KR20190124256A - 백신에 대한 면역 반응을 증진시키기 위한 증진된 adcc를 갖는 항-ctla-4 항체의 용도 - Google Patents

백신에 대한 면역 반응을 증진시키기 위한 증진된 adcc를 갖는 항-ctla-4 항체의 용도 Download PDF

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캐서린 이. 루이스
로버트 에프. 그라지아노
알란 제이. 코먼
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브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니
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Abstract

본 발명은 증진된 ADCC 활성을 갖는 항-CTLA-4 항체의 변이체 형태를 사용하여 백신에 대한 면역 반응을 증진시키는 방법을 제공한다. 본 발명에 사용하기 위한 변이체 항-CTLA-4 항체는 비푸코실화된 이필리무맙을 포함한다.

Description

백신에 대한 면역 반응을 증진시키기 위한 증진된 ADCC를 갖는 항-CTLA-4 항체의 용도
본 출원은 백신에 대한 면역 반응을 증진시키는 방법, 및 구체적으로 백신 아주반트로서의 면역조정 항체의 용도를 개시한다.
백신은 작용제, 예컨대 병원체 또는 종양 세포에 대한 면역 반응을 도출하도록 의도된다. 그러나, 백신은 항상 면역 반응을 도출하지는 않는다. 아주반트는 백신과 함께 투여되어 면역 반응을 증진시키는 화합물이지만, 전형적으로 세포성 면역보다는 체액성 면역을 증진시키며, 이는 암 백신의 유효성에 특히 중요하다. Ikeda et al. (2004) Cancer Sci. 95:697. 면역조정 수용체에 대한 항체는 백신 아주반트로서 제안되었다. 문헌 [Keler et al. (2003) J. Immunol. 171:6251; Ponte et al. (2010) Immunol. 130:231; Kwek et al. (2012) Nat. Rev. Cancer 12:289]; WO 2009/100140; WO 2014/089113을 참조한다. 또한 임상 시험 NCT00113984 (전립선암을 위한 치료 백신에 대한 잠재적 아주반트로서 항-CTLA-4 항체 이필리무맙을 사용함)를 참조한다. 그러나, 기존 아주반트는 항상 완전히 효과적이지는 않다.
개선된 백신 아주반트 활성을 갖는 작용제에 대한 필요가 존재한다. 이러한 개선된 아주반트는 백신의 주어진 용량에서 백신에 대한 면역 반응의 크기를 이상적으로 증진시키고/거나, 목적하는 수준의 면역 반응을 달성하는데 필요한 백신의 양을 감소시키고/거나, 면역 반응의 지속기간을 증가시킬 것이다. 이러한 작용제는 바람직하게는 체액성 면역 반응 뿐만 아니라 세포성 면역 반응을 증진시킬 것이다.
본 발명은 증진된 ADCC 활성을 갖는 항-CTLA-4 항체를 사용하여 백신에 대한 면역 반응을 증진시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 증진된 ADCC 활성을 갖는 항-CTLA-4 항체는 백신, 예컨대 종양 백신과 함께 투여된다.
한 실시양태에서, 증진된 ADCC 활성을 갖는 항-CTLA-4 항체는 각각 서열식별번호(SEQ ID NO): 3 - 8의 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 증진된 ADCC 활성을 갖는 항-CTLA-4 항체는 각각 서열식별번호: 9 및 10의 VH 및 VL 서열을 포함한다. 추가 실시양태에서, 증진된 ADCC 활성을 갖는 항-CTLA-4 항체는 서열식별번호: 11 또는 12의 HC 서열 및 서열식별번호: 13의 LC 서열을 포함한다.
대안적 실시양태에서, 증진된 ADCC 활성을 갖는 항-CTLA-4 항체는 각각 서열식별번호: 14 - 19의 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 증진된 ADCC 활성을 갖는 항-CTLA-4 항체는 각각 서열식별번호: 20 및 21의 VH 및 VL 서열을 포함한다. 추가 실시양태에서, 증진된 ADCC 활성을 갖는 항-CTLA-4 항체는 서열식별번호: 22 또는 23의 HC 서열, 및 서열식별번호: 24의 LC 서열을 포함한다.
증진된 ADCC는 이필리무맙의 ADCC 활성과 관련하여 측정된다. 다양한 실시양태에서, 본 발명의 항-CTLA-4 항체는 이필리무맙과 비교하여 2배, 10배 또는 그 초과의 ADCC를 나타낸다. 한 실시양태에서, ADCC는 실시예 2에 기재된 NK92 세포 매개 용해 검정에 의해 측정된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 증진된 ADCC를 갖는 항-CTLA-4 항체는 실시예 2에 기재된 검정에서 이필리무맙에 대한 EC50보다 적어도 2배 더 낮은 EC50을 나타낸다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 증진된 ADCC를 갖는 항-CTLA-4 항체는 실시예 2에 기재된 검정에서 이필리무맙에 대한 EC50보다 적어도 10배 더 낮은 EC50을 나타낸다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 증진된 ADCC를 갖는 항-CTLA-4 항체는 감소된 푸코실화를 갖거나, 또는 저푸코실화 또는 비푸코실화된다. 추가 실시양태에서, 본 발명의 증진된 ADCC를 갖는 항-CTLA-4 항체는 i) FcγR 결합을 증진시키기 위한 Fc 영역에 대한 1개 이상의 아미노산 돌연변이, 및 임의로 ii) 감소 또는 제거된 푸코실화를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 증진된 ADCC를 갖는 항-CTLA-4 항체는 감소된 푸코실화를 갖는 이필리무맙이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 증진된 ADCC를 갖는 항-CTLA-4 항체는 저푸코실화된 이필리무맙이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 증진된 ADCC를 갖는 항-CTLA-4 항체는 비푸코실화된 이필리무맙이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 증진된 ADCC를 갖는 항-CTLA-4 항체는 감소된 푸코실화를 갖는 트레멜리무맙이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 증진된 ADCC를 갖는 항-CTLA-4 항체는 저푸코실화된 트레멜리무맙이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 증진된 ADCC를 갖는 항-CTLA-4 항체는 비푸코실화된 트레멜리무맙이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 증진된 ADCC를 갖는 항-CTLA-4 항체는 활성화 Fcγ 수용체 (FcγR)에 대한 결합을 증진시키는 적어도 1개의 아미노산 돌연변이, 예컨대 i) G236A, ii) S239D, iii) F243L, iv) E333A, v)　G236A/I332E, vi)　S239D/I332E, vii) S267E/H268F, viii) S267E/S324T, ix)　H268F/S324T, x)　G236A/S239D/I332E, xi) S239D/A330L/I332E, xii)　S267E/H268F/S324T 및 xiii)　G236A/S239D/A330L/I332E로 이루어진 군으로부터 선택되는 돌연변이 또는 돌연변이의 클러스터를 포함한다. 추가 실시양태에서, ADCC를 증진시키는 1개 이상의 아미노산을 포함하는 증진된 ADCC 활성을 갖는 항-인간 CTLA-4 항체는 또한 감소된 푸코실화를 갖거나 또는 저푸코실화 또는 비푸코실화된다.
도면에 제공된 실험 결과는 실시예 1에 기재된 마우리티안 시노몰구스 마카크에서 실험의 3회의 독립적 반복 (반복 A, 반복 B 및 반복 C)으로부터 유래된다. 4마리의 시노/군이 수반된 반복 A는 도 1a, 2a, 3a, 4a, 5a, 7a, 8a, 및 9a에 제시된 데이터를 수득하는데 사용된 샘플을 제공하였다. 6마리의 시노/군이 수반된 반복 B는 도 1b, 2b, 3b, 4b, 5b, 6a (반복 A로부터의 Nef LT9 데이터가 존재하지 않음), 7b, 8b, 9b 및 11에 제시된 데이터를 수득하는데 사용된 샘플을 제공하였다. 6마리의 시노/군이 수반된 반복 C는 도 1c, 2c, 3c, 4c, 5c, 6b (반복 A로부터의 Nef LT9 데이터가 존재하지 않음), 7c, 8c, 및 9c에 제시된 데이터를 수득하는데 사용된 샘플을 제공하였다. 데이터 포인트에 대한 특정 수치 값은 별개의 실험 프로토콜에서의 작은 차이로 인해 반복 사이에서 달라질 수 있지만 (예를 들어, 반복 A 및 B를 반복 C와 비교함), 정성적 경향, 및 그에 따른 관련 과학적 결론은 동일하다.
비푸코실화된 항-CTLA-4 항체의 경우, 반복 B 및 C는 항-인간 CTLA-4 mAb 이필리무맙 (예르보이(YERVOY)®)을 사용하는 반면, 반복 A는 이필리무맙의 IgG1f 동종이형 변이체를 사용하였다. 두 동종이형 모두는 본원의 실험에서 기능적으로 동등하다.
도 1a-1c는 지시된 양 (10 mg/kg 또는 1 mg/kg)의 지시된 항체, 또는 비히클로 처리된 Mafa-A1*063+ 마우리티안 시노몰구스 마카크로부터 수득된 전혈에서의 FACS-분류된 Nef RM9-특이적 CD8+ CD3+ 림프구의 종방향 추적을 보여준다. 실시예 1에서 보다 상세하게 기재된 바와 같이, 동물은 또한 하나는 SIV Nef 단백질을 발현하고 다른 것은 SIV Gag 단백질을 발현하는 2개의 재조합 Ad5 벡터로 처리되었다. Nef RM9+ 세포는 RM9 펩티드-로딩된 MHC 부류 I 사량체에 대한 그의 결합에 기초하여 선택되었다. "불활성" 항-CTLA-4는 N-연결된 글리코실화 부위를 제거하여 이펙터 기능이 결여된 비글리코실화된 Fc 영역을 생성하는 N297A 중쇄 서열 변이체를 지칭한다. 이 도면 및 "불활성" 항-CTLA-4 항체의 사용을 보고하는 모든 다른 도면에서, 항체는 10 mg/kg으로 투여되었다. 도 1a-1c 모두에서, 10 mg/kg 항-CTLA4-NF (상향 삼각형)는 가장 위에 있는 곡선이다.
도 2a-2c는 지시된 양 (10 mg/kg 또는 1 mg/kg)의 지시된 항체, 또는 비히클로 처리된 Mafa-A1*063+ 마우리티안 시노몰구스 마카크로부터 수득된 전혈에서의 FACS-분류된 Gag GW9-특이적 CD8+ CD3+ 림프구의 종방향 추적을 보여준다. 실시예 1에서 보다 상세하게 기재된 바와 같이, 동물은 또한 하나는 SIV Nef 단백질을 발현하고 다른 것은 SIV Gag 단백질을 발현하는 2개의 재조합 Ad5 벡터로 처리되었다. Gag GW9+ 세포는 GW9 펩티드-로딩된 MHC 부류 I 사량체에 대한 그의 결합에 기초하여 선택되었다. 도 2a-2c 모두에서, 10 mg/kg 항-CTLA4-NF (상향 삼각형)는 가장 위에 있는 곡선이다.
도 3a-3c는 지시된 양 (10 mg/kg 또는 1 mg/kg)의 지시된 항체, 또는 비히클로 처리된 Mafa-A1*063+ 마우리티안 시노몰구스 마카크로부터 수득된 전혈에서의 FACS 분류된 Nef LT9-특이적 CD8+ CD3+ 림프구의 종방향 추적을 보여준다. 실시예 1에서 보다 상세하게 기재된 바와 같이, 동물은 또한 하나는 SIV Nef 단백질을 발현하고 다른 것은 SIV Gag 단백질을 발현하는 2개의 재조합 Ad5 벡터로 처리되었다. Nef LT9+ 세포는 LT9 펩티드-로딩된 MHC 부류 I 사량체에 대한 그의 결합에 기초하여 선택되었다. 도 3a-3c 모두에서, 10 mg/kg 항-CTLA4-NF (상향 삼각형)는 가장 위에 있는 곡선이다.
