/ PI阴性)和不可逆(膜联蛋白V阳性/ PI阳性)程序性细胞死亡。胱天蛋白酶-3被外源性死亡受体诱导的和内在的线粒体细胞死亡途径活化。因此，活性胱天蛋白酶-3也是起始死亡级联的标志物。在DR5阳性COLO 205结肠癌细胞中分析在IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G和BsAb DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G的组合结合后细胞死亡的诱导。通过合并含有非贴壁细胞和胰蛋白酶化的贴壁细胞的培养上清液来收集细胞。将细胞通过细胞过滤器，通过以1,200rpm离心5分钟来沉淀，并以0.2x106个细胞/mL的浓度重新悬浮于培养基中。将500 μL单细胞悬浮液(100,000个细胞/孔)接种在24孔平底培养板(Greiner Bio-One, 目录号662160)中并在37℃下孵育16小时。添加500μL抗体样品(1μg抗体最终浓度)并在37℃下孵育5小时或24小时。作为阳性对照，将细胞与5μM星形孢菌素(Sigma Aldrich，目录号S6942)一起孵育。将细胞用250μL 1x PBS洗涤一次。通过与100μL0.05％胰蛋白酶在37℃下孵育10分钟来收获贴壁细胞。将200μL培养基添加至胰蛋白酶化的细胞中，并将细胞转移至96孔圆底FACS板(Greiner Bio-One，目录号650101)中，并与非贴壁细胞合并。将细胞通过以1,200 rpm离心5分钟来沉淀，重新悬浮于200μL冰冷的PBS中，并在96孔圆底FACS板中分成两份100μL的样品，分别用于膜联蛋白V/PI和活性胱天蛋白酶-3染色。
使用FITC膜联蛋白V凋亡检测试剂盒I(BD Pharmingen，目录号556547)进行膜联蛋白V/PI双重染色。将细胞用冰冷的PBS洗涤一次，并在4℃下在50μL膜联蛋白V/PI染色溶液(膜联蛋白V-FITC 1:00和PI 1:25)中孵育15分钟。将细胞用100μL结合缓冲液洗涤，重新悬浮于20μL结合缓冲液中，并在1小时内在iQue筛选仪(IntelliCyt)上测量荧光。使用GraphPad Prism软件分析数据并绘制曲线。
使用PE活性胱天蛋白酶-3凋亡试剂盒(BD Pharmingen，目录号550914)进行活性胱天蛋白酶-3染色。将细胞用冰冷的PBS洗涤一次，重新悬浮于100μL Cytofix/Cytoperm固定和透化溶液中并在冰上孵育20分钟。将细胞在室温下沉淀，用100μL 1x Perm/洗涤缓冲液洗涤两次，并重新悬浮于100μL PE兔抗活性胱天蛋白酶-3(1:10)中，用于在室温下孵育30分钟。将细胞在室温下沉淀，用100μL 1x Perm/洗涤缓冲液洗涤一次并重新悬浮浮于20μL 1x Perm/洗涤缓冲液中。在iQue筛选仪上测量荧光。使用GraphPad Prism软件分析数据并绘制曲线。
图15显示，在孵育5小时后，嵌合抗体IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G的组合有效诱导细胞死亡的早期阶段，如通过膜联蛋白V阳性/ PI阴性(图15A)和活性胱天蛋白酶3阳性细胞(图15B)的百分比与阴性对照抗体IgG1-b12相比的增加所示。与没有E430G突变的DR5抗体的组合(IgG1-DR5-01-K409R + IgG1-DR5-05-F405L)或任何单一抗体相比，在用IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G的组合处理的细胞中，膜联蛋白V阳性/ PI阴性和活性胱天蛋白酶-3阳性细胞的百分比更高。在5小时时间点，在所有样品中，膜联蛋白V/PI双重阳性细胞的百分比与背景水平相当(图15C)。
BsAb DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G有效诱导细胞死亡的早期阶段，如通过5小时孵育后的膜联蛋白V阳性/ PI阴性(图15A)和活性胱天蛋白酶-3阳性细胞(图15B)的百分比与阴性对照抗体IgG1-b12相比的增加所示。与没有E430G突变的双特异性抗体(BsAb DR5-01-K409R x DR5-05-F405L)或任何单特异性抗体相比，已用BsAb DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G处理的细胞中的膜联蛋白V阳性/PI阴性和活性胱天蛋白酶-3阳性细胞的百分比更高。在5小时时间点，在所有样品中，膜联蛋白V/PI双重阳性细胞的百分比与背景水平相当(图15C)。
孵育24小时之后，膜联蛋白V/PI双重阳性细胞的百分比(图15D)在用IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G处理的样品中增强，表明细胞已进入不可逆的细胞死亡阶段。同样在该阶段，与用没有E430G突变的DR5抗体的组合(IgG1-DR5-01-K409R + IgG1-DR5-05-F405L)或任何单一抗体处理的样品中相比，IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G的组合的效果更强(膜联蛋白V/PI双重阳性细胞的百分比增加更大(图15E))。在相同时间点，用IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G处理的细胞中，活性胱天蛋白酶3阳性细胞的百分比最高。
孵育24小时之后，膜联蛋白V/PI双重阳性细胞的百分比(图15D)在用BsAb DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G处理的样品中增强，表明细胞已进入不可逆的细胞死亡阶段。同样在该阶段，与用没有E430G突变的双特异性抗体(BsAb DR5-01-K409R xDR5-05-F405L)或任何单特异性抗体处理的样品中相比，BsAb DR5-01-K409R-E430G xDR5-05-F405L-E430G的效果更强(膜联蛋白V/PI双重阳性细胞的百分比增加更大(图15E))。在相同时间点，用BsAb DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G处理的细胞中，活性胱天蛋白酶3阳性细胞的百分比最高。
这些数据表明，抗体组合IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G和BsAB DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G在COLO 205结肠癌细胞中诱导早期和晚期阶段的细胞死亡，并且比没有E430G六聚化增强突变的抗体组合和BsAb更有效。
实施例16：具有六聚化增强突变的抗体组合IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G或BsAb DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G在COLO 205结肠癌细胞上结合后的胱天蛋白酶-3和-7活化。
