KR20100097651A - 베타-아밀로이드 펩티드에 특이적인 신규 항체 및 진단제 또는 진단약으로서의 그 용도 - Google Patents

베타-아밀로이드 펩티드에 특이적인 신규 항체 및 진단제 또는 진단약으로서의 그 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은, Aβ8-x 펩티드의 N-말단 영역에 특이적으로 결합하고, Aβ1-x(여기서, x는 40 또는 42)를 인식하지 아니하며, 단일클론 항체 및 Aβ8-x 펩티드 간의 면역학적 복합체(immunological complex) 형성에 의하여 결정되는 것과 같은, Aβ8-x 펩티드에 대한 고도의 친화성을 제공하는 단일클론 항체에 관한 것이다.

Description

베타-아밀로이드 펩티드에 특이적인 신규 항체 및 진단제 또는 진단약으로서의 그 용도{NEW ANTIBODIES SPECIFIC OF THE β-AMYLOID PEPTIDES AND THEIR USES AS DIAGNOSTIC AGENTS OR DRUGS}
본 발명은 베타-아밀로이드 펩티드(β-amyloid peptides)에 특이적인 신규 항체 및 진단제 또는 진단약으로서의 그 용도에 대한 것이다.
아밀로이드증(amyloidosis)이란, 포유류에 있어서 아밀로이드 섬유(amyloid fibers)의 존재로 특징 지어지는 병적 증상을 의미한다. 아밀로이드(amyloid)는 특정 단백질 침적(protein deposits)을 제외한 다양한 집합체를 일컫는 포괄적인 용어이다. 모든 아밀로이드 침적은 특정 염료(예를 들어, 콩고 레드(Congo red))에 의하여 착색되며, 착색 후 편광하에서 특징적인 적-녹 복굴절(birefringent)이 발현되는 공통적인 형태학적 특징을 지닌다. 서로 다른 아밀로이드들은 또한 그 침적층(deposits) 내에 존재하는 단백질 타입에 의하여 구별된다. 예를 들어, 스크래피(scrapie), 광우병(bovine spongiform encephalitis), 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease) 등과 같은 신경변성 질환(neurodegenerative disease)들은 중추신경계 내의 단백효소 내성 형태(protease-resistant form)의 프리온 단백질(AScr 또는 PrP-27로 호칭됨)의 발현 및 축적으로 특징지어진다. 마찬가지로, 알츠하이머 병(Alzheimer's disease), 기타 신경변성 질환은 신경반(neuritic plaque) 및 신경섬유다발(neurofibrillary tangle)에 의하여 특징지어진다. 이 경우, 플라크 및 혈관 아밀로이드는 섬유성 베타-아밀로이드 단백질(fibrillar b-amyloid protein)의 침적에 의하여 형성된다.
알츠하이머 병(AD)는 가장 일반적인 타입의 노인성 치매(senile dementia)이며, 모든 치매의 40 - 60%를 차지하고 있는 것으로 여겨진다. AD의 발병은 연령의 증가에 따라 증가하며, 65세 이상 노인의 10명 중 1명, 85세 이상인 경우에는 2명 중 1명에게 발병한다. 전반적으로, 상기 질병의 자연사는, 궁극적으로 치명적인 뇌 손상, 심각한 행동 및 성격 변화, 과도하게 손상된 인지 능력으로 귀결되는 진행성 뇌 질환으로 특징지어질 수 있다. 이들 장애는 잘 드러나지 않는 뇌 세포의 괴사 및 이들 간의 상호작용의 손상에 관련된 것이다. AD 환자들에 대한 보호시설 및 보조적 수단에 의한 간병을 제공하여야 할 큰 비용 측면에 있어서, AD의 사회 및 국가 경제에 대한 충격은 실로 엄청나다.
AD 발병 뇌에서 신경 손상과 관련된 두 가지 주요 형태의 조직학적 병변이 발견되었다(Felician and Sandson, (1999), The neurobiology and pharmacotherapy of Alzheimer's disease. J. Neuropsychiatry Clin. Neurosci. 11: 19-31):
(ⅰ) 세포 내 수준(intracellular level)에서, AD 환자들의 신경세포의 세포골격(cytoskeleton)은 진행적으로 장애를 겪으며 쌍나선형 필라멘트(paired helical filaments, PHF)로 이루어진 신경섬유다발(NFTs)로 대체된다;
(ⅱ) 세포 외 수준(extracellular level)에서, 아밀로이드 플라크들은 섬유성 베타-아밀로이드(fibrillary β-amyloid, Aβ)의 침적에 의하여 형성된다.
Aβ는 노인반(senile plaque)의 주성분이다. Aβ는 각각 40(Aβ1-40) 및 42(Aβ1-42) 아미노산으로 이루어진, 주로 두 가지 크기 및 소량의 다른 사이즈로 발견되는 작은 펩티드이다. Aβ는 APP의 단백질분해 분할(proteolytic cleavage)로부터 대사하는 것으로 알려져 있다(Saido, (2000): Degradation of amyloid-b peptide: a key to Alzheimer pathogenesis, prevention and therapy. Neurosci. News 3: 52-62). APP는 알려져 있긴 하지만, 명확하게 규명되지는 아니한 신경성장에 관련된 작용(neurotrophic function)을 가지는 거대 막투과 단백질이다(Seo et al., (2001), Effects of nicotine on APP secretion and Abeta- or CT(105)-induced toxicity. Biol. Psychiatry 49: 240-247). APP는 두 가지 주요 경로를 통해 분리된다. 주경로로서의 비-아밀로이드 형성 경로(non-amyloidogenic route)와 두 번째 부경로로서, 최종 생성물로서 Aβ를 생성하는 아밀로이드 형성 경로(amyloidogenic route)가 그것이다.
APP 대사의 주요 경로는, β-아밀로이드 펩티드 영역의 중앙 근방 APP 내의 단일 사이트(single site)에서의 α-세크리타아제(α-secretase)에 의한 분할(cleavage)을 통하여 이루어진다(Esch et al., (1990), Cleavage of amyloid beta peptide during constitutive processing of its precursor. Science 248: 1122-1124; Sisodia, (1992), Beta-amyloid precursor protein cleavage by a membrane-bound protease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6075-6079). 이 경로에 의하여 생성된 생성물은 APP(APPsα)의 거대 N-말단 영역(large N-terminal region) 및 막과 연관된 C-말단 절편(membrane associated C-terminal fragment)(C83)이며, 이후에 이들은 γ-세크리타아제에 의하여 가수분해되어 거의 알려지지 않은 작은 p3 펩티드를 생성한다. 이것은 상기 분할 사이트가 Aβ 형성 가능성이 없는 Aβ서열의 대략 중앙부에 위치하기 때문에 비-아밀로이드 형성 경로를 통한 것이다. 두 번째 APP 진행경로(processing pathway)는 β- 및 γ-세크리타아제에 의한 APP의 N- 및 C-말단 분할이다(도 1 참조). 이들 두 가지 단백질분해단계(proteolytic step)로부터 얻어지는 분자들은 APP, Aβ40 및 Aβ42의 중앙 절편들이며, 형성된 전체 Aβ 중에서 Aβ40가 가장 풍부하다(Conde, (2002), b-amyloid peptide as a target for treatment of Alzheimer's disease. Expert Opin. Ther. Patents 12: 503-512). β-세크리타아제는 β-아밀로이드 펩티드의 아미노 말단에 부착되어, 첫 번째로 작용하며, 이어서 γ-세크리타아제가 상기 펩티드의 카르복시 말단에 작용한다. 이러한 진술은 β-세크리타아제 분할에 의하여 생성되는 C-말단 절편이 세포 내에서 용이하게 발견되는 반면, 단일 C-말단 γ 분할에 관계된 APP 절편들은 그러하지 아니한 현상에 근거한 것이다(Haass et al., (1992), Amyloid beta-peptide is produced by cultured cells during normal metabolism. Nature 359: 322-325; Seubert et al., (1992), Isolation and quantification of soluble Alzheimer's beta-peptide from biological fluids. Nature 359: 325-327).
실질 플라크 침적(parenchymal plaque deposition)에 관여하는 이러한 아밀로이드 펩티드들은 형질전환 마우스 모델과 구별된다(Sergeant,N. et al ., (2003) Truncated beta-amyloid peptide species in pre-clinical Alzheimer's disease as new targets for the vaccination approach. Journal of Neurochemistry 85: 1581-1591; Kalback,W. et al ., (2002) APP transgenic mice Tg2576 accumulate Abeta peptides that are distinct from the chemically modified and insoluble peptides deposited in Alzheimer's disease senile plaques. Biochemistry 41: 922-928; Rufenacht,P. et al . (2005) Quantification of the Aβ peptide in Alzheimer's plaques by laser dissection microscopy combined with mass spectrometry. J Mass Spectrom 40: 193-201).