도 4a-4c는 지시된 양 (10 mg/kg 또는 1 mg/kg)의 지시된 항체, 또는 비히클로 처리하고 22일 (도 4a), 또는 22일 및 43일 (도 4b 및 4c) 후에, Mafa-A1*063+ 마우리티안 시노몰구스 마카크로부터 수득된 피콜-단리된 PBMC에서의 배경 차감 후의 스팟-형성 세포 (SFC) 값으로서 제시된, Nef RM9-펩티드 유도된 IFN-γ 생산을 보여주는 ELISPOT 결과를 제시한다. 이 도면 및 본원의 모든 다른 도면에서, 항체는 투여가 지시되지 않은 경우에 10 mg/kg으로 투여되었다. 실시예 1에서 보다 상세하게 기재된 바와 같이, 동물은 또한 하나는 SIV Nef 단백질을 발현하고 다른 것은 SIV Gag 단백질을 발현하는 2개의 재조합 Ad5 벡터로 처리되었다. PBMC를 10 μM Nef RM9 최소 최적 펩티드로 18시간 동안 자극하였다.
도 5a-5c는 지시된 양 (10 mg/kg 또는 1 mg/kg)의 지시된 항체, 또는 비히클로 처리하고 22일 (도 5a), 또는 22일 및 43일 (도 5b 및 5c) 후에, Mafa-A1*063+ 마우리티안 시노몰구스 마카크로부터 수득된 피콜-단리된 PBMC에서의 배경 차감 후의 스팟-형성 세포 (SFC) 값으로서 제시된, Gag GW9-펩티드 유도된 IFN-γ 생산을 보여주는 ELISPOT 결과를 제시한다. 실시예 1에서 보다 상세하게 기재된 바와 같이, 동물은 또한 하나는 SIV Nef 단백질을 발현하고 다른 것은 SIV Gag 단백질을 발현하는 2개의 재조합 Ad5 벡터로 처리되었다. PBMC를 10 μM Gag GW9 최소 최적 펩티드로 18시간 동안 자극하였다.
도 6a-6b는 지시된 양 (10 mg/kg 또는 1 mg/kg)의 지시된 항체, 또는 비히클로 처리하고 22 및 43일 후에 Mafa-A1*063+ 마우리티안 시노몰구스 마카크로부터 수득된 피콜-단리된 PBMC에서의 배경 차감 후의 스팟-형성 세포 (SFC) 값으로서 제시된, Nef LT9-펩티드 유도된 IFN-γ 생산을 보여주는 ELISPOT 결과를 제시한다. 본 실험은 반복 A로부터의 데이터를 포함하지 않고, 단지 반복 B 및 C로부터의 데이터만을 포함한다. 실시예 1에서 보다 상세하게 기재된 바와 같이, 동물은 또한 하나는 SIV Nef 단백질을 발현하고 다른 것은 SIV Gag 단백질을 발현하는 2개의 재조합 Ad5 벡터로 처리되었다. PBMC를 10 μM Nef LT9 최소 최적 펩티드로 18시간 동안 자극하였다.
도 7a-7c는 지시된 양 (10 mg/kg 또는 1 mg/kg)의 지시된 항체, 또는 비히클로 처리된 Mafa-A1*063+ 마우리티안 시노몰구스 마카크의 전혈에서 순환하는 Ki-67+ CD4+ CD3+ 림프구 (유동 세포측정법에 의해 측정됨)의 종방향 추적을 보여준다. 실시예 1에서 보다 상세하게 기재된 바와 같이, 동물은 또한 하나는 SIV Nef 단백질을 발현하고 다른 것은 SIV Gag 단백질을 발현하는 2개의 재조합 Ad5 벡터로 처리되었다. Ki-67은 증식의 세포내 마커이다. 도 7c 및 도 8c에서 제43일에 제시된 값은 이례적으로 높은 것으로 보이고, 아마도 이상치를 나타낸다.
도 8a-8c는 지시된 양 (10 mg/kg 또는 1 mg/kg)의 지시된 항체, 또는 비히클로 처리된 Mafa-A1*063+ 마우리티안 시노몰구스 마카크의 전혈에서 순환하는 Ki-67+ CD8+ CD3+ 림프구 (유동 세포측정법에 의해 측정됨)의 종방향 추적을 보여준다. 실시예 1에서 보다 상세하게 기재된 바와 같이, 동물은 또한 하나는 SIV Nef 단백질을 발현하고 다른 것은 SIV Gag 단백질을 발현하는 2개의 재조합 Ad5 벡터로 처리되었다. Ki-67은 증식의 세포내 마커이다. 도 8a-8c 모두에서, 10 mg/kg 항-CTLA4-NF (상향 삼각형)는 가장 위에 있는 곡선이다.
도 9a-9c는 지시된 양 (10 mg/kg 또는 1 mg/kg)의 지시된 항체, 또는 비히클로 처리하고 22 및 43일 후에 Mafa-A1*063+ 마우리티안 시노몰구스 마카크로부터 수득된 피콜-단리된 PBMC에서의 배경 차감 후의 스팟-형성 세포 (SFC) 값으로서 제시된, Ad5 단백질-유도된 IFN-γ 생산을 보여주는 ELISPOT 결과를 제시한다. 항체는 투여가 지시되지 않은 경우에 10 mg/kg으로 투여되었다. 실시예 1에서 보다 상세하게 기재된 바와 같이, 동물은 또한 하나는 SIV Nef 단백질을 발현하고 다른 것은 SIV Gag 단백질을 발현하는 2개의 재조합 Ad5 벡터로 처리되었다. PBMC를 18시간 동안 5x108개의 열-불활성화 Ad5 바이러스 입자로 자극하였다.
도 10은 표적 세포의 특이적 NK 세포-매개 용해에 대한 항-CTLA-4 항체 이필리무맙의 비푸코실화의 효과를 보여준다. 이는 인간 공여자로부터의 활성화된 Treg의 특이적 용해를 유도하는 세포주 NK92의 능력의 검정에서, 이소형 대조군 (삼각형 데이터 포인트, 하부 곡선)과 비교하여 이필리무맙 (원 데이터 포인트) 및 이필리무맙의 비푸코실화된 변이체 (사각형 데이터 포인트, 최상단 곡선)의 적정을 제공한다. 실시예 2를 참조한다. 비푸코실화된 Fc는 이필리무맙의 용해 활성을 증가시켜, EC50을 1.5 μg/ml에서 0.0065 μg/ml로 감소시킨다.
도 11은 10 mg/kg 이필리무맙, 10 mg/kg 이필리무맙-NF 또는 비히클로 처리된 Mafa-A1*063+ 마우리티안 시노몰구스 마카크의 혈액 내 Treg의 빈도를 보여준다. 데이터는 반복 B의 원숭이로부터 수득되었다. 실시예 1을 참조한다. 이필리무맙 데이터는, 대체로 최상단 곡선인 파선 상의 다이아몬드로서 제시된다. 이필리무맙-NF 데이터는 대체로 중간 곡선인 실선 상의 삼각형으로서 제시된다. 비히클 대조군 데이터는 대체로 최하단 곡선인 점선 상의 원으로서 제시된다. 데이터 포인트는 6마리 동물의 평균이고, 오차 막대는 하나의 표준 편차를 나타낸다.
정의
본 개시내용을 보다 용이하게 이해할 수 있도록, 특정 용어를 먼저 정의한다. 본원에서 달리 명확하게 제공된 경우를 제외하고는, 본 출원에 사용된 하기 용어 각각은 하기에 제시된 의미를 가질 것이다. 추가의 정의가 본 출원 전반에 걸쳐 제시된다.
본원에 사용된 "아주반트"는 대상체에게 백신과 함께 투여되어, 아주반트 없이 백신이 투여되었을 때 발생할 면역 반응과 비교하여 백신에 대한 면역 반응을 증진시키는 작용제를 지칭한다. 본 발명의 아주반트는 증진된 ADCC 활성을 갖는 항-CTLA-4 항체이다.
"투여하는", "투여하다" 또는 "투여"는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다양한 방법 및 전달 시스템 중 임의의 것을 사용하여, 치료제를 포함하는 조성물을 대상체에게 물리적으로 도입하는 것을 지칭한다. 본 발명의 항체의 바람직한 투여 경로는 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 척추 또는 다른 비경구 투여 경로, 예를 들어 주사 또는 주입에 의한 것을 포함한다. 본원에 사용된 어구 "비경구 투여"는 통상적으로 주사에 의하는, 경장 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하며, 비제한적으로, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 림프내, 병변내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 경기관, 피하, 각피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입, 뿐만 아니라 생체내 전기천공을 포함한다. 대안적으로, 본 발명의 항체는 비-비경구 경로, 예컨대 국소, 표피 또는 점막 투여 경로를 통해, 예를 들어 비강내로, 경구로, 질로, 직장으로, 설하로 또는 국소로 투여될 수 있다. 또한, 투여는 예를 들어 1회, 복수회, 및/또는 1회 이상의 연장된 기간에 걸쳐 수행될 수 있다.
백신과 "함께" 증진된 ADCC를 갖는 항-CTLA-4 항체의 투여는 임의의 투여 스케줄 또는 투여 횟수를 포함한 임의의 순서의 투여 또는 동시 투여를 포괄하며, 단 증진된 ADCC를 갖는 항-CTLA-4 항체의 투여는 백신에 대한 면역 반응을 부스팅하도록 의도된다.
"항체" (Ab)는, 비제한적으로, 항원에 특이적으로 결합하고 디술피드 결합에 의해 상호연결된 적어도 2개의 중쇄 (HC) 및 2개의 경쇄 (LC)를 포함하는 당단백질 이뮤노글로불린을 포함할 수 있다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인, CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 상보성 결정 영역 (CDR)으로 불리는 초가변성의 영역으로 추가로 세분될 수 있고, 이는 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는 보다 보존된 영역 사이에 위치한다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 하기 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다.
본원에 사용된 바와 같이, 및 통상적인 해석에 따라, 중쇄 및/또는 경쇄를 포함하는 것으로 기재된 항체는 "적어도 1개의" 언급된 중쇄 및/또는 경쇄를 포함하는 항체를 지칭하고, 따라서 2개 이상의 중쇄 및/또는 경쇄를 갖는 항체를 포괄할 것이다. 구체적으로, 이와 같이 기재된 항체는 2개의 실질적으로 동일한 중쇄 및 2개의 실질적으로 동일한 경쇄를 갖는 통상적인 항체를 포괄할 것이다. 항체 쇄는 이들이 번역후 변형, 예컨대 리신 잔기의 C-말단 절단, 대안적인 글리코실화 패턴 등으로 인해 상이한 경우에 실질적으로 동일하지만 완전히 동일하지는 않을 수 있다. 그러나, 글리칸에서의 푸코실화가 상이한 항체는 실질적으로 동일하지 않다.
달리 나타내거나 문맥상 명백하지 않는 한, 그의 표적 특이성에 의해 정의된 항체 (예를 들어 "항-CTLA-4 항체")는 그의 인간 표적 (예를 들어 인간 CTLA-4)에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 이러한 항체는 다른 종으로부터의 CTLA-4에 결합하거나 결합하지 않을 수 있다.