在实施例15中，描述了与抗体组合IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G孵育在COLO 205结肠癌细胞中诱导胱天蛋白酶-3活化。与抗体组合孵育5小时之后，活性胱天蛋白酶-3阳性细胞的百分比比孵育24小时之后更高。在本实施例中，使用胱天蛋白酶-Glo 3/7测定法(Promega, 目录号G8091)以时间测量胱天蛋白酶-3/7活化，其中具有胱天蛋白酶-3/7识别基序DEVD的底物在切割后释放氨基荧光素(萤光素酶的底物)。通过合并含有非贴壁细胞和胰蛋白酶化的贴壁COLO 205的培养上清液来收集细胞。将细胞通过细胞过滤器，通过以1,200rpm离心5分钟来沉淀，并以0.8x105个细胞/mL的浓度重新悬浮于培养基中。将25 μL单细胞悬浮液(2,000个细胞/孔)接种在384孔培养板(Perkin Elmer,目录号6007680)中并在37℃下孵育16小时。添加25μL抗体样品(1μg抗体最终浓度)并在37℃下孵育1、2、5和24小时。从孵育箱中取出板以使温度降低直至室温。将细胞通过以300xg离心3分钟来沉淀。除去25μL上清液并用25μL胱天蛋白酶-Glo 3/7底物代替。通过以500rpm摇动1分钟来混合之后，将板在室温下孵育1小时。在EnVision Multilabel Reader(PerkinElmer)上测量发光。在1、2至5小时的时间过程中，与没有六聚化增强突变的IgG1-DR5-01-K409R + IgG1-DR5-05-F405L的组合相比，抗体组合IgG1-DR5-01-K409R-E430G +IgG1-DR5-05-F405L-E430G显示更快和更强的胱天蛋白酶-3/7活化的诱导(图16A)。类似地，与没有六聚化增强突变的BsAb DR5-01-K409R x DR5-05-F405L相比，BsAb DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G显示更快和更强的胱天蛋白酶-3/7活化的诱导(图16B)。24小时之后，对于所有测试的DR5抗体，胱天蛋白酶-3/7活化几乎降至基线水平。
实施例17：K409R或F405L突变的引入对具有六聚化增强突变的抗体的效力没有影响。
在本申请中描述的许多实验中，抗死亡受体抗体在IgG Fc结构域中含有K409R或F405L (EU编号)突变。如WO2011/131746中所述，这些突变使得能够在受控的还原条件下通过含K409R的IgG1和含F405L的IgG1之间的Fab臂交换反应来生成双特异性死亡受体抗体。在没有Fab臂交换的情况下，携带K409R或F405L突变的人IgG1抗体被认为显示与野生型人IgG1相同的功能特征(Labrijn等人, Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Mar 26;110(13):5145-50)。在这里，我们显示K409R或F405L突变的存在对亲本IgG1-DR5-01-K409R-E430G和IgG1-DR5-05-F405L-E430G抗体的组合体外诱导肿瘤细胞中的细胞死亡的能力没有影响。如实施例5中所述进行活力测定以便将抗体组合IgG1-DR5-01-K409R-E430G +IgG1-DR5-05-F405L-E430G诱导杀死BxPC-3胰腺癌细胞的能力与抗体组合IgG1-hDR5-01-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G的能力进行比较。在与抗体组合IgG1-hDR5-01-K409R-E430G+ IgG1-hDR5-05-F405L-E430G孵育之后，BxPC-3胰腺癌细胞系显示与抗体组合IgG1-hDR5-01-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G类似的活力曲线(图17)。这些数据表明，K409R和F405L突变对具有E430G六聚化增强突变的抗体的组合的效力没有影响。
实施例18：组合IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G中不同抗体比率的癌细胞杀伤能力。
如实施例5中所述进行活力测定以研究抗体组合IgG1-DR5-01-K409R-E430G +IgG1-DR5-05-F405L-E430G当以IgG1-DR5-01-K409R-E430G和IgG1-DR5-05-F405L-E430G的不同比率组合时诱导杀死BxPC-3胰腺癌细胞的能力。将抗体以IgG1-DR5-01-K409R-E430G和IgG1-DR5-05-F405L-E430G的不同比率组合，所述比率表示为100:0、90:10、80:20、70:30、60:40、50:50、40:60、30:70、20:80、10:90和0:100的比率DR5-01-E430G:DR5-05-E430G。在20μg/mL和4μg/mL总抗体浓度下，在含有抗体IgG1-DR5-01-K409R-E430G和IgG1-DR5-05-F405L-E430G两者的所有测试的抗体比率下，杀伤同样有效。在0.8μg/mL和0.16μg/mL总抗体浓度下，含有抗体IgG1-DR5-01-K409R-E430G和IgG1-DR5-05-F405L-E430G两者的所有测试的抗体比率均诱导杀伤(图18)。
实施例19：组合IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G中不同抗体比率的癌细胞杀伤能力。
如实施例5中所述进行活力测定以研究抗体组合IgG1-hDR5-01-G56T-E430G +IgG1-hDR5-05-E430G当以不同的抗体比率(在图19中表示为100:0、98:2、96:4、94:6、92:8、90:10、50:50、10:90、8:92、6:94、4:96、2:98和0:100的比率DR5-01-E430G:DR5-05-E430G)组合时诱导杀死BxPC-3胰腺癌和HCT-15结肠癌细胞的能力，其中对于BxPC-3的最终抗体浓度为10μg/mL，且对于HCT-15的最终抗体浓度为20μg/mL。在含有抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430G和IgG1-hDR5-05-E430G两者的所有测试的抗体比率下，杀伤同样有效(图19)。
实施例20：六聚化增强突变对皮下COLO 205结肠癌异种移植模型中抗DR5抗体的体内效力的影响。
在具有COLO 205人结肠癌细胞的皮下模型中，将IgG1-DR5-05-F405L-E430G的体内抗肿瘤效力与没有六聚化增强突变的IgG1-DR5-05-F405L的体内抗肿瘤效力进行比较。在第0天，通过合并含有非贴壁细胞和胰蛋白酶化的贴壁细胞的培养上清液来收集细胞。将3x106个细胞在体积为200μL PBS中注入6-11周龄雌性SCID小鼠(C.B-17/IcrHan®Hsd-Prkdcscid; Harlan)的侧腹中。所有实验和动物处理均由地方当局批准，并根据所有适用的国际、国家和地方法律和指南进行。通过卡尺(PLEXX)测量为0.52 × (长度) × (宽度)2来每周至少两次监测肿瘤发展。测量肿瘤，直至终点肿瘤体积为1,500 mm3，直至肿瘤显示溃疡形成，直至观察到严重的临床症状，或直至肿瘤生长阻断小鼠的移动。在第6天，平均肿瘤体积为~200 mm3，并将小鼠分选至具有相同肿瘤大小方差的组(下表)中。在第6和13天通过腹膜内(i.p.)注射200μL PBS中的100μg抗体来治疗小鼠(5mg/kg/剂量)。为了检查正确的抗体施用，在首次剂量后三天获得血清样品用于IgG血清测定。一只个别小鼠没有可检测到的人IgG血浆水平，并且从统计分析中排除(下表)。对于其他小鼠，当假设用Vcen = 50mL/kg、Vs = 100 mL/kg和11.6天的消除半衰期的2-隔室模型时，人抗体血浆浓度符合预期(数据未显示)。测量肿瘤，直至肿瘤接种后16周。
治疗组和给药
图20A显示以时间的每个治疗组的平均肿瘤体积。对于具有六聚化增强突变的抗DR5抗体(IgG1-DR5-05-F405L-E430G)，观察到完全的肿瘤消除。相反，没有六聚化增强突变的IgG1-DR5-05-F405L与IgG1-b12相比强烈抑制肿瘤生长，但不导致完全的肿瘤消除。