특히, Aβ42의 N-절두된 형태(N-truncated form)들은 온전한 크기(full-size)의 세크리타아제에 의하여 생성된 Aβ보다도 훨씬 더 풍부하다. 나아가,모델 시스템과 CSF 및 플라즈마와 같은 순환 유체 내에서는 추가적으로 Aβ 펩티드의 수가 증가하는 것이 검출되었다(Lewczuk,P. et al . (2004), Amyloid beta peptides in cerebrospinal fluid as profiled with surface enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry: evidence of novel biomarkers in Alzheimer's disease. Biol . Psychiatry . Mar. 1. ; 55, 524-530; Lewczuk,P. et al . (2004), Electrophoretic separation of amyloid beta peptides in plasma. Electrophoresis . 25, 3336-3343　; Lewczuk,P. et al . (2003), The amyloid-beta (Abeta) peptide pattern in cerebrospinal fluid in Alzheimer's disease: evidence of a novel carboxyterminally elongated Aβ peptide. Rapid Commun. Mass Spectrom .; 17, 1291-1296; Wiltfang,J. et al . (2002), Highly conserved and disease-specific patterns of carboxyterminally truncated Aβ peptides 1-37/38/39 in addition to 1-40/42 in Alzheimer's disease and in patients with chronic neuroinflammation. J. Neurochem . 81, 481-496; Qi-Takahara,Y. et al . (2005), Longer forms of amyloid beta protein: implications for the mechanism of intramembrane cleavage by gamma-secretase. J Neurosci 25, 436-445; Funamoto,S. et al . (2004), Truncated carboxyl-terminal fragments of beta-amyloid precursor protein are processed to amyloid beta-proteins 40 and 42. Biochemistry 43, 13532-13540, Sato,T. et al . (2003), Potential link between amyloid beta-protein 42 and C-terminal fragment gamma 49-99 of beta-amyloid precursor protein. J Biol . Chem . 278, 24294-24301).
β-아밀로이드 펩티드에 특이적인 항체를 이용한 알츠하이머에 대한 면역요법은 알츠하이머 질병을 치료하기 위한 가능성 있는 신규 치료방법이다(Schenk et al., (2000), beta-peptide immunization: a possible new treatment for Alzheimer's disease. Arch Neurol 57: 934-936; Hock et al., (2003), Antibodies against beta-amyloid slow cognitive decline in Alzheimer's disease. Neuron 38: 547-554).
그러나, β-아밀로이드는 통상적인 조직의 통상적인 구성요소이기 때문에, 생체 내 유체의 격심한 부작용이 최초의 임상학적 시도를 좌절시켰다(Orgogozo et al., (2003), Subacute meningoencephalitis in a subset of patients with AD after Abeta 42 immunization. Neurology 61: 46-54).
Sergeant 등(Sergeant et al., (2003), Truncated beta-amyloid peptide species in pre-clinical Alzheimer's disease as new targets for the vaccination approach. Journal of Neurochemistry 85: 1581-1591)은, 초기 아밀로이드 침적물 중 모든 Aβ 종의 60%가 아미노 절두형(amino-truncated) Aβ 종임을 밝혀내었다.
국제출원 WO 2004/029630에서는, 특이적으로 Aβ11-x 펩티드는 인식하지만, Aβ1-x 펩티드는 인식하지 아니하는 단일클론 항체가 개시되었다(x는 40 또는 42).
면역에 사용되는 펩티드들은 β 세크리타아제_11 분할 사이트(β secretase_11 cleavage site) 중 최초의 5 내지 7 인간 아미노산이다(β 세크리타아제는 Glu 11에서 APP 단백질을 분할한다). 그럼에도 불구하고, Aβ11-x 펩티드들은 아밀로이드 침적의 초기단계에서 발견되는 Aβ 펩티드가 아니다(Sergeant et al., Truncated beta-amyloid peptide species in pre-clinical Alzheimer's disease as new targets for the vaccination approach. Journal of Neurochemistry 85, 1581-1591 (2003)). 게다가, Aβ11-x는 β 세크리타아제의 분할에 의하여 생성되는 점에서, 발병종이 아니며, Aβ42의 N-절두 형태가 온전한 크기(full-size)의 Aβ42 및 Aβ11-x 종들보다 훨씬 더 풍부하다.
국제출원 WO 2004/013172에서는, 절두된 베타-아밀로이드 펩티드 종인 Aβm-n (여기서, m은 1 내지 10, n은 m+3 내지 m+15)에 대하여 특이적인 다클론 항체(polyclonal antibodies)에 관한 것이다. 면역에 사용되는 펩티드들은 Aβ5-12, Aβ6-13, Aβ8-15, Aβ9-16이다. 상기 출원에서의 항체는 다클론 항체이지만, 중간정도의 친화성(moderate affinity)을 가진다.
Murayama K. S. 등은(Murayama K. S. et al ., (2007), A novel monoclonal antibody specific for the amino-truncated b-amyloid Aβ5-40/42 produced from caspase-cleaved amyloid precursor protein, 161: 244-249), 펩티드 Aβ5-12 면역을 이용하여 얻어지는 단일클론 항체에 있어서, 이것이 Aβ1-40가 아닌 Aβ5-40를 특이적으로 인식하는 것에 대하여 기재되어 있다.
두 가지 다른 항체들이 이 논문에 기재되었으며, 이는:
● Aβ17-24에 대하여 특이적인 마우스 단일클론 항체 4G8;
● Aβ15-30에 대하여 특이적인 토끼 다클론 항체 Ab-1이다.
그럼에도, 이들 두 항체는 Aβ5-40 또는 Aβ1-40에 대해서는 특이성을 갖거나 이들을 인식하지는 아니한다.
본 발명의 목적 중 하나는 Aβ8-x 펩티드의 N-말단 영역에 특이적으로 결합하고, Aβ1-x(여기서, x는 40 또는 42)를 인식하지 아니하며, β 아밀로이드 침적의 초기단계 펩티드들을 특이적으로 인식할 수 있는 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 Aβ의 N-절두 펩티드에 대한 면역반응을 생성하는데 유용하여, 결국 알츠하이머 질병의 예방 및 치료에 유용한 합성 펩티드를 제공하는 것이다.
본 발명은 또한 Aβ8-x 펩티드의 N-말단 영역에 특이적으로 결합하는 항체를 얻기 위한 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 나아가, 포유류에 있어서의 아밀로이드 침적(amyloid burden)을 진단하는 방법에 대한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 포유류에 있어서, 알츠하이머 질병과 같은 Aβ 형성 및/또는 응집(aggregation)에 연관된 질병에 대한 민감성을 판별하는 방법, 포유류에 있어서, 알츠하이머 질병과 같은 β-아밀로이드 형성 및/또는 응집에 연관된 질병 진행의 위험성의 판별방법, 포유류에 있어서, β-아밀로이드 침적의 제거를 선별(screening)하는 방법 또는 포유류에 있어서의 β-아밀로이드 침적 수준을 예측하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 또한, Aβ8-x 펩티드의 N-말단 영역에 특이성을 가지는 항체, 또는 알츠하이머 질병의 예방 또는 치료를 목적으로 하는 의약품 또는 백신의 제조에 유용한 N-절두(N-truncated) Aβ 펩티드의 자유 N-말단부(free N-terminal-end)를 모사한 자유 N-말단부를 이용한 합성 펩티드를 포함하는 치료제 또는 백신 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 나아가 알츠하이머 질병의 예방 또는 치료를 목적으로 하는 의약품 또는 백신의 제조를 위한 항체의 용도에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 Aβ8-x 펩티드(x는 11 내지 42)의 N-말단 영역에 특이적으로 결합하며,Aβ1-40 또는 Aβ1-42를 인식하지 아니하는 항체에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, "항체(antibody)"라는 용어는 Aβ8-x 에 대하여 특이적인 다클론 항체 또는 단일클론 항체를 지칭하는데에 사용되었으며, 또한 Aβ8-x 에 대하여 특이적인 단일클론을 모사한 절편(fragments) 또는 분자, 특히 에피토브 결합 절편(epitope binding fragment)을 포함한다. 절편 또는 분자는 재조합 DNA 기술 또는 효소적 또는 화학적 방법에 의하여 단일클론으로부터 유도될 수 있으며, 항원 절편에 대한 단일클론과 비교하여 유사한 특성을 보이는 것일 수 있다.
"다클론 항체"는, 서로 다른 B-세포선들로부터 유래한 항체를 의미한다.
"단일클론 항체"는, 오직 하나의 유형의 세포, 즉 하이브리도마 세포(hybridoma cell)로 부터 유래한 항체를 의미한다.
"하이브리도마" 세포는, 예를 들면 포유동물 세포와 융합된 끝없이 복제가능한 암세포와 같이 항체를 연속적으로 생산할 융합세포를 의미한다.