이뮤노글로불린은 IgA, 분비형 IgA, IgG 및 IgM을 포함하나 이에 제한되지는 않는 통상적으로 알려져 있는 이소형 중 임의의 것으로부터 유래할 수 있다. IgG 이소형은 특정 종에서 하위부류로 분류될 수 있다: 인간에서 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4, 및 마우스에서 IgG1, IgG2a, IgG2b 및 IgG3. "이소형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 코딩되는 항체 부류 (예를 들어, IgM 또는 IgG1)를 지칭한다. "항체"는, 예로서, 동종이형 변이체; 모노클로날 및 폴리클로날 항체; 키메라 및 인간화 항체; 인간 또는 비-인간 항체; 완전 합성 항체; 및 단일 쇄 항체를 포함한 자연 발생 및 비-자연 발생 항체 둘 다를 포함한다. 달리 나타내거나 문맥상 명백하지 않는 한, 본원에 개시된 항체는 인간 IgG1 항체이다. IgG1 불변 도메인 서열은 이필리무맙의 불변 도메인으로서 본원에 제공된 IgG1 동종이형 변이체 (IgG1fa, 서열식별번호: 11의 잔기 119-448 및 서열식별번호: 12의 119-447) 및 IgG1za (서열식별번호: 28 및 29)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
"단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭한다 (예를 들어, CTLA-4에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 CTLA-4 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없음). 그러나, CTLA-4에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 항원, 예컨대 상이한 종으로부터의 CTLA-4 분자와 교차반응할 수 있다. 더욱이, 단리된 항체에는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다. 그에 비해, "단리된" 핵산은 자연에서 존재하는 핵산과 현저하게 상이한, 즉 특징적인 화학적 정체성, 성질 및 유용성을 갖는 물질의 핵산 조성물을 지칭한다. 예를 들어, 단리된 DNA는 천연 DNA와는 달리, 천연 DNA의 독립적 부분이고, 자연계에서 발견되는, 보다 큰 구조적 복합체인 염색체의 내재성 부분이 아니다. 추가로, 천연 DNA와 달리, 단리된 DNA는 특히, 질환을 진단하거나 또는 치료제의 효능을 예측하기 위해 유전자 발현을 측정하고 바이오마커 유전자 또는 돌연변이를 검출하기 위한 PCR 프라이머 또는 혼성화 프로브로서 사용될 수 있다. 단리된 핵산은 또한 관련 기술분야에 널리 공지된 표준 기술을 사용하여 다른 세포 성분 또는 다른 오염물, 예를 들어, 다른 세포 핵산 또는 단백질이 실질적으로 없도록 정제될 수 있다.
용어 "모노클로날 항체" ("mAb")는 단일 분자 조성의 항체 분자, 즉, 1차 서열이 본질적으로 동일하고, 특정한 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타내는 항체 분자의 제제를 지칭한다. 모노클로날 항체는 하이브리도마, 재조합, 트랜스제닉, 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 기술에 의해 생산될 수 있다.
"인간" 항체 (HuMAb)는 프레임워크 및 CDR 영역 둘 다가 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는 항체를 지칭한다. 게다가, 항체가 불변 영역을 함유하는 경우, 불변 영역은 또한 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된다. 본 발명의 인간 항체는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해, 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 또 다른 포유동물 종, 예컨대, 마우스의 배선으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 상에 그라프팅된 항체를 포함하는 것으로 의도되지 않는다. 용어 "인간" 항체 및 "완전 인간" 항체는 동의어로 사용된다.
"인간화" 항체는 비-인간 동물로부터 유래된 CDR 영역, 예를 들어 설치류 이뮤노글로불린 배선 서열을 갖는 항체를 지칭하고, 여기서 CDR 도메인 외부의 아미노산 중 일부, 대부분 또는 모두는 인간 면역글로불린으로부터 유래된 상응하는 아미노산으로 대체된다. 항체의 인간화 형태의 한 실시양태에서, CDR 도메인 외부의 아미노산 중 일부, 대부분 또는 모두는 인간 이뮤노글로불린으로부터의 아미노산으로 대체되었지만, 1개 이상의 CDR 영역 내의 아미노산 중 일부, 대부분 또는 모두는 변화되지 않는다. 특정한 항원에 결합하는 항체의 능력을 무효화시키지 않는 한, 아미노산의 작은 부가, 결실, 삽입, 치환 또는 변형은 허용가능하다. "인간화된" 항체는 원래 항체의 것과 유사한 항원 특이성을 보유한다.
"키메라 항체"는, 가변 영역은 한 종으로부터 유래되고 불변 영역은 또 다른 종으로부터 유래된 항체, 예컨대 가변 영역은 마우스 항체로부터 유래되고 불변 영역은 인간 항체로부터 유래된 항체를 지칭한다.
"항체 단편"은 일반적으로 무손상 항체에 의해 결합된 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하고 또한 FcR 결합 능력을 매개하는 항체의 Fc 영역을 보유하는 무손상 항체의 "항원-결합 부분" ("항원-결합 단편")을 포함하는 전체 항체의 부분을 지칭한다.
"항체-의존성 세포-매개 세포독성" ("ADCC")은 시험관내 또는 생체내 세포-매개 반응을 지칭하고, 여기서 FcR을 발현하는 비특이적 세포독성 세포 (예를 들어, 자연 킬러 (NK) 세포, 대식세포, 호중구 및 호산구)는 표적 세포 상의 표면 항원에 결합된 항체를 인식하고, 후속적으로 표적 세포의 용해를 유발한다. 이론적으로, 활성화 FcR을 갖는 임의의 이펙터 세포는 ADCC를 매개하도록 촉발될 수 있다.
본 발명의 항-CTLA-4 항체와 관련하여 본원에 사용된 "증진된 ADCC" 또는 "증진된 ADCC 활성"은 비변형된 이필리무맙에 의해 유도된 ADCC보다 더 큰 ADCC 활성 수준을 지칭한다. 본 발명의 증진된 ADCC를 갖는 이필리무맙은 예를 들어 그의 천연 IgG1 불변 도메인을 갖는 이필리무맙보다 더 큰 ADCC를 유도하는 변형된 형태의 이필리무맙이다. 트레멜리무맙의 경우, 증진된 ADCC는 또한 이필리무맙을 참조하여 측정된다. 본원에서 명세서 및 도면에 사용된 "이필리무맙", "ipi" 및 예르보이®는, 달리 명백하게 나타내지 않는 한, 서열식별번호: 13의 경쇄 및 서열식별번호: 12의 중쇄 (C-말단 리신 잔기가 결여됨)를 포함하는 항체를 지칭한다. 오직 반복 A의 실험과 관련하여, "이필리무맙"은 돌연변이 D357E 및 L359M (IgG1f)을 포함하는 동종이형 변이체를 포괄한다. 일부 실시양태에서, ADCC 활성의 증진 수준은 실시예 2에 기재된 검정에서 NK92 세포 매개 세포 용해에 대한 EC50의 적어도 2배, 및 임의로 적어도 10배의 감소로 측정된다.
"암"은 체내에서 비정상 세포의 비제어된 성장을 특징으로 하는 광범위한 다양한 질환 군을 지칭한다. 비조절된 세포 분열 및 성장은 분열 및 성장으로 인해 이웃 조직을 침습하는 악성 종양 또는 세포를 형성하고, 또한 림프계 또는 혈류를 통해 신체의 원위 부분으로 전이될 수 있다.
"세포 표면 수용체"는 신호를 수신할 수 있고 이러한 신호를 세포의 형질 막을 가로질러 전달할 수 있는 분자 및 분자 복합체를 지칭한다.
"이펙터 기능"은 항체 Fc 영역과 Fc 수용체 또는 리간드의 상호작용, 또는 그로부터 발생한 생화학적 사건을 지칭한다. 예시적인 "이펙터 기능"은 Clq 결합, 보체 의존성 세포독성 (CDC), Fc 수용체 결합, FcγR-매개 이펙터 기능, 예컨대 ADCC 및 항체 의존성 세포-매개 식세포작용 (ADCP), 및 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향조절을 포함한다. 이러한 이펙터 기능은 일반적으로 Fc 영역이 결합 도메인 (예를 들어, 항체 가변 도메인)과 조합될 것을 필요로 한다.
"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 이뮤노글로불린의 Fc 영역에 결합하는 수용체이다. IgG 항체에 결합하는 FcR은 이들 수용체의 대립유전자 변이체 및 대안적으로 스플라이싱된 형태를 포함한, FcγR 패밀리의 수용체를 포함한다. FcγR 패밀리는 3종의 활성화 (마우스에서 FcγRI, FcγRIII, 및 FcγRIV; 인간에서 FcγRIA, FcγRIIA, 및 FcγRIIIA) 수용체 및 1종의 억제 (FcγRIIB) 수용체로 이루어진다. 인간 FcγR의 다양한 특성이 표 1에 요약되어 있다. 대다수의 선천성 이펙터 세포 유형은 1종 이상의 활성화 FcγR 및 억제 FcγRIIB를 공동-발현하는 반면에, 자연 킬러 (NK) 세포는 1종의 활성화 Fc 수용체 (마우스에서 FcγRIII 및 인간에서 FcγRIIIA)를 선택적으로 발현하지만, 마우스 및 인간에서 억제 FcγRIIB는 발현하지 않는다.
"Fc 영역" (결정화가능 단편 영역) 또는 "Fc 도메인" 또는 "Fc"는, 면역계의 다양한 세포 (예를 들어, 이펙터 세포) 상에 위치하는 Fc 수용체 또는 전형적 보체계의 제1 성분 (C1q)에 대한 결합을 포함한, 이뮤노글로불린의 숙주 조직 또는 인자에 대한 결합을 매개하는 항체의 중쇄의 C-말단 영역을 지칭한다. 따라서, Fc 영역은 제1 불변 영역 이뮤노글로불린 도메인을 제외한 항체의 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드이다. IgG, IgA 및 IgD 항체 이소형에서, Fc 영역은 항체의 2개의 중쇄의 제2 (CH2) 및 제3 (CH3) 불변 도메인으로부터 유래된 2개의 동일한 단백질 단편으로 구성되고; IgM 및 IgE Fc 영역은 각각의 폴리펩티드 쇄에서 3개의 중쇄 불변 도메인 (CH 도메인 2-4)을 함유한다. IgG의 경우에, Fc 영역은 이뮤노글로불린 도메인 Cγ2 및 Cγ3, 및 Cγ1과 Cγ2 사이의 힌지를 포함한다. 이뮤노글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계가 달라질 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 통상적으로 위치 C226 또는 P230에서의 아미노산 잔기로부터 중쇄의 카르복시-말단까지의 스트레치로 정의되고, 여기서 넘버링은 카바트에서와 같은 EU 인덱스에 따른 것이다. 인간 IgG Fc 영역의 CH2 도메인은 약 아미노산 231에서 약 아미노산 340까지 연장되는 반면, CH3 도메인은 Fc 영역에서 CH2 도메인의 C-말단 측 상에 위치하고, 즉, 이는 IgG의 약 아미노산 341에서 약 아미노산 447까지 연장된다. 본원에 사용된 Fc 영역은 천연 서열 Fc 또는 변이체 Fc일 수 있다. Fc는 또한 단리된, 또는 Fc-포함 단백질 폴리펩티드, 예컨대 "Fc 영역을 포함하는 결합 단백질" ("Fc-융합 단백질" (예를 들어, 항체 또는 이뮤노어드헤신)로도 지칭됨)과 관련된 이러한 영역을 지칭할 수 있다.
표 1
인간 FcγR의 특성
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본원에 사용된 "푸코실화" 및 "비푸코실화"는 항체의 위치 N297 (EU 넘버링)에서 N-연결된 글리칸 상의 코어 푸코스 잔기의 존재 또는 부재를 지칭한다.
"면역 반응"은 외래 작용제에 대한 척추동물 내에서의 생물학적 반응을 지칭하며, 반응은 이들 작용제 및 그에 의해 유발되는 질환에 대해 유기체를 보호한다. 면역 반응은 침입 병원체, 병원체로 감염된 세포 또는 조직, 암성 또는 다른 비정상 세포, 또는 자가면역 또는 병리학적 염증의 경우에는 정상 인간 세포 또는 조직의 선택적 표적화, 그에 대한 결합, 그에 대한 손상, 그의 파괴, 및/또는 그의 척추동물 신체로부터의 제거를 발생시키는, 면역계 세포 (예를 들어, T 림프구, B 림프구, 자연 킬러 (NK) 세포, 대식세포, 호산구, 비만 세포, 수지상 세포 또는 호중구) 및 이들 세포 중 임의의 것 또는 간에 의해 생산된 가용성 거대분자 (항체, 시토카인 및 보체 포함)의 작용에 의해 매개된다.