图20B显示肿瘤进展的Kaplan-Meier图，其中截止值设定在肿瘤体积>750 mm3。与用阴性对照抗体IgG1-b12治疗的小鼠相比，在用抗DR5抗体治疗的组中，肿瘤生长显著延迟(肿瘤大小截止值750 mm3处的Mantel-Cox分析：p<0.001)。在研究结束时(第112天)，与没有增强六聚化突变的IgG1-DR5-05-F405L组相比，用IgG1-DR5-05-F405L-E430G治疗的小鼠组显示具有肿瘤生长的小鼠显著更少(p<0.001)。
这些数据显示，与没有六聚化增强突变的IgG1-DR5-05-F405L相比，在IgG1-DR5-05-F405L中引入E430G六聚化增强突变导致皮下COLO 205结肠癌肿瘤模型中的肿瘤抑制增强。
实施例21：具有六聚化增强突变的IgG1-FAS-E09变体对细胞死亡的诱导。
六聚化增强突变E345R/E430G/S440Y的引入使得FAS抗体IgG1-FAS-E09能够诱导Jurkat人T淋巴细胞的剂量依赖性杀伤，如实施例6中所述。为了分析通过六聚化的IgG1-FAS-E09变体的抗体Fc-Fc相互作用以诱导细胞死亡的需求，我们利用自我排斥的突变K439E和S440K分别与六聚化增强突变E345R/E430G/S440Y (RGY)和E345R/E430G/Y436I(RGI)的组合(WO2014006217)。
基本上如实施例6中所述进行Jurkat人T淋巴细胞上的活力测定。简言之，将每孔100μL中的19,200个细胞接种于96孔板中。添加50μL系列稀释抗体制备系列(范围0.0006至10 μg/mL最终浓度，6倍稀释)并在37℃下孵育4天。培养细胞的活力通过TOPRO-3碘测定，如实施例6中所述。在BD LSRFORTESSA细胞分析仪(BD Biosciences)上通过流式细胞术分析TOPRO-3染色。使用GraphPad Prism软件，使用非线性回归(具有可变斜率的S形剂量-反应)分析数据和绘制曲线。图21显示从TOPRO-3阴性细胞百分比计算的活细胞百分比。六聚化增强突变RGY的引入使得FAS抗体IgG1-FAS-E09能够诱导Jurkat人T淋巴细胞的剂量依赖性杀伤。在IgG1-FAS-E09-RGEY中存在Fc-Fc排斥突变K439E抑制通过IgG1-FAS-E09-RGY的杀伤。含有排斥突变S440K的IgG1-FAS-E09-RGIK也不诱导Jurkat细胞的杀伤。当通过组合各自具有互补突变K439E或S440K之一的两种抗体IgG1-FAS-E09-RGEY和IgG1-FAS-E09-RGIK来中和Fc-Fc排斥时，杀伤效力得到恢复。这些数据说明，通过Fc-Fc相互作用的六聚化对于具有六聚化突变RGY或RGI的IgG1-FAS-E09变体对细胞死亡的诱导是必需的。
实施例22：具有六聚化增强突变E430G的抗DR5抗体IgG1-DR5-CONA能够杀死人结肠癌细胞。
本研究说明具有六聚化增强突变E430G的抗DR5抗体IgG1-DR5-CONA杀死贴壁人结肠癌细胞COLO 205的能力。如实施例4中所述收获COLO 205细胞。将100 μL单细胞悬浮液(5,000个细胞/孔)接种在96孔平底板中并在37℃下孵育过夜。添加50μL抗体浓度系列样品(范围0.04至10 μg/mL最终浓度，4倍稀释)并在37℃下孵育3天。作为阳性对照，将细胞与5μM星形孢菌素一起孵育。如实施例4中所述，在CellTiter-Glo发光细胞活力测定中测定细胞培养物的活力。在EnVision Multilabel Reader (PerkinElmer)上测量发光。使用GraphPad Prism软件，使用非线性回归(具有可变斜率的S形剂量-反应)分析数据和绘制曲线。使用下式计算活细胞的百分比：%活细胞= [(抗体样品的发光 - 星形孢菌素样品的发光)/(无抗体样品的发光 - 星形孢菌素样品的发光)] *100。
图22显示六聚化增强突变E430G的引入导致通过IgG1-DR5-CONA-E430G的剂量依赖性杀伤，而亲本野生型抗体IgG1-DR5-CONA不能杀死贴壁的COLO 205结肠癌细胞。
实施例23：六聚化增强突变S440Y的引入改善抗DR5抗体诱导人结肠癌细胞上的细胞死亡的效力。
在活力测定中研究六聚化增强突变S440Y对单一抗体和IgG1-hDR5-01-G56T和IgG1-hDR5-05的组合杀死COLO 205人结肠癌细胞的能力的影响。如实施例4中所述收获细胞并进行活力测定。简言之，将100μL单细胞悬浮液(每孔5,000个细胞)接种于96孔板中。添加50μL系列稀释抗体制备系列(范围0.0003至20 μg/mL最终浓度，4倍稀释)并在37℃下孵育3天。如实施例4中所述，在CellTiter-Glo发光细胞活力测定中测定培养细胞的活力。如实施例22中所述分析发光数据。
图23A显示六聚化增强突变S440Y的引入导致通过单一抗体IgG1-hDR5-01-G56T-S440Y和IgG1-hDR5-05-S440Y的剂量依赖性杀伤，而亲本野生型抗体IgG1-hDR5- 01-G56T和IgG1-hDR5-05不能杀死COLO 205结肠癌细胞。通过在两种抗体中引入S440Y突变，IgG1-hDR5-01-G56T + IgG1-hDR5-05的组合的效力也得到改善，由减少的EC50代表(图23B)。
实施例24：六聚化增强突变E430G的引入改善抗DR5抗体的组合IgG1-DR5-CONA +IgG1-DR5-chTRA8诱导细胞死亡的效力。
通过夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)中的夹心结合测定测量IgG1-DR5-CONA-K409R和IgG1-DR5-chTRA8-F405L与DR5的细胞外结构域的结合之间的竞争。96孔平底ELISA板(Greiner bio-one; 目录号655092)在4℃下用100μL PBS中的2 μg/mL DR5抗体(IgG1-DR5-CONA-K409R或IgG1-DR5-chTRA8-F405L)包被过夜。将孔通过添加200μL PBSA [PBS/1％牛血清白蛋白(BSA; Roche目录号10735086001)]来封闭，并在室温下孵育1小时。将孔用PBST [PBS/0.05％ Tween-20(Sigma-Aldrich; 目录号63158)]洗涤三次。接下来，在总体积为100 μL的PBSTA(PBST/0.2％BSA)中添加DR5ECD-FcHis标签(0.2μg/mL最终浓度)和竞争抗体(1μg/mL最终浓度)并在室温下在摇动的同时孵育1小时。用PBST洗涤三次之后，将孔在ELISA振荡器上与100 μL PBSTA中的生物素化抗His标签抗体(R&D Systems; 目录号BAM050; 1:2.000)在室温下孵育1小时。用PBST洗涤三次之后，将孔在ELISA振荡器上与PBSTA中的链霉抗生物素蛋白标记的Poly-HRP (Sanquin; 目录号M2032; 1:10.000)在室温下孵育20分钟。用PBST洗涤三次之后，通过与100 μL 2,2’-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[ABTS (Roche; 目录号11112597001)]在室温下避光孵育30分钟来显现反应。通过添加等体积的2％草酸来终止底物反应。在ELISA读数器(BioTek ELx808吸光度酶标仪)上测量405 nm处的荧光。