본 발명에 의한 항체는 상술한 전체 길이(full length)의 항체와 함께 그 에피토프-결합 절편을 모두 포함한다. 본 명세서의 "항체절편"은, 전체 길이 항체에 의하여 인식되는 에피토프에 결합하는 능력을 보유한 항체의 여하한 부위를 모두 포함하는 것으로서, 일반적으로 "에피토프-결합 절편(epitope-binding fragments)"으로 칭한다. 항체절편의 예로서, Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, 단일 사슬 Fvs(scFv), 단일사슬 항체, 이황화-결합 Fvs(disulfide-linked Fvs, dsFv) 및 VL 또는 VH 영역을 포함하는 절편 등을 들 수 있지만, 이에 한정되지는 아니한다. 단일사슬 항체를 포함하는 에피토프-결합 절편은 다음의 다양한 영역들이 단독 또는 조합된 것을 포함할 수 있다: 힌지 영역(hinge region), CH1, CH2, 및 CH3 도메인.
이러한 절편들은 Fab 절편들 또는 F(ab')2 절편 중 하나 또는 모두를 포함할 수 있다. 나아가, 상기 절편들은 다음의 이뮤노글로불린 집합체 중 하나 또는 이들의 조합일 수 있다: IgG, IgM, IgA, IgD, 또는 IgE, 및 이들의 하위집합체. Fab 및 F(ab')2 절편들은 파파인(papain) (Fab 절편) 또는 펩신( F(ab')2 절편)과 같은 효소를 이용한 단백질분해 분할에 의하여 생성될 수 있다.
"단일 사슬 FVs(Single-chain FVs)" ("scFvs") 절편은 항체 경쇄 가변 영역(antibody light chain variable region)(VL)의 적어도 하나의 절편에 연결된 항체 중쇄 가변 영역(antibody heavy chain variable region)(VH)의 적어도 하나의 절편을 포함하는 에피토프-결합 절편이다. 연결자(lilnker)는, 상기 단일 사슬 항체 절편을 유도하는 전체 항체의 목표 분자 결합특이성을 유지하기 위하여, VL 및 VH 영역들이 일단 연결된 후, 이들이 적절한 3차원 접힘이 확실히 발생하도록 선택되는, 짧고, 연성을 가진 펩티드일 수 있다. VL 또는 VH 서열의 카르복실 말단들은 연결자에 의하여 상보적인 VL 또는 VH 서열의 아미노산 말단에 공유 결합될 수 있다.
본 발명에 의한 단일 사슬 항체 절편은 본 명세서에서 기술하는 모든 항체의 적어도 하나의 가변성(variable) 또는 상보성 결정 영역(complementarity determining regions, CDRs)을 보유한 아미노산 서열을 포함하나, 이들 항체의 불변 영역(costant domain) 중 일부 전부는 제외된다. 이들 불변 영역은 항원 결합에 필요하지 아니하나, 전체적인 항체들의 구조 중에 주요 부위를 구성한다. 단일 사슬 항체 절편은 따라서, 불변 영역의 일부 또는 전부를 포함하는 항체의 사용과 연관된 일부 문제점들을 극복할 수 있다. 예를 들면, 단일 사슬 항체 절편은 생체 분자와 중쇄 불변 영역과의 불필요한 상호작용 또는 기타 원치않은 생물학적 거동을 배제하려는 경향이 있다. 더욱이, 단일 사슬 항체 절편들은 전체적인 항체에 비하여 상당히 작은 크기를 가지며, 따라서 전체 항체보다 더 큰 모세관 투과성(capillary permeability)을 가질 수 있어, 단일 사슬 항체 절편은 보다 효율적으로 목적 항원-결합 사이트에 자리잡고, 결합할 수 있게 된다. 또한, 항체절편들은 원핵세포(prokaryotic cells) 내에서 상대적으로 거대한 스케일로 생성될 수 있기 때문에, 이들의 생성을 촉진한다. 나아가, 단일 사슬 항체절편들의 상대적으로 작은 크기로 인하여, 전체 항체에 비하여 수용체 내에서의 면역반응의 유발가능성이 낮아진다.
단일 사슬 항체절편은 분자 클로닝(molecular cloning), 항체파지 디스플레이 라이브러리 또는 해당 기술분야의 기술자들에게 잘 알려진 유사한 기술들을 이용하여 생성될 수 있다. 이들 단백질은, 예를 들면, 진핵세포 또는 박테리아를 포함한 원핵세포 내에서 생성될 수 있다. 본 발명에 의한 에피토프-결합 절편 역시 해당 기술분야에서 잘 알려진 다양한 파지 디스플레이 방법들(phage display methods)을 이용하여 생성될 수 있다. 파지 디스플레이 방법에 따르면, 기능적 항체 영역들은 이들을 인코딩하는 폴리뉴클리오티드 서열을 운반하는 파지 입자들의 표면상에 표시된다. 특히, 이러한 파지는 레퍼토르(repertoire) 또는 조합식 항체 라이브러리(combinatorial antibody library)(예를 들면, 인간 또는 마우스)로부터 발현되는 에피토프-결합 도메인을 표시하는데 활용될 수 있다. 목적하는 항원에 결합하여 에피토프-결합 도메인을 발현하는 파지(Phage)는, 항원을 이용하여 선택되거나 식별될 수 있다. 예를 들면, 표지된 항원 결합을 이용하거나 고체 표면 또는 비드(bead)에 포획하는 방법을 사용할 수 있다. 이들 방법에 사용되는 파지들은 전형적으로 유전형 Ⅲ 또는 유전형 Ⅷ 단백질과 재조합적으로 융합된 Fab, Fv 또는 이황화-안정화된(disulfide-stabilized) Fv 항체 도메인을 가진 파지로부터 발현되는 fd 및 M13 결합 도메인을 포함하는 섬유상 파지(filamentous phage)이다.
본 발명에 의한 에피토프-결합 절편을 만드는데 사용될 수 있는 파지 디스플레이 방법의 예로서, Brinkman et al ., 1995, J. Immunol . Methods, 182: 41-50; Ames et al ., 1995, J. Immunol . Methods, 184: 177-186; Kettleborough et al ., 1994, Eur. J. Immunol ., 24: 952-958; Persic et al ., 1997, Gene, 187: 9-18; Burton et al ., 1994, Advances in Immunology, 57: 191-280; WO/1992/001047; WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; and U.S. Pat. Nos. 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743 및 5,969,108에 기재된 것들을 들 수 있으며, 이들 문헌 각각을 참조하여 전체로서 통합될 수 있다.
파지 선택 후에, 상기 절편들을 인코딩하는 파지의 영역들은 분리된 후, 아래에 기술된 바와 같은 재조합 DNA 기술을 이용하여, 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모, 및 박테리아 등을 포함한 선택된 호스트 내에서의 발현을 통하여 에피토프-결합 절편을 생성하는데에 사용될 수 있다. 예를 들면, 이러한 기술로서, Fab, Fab', 및 F(ab')2 절편 재조합적으로 생산하는 기법들 역시 다음의 문헌에 기재된 방법들이 적용될 수 있다: WO 92/22324; Mullinax et al ., 1992, BioTechniques, 12(6): 864-869; Sawai et al ., 1995, AJRI, 34: 26-34; and Better et al ., 1988, Science, 240:1041-1043; 이들 문헌 각각은 상호 참조하여 전체로서 통합될 수 있다. 단일 사슬 Fvs 및 항체의 생성에 사용될 수 있는 기술의 예들은, U.S. Pat. Nos. 4,946,778 and 5,258,498; Huston et al ., 1991, Methods in Enzymology, 203: 46-88; Shu et al ., 1993, PNAS, 90: 7995-7999; Skerra et al., 1988, Science, 240:1038-1040에 제시된 것들을 포함한다.
아울러, 본 발명의 범위 내에는, 본 발명에서 특정적으로 개시된 항체의 기능적 균등물들이 포함된다. "기능적 균등물"이라는 용어는 대응하는 염기(homologous sequences)를 가진 항원, 키메릭 항원, 인공 항원 및 변형된 항원을 포함하며, 예를 들면, 각 기능적 균등물은 상기 정의된 바와 같은 Aβ8-x 펩티드의 N-말단 영역에 특이적으로 결합하는 그것의 능력에 의하여 정의된다. 통상의 기술자들은 "항체절편" 분자그룹 및 "기능적 균등물" 그룹의 용어에 있어서, 서로 중복되는 부분이 있다는 것이 이해될 것이다. 기능적 균등물을 생성하는 방법은 해당 기술분야의 숙련된 기술자들에게 알려져 있으며, 예를 들면, WO 93/21319, EP 239,400; WO 89/09622; EP 338,745; and EP 332,424과 같은 문헌에 기재되어 있다. 이들 각각의 문헌은 각각을 참조하여 전체로서 통합될 수 있다.