"면역조정제" 또는 "면역조절제"는 면역 반응의 조정, 조절 또는 변형에 수반될 수 있는 신호전달 경로의 성분을 지칭한다. 면역 반응을 "조정하는", "조절하는" 또는 "변형하는"은 면역계의 세포에서 또는 이러한 세포의 활성에서의 임의의 변경을 지칭한다. 이러한 조정은 다양한 세포 유형의 수에서의 증가 또는 감소, 이들 세포의 활성에서의 증가 또는 감소, 또는 면역계 내에서 발생할 수 있는 임의의 다른 변화에 의해 나타날 수 있는 면역계의 자극 또는 억제를 포함한다. 억제 및 자극 면역조정제 둘 다가 확인되었고, 이들 중 일부는 종양 미세환경에서 증진된 기능을 가질 수 있다. 개시된 발명의 바람직한 실시양태에서, 면역조정제는 T 세포의 표면 상에 위치한다. "면역조정 표적" 또는 "면역조절 표적"은 물질, 작용제, 모이어티, 화합물 또는 분자에 의한 결합에 대해 표적화되고, 그의 활성이 결합에 의해 변경되는 면역조정제이다. 면역조정 표적은 예를 들어, 세포 표면 상의 수용체 ("면역조정 수용체") 및 수용체 리간드 ("면역조정 리간드")를 포함한다.
"면역요법"은 면역 반응을 유도, 증진, 억제, 또는 달리 변형하는 것을 포함하는 방법에 의해 질환을 앓거나, 또는 그에 걸릴 위험이 있거나 또는 그의 재발을 겪고 있는 대상체를 치료하는 것을 지칭한다.
"내인성 면역 반응을 강화시키는"은 대상체에서 기존 면역 반응의 유효성 또는 효력을 증가시키는 것을 의미한다. 유효성 및 효력의 이러한 증가는, 예를 들어 내인성 숙주 면역 반응을 억제하는 메카니즘을 극복하거나 또는 내인성 숙주 면역 반응을 증진시키는 메카니즘을 자극함으로써 달성될 수 있다.
"단백질"은 쇄의 길이에 대한 상한치 없이, 적어도 2개의 연속적으로 연결된 아미노산 잔기를 포함하는 쇄를 지칭한다. 단백질에서의 1개 이상의 아미노산 잔기는 변형 예컨대, 비제한적으로, 글리코실화, 인산화 또는 디술피드 결합 형성을 함유할 수 있다. 용어 "단백질"은 본원에서 "폴리펩티드"와 상호교환가능하게 사용된다.
"대상체"는 임의의 인간 또는 비-인간 동물을 포함한다. 용어 "비-인간 동물"은 척추동물, 예컨대 비인간 영장류, 양, 개, 토끼, 설치류 예컨대 마우스, 래트 및 기니 피그, 조류 종 예컨대 닭, 양서류, 및 파충류를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 바람직한 실시양태에서, 대상체는 포유동물 예컨대 비인간 영장류, 양, 개, 고양이, 토끼, 페릿 또는 설치류이다. 개시된 발명의 임의의 측면의 보다 바람직한 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 용어 "대상체" 및 "환자"는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
약물 또는 치료제, 예컨대 본 발명의 Fc 융합 단백질의 "치료 유효량" 또는 "치료 유효 투여량"은 단독으로, 또는 또 다른 치료제와 조합하여 사용되는 경우에, 질환 증상의 중증도 감소로 입증되는 질환 퇴행, 질환 무증상 기간의 빈도 및 지속기간 증가, 또는 질환 고통으로 인한 손상 또는 장애 예방을 촉진시키는 약물의 임의의 양이다. 약물의 치료 유효량 또는 치료 유효 투여량은 "예방 유효량" 또는 "예방 유효 투여량"을 포함하며, 이는 질환이 발생할 위험이 있거나 또는 질환이 재발될 위험이 있는 대상체에게 단독으로, 또는 또 다른 치료제와 조합하여 투여되는 경우에, 질환의 발생 또는 재발을 억제하는 약물의 임의의 양이다. 질환 퇴행을 촉진하거나 질환의 발생 또는 재발을 억제하는 치료제의 능력은 숙련된 진료의에게 공지된 다양한 방법을 사용하여, 예컨대 임상 시험 동안 인간 대상체에서, 인간에서의 효능을 예측하는 동물 모델 시스템에서, 또는 시험관내 검정에서 치료제의 활성을 검정함으로써 평가될 수 있다.
예로서, 항암제는 대상체에서 암 퇴행을 촉진시킨다. 바람직한 실시양태에서, 약물의 치료 유효량은 암이 제거되는 시점까지 암 퇴행을 촉진시킨다. "암 퇴행을 촉진시키는 것"은 유효량의 약물을 단독으로 또는 항신생물제와 조합하여 투여함으로써 환자에서 종양 성장 또는 크기의 감소, 종양의 괴사, 적어도 1종의 질환 증상의 중증도 감소, 질환 무증상 기간의 빈도 및 지속기간 증가, 질환 고통으로 인한 손상 또는 장애 예방, 또는 달리 질환 증상의 호전을 발생시키는 것을 의미한다. 또한, 치료와 관련하여 용어 "유효" 및 "유효성"은 약리학적 유효성 및 생리학적 안전성 둘 다를 포함한다. 약리학적 유효성은 환자에서 암 퇴행을 촉진시키는 약물의 능력을 지칭한다. 생리학적 안전성은 약물의 투여로부터 생성되는 독성의 수준, 또는 세포, 기관 및/또는 유기체 수준에서의 다른 유해 생리학적 효과 (부작용)를 지칭한다.
종양 치료에 대한 예로서, 치료 유효량 또는 치료 유효 투여량의 약물은 바람직하게는 세포 성장 또는 종양 성장을 비치료된 대상체에 비해 적어도 약 20%, 보다 바람직하게는 적어도 약 40%, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 60%, 및 보다 더 바람직하게는 적어도 약 80%만큼 억제한다. 가장 바람직한 실시양태에서, 치료 유효량 또는 치료 유효 투여량의 약물은 세포 성장 또는 종양 성장을 완전히 억제하며, 즉, 바람직하게는 세포 성장 또는 종양 성장을 100%만큼 억제한다. 종양 성장을 억제하는 화합물의 능력은 인간 종양에서 효능을 예측하는 동물 모델 시스템, 예컨대 CT26 결장 선암종, MC38 결장 선암종 및 Sa1N 섬유육종 마우스 종양 모델에서 평가될 수 있다. 대안적으로, 조성물의 이러한 특성은 세포 성장을 억제하는 화합물의 능력을 검사함으로써 평가할 수 있고, 이러한 억제는 숙련된 진료의에게 공지된 검정에 의해 시험관내에서 측정될 수 있다. 본 발명의 다른 바람직한 실시양태에서, 종양 퇴행은 적어도 약 20일, 보다 바람직하게는 적어도 약 40일, 또는 보다 더 바람직하게는 적어도 약 60일의 기간 동안 관찰되고 지속될 수 있다.
대상체의 "치료" 또는 "요법"은 질환과 연관된 증상, 합병증, 상태 또는 생화학적 징후의 발병, 진행, 발달, 중증도 또는 재발을 역전시키거나, 완화시키거나, 호전시키거나, 억제하거나, 늦추거나 또는 예방할 목적으로 대상체에 대해 수행되는 임의의 유형의 개입 또는 과정, 또는 활성제의 투여를 지칭한다.
증진된 ADCC를 갖는 항-CTLA-4 항체는 아주반트로서 보다 효과적이다
현재 CTLA-4는 주로 CD4+ T 세포의 2개의 주요 하위세트에 대한 2가지 특징적인 효과를 통해 그의 생리학적 기능을 발휘하는 것으로 인식된다: (1) 헬퍼 T 세포 활성의 하향-조정, 및 (2) 조절 T 세포 (Treg)의 면역억제 활성의 증진. Lenschow et al. (1996) Ann. Rev. Immunol. 14:233; Wing et al. (2008) Science 322:271; Peggs et al. (2009) J. Exp. Med. 206:1717. Treg는 높은 수준의 표면 CTLA-4를 구성적으로 발현하는 것으로 알려져 있고, 이 분자는 그의 조절 기능에 필수적인 것으로 제안되었다. Takahashi et al. (2000) J. Exp. Med. 192:303; Birebent et al. (2004) Eur. J. Immunol. 34:3485. 따라서, Treg 집단이 CTLA-4 차단의 효과에 가장 감수성일 수 있다. 이필리무맙 환자의 연구는 또한 반응자가, 비-반응자와 구별되게, 치료 후에 감소된 Treg 침윤을 나타내며, ADCC 메카니즘을 통해 발생하고 FcγRIIIA-발현 비-전형적 (CD14+CD16++) 단핵구에 의해 매개되는 고갈을 나타낸다는 것을 보여준다. Romano et al. (2014) J. Immunotherapy of Cancer 2(Suppl. 3):O14.
한 측면에서, 본 발명은 증진된 ADCC를 나타내도록 변형된 항-CTLA-4 항체, 예컨대 이필리무맙을 투여함으로써 백신에 대한 면역 반응을 증진시키는 개선된 방법을 제공한다. 이러한 항체는 본원에 제공된 실험 결과에 비추어 개선된 백신 아주반트 활성을 나타낸다.
증진된 ADCC 활성을 갖는 항-CTLA-4 항체는 백신에 대한 면역 반응을 증진시킬 것으로 예상되지 않았었다. 암 치료에 있어서 이러한 항체의 효과에 대한 선행 실험은 사실상, 증진된 ADCC를 갖거나 갖지 않는 항-CTLA4 항체를 사용한 치료가 실제로 말초 (즉, 종양 미세환경의 외부)에서 조절 T 세포 (Treg)의 집단을 증가시켰음을 보여주었는데, 이는 백신 반응을 증진시키기보다는 오히려 그를 감소시킬 것으로 예상되던 것이었다. 문헌 [Selby et al. (2013) Cancer Immunol. Res. 1:32], 요약서, 및 도 2a를 참조한다.
증진된 ADCC를 갖는 이러한 항-CTLA-4 항체를 사용하면 백신의 주어진 용량에서 백신 효능을 증진시킬 수 있거나, 또는 임의의 주어진 수준의 효능을 달성하기 위해 보다 낮은 투여량을 허용할 수 있고/거나, 면역 반응의 지속성을 증가시킬 수 있다. 증진된 ADCC 활성을 갖는 항-CTLA-4 항체를 사용하는 것을 수반하는 본 발명의 방법은 B 세포 및 T 세포 면역 반응 둘 다를, 자기 및 외래 항원 둘 다에 대해, 및 우세 및 준우세 에피토프 둘 다에 대해 증진시킬 것으로 예상될 것이다. 이에 따라, 본 발명의 방법은 백신 항원의 경험이 없는 대상체에서 예방 백신의 유효성을 증진시킬 수 있고, 또한 기존 (백신접종 전) 항-항원 면역 반응이 고갈된 대상체에서 치료 백신의 유효성을 증진시킬 수 있다.
마우스 모델 실험
OVA 백신 프라임-부스트 모델을 사용하여 항-CTLA-4 항체의 아주반트 활성에 대한 증진된 ADCC 활성의 효과를 시험하였다. 마우스를 마우스 IgG1, IgG2b, 또는 IgG1-D265A (매우 불량한 Fc-연관 이펙터 기능을 생성함 - Baudino et al. (2008) J. Immunol. 181:6664)로서, 또는 마우스 IgG2a (증진된 ADCC를 나타냄)로서의 항-마우스 CTLA-4 항체 9D9로 처리하였다. WO 2014/089113을 참조한다. 실험은 또한 mIgG2a 이소형 대조군, OVA-단독 및 나이브 마우스를 포함하였다. 마우스 IgG2a 항체는 인간 IgG1 항체 이필리무맙과 비교하여 증진된 ADCC를 나타낸다.