图24A显示表示为在竞争抗体存在的情况下DR5ECD-FcHisC标签与包被的抗体的结合相对于在竞争抗体不存在的情况下DR5ECD-FcHisC标签的结合的抑制百分比的结合竞争(％抑制= 100 - [(在竞争抗体存在的情况下的结合/在竞争抗体不存在的情况下的结合)]*100)。在可溶性IgG1-DR5-chTRA8-F405L存在的情况下，DR5ECD-FcHis标签与包被的IgG1-DR5-CONA-K409R的结合未被抑制。反之亦然，在可溶性IgG1-DR5-CONA-K409R存在的情况下，DR5ECD-FcHis标签与包被的IgG1-DR5-chTRA8-F405L的结合也未被抑制。这些数据说明，IgG1-DR5-CONA-K409R和IgG1-DR5-chTRA8-E430G彼此不竞争结合DR5ECD-FcHisC标签。
接下来，在活力测定中研究六聚化增强突变E430G对非交叉阻断性抗DR5抗体IgG1-DR5-CONA + IgG1-DR5-chTRA-8的组合杀死贴壁的BxPC-3人胰腺癌细胞的能力的影响，如实施例5中所述。图24显示，与没有E430G六聚化增强突变的亲本抗体的组合相比，具有六聚化增强突变的抗体组合IgG1-DR5-CONA-E430G + IgG1-DR5-chTRA8-E430G显示BxPC-3细胞的增加的剂量依赖性杀伤。
实施例25：六聚化增强突变对皮下HCT15结肠癌异种移植模型中抗DR5抗体的组合IgG1-hDR5-01-G56T + IgG1-hDR5-05的体内效力的影响。
在CrownBiosciences, Taicang, China的皮下HCT15人结肠癌异种移植模型中，将抗DR5抗体组合IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G的体内抗肿瘤效力与没有E430G六聚化增强突变的IgG1-hDR5-01-G56T + IgG1-hDR5-05的体内抗肿瘤效力进行比较。将细胞作为单层培养物在补充有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中在37℃下在空气中5% CO2的气氛中维持。通过胰蛋白酶-EDTA处理收获指数生长期的贴壁细胞。将5x106个细胞在体积为100μL的PBS中注入7-9周龄雌性BALB/c裸小鼠的侧腹中。研究期间动物的护理和使用根据实验室动物关爱评估和认证协会(AAALAC)的规定进行。使用卡尺以两个维度每周两次测量肿瘤体积，并且体积使用下式以mm3表示：V = 0.5 a x b2，其中a和b分别是肿瘤的长直径和短直径。使用随机区组设计将小鼠分组，并且当平均肿瘤大小达到161 mm3时开始治疗(每组8只小鼠)。根据Q7D方案通过i.v.注射10 μg抗体(0.5mg/kg，即0.25mg/kg的组合中的每种抗体)来将小鼠治疗三次。用0.5 mg/kg IgG1-b12平行治疗对照组中的小鼠。
图25A显示每个治疗组的平均肿瘤体积。抗体组合IgG1-hDR5-01-G56T-E430G +IgG1-hDR5-05-E430G显示比IgG1-hDR5-01-G56T + IgG1-hDR5-05更好的肿瘤生长抑制。图25B显示在第21天每个治疗组的肿瘤体积。组合IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G比等剂量IgG1-hDR5-01-G56T + IgG1-hDR5-05显著更好地抑制肿瘤生长进展(Mann Whitney检验(P < 0.0011))。图25C显示肿瘤进展的Kaplan-Meier图，其中截止值设定在肿瘤体积>750 mm3。组合IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G比等剂量IgG1-hDR5-01-G56T + IgG1-hDR5-05更好地抑制肿瘤生长进展。这些数据说明，在抗DR5抗体组合IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G中引入E430G六聚化增强突变导致具有HCT15人结肠癌细胞的体内异种移植模型中的增强的肿瘤生长抑制。
实施例26：抗DR5抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430G和IgG1-hDR5-05-E430G在皮下COLO 205结肠癌异种移植模型中的体内效力。
对于单一抗体和两种抗体的组合评估抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430G和IgG1-hDR5-05-E430G的体内抗肿瘤效力，并且在皮下COLO 205人结肠癌异种移植模型中与没有E430G突变的亲本抗体进行比较。基本上如实施例20中所述进行肿瘤细胞接种、小鼠处理、肿瘤生长测量和终点测定。将3x106个细胞在体积为100μL的PBS中注射入5-8周龄雌性SCID小鼠(C.B-17/IcrHan®Hsd-Prkdcscid; Harlan)的侧腹中。在第9天，测量平均肿瘤体积，并将小鼠分选至具有相同肿瘤大小方差的组中。在第9天通过静脉内(i.v.)注射200μg PBS中的10 μg(0.5mg/kg)抗体来处理小鼠。用10 μg (0.5 mg/kg) IgG1-b12治疗对照组中的小鼠。
表 2：治疗组和给药
图26A显示以时间计的每个治疗组的平均肿瘤体积。与没有E430G突变的亲本抗体相比，在单一抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430G和IgG1-hDR5-05-E430G中引入E430G突变导致肿瘤生长的增强抑制。对于IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G和对于没有E430G突变的亲本抗体的组合，用抗体组合的治疗诱导完全肿瘤消退。在第19天，用DR5-抗体治疗的所有组的平均肿瘤大小显著小于用阴性对照抗体IgG1-b12治疗的动物中的(MannWhitney检验(P <0.001))(数据未显示)。图26B显示肿瘤进展的Kaplan-Meier图，其中截止值设定在肿瘤体积>500 mm3。与用阴性对照抗体IgG1-b12治疗的小鼠相比，在所有用抗DR5抗体治疗的组中，肿瘤生长显著延迟(肿瘤大小截止值500 mm3处的Mantel-Cox分析：p<0.0001)。与用其他测试的抗DR5抗体处理的小鼠相比，用没有六聚化增强突变E430G的单一抗体IgG1-hDR5-01-G56T和IgG1-hDR5-05治疗的小鼠显著更早地显示肿瘤生长(肿瘤大小截止值500 mm3处的Mantel-Cox分析：p<0.0001)。
序列表
<110> Genmab B.V.
<120> 抗死亡受体抗体及其使用方法
<130> P/0098-WO
<160> 50
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 2
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
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50 55 60
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65 70 75 80
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Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
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130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