인공 항체(artificial antibodies)는 scFv 절편, 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라아바디(tetraabody) 및 mru를 포함하며(Winter, G. and Milstein, C., 1991, Nature, 349: 293-299; Hudson, P.J., 1999, Current Opinion in Immunology, 11: 548-557 참조), 이들 각각은 항원-결합 능력을 가진다. 상기 단일 사슬 Fv 절편(scFv)에 있어서, 항체의 VH 및 VL 도메인들은 연성의 펩티드에 의하여 연결된다. 전형적으로 이러한 연결자(linker) 펩티드는 약 15아미노산 잔기 길이(amino acid residues long)를 가진다. 만약 상기 연결자가 훨씬 작다면, 예를 들면 5 아미노산이라면, 디아바디(diabody)들이 형성되며, 이들은 이가(二價)의 scFv 다이머(dimer)이다. 만약, 상기 연결자가 3 아미노산 잔기 이하로 축소된다면, 트리아바디(triabody) 및 테트라아바디(tetraabody)로 일컬어지는 트리머 및 테트라머의 구조가 형성된다. 항체의 가장 작은 결합단위는 CDR, 전형적으로는 충분한 특이적 인식 및 결합능력을 가지며, 별도로 분리하여 사용될 수 있는 중쇄의 CDR2이다. 이러한 절편은 분자적 인식단위(molecular recognition unit ) 또는 mru라고 일컬어진다. 이러한 몇몇 mru들은 짧은 연결자 펩티드들에 의하여 서로 연결됨으로써, 단일 mru보다 결합 활성(avidity)이 큰 인공적인 결합 단백질을 형성할 수 있다.
본 발명에 의한 기능적 균등물은 또한 변형된 항체, 구체적으로, 여하한 타입의 분자의 상기 항체에 대한 공유적 부착(covalent attachment)에 의하여 변형된 항체를 포함한다. 예를 들면, 변형된 항체는, 구체적으로, 글리실화(glycosylation), 아세틸화(acetylation), 페길화(pegylation), 포스포릴화(phosphorylation), 아미드화(amidation), 공지의 보호/블로킹기에 의한 유도체화(derivatization), 단백질분해 분할, 세포 리간드 또는 기타 단백질로의 연결 등에 의하여 변형된 항체를 포함한다. 상기 공유적 부착은 항체가 항유전자형 반응(anti-idiotypic response)을 생성하는 것을 방해하지 아니한다. 이들 변형은 공지의 기술에 의하여 수행될 수 있으며, 이러한 공지기술은, 특이성 화학적 분할(specific chemical cleavage), 아세틸화, 포르밀화(formylation), 투니카마이신(tunicamycin)의 대사적 합성 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 추가적으로, 상기 변형된 항체들은 하나 또는 그 이상의 비-전형적(non-classical) 아미노산을 포함할 수 있다.
기능적 균등물은 서로 다른 구조체(framework) 내에서 서로 다른 사슬상에 위치한 서로 다른 CDR 들을 교체함으로써 생성될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 주어진 CDR의 집합체에 대하여 서로 다른 중쇄들의 치환됨으로써 서로 다른 항체 군들이 생성가능하며, 예를 들면, IgG1-4, IgM, IgA1-2, IgD, IgE 항체 타입 및 이소타입(isotype)이 생성될 수 있다. 마찬가지로, 본 발명의 범위에 속하는 인공 항체들는 전체적인 합성 구조체 내에서의 주어진 CDR들의 집합체를 끼워넣음(embedding)으로써 생성될 수 있다.
기능적 균등물은 해당 기술분야에서의 다양한 공지기술을 이용하여, 특정한 CDR 집합체가 삽입된 가변 및/또는 불변 영역 서열 내에서의 돌연변이(mutation), 결실 및/또는 삽입에 의하여 쉽게 생성될 수 있다.
Aβ8-x 펩티드의 N-말단 영역에 특이적으로 결합하는 항체는 면역학적 검정법(immunoassay)에 의하여 검출될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 "면역학적 검정법(immunoassay)"은, 항원(즉, Aβ8-x 펩티드의 N-말단 영역)에 특이적으로 결합하는 항체를 활용하는 검정법이다. 이러한 면역학적 검정법은 따라서 항체에 대한 단백질의 특이적 결합의 검출로 특징지어진다.
"~에 특이적으로 결합하는", "특이적 인식", "특이적으로 인식하는", "~과 특이적으로 반응하는" 또는 "~과의 면역학적인 반응을 특이적으로 형성하는" 이라는 표현은, Aβ8-x 펩티드의 N-말단 영역에 대한 항체에 의한 결합반응을 의미하는 것으로서, 피검 샘플 내의, 서로 다른 단백질 및/또는 생체물질들의 비균질적인 군집체의 존재하에서, Aβ8-x 펩티드의 N-말단 영역의 존재에 대한 결정요인이다. 특이성은 Luminex 검정에 의하여 결정될 수 있다. 이 검정법을 사용하여, 본 발명의 항체들은 Aβ8-x 펩티드에 대한 고도의 특이성을 제공한다. 예를 들면, 특정 항체를 이용하여 얻어진 평균 형광강도(Mean Fluorescence Intensity, MFI)는 Aβ8-x 펩티드상에서 얻어진 것이 Aβ6-13과 같은 비특이성 펩티드상에서 얻어진 것보다 훨씬 높다. 예를 들면, Aβ8-15 펩티드상의 TeiA1.1을 이용한 경우, MFI= 1822인 반면, Aβ6-13 펩티드상에서는 불과 24이다(실시예3 및 표 3 참조).
면역학적 방법은 유체 또는 겔 침전반응, 면역성 확산(immunodiffusion(단일 또는 이중)), 응집검정법(agglutination assays), 면역 전기영동법(immunoelectrophoresis), 표지면역검정법(radioimmunoassays, RIA), 효소-결합 면역흡착제 검정법(immunosorbent assays, ELISA), 웨스턴 블롯(Western blots), 리포솜 면역검정법(iposome immunoassays)(Monroe 등, 1986), 보체고정 검정법(complement fixation assays), 면역방사측정법(immunoradiometric assays), 형광 면역검정법(fluorescent immunoassays), 단백질 A 면역검정법(protein A immunoassays), 또는 면역PCR(immunoPCR) 등 을 포함하지만, 이에 한정되지는 아니한다. 서로 다른 면역검정법들의 전체적인 개요는 Wild D. (2001) (Wild D. (2001), The Immunoassay Handbook 2nd edition. Nature Pr., London, UK) and Ghindilis et al. (2002) (Ghindilis A.L., Pavlov A.R., Atanassov P.B. (eds.) (2002) Immunoassay Methods and Protocols. Humana Press, Totowa, NJ, US)에 제시되어 있다.
따라서, 지정된 면역검정법 조건하에서, 특수화된 항체가 본 발명에 의한 Aβ8-x 펩티드의 N-말단 영역에 바람직하게 결합하는 한편, 다른 단백질 또는 단백질 이형체(isoform)와의 결합은 현저한 양으로 발현되지 아니한다.
특히, 상기 특수화된 항체는 Aβ1-42 펩티드에 결합하지 아니하며, 따라서 치료용 목적으로 사용될 경우에 있어서, Aβ1-42 펩티드에 대한 항체 이용시 극심한 부반응이 발생하지 아니한다(실시예 5 참조).
이러한 반응은 면역원 투여에 의하여 유발되는 적극 반응(active response)일 수도 있고, 항체 또는 전형적인 T-세포의 투여에 의하여 유발되는 소극 반응(passive response)일 수도 있다. 세포 면역반응은 Class I 또는 Class II MHC 분자들과 연관된 폴리펩티드 에피토프들을 활성화된 항원-특이성 CD4 T 헬퍼 세포들 및/또는 CD8+ 세포독성 T-세포들에 제공함으로써 유발된다. 상기 반응은 단핵 백혈구 (monocytes), 대식세포, NK세포, 호염기성 세포(basophil), 수지상세포(dendritic cell), 성상(星狀) 세포(astrocytes), 소교세포(microglia cell), 산호성 백혈구(eosinophils) 또는 비활성 면역의 화합물의 활성과 연관된 것일 수 있다.
"면역성 제제(immunogenic agent)" 또는 "면역원(immunogen)"은 선택적으로 보조제와 함께 포유류에 투여함으로써 자기 자신에 대한 면역학적 반응을 유발할 수 있다.
바람직한 일 실시형태에 있어서, 상기 항체는 Aβ8-x 펩티드의 자유 N-말단부에 대하여 고도의 특이성을 제공한다.
"자유 N-말단부"는, 예를 들어 NH2 말단부를 가지는 아미노산과 같이, 보호되지 아니한(unblocked) N-말단부를 일컫는다.