마우스를 제0일에 OVA 펩티드로 피하로 (sc) 면역화시키고, 제14일에 OVA 펩티드로 sc로 챌린지하였다. 항체를 군당 10마리의 마우스에게 제-1, 1, 13 및 15일에 복강내로 (ip) 0.1 mg/용량으로 투여하였다. 제21일에, 마우스를 혈청 및 혈액 내의 항-OVA 역가를 위해, 및 검정을 위해 채혈하였다.
mIgG2a 항-CTLA-4 mAb (증진된 ADCC를 가짐)로 처리된 마우스에서의 비장은 전형적으로 다른 군보다 ~20% 더 무거웠고, 이는 모두 서로 유사하였다. 이들 동일한 마우스는 제21일에 증진된 혈청 항-OVA IgG 역가, 뿐만 아니라 ELISPOT에 의해 측정시 비장에서의 증진된 OVA-특이적 IFN-γ 생산을 나타내었다.
다른 실험은 다른 이소형과 비교하여 증진된 ADCC 활성을 갖는 9D9 IgG2a로 처리된 마우스의 혈액, 비장 또는 서혜 림프절에서 Foxp3+ Treg의 고갈의 증진이 없었다는 것을 입증하였다 (CD45+ 세포의 백분율로서 측정됨).
이들 동일한 항체를 또한 미엘린 핍지교세포 당단백질 (MOG) 펩티드-유도된 실험적 자가면역 뇌척수염 (EAE) 모델에서 시험하였다. 제0일에, MOG35-55/CFA를 63마리의 암컷 C57BL/6 마우스 (5마리 마우스/군 + 3마리의 나이브 마우스)에게 sc로 투여하였다. 백일해 독소를 제0 및 2일에 iv로 투여하였다. 항체 (9D9 IgG1-D265A, 9D9 IgG2a, mIgG1 이소형 대조군, 및 비-차단 항-mCTLA-4 mAb 5G6-mIgG2a)를 제0, 3 및 6일에 투여하였고, 제0일에 항체 용량은 MOG와 백일해 독소 사이에 투여되었다. 마우스를 제15일에 희생시켰다. mIgG2a 항체 둘 다는 EAE 질환 스코어를 이소형 대조군과 비교하여 극적으로 증진시켰고, mIgG1-D265A는 보다 중간 정도의 증진을 제공하였다. 이 모델에서의 증진된 질환 스코어는 증진된 항-MOG 면역 반응과 상관관계가 있고, 따라서 아주반트 활성을 증진시킨다. 상기 OVA 모델에서와 같이, 증진된 ADCC mAb (mIgG2a)는 비장 또는 림프절에서 Foxp3+ Treg를 고갈시키지 않고 (CD45+ 세포의 백분율로서 측정됨), 또한 중추 신경계 (CNS)에서도 고갈시키지 않는다.
OVA- 및 MOG-유도된 면역 반응 모델 둘 다에서, 증진된 ADCC 활성을 갖는 항-CTLA-4 mAb (mIgG2a), 차단 항체 및 비-차단 항체 둘 다는 보다 큰 면역 반응을 도출하지만, Treg 고갈을 유발하지는 않는다.
시노몰구스 원숭이 실험
본원에 개시된 바와 같은 추가의 실험은 항-인간 CTLA-4 항체 이필리무맙 (예르보이®) 및 증진된 ADCC를 갖는 비푸코실화된 이필리무맙 (ipi-NF)을 사용하여 영장류 (시노몰구스 원숭이)에서의 항-CTLA-4 항체의 아주반트 활성에 대한 증진된 ADCC 활성의 역할을 조사하였다 (도 10).
다양한 도면 및 실시예에 개시된 바와 같이, 및 마우스 결과와 일치하게, 증진된 ADCC를 갖는 항-CTLA-4 항체는 증진된 ADCC를 갖지 않는 달리 동등한 항-CTLA-4 항체보다 더 크고 더 강건한 면역 반응을 도출하였다 (즉, 이필리무맙-NF 대 이필리무맙). 이러한 증진된 면역 반응은 백신 항원-특이적 CD8+ T 세포 반응 (도 1a-1c, 2a-2c 및 3a-3c), 백신 항원-유도된 IFN-γ 생산 (도 4a-4c, 5a-5c 및 6a-6b) 및 Ad5-유도된 IFN-γ 생산 (도 9a-9c)에서 반영되었다. 이필리무맙-NF는 또한 Ki-67 발현에 의해 측정시 CD4+ 및 CD8+ T 세포 증식을 증가시켰다 (도 7a-7c 및 8a-8c). 이필리무맙의 증진된 ADCC 형태 (이필리무맙-NF)는 연구되는 원숭이의 혈액에서 Treg 고갈을 유발하지 않았다 (도 11).
증진된 이펙터 기능을 갖는 개선된 항-CTLA-4 항체
항체의 Fc 영역에 대한 다양한 변형이 이펙터 기능을 증진시키는 것으로 밝혀졌다. 마우스에서, 활성화 Fc 감마 수용체에 대한 증진된 결합 및 Fc 감마 억제 수용체에 대한 감소된 결합은 하기 계층을 따른다: mIgG2a >> mIgG2b >> mIgG1D265A. 이러한 계층은 문헌 [Nimmerjahn & Ravetch (2005) Science 310:1510]에 의해 정의되고 ADCC 기능을 매개하는 항체에 대해 결정된 활성화 Fc 수용체 대 억제 Fc 수용체에 대한 이뮤노글로불린 Fc 영역의 결합의 활성 비 (A/I 비로 알려짐)를 따른다.
특정 측면에서, 본 발명의 개선된 항-CTLA-4 항체는 인간 IgG1 항체이다. 본 발명의 항-CTLA-4 항체에서의 ADCC 활성은 예를 들어 Fc 영역에 하나 이상의 아미노산 치환을 도입하거나, N-연결된 글리칸에서 글리코실화 패턴을 변경시키거나, 또는 둘 다에 의해 증진될 수 있다.
이펙터 기능을 증진시키는 Fc 돌연변이
일부 실시양태에서, ADCC 활성은 Fc 영역의 아미노산 서열을 변형시킴으로써, 예를 들어 ADCC를 증진시키기 위해 자연 발생 인간 IgG1 서열에 돌연변이를 부가함으로써 증가된다. ADCC 활성과 관련하여, 인간 IgG1 ≥ IgG3 ≫ IgG4 ≥ IgG2이며, 따라서 IgG2 또는 IgG4보다 IgG1 불변 도메인이 ADCC를 증진시키기 위한 출발점으로서 선택될 수 있다. 본원에 정의된 바와 같이, 비변형된 인간 IgG1은 이필리무맙에서 발생한 것과 같이 증진된 ADCC를 갖지 않는다. 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 증가시키고/거나 Fcγ 수용체 (FcγR)에 대한 친화도를 증가시키기 위해 Fc 영역은 하기 위치: 234, 235, 236, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 262, 263, 264, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 313, 315, 320, 322, 324, 325, 326, 327, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 433, 434, 435, 436, 437, 438 또는 439에서 1개 이상의 아미노산을 변형시킴으로써 변형될 수 있다. WO 2012/142515를 참조하고; 또한 WO 00/42072를 참조한다. 예시적인 개별 치환은 236A, 239D, 239E, 268D, 267E, 268E, 268F, 324T, 332D, 및 332E를 포함한다. 예시적인 변이체 클러스터는 239D/332E, 236A/332E, 236A/239D/332E, 268F/324T, 267E/268F, 267E/324T, 및 267E/268F/324T를 포함한다. 예를 들어, I332E와 임의로 조합될 수 있는 G236A 변이체를 포함하는 인간 IgG1Fc는 FcγIIA / FcγIIB 결합 친화도 비를 대략 15배 증가시키는 것으로 밝혀졌다. Richards et al. (2008) Mol. Cancer Therap. 7:2517; Moore et al. (2010) mAbs 2:181. FcyR 및 보체 상호작용을 증진시키기 위한 다른 변형은 치환 298A, 333A, 334A, 326A, 247I, 339D, 339Q, 280H, 290S, 298D, 298V, 243L, 292P, 300L, 396L, 305I, 및 396L을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이들 및 다른 변형은 문헌 [Strohl (2009) Current Opinion in Biotechnology 20:685-691]에서 검토된다. 구체적으로, ADCC 및 CDC 둘 다는 IgG1의 위치 E333에서의 변화, 예를 들어 E333A에 의해 증진될 수 있다. Shields et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591. IgG1에서 이펙터 기능을 증진시키기 위한 P247I 및 A339D/Q 돌연변이의 사용이 WO 2006/020114에 개시되어 있고, D280H, K290S ± S298D/V가 WO 2004/074455에 개시되어 있다. K326A/W 및 E333A/S 변이체는 인간 IgG1에서, 및 E333S는 IgG2에서 이펙터 기능을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. Idusogie et al. (2001) J. Immunol. 166:2571. 다른 실험은 G236A/S239D/A330L/I332E가 FcRIIa 및 FcRIIIa에 대한 증진된 결합을 발생시킨다는 것을 밝혀냈다. Smith et al. (2012) Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 109:6181; Bournazos et al. (2014) Cell 158:1243.
달리 나타내거나 문맥상 명백하지 않는 한, 항체의 Fc 영역에서의 아미노산 잔기 넘버링은 EU 넘버링 규정 (문헌 [Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, MD]에서와 같은 EU 인덱스; 또한 미국 특허 출원 공개 번호 2008/0248028의 도 3c-3f 참조)에 따른 것이고, 단 넘버링이 반드시 연속적이어야 하는 경우에 서열 목록에서의 서열의 잔기를 구체적으로 언급하는 경우는 제외한다. 예를 들어, Fc 영역에서의 아미노산 치환의 효과에 관한 참고 문헌은 전형적으로 EU 넘버링을 사용할 것이고, 이는 항체의 Fc 영역에서의 임의의 주어진 잔기가 그것이 부착되는 가변 도메인의 길이와 관계없이 동일한 번호에 의해 언급되도록 한다. 드문 경우에, 언급된 정확한 Fc 잔기를 확인하기 위해 언급된 문서를 참조하는 것이 필요할 수 있다.
구체적으로, FcγR1, FcγRII, FcγRIII 및 FcRn에 대한 인간 IgG1 상의 결합 부위가 맵핑되어 있고, 개선된 결합을 갖는 변이체가 기재되어 있다. Shields et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604. 조합 돌연변이체 T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A 및 S298A/E333A/K334A를 포함한 위치 256, 290, 298, 333, 334 및 339에서의 특정 돌연변이가 FcγRIII에 대한 결합을 개선시키는 것으로 밝혀졌다 (증진된 FcγRIIIa 결합 및 ADCC 활성을 가짐). S239D/I332E 및 S239D/I332E/A330L 돌연변이를 갖는 변이체를 포함한, FcγRIIIa에 대해 강하게 증진된 결합을 갖는 다른 IgG1 변이체가 확인되었고, 이는 시노몰구스 원숭이에서 FcγRIIIa에 대한 친화도의 가장 큰 증가, FcγRIIb 결합의 감소, 및 강한 세포독성 활성을 보여주었다. Lazar et al. (2006) Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 103:4005; Awan et al. (2010) Blood 115:1204; Desjarlais & Lazar (2011) Exp. Cell Res. 317:1278. 항체 예컨대 알렘투주맙 (CD52-특이적), 트라스투주맙 (HER2/neu-특이적), 리툭시맙 (CD20-특이적), 및 세툭시맙 (EGFR-특이적) 내로 삼중 돌연변이를 도입한 것은 시험관내 ADCC 활성을 크게 증진시켰고, S239D/I332E 변이체는 마카크에서 B 세포를 고갈시키는 증진된 능력을 보여주었다. Lazar et al. (2006) Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 103:4005. 또한, B 세포 악성종양 및 유방암 모델에서 인간 FcγRIIIa를 발현하는 트랜스제닉 마우스에서 FcγRIIIa에 대한 증진된 결합 및 병행하여 증진된 ADCC 활성을 나타내는 L235V, F243L, R292P, Y300L, V305I 및 P396L 돌연변이를 함유하는 IgG1 돌연변이체가 확인되었다. Stavenhagen et al. (2007) Cancer Res. 67:8882; 미국 특허 번호 8,652,466; Nordstrom et al. (2011) Breast Cancer Res. 13:R123.