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<211> 330
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
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<210> 4
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 5
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 5
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
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Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
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35 40 45
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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<223> N/A
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<220>
<223> N/A
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<223> N/A
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<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
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Gln Lys Lys Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
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<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
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Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
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<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 13
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<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 14
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<210> 15
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 15
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<210> 16
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 16
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 17
Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Phe
1 5
<210> 18
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 18
Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr
1 5
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 19
Val Arg Gly Leu Tyr Thr Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 20
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 20
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<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 21
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1 5 10 15
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Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
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Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 22
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 22
Gln Ser Ile Ser Asn Asn
1 5
<210> 23
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 23
Gln Gln Gly Asn Ser Trp Pro Tyr Thr
1 5
<210> 24
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 24
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Phe Ala Ser Gln Ser Ile Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Ser Trp Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 25
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Phe Ala Ser Gln Ser Ile Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Ser Trp Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 26
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
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Ile Asp Pro Ala Asn Thr Asn Thr
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 27
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Phe Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Thr Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Thr Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Gly Leu Tyr Thr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 28
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 28
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Phe Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Thr Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Thr Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Gly Leu Tyr Thr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 29
Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr His
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 30
Ala Arg Trp Gly Thr Asn Val Tyr Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 31
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 31
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
His Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Glu Tyr Asp Gln Lys Phe
50 55 60
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Leu Val Thr Val Ser Ser
115
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<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 32
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
His Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Glu Tyr Asp Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Gly Thr Asn Val Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 33
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 33
Ser Ser Val Ser Tyr
1 5
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 34
Gln Gln Tyr His Ser Tyr Pro Pro Thr
1 5
<210> 35
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 35
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Tyr Pro Pro Thr
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Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 36
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Tyr Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 37
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 37
Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly Asp Tyr Phe
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 38
Ile His Asn Ser Gly Thr Thr
1 5
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<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 39
Ala Arg Asp Arg Gly Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10
<210> 40
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 40
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
20 25 30
Asp Tyr Phe Trp Ser Trp Ile Arg Gln Leu Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Cys Ile Gly His Ile His Asn Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Lys Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Asp Arg Gly Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 41
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 41
Gln Gly Ile Ser Arg Ser Tyr
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 42
Gln Gln Phe Gly Ser Ser Pro Trp Thr
1 5
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<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 43
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Arg Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ser Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 44