본 발명에 의한 항체는 고도의 특이성을 가진 다클론 항체 또는 고도의 특이성을 가진 단일클론 항체일 수 있다.
다른 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 항체는 Aβ8-x 펩티드에 대하여 고도의 친화성을 제공한다.
여기서, "친화성(affinity)"이란 용어는 Aβ8-x 펩티드의 자유 N-말단 영역에 대한 항체의 결합강도, 즉 상기 항체가 Aβ8-x 펩티드의 자유 N-말단 영역에 얼마나 강하게 결합되어 있는지를 의미한다.
본 발명에 의한 항체는 고도의 친화성을 가진 다클론 항체 또는 고도의 친화성을 가진 단일클론 항체일 수 있다.
Aβ8-x 펩티드의 자유 N-말단 영역에 대한 본 발명의 단일클론 항체의 친화성은 브릿징 검정 테스트(bridging assay test)에 의하여 결정된다(실시예 3 참조). 1 이하의 OD 수치는 낮은 친화성을 의미하며, 1 이상은 그 타겟에 대한 단일클론 항체의 높은 친화성을 나타낸다.
다른 진보적 실시형태에 있어서, 본 발명에 의한 항체는 고도의 특이성 및 고도의 친화성을 갖춘 다클론 항체 또는 고도의 특이성 및 고도의 친화성을 갖춘 단일클론 항체일 수 있다.
보다 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 항체는 뇌 내의 Aβ8-x 펩티드의 실질 아밀로이드 침적(parenchymal amyloid deposition)에 특이적으로 반응하며, 맥관의 아밀로이드 침적(vascular amyloid deposits)에는 상호작용하지 아니한다.
면역반응의 유발은 면역원이 투여되었을 경우, 상기 면역원에 대한 반응성을 갖는 항체 또는 T-세포를 유발하는 "능동적(active)" 경로를 통한다. 면역반응의 유발은 항체가 투여되었을 경우, 그 자체가 포유류 체내의 N-말단 절두 Aβ8-x 펩티드와 결합하는 "수동적(passive)" 경로를 통한다.
상기 수동적 면역의 부작용 중 하나는 미세출혈(microhemorrhages)의 빈번한 발생이다. 이러한 미세출혈의 증가는 주사된 항체의 혈관 벽(vessel walls) 내에서의 A β펩티드에 대한 고정에 의하여 설명될 수 있다(실시예 5 참조).
따라서, 특이적으로 실질 아밀로이드 침적을 타겟으로 하며, 맥관의 아밀로이드 침적(vascular amyloid deposits)에는 그렇지 아니한 본 발명에 의한 항체는 Aβ1-42 펩티드에 대한 항체에서 발견되는 극심한 부작용이 발생하지아니한다(실시예 5 참조).
바람직한 일 실시형태에서, 본 발명은 x가 15 내지 42이며, 특히 단일클론 항체에 관한 것이다.
바람직한 일 실시형태에서, 본 발명은 Aβ8-x 펩티드의 N-말단 영역에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체에 관한 것으로서, 상기 항체의 가변영역은 각각 경쇄(light chain) 및 중쇄(heavy chain)에 대응하며, 아래 아미노산 서열 쌍 중 하나를 포함한다:
굵은 글씨로 표현된 부분은 경쇄의 상보성 결정영역(Complementarity Determining Regions )(CDR-Lx) 또는 중쇄의 상보성 결정영역(CDR-Hx)에 대응하는 부분이다.
●항체 TeiA 1.6 (IGH521하이브리도마에 의한 분비)
경쇄 가변영역:
CDR-L1 CDR-L2
SSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLAGRYQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWAST
CDR-L3
RDSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYTYPLTFAG
(SEQ ID NO : 1)
중쇄 가변영역:
CDR-H1 CDR-H2 GGLVQPGGSLRLSCAISGFTFSDFYMEWVRQPPGKRLEWIAASRNKANDYTT
CDR-H3
EYSASVKGRFIVSRDTSQSILYLQMNALRAEDTAIYYCATYHDYAMDYWGQ
GTSVTVSS (SEQ ID NO : 2)
●항체 TeiA 1.7 (IGH522 하이브리도마에 의한 분비)
경쇄 가변영역:
CDR-L1 CDR-L2
SSLTVTAGEKVTMNCKSSQNLLNSGNQVNYLTWFQQKPGQPPKLLITWAST
CDR-L3
RESGVPDRFIGSGSGTDFTLTINSVQAEDLAVYYCQNDYRYPLTFGAG
(SEQ ID NO:3)
중쇄 가변영역: CDR-H1 CDR-H2 GGLVQPGGSLRLSCATSGFTFSDFYMEWVRQPPGRRLEWIAASRDKAKDYTT
CDR-H3
EYSASVKGRFIVSRDTSQSIFYLQMNALRSEDTAIYYCATYFSYAMDYWGLG
TSVTVSS (SEQ ID NO : 4)
●항체 TeiA 1.8 (IGH523 하이브리도마에 의한 분비)
경쇄 가변영역:
CDR-L1 CDR-L2
SSLAVTAGERVTMSCKSSLTLLNSGSQTNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTR
CDR-L3
ESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPLTFGAG
(SEQ ID NO:5)
중쇄 가변영역: CDR-H1 CDR-H2
GGLVQPGGSLRLSCATAGFTFTDQYMSWVRQPPGKALEWLATIRNKAKGFT
CDR-H3
TEYSASVKGRFTISRDNSQSILYLQMSTLRAGDSATYYCAVYGNYAMDYWG
QGTSVNVSS (SEQ ID NO : 6 )
●항체 TeiA 2b.6 (IGH524 하이브리도마에 의한 분비)
경쇄 가변영역:
CDR-L1 CDR-L2
SSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLFNSGRQTNYLTWFQQRPGQAPKLLIYWASTR
CDR-L3
GSGVPDRFTGSGSGTEFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYTYPLTFGAG
(SEQ ID NO :7)
중쇄 가변영역:
CDR-H1 CDR-H2
GGLVQPGGSLRLSCATSGFTFTDFYMEWVRQPPGKRLEWIAASRNKANGYT
CDR-H3
TEYSASVKGRFIVSRDTSQGILYLQMSALRAEDTAIYYCAIYRYYAMDYWGQ
GTSVTVSS (SEQ ID NO : 8)
●항체 TeiA 1.1 (IGH525 하이브리도마에 의한 분비)
경쇄 가변영역:
CDR-L1 CDR-L2
SSLTVTAGEKVTMSCTSSQSLFNSGTQTNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTR
CDR-L3
ESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYTYPLTFGAG
(SEQ ID NO:9)
중쇄 가변영역:
CDR-H1 CDR-H2
GGLVQPGGSLRLSCATSGFTFSDFFIEWVRQPPGKRLEWITASRNKNYDYK
CDR-H3
TEYSASVKGRFIVSRDTSQSILYLQMNALRAEDTAIYYCAIYRHYAMDYWGQ
GTSVTVSS (SEQ ID NO : 10 )
본 발명에 있어서, "항체"는 이뮤노글로불린 유전자 또는 이뮤노글로불린 유전자 절편에 의하여 실질적으로 인코딩된 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드로 이루어진 단백질을 의미한다.
바람직한 실시형태에서, 상기 정의된 항체의 가변영역의 경쇄 및 중쇄의 CDR은 다음 아미노산 서열 중 하나를 포함한다.