상이한 IgG 이소형은 또한 차등 CDC 활성을 나타낸다 (IgG3>IgG1>>IgG2
Figure pct00002
IgG4). Dangl et al. (1988) EMBO J. 7:1989. 증진된 CDC를 목적으로 하는 사용을 위해, C1q에 대한 결합을 증가시키는 돌연변이를 도입하는 것이 또한 가능하다. 보체를 동원하는 능력 (CDC)은 IgG2 내 K326 및/또는 E333에서의 돌연변이, 예컨대 K326W (ADCC 활성을 감소시킴) 및 E333S에 의해 증진되어, 보체 캐스케이드의 제1 성분인 C1q에 대한 결합을 증가시킬 수 있다. Idusogie et al. (2001) J. Immunol. 166:2571. 인간 IgG1 내로 S267E / H268F / S324T를 (단독으로 또는 임의의 조합으로) 도입하는 것은 C1q 결합을 증진시킨다. Moore et al. (2010) mAbs 2:181. 문헌 [Natsume et al. (2008) Cancer Res. 68:3863] (그 안의 도 1)의 IgG1/IgG3 하이브리드 이소형 항체 "113F"의 Fc 영역은 또한 증진된 CDC를 부여한다. 또한 문헌 [Michaelsen et al. (2009) Scand. J. Immunol. 70:553 및 Redpath et al. (1998) Immunology 93:595]을 참조한다.
이펙터 기능을 증가 또는 감소시킬 수 있는 추가의 돌연변이는 문헌 [Dall'Acqua et al. (2006) J. Immunol. 177:1129]에 개시되어 있다. 또한 문헌 [Carter (2006) Nat. Rev. Immunol. 6:343; Presta (2008) Curr. Op. Immunol. 20:460]을 참조한다.
일부 실시양태에서, ADCC를 증진시키기 위한 Fc 영역 내의 아미노산 치환은 이필리무맙의 IgG1fa 동종이형 (서열식별번호: 11의 잔기 119 - 448 및 서열식별번호: 12의 잔기 119 - 447) 및 IgG1za (서열식별번호: 28 및 29)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 IgG1 동종이형에서 이루어질 수 있다.
증진된 ADCC를 갖는 비푸코실화된 항-CTLA-4 항체
비푸코실화된, 달리 비변형된 IgG1f 항체를 비교하는 실험은 표 2에 제시된 바와 같이 활성화 Fcγ 수용체에 대한 증진된 결합을 보여주었고, 이는 본 발명의 증진된 항-CTLA-4 항체에 사용하기 위한 그의 적합성을 입증한다. 동종이형 IgG1f는 이필리무맙 동종이형 IgG1fa (서열식별번호: 11 및 12)에 대한 D357E 및 L359M 돌연변이를 갖는다. IgG1f는 동종이형 IgG1za (서열식별번호: 28 및 29)에 대한 K97R, D239E 및 L241M 돌연변이를 갖고, 이는 서열식별번호: 11 및 12의 이필리무맙 서열 넘버링에 대한 K215R, D357E 및 L359M 돌연변이와 동등하다.
표 2
비푸코실화된 IgG1f Fc 영역의 Fc 수용체 결합
KD 값 (nM)
Figure pct00003
감소된 푸코실화, 비푸코실화 및 저푸코실화
항체와 FcγR의 상호작용은 또한 N297 잔기에서 각각의 Fc 단편에 부착된 글리칸 모이어티를 변형시킴으로써 증진될 수 있다. 특히, 코어 푸코스 잔기의 부재는 항원 결합 또는 CDC를 변경시키지 않으면서 활성화 FcγRIIIA에 대한 IgG의 개선된 결합을 통해 ADCC를 강하게 증진시킨다. Natsume et al. (2009) Drug Des. Devel. Ther. 3:7. 비-푸코실화된 종양-특이적 항체가 생체내 마우스 모델에서 치료 활성을 증진시킨다는 확실한 증거가 존재한다. Nimmerjahn & Ravetch (2005) Science 310:1510; Mossner et al. (2010) Blood 115:4393.
항체 글리코실화의 변형은, 예를 들어 변경된 글리코실화 기구를 갖는 숙주 세포에서 항체를 발현시킴으로써 달성될 수 있다. 증진된 ADCC를 나타내는, 감소된 또는 제거된 푸코실화를 갖는 항체가 본 발명의 방법에서 특히 유용하다. 변경된 글리코실화 기구를 갖는 세포는 관련 기술분야에 기재되어 있고, 본 개시내용의 재조합 항체를 발현시켜 변경된 글리코실화를 갖는 항체를 생산하기 위한 숙주 세포로 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포주 Ms704, Ms705, 및 Ms709는 푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8 (α-(1,6) 푸코실트랜스퍼라제 (미국 특허 출원 공개 번호 20040110704; [Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol. Bioeng. 87: 614] 참조)이 결여되며, 이로써 이들 세포주에서 발현된 항체는 그의 탄수화물에 푸코스가 결여되어 있다. 또 다른 예로서, EP 1176195는 또한 기능적으로 파괴된 FUT8 유전자를 갖는 세포주 뿐만 아니라, 항체의 Fc 영역에 결합하는 N-아세틸글루코사민에 푸코스를 부가하기 위한 활성이 거의 또는 전혀 없는 세포주, 예를 들어 래트 골수종 세포주 YB2/0 (ATCC CRL 1662)을 기재한다. PCT 공개 WO 03/035835는 Asn(297)-연결된 탄수화물에 푸코스를 부착시키는 능력이 감소되고, 또한 숙주 세포에서 발현된 항체의 저푸코실화를 발생시키는 변이체 CHO 세포주 Lec13을 기재한다. 또한 문헌 [Shields et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733]을 참조한다. 변형된 글리코실화 프로파일을 갖는 항체는 또한 PCT 공개 번호 WO 2006/089231에 기재된 바와 같이 계란에서 생산될 수 있다. 대안적으로, 변형된 글리코실화 프로파일을 갖는 항체는 식물 세포, 예컨대 렘나(Lemna)에서 생산될 수 있다. 예를 들어 미국 공개 번호 2012/0276086을 참조한다. PCT 공개 번호 WO 99/54342는 당단백질-변형 글리코실 트랜스퍼라제 (예를 들어, 베타(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III (GnTIII))를 발현하도록 조작된 세포주를 기재하며, 여기서 조작된 세포주에서 발현된 항체는 항체의 ADCC 활성을 증가시키는 증가된 양분성 GlcNac 구조를 나타낸다. 또한 문헌 [Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176]을 참조한다. 대안적으로, 항체의 푸코스 잔기는 푸코시다제 효소를 사용하여 절단할 수 있다. 예를 들어, 효소 알파-L-푸코시다제는 항체로부터 푸코실 잔기를 제거한다. Tarentino et al. (1975) Biochem. 14:5516. 감소된 푸코실화를 갖는 항체는 또한 미국 특허 번호 8,642,292에 기재된 바와 같이, GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥실로스를 기질로서 사용하는 효소, 예컨대 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥실로스 리덕타제 (RMD)를 코딩하는 재조합 유전자를 보유하는 세포에서 생산될 수 있다. 대안적으로, 세포는 푸코스 잔기의 N-연결된 글리칸 또는 당단백질, 예컨대 배지에서 성장된 세포에 의해 생산된 항체에의 부가를 차단하는 푸코스 유사체를 함유하는 배지에서 성장될 수 있다. 미국 특허 번호 8,163,551; WO 09/135181.
비푸코실화된 항체는 푸코실화된 항체와 비교하여 크게 증진된 ADCC를 나타내기 때문에, 항체 제제는 본 발명의 방법에서 유용한 푸코실화된 중쇄가 완전히 없을 필요는 없다. 푸코실화된 중쇄의 잔류 수준은 실질적으로 비푸코실화된 중쇄 제제의 ADCC 활성을 유의하게 방해하지 않을 것이다. 그럼에도 불구하고, 코어 푸코스를 N-글리칸에 부가하기에 충분히 적격인 통상적인 CHO 세포에서 생산된 항체는 수 퍼센트 내지 15% 비푸코실화된 항체를 포함할 수 있다. 비푸코실화된 항체는 CD16에 대해 10배 더 높은 친화도 및 ADCC 활성의 최대 30배 내지 100배 증진을 나타낼 수 있고, 따라서 비푸코실화된 항체의 비율의 심지어 작은 증가도 제제의 ADCC 활성을 극적으로 증가시킬 수 있다. 배양물 중 정상 CHO 세포에서 생산될 것보다 더 많은 비푸코실화된 항체를 포함하는 임의의 제제는 약간의 수준의 증진된 ADCC를 나타낼 수 있다. 이러한 항체 제제는 본원에서 감소된 푸코실화를 갖는 제제로 지칭된다. 정상 CHO 세포로부터 수득된 비푸코실화의 원래 수준에 따라, 감소된 푸코실화 제제는 50%, 30%, 20%, 10% 및 심지어 5% 정도의 비푸코실화된 항체를 포함할 수 있다. 감소된 푸코실화는 정상 CHO 세포에서 제조된 항체와 비교하여 2배 이상의 ADCC 증진을 나타내는 제제로서 기능적으로 정의되고, 비푸코실화된 종의 임의의 고정된 백분율과 관련하여서는 그렇지 않다.
다른 실시양태에서, 비푸코실화의 수준은 구조적으로 정의된다. 본원에 사용된 비푸코실화된 또는 비-푸코실화된 (동의어로 사용된 용어) 항체 제제는 95% 초과의 비푸코실화된 항체 중쇄 (100% 포함)를 포함하는 항체 제제이다. 저푸코실화된 항체 제제는 95% 이하의 푸코스가 결여된 중쇄를 포함하는 항체 제제, 예를 들어 중쇄 중 80 내지 95%, 예컨대 85 내지 95%, 및 90 내지 95%가 푸코스가 결여된 항체 제제이다. 달리 나타내지 않는 한, 저푸코실화된은 중쇄 중 80 내지 95%가 푸코스가 결여된 항체 제제를 지칭하고, 비푸코실화된은 중쇄 중 95% 초과가 푸코스가 결여된 항체 제제를 지칭하고, "저푸코실화된 또는 비푸코실화된"은 중쇄 중 80% 이상이 푸코스가 결여된 항체 제제를 지칭한다.
일부 실시양태에서, 저푸코실화된 또는 비푸코실화된 항체는 푸코실화에 필수적인 효소가 결여된 세포, 예컨대 FUT8 (예를 들어 미국 특허 번호 7,214,775), 또는 외인성 효소가 푸코실화를 위한 대사 전구체의 풀을 부분적으로 고갈시키는 세포 (예를 들어 미국 특허 번호 8,642,292), 또는 푸코실화에 수반되는 효소의 소분자 억제제의 존재 하에 배양된 세포 (예를 들어 WO 09/135181)에서 생산된다.
항체 제제에서의 푸코실화의 수준은 겔 전기영동, 액체 크로마토그래피 및 질량 분광측정법을 포함하나 이에 제한되지는 않는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다. 달리 나타내지 않는 한, 본 발명의 목적을 위해, 항체 제제에서의 푸코실화의 수준은 본질적으로 실시예 3에 기재된 바와 같이 친수성 상호작용 크로마토그래피 (또는 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피, HILIC)에 의해 결정된다. 항체 제제의 푸코실화 수준을 결정하기 위해, 샘플은 N-연결된 글리칸을 절단하기 위해 PNGase F로 처리하여 변성되고, 이어서 이는 푸코스 함량에 대해 분석된다. 전장 항체 쇄의 LC/MS는 항체 제제의 푸코실화 수준을 검출하는 대안적 방법이지만, 질량 분광법은 본래 덜 정량적이다.