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 44
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Val
1 5
<210> 45
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 45
Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr
1 5
<210> 46
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 46
Ala Arg Arg Gly Asp Ser Met Ile Thr Thr Asp Tyr
1 5 10
<210> 47
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 47
Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Asp Ser Met Ile Thr Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 48
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 48
Gln Asp Val Gly Thr Ala
1 5
<210> 49
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 49
Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Arg Thr
1 5
<210> 50
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 50
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Arg Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210

Claims (57)

1.包含人免疫球蛋白IgG的Fc区和结合含有细胞内死亡结构域的死亡受体的抗原结合区的抗体，其中所述Fc区在对应于根据EU编号的人IgG1中的位置E430、E345或S440的氨基酸位置处包含突变。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中在对应于根据EU编号的人IgG1中的位置S440的氨基酸位置处的突变是S440Y或S440W。
3.根据权利要求1或2所述的抗体，其中所述Fc区在对应于根据EU编号的人IgG1中的E430和E345的氨基酸位置处包含至少第一和第二突变。
4.根据权利要求3所述的抗体，其中所述Fc区在选自根据EU编号的人IgG1中的Y436和S440的氨基酸位置处还包含第三突变。
5.根据权利要求1-4所述的抗体，其中所述Fc区包含选自以下的突变：E430G、E345K、E430S、E430F、E430T、E345Q、E345R、E345Y、S440W和S440Y。
6.根据权利要求1-5所述的抗体，其中所述Fc区包含选自以下的突变：E430G、E345K和S440Y。
7.根据权利要求4所述的抗体，其中在对应于根据EU编号的人IgG1中的E430、E345和S440的氨基酸位置处的第一、第二和第三突变是E430G、E345R和S440Y。
8.根据权利要求4所述的抗体，其中在对应于根据EU编号的人IgG1中的E430、E345和S436的氨基酸位置处的第一、第二和第三突变是E430G、E345R和Y436I。
9.根据权利要求1至7所述的抗体，其中所述Fc区在对应于K439的氨基酸位置中包含进一步突变。
10.根据权利要求1、3-5、8所述的抗体，其中所述Fc区在对应于根据EU编号的人IgG1中的E430和/或E345的氨基酸位置处包含突变，且其中所述Fc区在对应于S440的氨基酸位置处包含进一步突变，条件是所述突变不是S440Y或S440W。
11.根据权利要求9所述的抗体，其中所述进一步突变选自：K439E、K439D。
12.根据权利要求10所述的抗体，其中所述进一步突变选自：S440K、S440R和S440H。
13.根据权利要求1、3-10所述的抗体，其中所述进一步突变选自K439E或S440K。
14.根据前述权利要求1-中任一项所述的抗体，其中包含细胞内死亡结构域的死亡受体的成员选自：FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR和NGFR。
15.根据前述权利要求1-14中任一项所述的抗体，其中包含细胞内死亡结构域的死亡受体的成员是FAS。
16.根据前述权利要求1-14中任一项所述的抗体，其中包含细胞内死亡结构域的死亡受体的成员是DR4。
17.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgD或IgM同种型。
18.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体是IgG1同种型。
19.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体是IgG1m(f)、IgG1m(a)、IgG1m(z)、IgG1m(x)同种异型或混合的同种异型。
20.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
21.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体是人的、人源化的或嵌合的。
22.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体是激动性的。
23.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体诱导靶细胞中的程序性细胞死亡，诸如胱天蛋白酶依赖性细胞死亡。
24.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体在表达选自以下的含有细胞内死亡结构域的死亡受体的成员的靶细胞中诱导凋亡：FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR和NGFR 。
25.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体降低细胞活力。
26.多特异性抗体，其包含一个或多个根据前述权利要求1-19和21-25中任一项所述的抗原结合区。
27.根据权利要求26所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体是双特异性抗体，其包含如前述权利要求1-19和21-25中任一项中所定义的第一抗原结合区和第二抗原结合区。
28.根据权利要求27所述的双特异性抗体，其中所述第一抗原结合区和所述第二抗原结合区结合选自以下的包含细胞内死亡结构域的死亡受体的一个或多个成员上的不同表位：FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR和NGFR。
29.根据前述权利要求27至28中任一项所述的双特异性抗体，其中结合选自FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR和NGFR的包含细胞内死亡结构域的死亡受体的成员的所述第一抗原结合区不阻断结合选自FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR和NGFR的包含细胞内死亡结构域的死亡受体的成员的所述第二抗原结合区的结合。