●항체 TeiA 1.6 ( IGH521 서열)
경쇄 가변영역의 CDR :
CDR-L1:
KSSQSLLAGRYQKNYLT (SEQ ID NO : 11)
CDR-L2:
WASTRDSG (SEQ ID NO : 12)
CDR-L3:
QNDYTYPLT (SEQ ID NO : 13)
중쇄 가변영역의 CDR :
CDR-H1:
GFTFSDFYME (SEQ ID NO : 14)
CDR-H2:
ASRNKANDYTTEYSASVKG (SEQ ID NO : 15)
CDR-H3
YHDYAMDY (SEQ ID NO : 16)
●항체 TeiA 1.7 ( IGH522 서열)
경쇄 가변영역의 CDR :
CDR-L1:
KSSQNLLNSGNQVNYLT (SEQ ID NO : 17)
CDR-L2:
WASTRESG (SEQ ID NO : 18)
CDR-L3:
QNDYRYPLT (SEQ ID NO : 19)
중쇄 가변영역의 CDR : CDR-H1: GFTFSDFYME (SEQ ID NO : 14)
CDR-H2:
ASRDKAKDYTTEYSASVKG (SEQ ID NO : 20)
CDR-H3:
YFSYAMDY (SEQ ID NO : 21)
●항체 TeiA 1.8 ( IGH523 서열)
경쇄 가변영역의 CDR :
CDR-L1:
KSSLTLLNSGSQTNYLT (SEQ ID NO : 22)
CDR-L2:
WASTRESG (SEQ ID NO : 18)
CDR-L3:
QNDYSYPLT (SEQ ID NO : 23)
중쇄 가변영역의 CDR : CDR-H1:
GFTFTDQYMS (SEQ ID NO : 24)
CDR-H2:
TIRNKAKGFTTEYSASVKG (SEQ ID NO : 25)
CDR-H3:
YGNYAMDY(SEQ ID NO : 26)
●항체 TeiA 2b.6 ( IGH524 서열)
경쇄 가변영역의 CDR : CDR-L1:
KSSQSLFNSGRQTNYLT (SEQ ID NO : 27)
CDR-L2:
WASTRGS (SEQ ID NO : 28)
CDR-L3: QNDYTYPLT (SEQ ID NO : 13) 중쇄 가변영역의 CDR :
CDR-H1:
GFTFTDFYME (SEQ ID NO : 29)
CDR-H2:
ASRNKANGYTTEYSASVKG (SEQ ID NO : 30)
CDR-H3: YRYYAMDY (SEQ ID NO : 31)
●항체 TeiA 1.1 ( IGH525 서열)
경쇄 가변영역의 CDR :
CDR-L1:
TSSQSLFNSGTQTNYLT (SEQ ID NO : 32)
CDR-L2:
WASTRESG (SEQ ID NO :18)
CDR-L3: QNDYTYPLT (SEQ ID NO : 13) 중쇄 가변영역의 CDR :
CDR-H1:
GFTFSDFFIE (SEQ ID NO : 33)
CDR-H2:
ASRNKNYDYKTEYSASVKG (SEQ ID NO : 34)
CDR-H3:
YRHYAMDY (SEQ ID NO : 35)
본 발명에 의한 CDR들은, Aβ8-X 펩티드의 특이성이 유지되는 한, 그들의 완전 동일물뿐 아니라, 변형물(variant) 역시 포함한다. 즉, 하나 또는 그 이상의 변형된 아미노산 잔여물 (amino acid residues) 내의 CDR 아미노산 서열 역시 CDR 서열로서 사용될 수 있다. CDR 변형물의 아미노산 서열 내의 변형된 아미노산 잔여물은 전체 CDR내에서, 바람직하게는 30% 또는 그 이하, 더욱 바람직하게는 20% 또는 그 이하, 가장 바람직하게는 10% 또는 그 이하로 포함된다.
따라서, 지정된 CDR 또는 대응하는 염기(homologous sequences) 중 적어도 하나를 포함하는 여하한 항체, 절편, 분자 또는 리간드가 사용될 수 있다.
CDR들은 에피토프 인식 및 항체 결합에 있어서 기본적으로 중요성을 가진다. 하지만, 변화는 , 항체의 관련 에피토프에 대한 인식 및 결합 능력을 저해하지 아니하면서, CDR들을 포함하는 상기 잔여물에 가하여진다. 예를 들면, 에피토프 인식에 영향을 주지 아니하면서, 반면 상기 항체의 에피토프에 대한 결합 친화성을 증가시키는 변화가 수행된다.
몇몇 연구들에서는, 항체의 서열 내의 다양한 위치에서 하나 또는 그 이상의 아미노산을 도입하는 경우에 있어서의 효과에 대하여, 기본적인 항체 서열에 대한 지식, 즉 그 결합 및 발현 정도 특성의 기반하에서 검토가 이루어졌다 (Yang, W. P. et al ., 1995, J. Mol . Biol ., 254　: 392-403; Rader, C. et al ., 1998, Proc . Natl. Acad . Sci . USA, 95　: 8910-8915; Vaughan, T. J. et al ., 1998, Nature Biotechnology, 16　: 535-539).
이들 연구(소위, 친화성 성숙 기술(affinity maturation techniques))에서, 기본 항체의 균등물은, 올리고뉴클레이디드-매개의 사이트-특이화된 돌연변이 생성(site-directed mutagenesis), 카세트 돌연변이 생성(cassette mutagenesis), 실수-유발 PCR(error-prone PCR), DNA 셔플링(DNA shuffling) 또는 대장균의 돌연변이 유발인자 변형(mutator-strains of E. coli)과 같은 방법을 이용하여, CDR1, CDR2, CDR3 또는 구조체 영역(framework regions) 내에서의 중쇄 및 경쇄 유전자의 서열의 변화에 의하여 생성되었다(Vaughan, T. J. et al ., 1998, Nature Biotechnology, 16: 535-539; Adey, N. B. et al ., 1996, Chapter 16, pp. 277-291, in "Phage Display of Peptides and Proteins" Eds. Kay, B. K. et al ., Academic Press). These methods of changing the sequence of the primary antibody have resulted in improved affinities of the secondary antibodies (Gram, H. et al ., 1992, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 89　: 3576-3580; Boder, E. T. et al ., 2000, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 97: 10701-10705; Davies, J. and Riechmann, L., 1996, Immunotechnolgy, 2: 169-179; Thompson, J. et al ., 1996, J. Mol . Biol ., 256: 77-88; Short, M. K. et al ., 2002, J. Biol . Chem., 277: 16365-16370; Furukawa, K. et al ., 2001, J. Biol . Chem ., 276: 27622-27628).
본 발명에 있어서 기술된 항체, 항체 서열에 있어서, 유사한 방향성의, 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔여물의 변화 전략은 상술한 바와 같이 Aβ8-x 펩티드의 N-말단 영역에 대한 향상된 친화성을 포함하는 향상된 기능을 가지며, Aβ8-x 펩티드의 N-말단 영역에 특이적으로 결합하는 항체를 개발하는데에 사용될 수 있다.
바람직한 아미노산 치환은: (1) 단백질분해에 대한 민감성 감소, (2) 산화에 대한 민감성 감소, (3) 단백질 복합체 형성을 위한 결합 친화성 변화 및 (4) 이들 유사체의 기타 물리화학적 또는 기능적 특성의 부여 또는 변경을 일으킨다. 상기 유사체는, 자연 발생 펩티드 서열 이외에 서열의 다양한 돌연변이단백질(muteins)을 포함한다. 예를 들면, 단일 또는 복수의 아미노산 치환(바람직하게는 보존적 아미노산 치환(conservative amino acid substitutions))은 상기 자연 발생적 서열(바람직하게는 도메인 외부의 폴리펩티드 영역에서) 분자 상호간 접촉을 형성하면서 수행된다. 보존적 아미노산 치환은 부계 서열(parent sequence)의 구조적인 특성을 실질적으로 변화시켜선 안된다(즉, 교체 아미노산은 부계 서열 내에서 발생하는 나선형 구조를 파괴하거나 부계 서열을 특징지어주는 다른 타입의 2차 구조에 지장을 주는 경향을 가져선 안된다. 알려진 폴리펩티드 2차 및 3차 구조는 Proteins, Structures and Molecular Principles에 기술되어 있으며(Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N. Y. (1991)) ; 및 Thornton et al ., 1991, Nature, 354: 105, 이들 문헌 각각을 참조하여 전체로서 통합될 수 있다.
개선된 항체는 또한, 특정한 특성을 가진 동물 면역, 하이브리도마 형성 및 항체 선택의 표준적인 기술에 의하여 마련된 개선된 특성을 가진다.
또한, 개선된 항체의 생성을 위하여 특이적으로 설계된 셀 라인의 사용도 가능하다. 특히, 이들 셀 라인은, 푸코실화(fucosylated)의 정도가 약하거나, 완전히 비푸코실화(defucosylated)된 항체를 제조할 수 있는 글리코실화 경로의 변경된 규제(regulation of the glycosylation pathway)를 구비한다. 이러한 셀 라인 및 이들을 설계하는 방법은 예를 들면, Shinkawa et al . (2003, J. Biol . Chem. 278(5): 3466-3473), Ferrara et al . (2006, J. Biol . Chem . 281(8): 5032-5036; 2006, Biotechnol. Bioeng . 93(5): 851-61), EP 1331266, EP 1498490, EP 1498491, EP 1676910, EP 1792987, and WO 99/54342 등에 개시되어 있다.
다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 Aβ8-x 펩티드의 N-말단 영역에 결합하는 항체에 관한 것으로서, 상기 항체는 방사성 핵종(核種) (radionuclide), 플루오르(fluor), 효소라벨(enzyme label), 효소기질(enzyme substrate), 효소 공요소(enzyme co-factor), 효소 저해제(enzyme inhibitor) 및 합텐(hapten)을 포함하는 군에서 선택되는 화합물로 라벨링(표지)된다.
본 연구에 사용되는 특정한 라벨 또는 검출가능한 기(group)는, 이것이 본 발명에서 사용되는 항체의 특이적 결합을 현저하게 방해하는 것이 아닌 한, 일반적으로 본 발명에 있어서 주요한 측면이라고는 할 수 없다.