비푸코실화된 이필리무맙은 증진된 ADCC를 나타낸다
이필리무맙의 비푸코실화된 형태는 EC50을 1.5 μg/mL에서 6.5 ng/mL로 감소시킴으로써, 인간 공여자로부터의 활성화된 Treg의 NK92 세포 기반 용해를 도출하는데 보다 효과적인 것으로 밝혀졌다. 도 10을 참조한다.
추가의 잠재적 Fc 변형
Fc 영역은 신생아 Fc 수용체 FcRn에 대한 IgG의 친화도를 증가시키도록 돌연변이될 수 있으며, 이는 항체의 생체내 반감기를 연장시키고 항종양 활성을 증가시킨다. 예를 들어, M428L/N434S 돌연변이를 베바시주맙 (VEGF-특이적) 및 세툭시맙 (EGFR-특이적)의 Fc 영역 내로 도입하는 것은 원숭이에서 항체 반감기가 증가시키고, 마우스에서 항종양 반응이 개선시켰다. Zalevsky et al. (2010) Nat. Biotechnol. 28:157.
항-CTLA-4 항체
특정 실시양태에서, ADCC를 증진시키도록 변형될 출발 항-CTLA-4 항체는 이필리무맙 또는 트레멜리무맙, 또는 그의 가변 도메인 서열을 공유하는 항체이다. CTLA-4의 세포외 도메인을 인식하고 이에 결합하는 모노클로날 항체는 미국 특허 번호 5,977,318에 기재되어 있다. 본 개시내용의 인간 모노클로날 항체는 다양한 방법, 예를 들어 마우스 시스템보다는 인간 면역계의 일부를 보유하는 트랜스제닉 또는 트랜스크로모소믹 마우스를 사용하여, 또는 시험관내 디스플레이 기술, 예컨대 파지 또는 효모 디스플레이를 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어 문헌 [Bradbury et al. (2011) Nat. Biotechnol. 29(3):245]을 참조한다. 트랜스제닉 및 트랜스크로모소믹 마우스는 본원에서 각각 HUMAB MOUSE® (Lonberg et al. (1994) Nature 368:856) 및 KM MOUSE® (WO 02/43478)로 지칭되는 마우스를 포함한다. 본 개시내용의 예시적인 인간 항-인간 CTLA-4 항체의 생산은 미국 특허 번호 6,984,720 및 7,605,238에 상세하게 기재되어 있다. 이들 특허에서 10D1로 확인된 인간 IgG1 항-CTLA-4 항체는 또한 이필리무맙 (또한 이전에는 MDX-010 및 BMS-734016으로 알려짐)으로도 알려져 있으며, 이는 예르보이®로 시판되고 있다. 본 개시내용의 다른 예시적인 인간 항-CTLA-4 항체는 트레멜리무맙 (이전에 티실리무맙; CP-675,206), 인간 IgG2 항-인간 CTLA-4 항체를 포함하여, 미국 특허 번호 6,682,736 및 7,109,003에 기재되어 있다.
인간 항-인간 CTLA-4 모노클로날 항체인 이필리무맙은 절제불가능한 또는 전이성 흑색종의 치료 및 III기 흑색종의 아주반트 치료를 위해 승인되었고, 다른 암에서는 종종 다른 작용제와 조합하여 임상 시험 중이다. Hoos et al. (2010) Semin. Oncol. 37:533; Hodi et al. (2010) N. Engl. J. Med. 363:711; Pardoll (2012) Nat. Immunol. 13(12): 1129. 이필리무맙은 대부분의 인간 Fc 수용체에 가장 잘 결합하는 인간 IgG1 이소형을 갖는다 (Bruhns et al. (2009) Blood 113: 3716).
대조적으로, 트레멜리무맙은 FcγRIIa 변이체 H131을 제외하고는 Fc 수용체에 효율적으로 결합하지 않는 IgG2 이소형이다. Bruhns et al. (2009) Blood 113: 3716. 트레멜리무맙은 IgG2 이소형이고, 따라서 IgG1인 이필리무맙보다 더 낮은 ADCC를 나타낸다. 중쇄 불변 도메인을 대체하여 "트레메-IgG1"을 생성함으로써 트레멜리무맙을 IgG1로 전환시키는 것은 이필리무맙과 유사한 수준으로 ADCC를 증가시킬 것으로 예상될 것이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 백신 아주반트로서 이필리무맙보다 더 큰 ADCC를 갖는 트레멜리무맙의 변이체 또는 트레메-IgG1의 사용을 수반한다.
추가의 항-CTLA-4 항체
추가의 항-CTLA-4 항체-관련 발명은 하기 공동-양도된 특허 출원 공개에 개시되어 있으며, 그 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다: WO　1993/000431; WO　97/020574; WO　00/032231; WO　2001/014424; 　WO　2003/086459; WO　2005/003298; WO　2006/121168; WO　2007/056540; WO　2007/067959; WO　2008/109075; WO　2009/148915; WO　2010/014784; WO　2011/011027; WO　2010/042433; WO　2011/146382; WO　2012/027536; WO　2013/138702; WO　2009/089260; WO　2013/142796; 및 WO　2013/169971. 증진된 ADCC (즉, 이필리무맙의 ADCC보다 더 큰 ADCC)를 갖는 이들 항체의 변이체는 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 설명되며, 이는 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 도면 및 모든 참고문헌, 특허 및 공개된 특허 출원의 내용은 본원에 참조로 명백하게 포함된다.
실시예 1
시노몰구스 마카크에서의 항-CTLA-4 백신 아주반트 실험
시간 경과에 따라 백신-유도된 항원-특이적 T-세포 반응의 면역 조정에 대한 ADCC 활성이 상이한 항-CTLA-4 항체 변이체의 효과를 추적하기 위해 Mafa-A1*063+ 마우리티안 시노몰구스 마카크 (마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis); MCM)에서 실험을 수행하였다. 3종의 상이한 항-CTLA-4 모노클로날 항체를 연구하였다: 이필리무맙 (ipi), 비푸코실화된 이필리무맙 (ipi-NF), 및 N297A 돌연변이를 갖는 이필리무맙 (ipi-N297A) (이는 N-연결된 글리코실화를 완전히 차단함). 이필리무맙과 비교하여, 비푸코실화된 이필리무맙은 증진된 ADCC를 나타내는 반면, N297A 이필리무맙은 감소/제거된 ADCC를 나타낸다.
원숭이 면역결핍 바이러스 (SIV) Gag 및 Nef 단백질에 대한 유전자를 아데노바이러스 혈청형 5 (Ad5) 벡터 내로 도입함으로써 바이러스 백신 면역원을 구축하였다. Nef 유전자 서열을 변형시켜 제2 및 제3 아미노산 잔기 (Gly - Gly)를 제거하여 미리스토일화 부위를 제거하였다. Gag-Ad5 및 Nef-Ad5 바이러스를 반대 뒷다리에서 근육내로 투여하여 (3x109개 바이러스 입자/MCM) 면역우성을 피하는 것을 도왔다. 3x109개 바이러스 입자/MCM은 증진된 아주반트 활성의 관찰 기회를 최대화하도록 선택된 준최적 투여를 나타낸다. 이어서, 동물을 i) 염수, ii) ipi (1 mg/kg 또는 10 mg/kg), iii) ipi-NF (1 mg/kg 및 10 mg/kg), 또는 iv) ipi-N297A (10 mg/kg)로 즉시 (정맥내로) 처리하였다. 혈액 샘플을 제4, 8, 15, 22, 36 및 43일에 채취하였다. 실험을 2회 더 반복하였으나, 이후의 실험에서는 군당 4마리가 아니라 6마리의 동물이었고 1 mg/kg 용량을 사용하지 않았다. 이후의 실험은 제3일의 혈액 샘플을 포함하였고, 제35일이 아니라 제36일의 것을 사용하였다. 또한, 제1 실험은 이필리무맙의 중쇄 (서열식별번호: 11)에 대한 D357E 및 L359M 변화를 포함하는 ipi-NF 항체에 대한 이필리무맙의 동종이형 변이체를 사용하였지만, 제2 및 제3 실험은 그렇지 않았다.
항원-특이적 T 세포를 검출하기 위한 전혈 FACS
전혈 형광-활성화된 세포 분류 (FACS) 검정을 사용하여, Ad5 백신 내의 여러 SIV-특이적 에피토프 (Nef RM9, Nef LT9, Gag GW9)에 특이적인 T-세포 반응을 펩티드-로딩된 MHC 부류 I 사량체를 사용하여 제8일 (반복 A에서는 제8일만), 제15일, 제22일, 제36일 및 제43일에 결정하였다. Nef RM9 = RPKVPLRTM = 서열식별번호: 25; Nef LT9 = LNMADKKET = 서열식별번호: 26; Gag GW9 = GPRKPIKCW = 서열식별번호: 27. 펩티드 (RM9/GW9/LT9)-로딩된 MHC-I 사량체를 사용하여 전혈 FACS에 의해 항원-특이적 T 세포를 검출하였다. 결과는 각각 SIV 에피토프 Nef RM9, Gag GW9 및 Nef LT9에 대한 결과를 제공하는 도 1a-1c, 2a-2c, 및 3a-3c에서 제공된다. 각각의 반복에서, 및 각각의 에피토프에 대해, 10 mg/kg의 ipi-NF는 가장 높은 백분율의 항원-특이적 CD8+ T 세포를 생성한다. Nef LT9에 특이적인 CD8+ T 세포는, 대략 제22일 내지 제36일에 피크에 도달하는 에피토프 Nef RM9 및 Gag GW9에 대해 특이적인 것보다 더 신속하게 피크에 도달하고 사라지기 시작한다.
PBMC에서의 항원-유도된 IFN-γ 생산을 검출하기 위한 ELISPOT 검정
효소-연결된 이뮤노스팟 (ELISPOT) 검정을 제22일 및 제43일 혈액 샘플로부터 단리된 피콜-단리된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 상에서 수행하여 항원 자극에 반응하여 발현된 IFN-γ의 수준을 결정하였다. PBMC를 18시간 동안 10 μM의 최소 최적 SIV 에피토프 펩티드로 자극하였다. 스팟-형성 세포 (SPC) 값을 측정하고 배경 값을 감산하였다.
결과는 도 4a-4c, 5a-5c 및 6a-6b에서 제공되며, 이는 각각 SIV 에피토프 Nef RM9, Gag GW9 및 Nef LT9를 사용한 자극에 대한 결과를 제공한다. ELISPOT 검정은 10 mg/kg ipi-NF 처리가 모든 반복에서 및 모든 SIV 에피토프에 대해 가장 높은 IFN-γ 생산을 도출하였음을 확인하였다.
벌크 T 세포 증식
세포 증식을 측정하기 위해 Ki-67 발현에 대해 유동 세포측정법에서 CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포를 또한 측정하였다. 결과는 도 7a-7c 및 8a-8c에서 제공된다. 10 mg/kg ipi-NF 처리는 모든 반복에서 증식을 증진시켰다.
PBMC에서의 Ad5-유도된 IFN-γ 생산을 검출하기 위한 ELISPOT 검정
상기 기재된 것과 유사한 ELISPOT 검정을 사용하여 Ad5-유도된 IFN-γ 생산을 측정하였다. 열-불활성화된 Ad5 비리온 (5x108개 바이러스 입자)을 18시간 동안 제22일 PBMC 또는 제43일 PBMC와 함께 인큐베이션하였다. 스팟-형성 세포 (SPC) 값을 측정하고 배경 값을 감산하였다. 결과는 도 9a-9c에서 제공된다. 도 4a-4c, 5a-5c 및 6a-6b에 제시된 SIV 항원으로 수득된 결과와 유사하게, 10 mg/kg 항-CTLA-4-NF 처리는 모든 반복에서 제22일 및 제43일 둘 다에서 가장 높은 IFN-γ 생산을 일관되게 도출하였다.