30.组合物，其包含至少一种根据前述权利要求中任一项所述的抗体。
31.根据权利要求30所述的组合物，其包含一种或多种根据前述权利要求中任一项所述的抗体。
32.根据前述权利要求30至31中任一项所述的组合物，其包含如前述权利要求1-29中任一项中所定义的第一抗体和第二抗体。
33.根据前述权利要求30至32中任一项所述的组合物，其包含：
i) 根据权利要求1至29所述的第一抗体，其中所述Fc区包含在对应于根据EU编号的人IgG1中的E430或E345的氨基酸位置处的第一突变和在对应于根据EU编号的人IgG1中的K439的氨基酸位置处的进一步突变，
ii) 根据权利要求1至29所述的第二抗体，其中所述Fc区包含在对应于根据EU编号的人IgG1中的E430或E345的氨基酸位置处的第一突变和在对应于根据EU编号的人IgG1中的S440的氨基酸位置处的进一步突变。
34.根据权利要求33所述的组合物，其包含其中所述进一步突变选自K439E和K439D的第一抗体，和其中所述进一步突变选自S440K、S440R或S440H的第二抗体。
35.根据权利要求33至34所述的组合物，其包含其中进一步突变是K439E的第一抗体，和其中进一步突变是S440K的第二抗体。
36.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述第一抗体和所述第二抗体结合选自以下的包含细胞内死亡结构域的死亡受体的一个或多个成员上的不同表位：诸如FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR和NGFR。
37.根据权利要求36所述的组合物，其中所述第一抗体和所述第二抗体结合选自以下的相同死亡受体上的不同表位：FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR和NGFR。
38.根据权利要求36所述的组合物，其中所述第一抗体和所述第二抗体结合选自以下的死亡受体的不同成员：FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR和NGFR。
39.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中结合选自FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR或NGFR的包含细胞内死亡结构域的死亡受体的一个成员的所述第一抗体不阻断结合选自FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR或NGFR的包含细胞内死亡结构域的死亡受体的一个成员的所述第二抗体的结合。
40.根据权利要求36、38至39所述的组合物，其中所述第一抗体结合DR4且所述第二抗体结合DR5。
41.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述第一抗体和所述第二抗体以以下摩尔比存在于组合物中：1:49至49:1摩尔比、诸如1:1摩尔比、1:2摩尔比、1:3摩尔比、1:4摩尔比、1:5摩尔比、1:6摩尔比、1:7摩尔比、1:8摩尔比、1:9摩尔比、1:5摩尔比、1:5摩尔比、1:5摩尔比、1:10摩尔比、1:15摩尔比、1:20摩尔比、1:25摩尔比、1:30摩尔比、1:35摩尔比、1:40摩尔比、1:45摩尔比、1:50摩尔比、50:1摩尔比、45:1摩尔比、40:1摩尔比、35:1摩尔比、30:1摩尔比、25:1摩尔比、20:1摩尔比、15:1摩尔比、10:1摩尔比、9:1摩尔比、8:1摩尔比、7:1摩尔比、6:1摩尔比、5:1摩尔比、4:1摩尔比、3:1摩尔比、2:1摩尔比。
42.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述第一抗体和所述第二抗体和/或任何额外抗体以等摩尔比存在于组合物中。
43.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物是药物组合物。
44.根据前述权利要求30至43中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包含药物载体。
45.根据前述权利要求30至44中任一项所述的组合物，其用作药物。
46.根据前述权利要求30至45中任一项所述的组合物，其用于治疗传染病、自身免疫性疾病或心血管异常。
47.根据前述权利要求30至45中任一项所述的组合物，其用于治疗实体瘤和/或血液肿瘤。
48.根据前述权利要求30至45、或47中任一项所述的组合物，其用于治疗实体瘤诸如，结肠直肠癌，包括结肠直肠癌和结肠直肠腺癌，膀胱癌，骨肉瘤，软骨肉瘤，乳腺癌，包括三阴性乳腺癌，中枢神经系统的癌症，包括成胶质细胞瘤，星形细胞瘤，成神经细胞瘤，神经纤维肉瘤，神经内分泌肿瘤，宫颈癌，子宫内膜癌，胃癌，包括胃腺癌，头颈癌，肾癌，肝癌，包括肝细胞癌，肺癌，包括NSCLC和SCLC，卵巢癌，胰腺癌，包括胰腺导管癌和胰腺腺癌，肉瘤或皮肤癌，包括恶性黑素瘤和非黑素瘤皮肤癌。
49.根据前述权利要求30至45、或47中任一项所述的组合物，其用于治疗血液肿瘤诸如，白血病，包括慢性淋巴细胞性白血病和骨髓性白血病，包括急性骨髓性白血病和慢性骨髓性白血病，淋巴瘤，包括非霍奇金淋巴瘤或多发性骨髓瘤，包括霍奇金淋巴瘤，或包括骨髓增生异常综合征。
50.根据前述权利要求30至45或47至49中任一项所述的组合物，其用于抑制表达FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR或NGFR的肿瘤的生长。
51.根据前述权利要求30至45或47至50中任一项所述的组合物，其用于诱导表达FAS、DR4、DR5、TNFR1、DR6、DR3、EDAR或NGFR的肿瘤中的凋亡。
52.治疗具有癌症的个体的方法，其包括向所述个体施用有效量的根据前述权利要求中任一项所述的抗体或组合物。
53.根据权利要求52所述的方法，其进一步包括施用额外治疗剂。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述额外治疗剂是一种或多种选自以下的抗癌剂：化学治疗剂(包括但不限于紫杉醇、替莫唑胺、顺铂、卡铂、奥沙利铂、伊立替康、多柔比星、吉西他滨、5-氟尿嘧啶、培美曲塞)、激酶抑制剂(包括但不限于索拉非尼、舒尼替尼或依维莫司)、凋亡调节剂(包括但不限于重组人TRAIL或birinapant)、RAS抑制剂、蛋白酶体抑制剂(包括但不限于硼替佐米)、组蛋白脱乙酰酶抑制剂(包括但不限于伏立诺他)、营养药物、细胞因子(包括但不限于IFN-γ)、抗体或抗体模拟物(包括但不限于抗EGFR、抗IGF-1R、抗VEGF、抗CD20、抗CD38、抗HER2、抗PD-1、抗PD-L1、抗CTLA4、抗CD40、抗CD137、抗GITR抗体和抗体模拟物)、抗体-药物缀合物。
55.部件试剂盒，其包含根据前述权利要求中任一项所述的抗体或组合物，其中所述抗体或组合物在一个或多个容器诸如小瓶中。
56.根据权利要求55所述的部件试剂盒，其中根据前述权利要求中任一项所述的抗体或组合物用于同时、分开或依次用于疗法中。
57.根据前述权利要求1至45或47至51中任一项所述的抗体或组合物用于制备用于治疗癌症的药物中的用途。
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