상기 검출가능한 기는 검출가능한 물리적 또는 화학적 성질을 가진 여하한 물질일 수 있다. 이러한 검출가능한 라벨들은 면역검정 분야에서 개발되고 있으며, 일반적으로, 이들 방법에 유용한 거의 모든 라벨들이 본 발명의 방법에 적용될 수 있다.
따라서, 이러한 라벨은 분광학적, 광화학적, 생물화학적, 면역화학적, 전기적, 광학적, 방사선학적 또는 화학적 수단에 의하여 검출가능한 여하한 조성물일 수 있다. 본 발명에서의 유용한 라벨들은 자기비드(magnetic beads)(예를 들면, DynabeadsTM), 형광 염료(예를 들면, 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate), 텍사스 레드, 로다민
), 방사능표지물(예를 들면, 3H, 125I, 35S, 14C, or 32P), 효소(예를 들면, 서양고추냉이 퍼옥시다아제(horseradish peroxidas, 알칼라인 포스파타아제 및 기타 ELISA에 상용적으로 사용되는 것들), 및 콜로이달 골드, 착색 글라스 또는 플라스틱(폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등) 비드와 같은 비색 라벨(colorimetric labels) 등을 포함하나, 이들에 한정되지는 아니한다.
상기 라벨(표지물)은 해당 분야에서 잘 알려진 방법에 의거하여, 검정에 있어서 목적하는 조성물과 직접 또는 간접적으로 결합될 수 있다. 상술한 바와 같이, 상기 다양한 라벨들은, 요구되는 민감성, 화합물과의 접합(conjugation) 용이성, 요구되는 안정성, 사용되는 기기 및 처리기법에 따라 선택되어 사용될 수 있다. 비방사성 라벨들은 종종 간접적인 수단에 의하여 부착된다.
일반적으로, 리간드 분자(예를 들면, 비오틴(biotin))는 항체와 공유결합한다. 상기 리간드는 이어서 고유하게 검출가능하거나(inherently detectable), 검출가능한 효소, 형광 화합물, 또는 화학발광 화합물(chemiluminescent compound)과 같은 신호 시스템에 공유적으로 결합하는 분자인 항-리간드(anti-ligand)(예를 들면, 스트렙타비딘(streptavidin))에 결합한다. 몇가지 리간드 및 항-리간드가 사용될 수 있다. 예를 들면 비오틴, 티록신(thyroxine), 및 코티솔(cortisol)과 같이, 자연적 항-리간드를 지닌 리간드에 있어서, 이것은 표지화되고, 자연적으로 발생하는 항-리간드와 결합하는데에 사용될 수 있다. 대신, 헵틴 또는 항원성 화합물이 항체와 조합하여 사용될 수 있다.
상기 항체는 신호-발생 화합물에, 예를 들면 효소 또는 형광단(fluorophore)을 이용한 접합에 의하여 화합물에 직접적으로 연결될 수 있다. 라벨로서 활용가능한 효소로서는, 주로 가수분해효소, 특히 포스파타아제(phosphatases), 에스테라아제(esterases) 및 글리코시다아제(glycosidases) 또는 옥시도리덕타아제(oxidoreductases), 특히 퍼옥시다아제(peroxidases)를 들 수 있다.
형광 화합물은 형광단(fluorescein) 및 그 유도체, 로다민 및 그 유도체, 단실(dansyl), 움벨리페론(umbelliferone) 등을 포함한다. 화학발광 화합물은 루시페린(luciferin) 및 2,3-디히드로프탈라진디온(2,3-dihydrophtalazinediones), 예를 들면 루미놀(luminol)을 포함한다. 기타 라벨링 또는 신호 발생에 대한 개요는 미국특허 US4,391,904에 개시되어 있다.
라벨을 검출하는 수단은 해당 기술분야에서 잘 알려진 바와 같다. 따라서, 예를 들면, 상기 라벨이 방사성 라벨인 경우, 검출수단은 신틸레이션 카운터(scintillation counter) 또는 자기방사법(autoradiography)에서의 사진필름(photographic film)을 사용할 수 있다. 상기 라벨이 형광 라벨인 경우, 이것은 형광물질을 적절한 파장의 광을 이용하여 여기시킴으로써 얻어지는 형광을 검출함으로써 검출될 수 있다. 상기 형광은, 전하(電荷) 결합 소자(素子)(CCDs) 또는 광전자 배증관(photomultipliers)과 같은 전자 검출장치를 이용하여 사진 필름에 의하여 시각적으로 검출할 수 있다.
유사하게, 효소 라벨은 상기 효소에 대한 적절한 기질을 제공하여 얻어지는 반응 생성물을 검출함으로써 검출될 수 있다. 마지막으로 간단한 비색 라벨(colorimetric labels)은, 라벨과 연관된 발색을 관찰함으로써 간단하게 검출될 수 있다.
바람직한 일 실시형태에서, 단일클론 항체는 인간화된 항체(humanised antibody)이다.
"인간화된 항체"는, 마우스 항체 유래의 최소 마우스 부분이 인간 항체에 이식된 유전적으로 설계된 항체를 의미한다; 일반적으로 인간화된 항체는 5 ~ 10% 마우스 및 90 ~ 95% 인간 항체로 이루어진다.
인간화된 항체는 마우스 항체 및 키메릭 항체에서 보이는 HAMA(마우스 항체에 반하는 방향성을 가지는 인간 항체, human Antibodies directed against mouse antibodies) 및 HACA(키메릭 항체에 반하는 방향성을 가지는 인간 항체, human Antibodies directed against chimeric antibodies) 반응에 대응되며, 이들에 대한 인간 면역시스템이 최소한이거나 전무하다는 장점을 가진다.
다른 측면에 따르면, 본 발명은 상기 정의된 모노클론, 즉 Aβ8-x 펩티드의 N-말단 영역에 특이적으로 결합하며, Aβ1-40, Aβ1-42를 인식하지 않고, 특히 그 가변영역은 상기 정의된 아미노산 서열쌍 중 하나를 포함하고, 고도의 특이성을 보이는 을 생성하는 하이브리도마에 관한 것이다.
바람직한 일 실시형태에서, 상기 정의된 하이브리도마는 2007.8.23일자로,
BCCM / LMBP Plasmid Collection
Department of Molecular Biology
Ghent University
'Fiers-Schell-Van Montagu' building
Technologiepark 927
B-9052 Gent - Zwijnaarde
BELGIUM
에, 다음 Accession No로 기탁된 것이다:
TeiA 1.6 or 2.6F4C2 (IGH521) --> LMBP 6594CB
TeiA 1.7 or 2.8A3F8 (IGH522) --> LMBP 6595CB
TeiA 1.8 or 1.3B12H3 (IGH523) --> LMBP 6596CB
TeiA 2b.6 or 2.13E5E4 (IGH524) --> LMBP 6597CB
TeiA 1.1 or 3.46B10E7 (IGH 525) --> LMBP 6598CB
다른 측면에 따르면, 본 발명은 아밀로이드 침적을 감소시키며, 단일클론 항체를 분리하는데 효과적인 항체 생성을 일으키는 면역 반응을 발생시키는 펩티드 제제에 관한 것이다.
"펩티드 제제(peptide preparation)"는, N-절두된 Aβ펩티드의 자유 N-말단부를 모사한 자유 N-말단부를 이용한 짧은 합성 펩티드를 의미한다.
사용되는 펩티드는 다음과 같다: Aβ8-x 모사 펩티드: SGYGVHHGC-KLH
KLH는 "keyhole limpet hemocyanin"의 약자로서, 이황화 결합(disulfide bridge)에 의하여 시스테인(cysteine)에 결합한다. Aβ에 대응하는 서열은 밑줄친 부분으로서, 스페이서 아미노산인 글리신(glycine)이 뒤따른다. Aβ8-x 는 IGP-2119 (PG127) 와 유사하다(표 2).
펩티드 제제는 포스페이트 살린 버퍼(phosphate saline buffer) 내에서 혼합되며, 복강내 투여(intraperitoneal injections)를 위하여 Freund 보조제(adjuvant)가 첨가된다(도 2).
24주 후, 상기 면역 반응을 TAPIR에 의하여 분석하였으며(도 3), 아밀로이드 축적(load)의 효과는 웨스턴 블로팅에 의하여 결정하였다(도 4).
다른 측면에 있어서, 본 발명은 Aβ8-x펩티드의 자유 N-말단 영역에 특이적으로 결합하고, Aβ1-42를 인식하지 않으며, 고도의 특이성을 제공하는 상기 정의된 항체(x는 11 내지 42, 특히 15 내지 42)의 제조방법에 관한 것으로서, 상기 제조방법은, Aβ8-x펩티드 및 T-헬퍼 에피토프, 특히 T-헬퍼 에피토프와 함께 융합된 Aβ8-x펩티드, 또는 Aβ8-x 분지 펩티드(Aβ8-x branched peptide), 특히 Aβ8-15 펩티드를 이용하여 적절한 동물을 면역화하는 단계를 포함한다.