시험된 모든 검정에서, 항-CTLA-4-NF는 이러한 시노 백신 모델에서 일반적으로 3종의 별개의 SIV 항원에 대해 및 Ad5 항원에 대해 면역 반응을 증진시켰다. 비푸코실화된 항체는 일관되게, 이필리무맙에서 관찰된 것보다 크기가 더 크고 더 강건한 면역 반응을 일관되게 생성하였다.
Treg 고갈
시노몰구스 마카크의 혈액에서의 순환 Treg의 빈도를 전혈 FACS 검정에 의해 결정하였다. 반복 B의 동물로부터의 샘플을 분류하여, 시간 경과에 따른 Treg의 빈도를 투여된 항체의 함수로서 결정하였다. 결과는 도 11에서 제공된다. 증진된 ADCC를 갖는 항-CTLA-4 mAb인 이필리무맙-NF는 이필리무맙과 비교하여 증진된 Treg 고갈을 나타내지 않았고, 사실상 비히클 대조군과 유의하게 상이하지 않았다.
실시예 2
1차 인간 세포를 사용한 NK-매개 세포 용해의 촉진에 의해 측정된, 증진된 ADCC를 갖는 항-CTLA-4 항체
비푸코실화된 이필리무맙을 하기와 같이 인간 공여자로부터의 Treg의 NK 세포-매개 용해를 촉진시키는 그의 능력에 대해 시험하였다. 간략하게, 표적 세포로서 사용하기 위한 Treg를 자기 비드를 사용하여 음성 선택에 의해 분리하고, 72시간 동안 활성화시켰다. 인간 공여자로부터의 이펙터로서 사용하기 위한 NK 세포를 자기 비드를 사용하여 음성 선택에 의해 분리하고, 24시간 동안 IL-2로 활성화시켰다. 칼세인-표지된 활성화된 Treg (공여자 류코팩(Leukopak) AC8196)를 다양한 농도의 이필리무맙, 이필리무맙-NF 또는 IgG1 대조군으로 30분 동안 코팅한 다음, 2시간 동안 NK 이펙터 세포와 함께 10:1의 비로 인큐베이션하였다. 칼세인 방출은 엔비전(Envision) 플레이트 판독기 (퍼킨 엘머(Perkin Elmer))를 사용하여 배지의 형광 강도를 판독함으로써 측정하고, 항체-의존성 세포 용해의 백분율은 평균 형광 강도 (MFI)에 기초하여 하기 식에 의해 계산하였다: [(시험 MFI - 평균 배경)/(평균 최대 - 평균 배경)] x100. 결과는 도 10에서 제시된다. 비푸코실화된 이필리무맙은 이필리무맙 (1.5 μg/ml)보다 유의하게 더 낮은 EC50 (0.0065 μg/ml)에서 활성화된 Treg의 용해를 유도하였다.
실시예 3
항-CTLA-4 항체의 샘플 중 비푸코실화된 백분율을 결정하기 위한 검정
비푸코실화된 항-CTLA-4 mAb 제제를 분석하여 본질적으로 하기와 같이 비푸코실화된 중쇄의 백분율을 결정하였다.
먼저 우레아를 사용하여 항체를 변성시킨 다음, DTT (디티오트레이톨)를 사용하여 환원시켰다. 이어서, 샘플을 PNGase F로 37℃에서 밤새 소화시켜 N-연결된 글리칸을 제거하였다. 방출된 글리칸을 수집하고, 여과하고, 건조시키고, 2-아미노벤조산 (2-AA) 또는 2-아미노벤즈아미드 (2-AB)로 유도체화하였다. 이어서, 생성된 표지된 글리칸을 HILIC 칼럼 상에서 분할하고, 용리된 분획을 형광에 의해 정량화하고, 건조시켰다. 이어서, 분획을 코어 α(1,6)-연결된 푸코스 잔기를 방출하는 엑소글리코시다제, 예컨대 α(1-2,3,4,6) 푸코시다제 (BKF)로 처리하였다. 이어서, 비처리된 샘플 및 BKF-처리된 샘플을 액체 크로마토그래피에 의해 분석하였다. α(1,6)-연결된 푸코스 잔기를 포함하는 글리칸은 BKF 처리 후에 변경된 용리를 나타내는 반면, 비푸코실화된 글리칸은 변화되지 않았다. 또한, 올리고사카라이드 조성물을 질량 분광측정법에 의해 확인하였다. 예를 들어, 문헌 [Zhu et al. (2014) MAbs 6:1474]을 참조한다.
퍼센트 비푸코실화는 (항체 중쇄의 N297 (EU 넘버링)에서의 N-연결된 글리칸에서의 제1 GlcNac 잔기에 α1,6-연결된 푸코스가 결여된 글리칸) 대 (그 위치에서의 모든 글리칸의 총합 (푸코스가 결여된 글리칸 및 α1,6-연결된 푸코스를 갖는 글리칸))의 몰비 x 100으로서 계산된다.
표 3
서열 목록의 요약
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항체 서열과 관련하여, 서열 목록은 성숙 가변 영역 및 중쇄 및 경쇄의 서열을 제공하고, 즉 서열은 신호 펩티드를 포함하지 않는다.
등가물:
관련 기술분야의 통상의 기술자는 상용 실험을 사용하여 본원에 개시된 구체적 실시양태의 많은 등가물을 인식하거나 또는 그를 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 청구범위에 포괄되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Bristol-Myers Squibb Company <120> USE OF ANTI-CTLA-4 ANTIBODIES WITH ENHANCED ADCC TO ENHANCE IMMUNE RESPONSE TO A VACCINE <130> 12852-WO-PCT <160> 29 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 223 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Cys Leu Gly Phe Gln Arg His Lys Ala Gln Leu Asn Leu Ala 1 5 10 15 Thr Arg Thr Trp Pro Cys Thr Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Ile Pro 20 25 30 Val Phe Cys Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala 35 40 45 Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly 50 55 60 Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln 65 70 75 80 Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr 85 90 95 Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val 100 105 110 Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile 115 120 125 Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly 130 135 140 Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser 145 150 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<400> 17 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Tyr Leu Asp 1 5 10 <210> 18 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Phe Thr 1 5 <210> 20 <211> 176 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Pro Arg Gly Ala Thr Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met 100 105 110 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser 130 135 140 Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys 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Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 29 <211> 329 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 325

Claims (20)

  1. 이필리무맙의 ADCC 활성의 적어도 2배를 갖는 항-인간 CTLA-4 항체를 백신으로 치료된 인간 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 백신으로 치료된 인간 대상체에서 백신에 대한 면역 반응을 증진시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 항체가
    a. 서열식별번호: 3의 서열로 이루어진 CDRH1;
    b. 서열식별번호: 4의 서열로 이루어진 CDRH2;
    c. 서열식별번호: 5의 서열로 이루어진 CDRH3;
    d. 서열식별번호: 6의 서열로 이루어진 CDRL1;
    e. 서열식별번호: 7의 서열로 이루어진 CDRL2; 및
    f. 서열식별번호: 8의 서열로 이루어진 CDRL3
    을 포함하는 것인 항체.
  3. 제2항에 있어서, 항체가
    a. 서열식별번호: 9의 서열로 이루어진 중쇄 가변 도메인; 및
    b. 서열식별번호: 10의 서열로 이루어진 경쇄 가변 도메인
    을 포함하는 것인 항체.
  4. 제3항에 있어서, 항체가
    a. 서열식별번호: 12의 서열로 이루어진 중쇄; 및
    b. 서열식별번호: 13의 서열로 이루어진 경쇄
    를 포함하는 것인 항체.
  5. 제4항에 있어서, 항체가
    a. 서열식별번호: 11의 서열을 포함하는 중쇄; 및
    b. 서열식별번호: 13의 서열을 포함하는 경쇄
    를 포함하는 것인 항체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 이필리무맙의 ADCC 활성의 적어도 2배를 갖는 항-인간 CTLA-4 항체가 실시예 2에 상술된 NK92 세포 매개 용해 검정에서 이필리무맙에 대한 세포 용해에 대한 EC50보다 적어도 2배 더 낮은 세포 용해에 대한 EC50을 나타내는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 이필리무맙의 ADCC 활성의 적어도 2배를 갖는 항-인간 CTLA-4 항체가 실시예 2에 상술된 NK92 세포 매개 용해 검정에서 이필리무맙에 대한 세포 용해에 대한 EC50보다 적어도 10배 더 낮은 세포 용해에 대한 EC50을 나타내는 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 항체가
    a. 서열식별번호: 14의 서열로 이루어진 CDRH1;
    b. 서열식별번호: 15의 서열로 이루어진 CDRH2;
    c. 서열식별번호: 16의 서열로 이루어진 CDRH3;
    d. 서열식별번호: 17의 서열로 이루어진 CDRL1;
    e. 서열식별번호: 18의 서열로 이루어진 CDRL2; 및
    f. 서열식별번호: 19의 서열로 이루어진 CDRL3
    을 포함하는 것인 항체.
  9. 제8항에 있어서, 항체가
    a. 서열식별번호: 20의 서열로 이루어진 중쇄 가변 도메인; 및
    b. 서열식별번호: 21의 서열로 이루어진 경쇄 가변 도메인
    을 포함하는 것인 항체.
  10. 제9항에 있어서, 항체가
    a. 서열식별번호: 23의 서열로 이루어진 중쇄; 및
    b. 서열식별번호: 24의 서열로 이루어진 경쇄
    를 포함하는 것인 항체.
  11. 제9항에 있어서, 항체가
    a. 서열식별번호: 22의 서열을 포함하는 중쇄; 및
    b. 서열식별번호: 24의 서열을 포함하는 경쇄
    를 포함하는 것인 항체.
  12. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 이필리무맙의 ADCC 활성의 적어도 2배를 갖는 항-인간 CTLA-4 항체가 실시예 2에 상술된 NK92 세포 매개 용해 검정에서 이필리무맙에 대한 세포 용해에 대한 EC50보다 적어도 2배 더 낮은 세포 용해에 대한 EC50을 나타내는 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 이필리무맙의 ADCC 활성의 적어도 2배를 갖는 항-인간 CTLA-4 항체가 실시예 2에 상술된 NK92 세포 매개 용해 검정에서 이필리무맙에 대한 세포 용해에 대한 EC50보다 적어도 10배 더 낮은 세포 용해에 대한 EC50을 나타내는 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 이필리무맙의 ADCC 활성의 적어도 2배를 갖는 항-인간 CTLA-4 항체가 감소된 푸코실화를 갖는 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 이필리무맙의 ADCC 활성의 적어도 2배를 갖는 항-인간 CTLA-4 항체가 저푸코실화 또는 비푸코실화된 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 이필리무맙의 ADCC 활성의 적어도 2배를 갖는 항-인간 CTLA-4 항체가 비푸코실화된 것인 방법.
  17. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 이필리무맙의 ADCC 활성의 적어도 2배를 갖는 항-인간 CTLA-4 항체가 i) G236A; ii) S239D; iii) F243L; iv)　E333A; v) G236A/I332E; vi) S239D/I332E; vii) S267E/H268F; viii) S267E/S324T; ix) H268F/S324T; x) G236A/S239D/I332E; xi) S239D/A330L/I332E; xii) 　S267E/H268F/S324T; 및 xiii) G236A/S239D/A330L/I332E로 이루어진 군으로부터 선택되는 돌연변이 또는 돌연변이 클러스터를 포함하는 IgG1 중쇄 불변 영역을 포함하는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 이필리무맙의 ADCC 활성의 적어도 2배를 갖는 항-인간 CTLA-4 항체가 감소된 푸코실화를 갖는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 이필리무맙의 ADCC 활성의 적어도 2배를 갖는 항-인간 CTLA-4 항체가 저푸코실화 또는 비푸코실화된 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 이필리무맙의 ADCC 활성의 적어도 2배를 갖는 항-인간 CTLA-4 항체가 비푸코실화된 것인 방법.
KR1020197028077A 2017-02-28 2018-02-27 백신에 대한 면역 반응을 증진시키기 위한 증진된 adcc를 갖는 항-ctla-4 항체의 용도 KR20190124256A (ko)

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