"T-헬퍼 에피토프와 함께 융합된 Aβ8-x펩티드"라는 표현은, Livingston et al., (2002)에 의거하여, KLH로의 연결을 위하여 말단 시스테인을 함유하는 방법에 의한 Aβ8-x펩티드와 T-헬퍼 에피토프의 연결을 의미한다.
"Aβ8-x 분지 펩티드"라는 표현은, KLH과의 연결을 위하여 말단 시스테인을 포함하는 펩티드 스페이서로 연결된 Aβ8-x펩티드를 의미한다.
해당 분야의 숙련된 기술자들에 있어서, 상기 정의된 항체의 제조방법은 자명하지 않다. 왜냐하면, 다음의 종래 프로세스, 즉 5가지 펩티드(Aβ1-8, Aβ5-13, Aβ6-14, Aβ8-15, 및 Aβ9-17)를 이용한 면역화에 따르면, 특이성을 가지는 항체를 분비하는 하이브리도마를 분리할 수 없기 때문이다. 따라서, Aβ8-x펩티드 및 T-헬퍼 에피토프, 특히 T-헬퍼 에피토프와 함께 융합된 Aβ8-x펩티드 또는 Aβ8-x 분지 펩티드를 이용하여 면역화할 필요가 있다.
바람직한 일 실시형태에서, 본 발명은 상기 정의된 항체의 제조방법에 관한 것으로서, 상기 항체는 Aβ8-15 펩티드의 N-말단 영역에 특이적으로 결합하며, Aβ1-42를 인식하지 아니하고, 웨스턴 블롯 상에서 결정된 바와 같이, Aβ8-15 펩티드에 대한 고도의 친화성을 나타낸다.
"웨스턴 블롯(Western Blot)"은 주어진 조직의 호모제네이트(homogenate) 또는 추출물 샘플 내의 특정 단백질을 검출하는 방법이다.
다른 측면에 따르면, 본 발명은 상기 정의된 프로세스에 의하여 얻어진 것과 같은, Aβ8-x 펩티드의 N-말단 영역에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 포유류에 있어서의 아밀로이드 침적물을 시험관 내(in vitro) 에서 진단하기 위한 방법에 관한 것으로서,
(i) 상기 정의된 항체를 이용하여, 상기 포유류의 체액 내의 N-말단 절두Aβ8-x (N-terminal truncated Aβ8-x) 펩티드 수준을 정량화하는 단계,
(ii) 상기 포유류의 항체의 수준과 대조 포유류에서 얻어진 항체 수준을 비교하는 단계, 및
(iii) 상기 (ii) 단계로부터, 만약 상기 N-말단 절두Aβ8-x 수준이 상기 대조 포유류에서 측정된 수준에 대하여 수정되는 경우, 특히 상기 대조 포유류에서 측정된 수준보다 높은 경우, 상기 포유류가 신경계 질병을 지니고 있음을 추론하는 단계를 포함한다.
본 발명에서 설명하는 상기 포유류는 비-인간 포유류 , 예를 들면(제한되지는 않지만) 소, 염소, 말, 원숭이, 토끼(rabbit, hare), 개, 고양이, 쥐(mouse, rat), 엘크, 사슴 또는 호랑이 등을 포함한다. 바람직한 일 실시형태에서, 상기 포유류는 영장류이다.
바람직한 일 실시형태에서, 상기 정의된 방법에서의 포유류는 인간이며, 더욱 바람직하게는 상기 포유류는 인간 성인이다.
다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명은, 상기 정의된 방법에 있어서, 상기 항체의 Aβ8-42에 대한 특이성(specificity) 및 민감도(sensitivity)는 60% 이상, 바람직하게는 60 내지 100%이며, 더욱 바람직하게는 80% 이상이다.
"민감도"란 용어는, 상기 방법에 의하여 검출할 수 있는 Aβ8- 42펩티드의 검출의 정도를 의미한다.(Neurobiology of aging, Vol 19, No. 2, p109-116, 1998: Consensus report of the working group on: "Molecular and biochemical markers of AD" 참조). 이 연구그룹에서는, AD 내의 진단 키트의 표준을 설정하며, 민감도 및 특이성이 >80%이어야 한다고 언급하고 있다.
다른 바람직한 실시형태에서, 상기 정의된 방법에서의 체액은 중추 신경계 유체(cerebrospinal fluid, CSF) 또는 혈액이다.
"중추신경계 유체" 또는 "CSF"라는 용어는 해당 분야 내의 숙련자들에게 잘 알려진 모든 중추신경계 유체 또는 그 일부분(fraction)에 대한 유도체를 포함하도록 의도된 것이다. 따라서, 중추신경계 유체 샘플은 중추신경계 유체의 다양한 부분화된 형태(fractionated forms)를 포함할 수 있으며, 또는 저장성 또는 특정한 검정의 진행을 촉진시키기 위하여 첨가되는 다양한 희석물을 포함할 수 있다.
이러한 희석물들(diluents)은 해당 분야의 숙련자들에게 잘 알려져 있는 것으로서, 다양한 완충액(buffer), 보존제(preservatives) 등을 포함한다.
다른 측면에 따르면, 본 발명은, 포유류에 있어서, 알츠하이머 질병과 같은 β-아밀로이드 형성 및/또는 응집과 관련된 질병에 대한 민감성을 판별하는 방법, 포유류에 있어서, 알츠하이머 질병과 같은 β-아밀로이드 형성 및/또는 응집에 연관된 질병 진행의 위험성의 판별방법, 포유류에 있어서, β-아밀로이드 침적의 제거를 선별(screening)하는 방법 또는 포유류에 있어서의 β-아밀로이드 침적 수준을 예측하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은,
(i) 상기 포유류에서, 상기 정의된 항체를 이용하여 Aβ8-x 펩티드의 양을 결정하는 단계,
(ii) 상기 (i) 단계에서 결정된 양과 대조 포유류 내에서의 상기 Aβ8-x 펩티드의 N-말단영역에 특이적인 항체의 양을 비교하는 단계, 및
(ⅲ) 상기 (ii) 단계에서의 비교 결과로부터, 상기 포유류가 알츠하이머 질병과 같은 β-아밀로이드 형성 및/또는 응집과 관련된 질병에 대하여 민감한지, 상기 포유류가 알츠하이머 질병과 같은 β-아밀로이드 형성 및/또는 응집에 연관된 질병 진행의 위험성에 노출되어 있는지, 상기 포유류 내의 β-아밀로이드 침적이 제거되었는지, 또는 상기 포유류 내의 β-아밀로이드 수준은 어느 정도인지를 결정하는 단계를 포함한다.
상기 피검 포유류의 뇌(brain) 내에서 N-말단 절두 Aβ8- x 의 증가는, 예를 들어 상기 포유류가 β-아밀로이드 형성 및/또는 응집에 연관된 질병에 대하여 민감하다는, 또는 상기 포유류가 β-아밀로이드 형성 및/또는 응집에 연관된 질병 진행 위험성에 노출되었음을 나타내는 지표일 수 있다. 또한 이는 포유류 내에서의 Aβ침적이 아직 제거되지 않았음을 나타내는 지표일 수 있다.
접종 또는 치료 이후의 특정한 체액에서, N-말단 절두 Aβ8- x 의 수준의 증가는, Aβ침적물(Aβburden)의 정도를 나타내는 지표가 된다(DeMattos et al., 2002). N-말단 APP 용해성 절편은 주로 특정 체액에서 발견된다. 이들 N-말단 APP 용해성 절편의 존재는 비정상적인 APP의 분할을 나타내며, N-말단 절두형 Aβ변형물의 형성으로 귀결되고, 결과적으로, β-아밀로이드 형성 및/또는 응집에 연관된 질병에 대한 민감도 또는 그 진행의 위험성의 증가로 귀결된다.
바람직한 일 실시형태에서, 상기 정의된 방법에서 사용되는 Aβ8-x 펩티드의 N-말단 영역에 대한 특이성을 갖는 항체의 양은 상기 포유류로부터 얻어진 조직 샘플상에서 결정된다.
여기서, "조직(tissue)"은 뇌 조직을 의미한다.
다른 측면에 따르면, 본 발명은 적어도 하나의 버퍼, 및 적어도 하나의 검출 화합물, 적어도 하나의 상기 정의된 N-절두된 Aβ8-x 특이성 항체를 포함하는 키트에 관한 것이다.
바람직한 일 실시형태에서, 상기 정의된 키트는, 바람직하게는 상기 정의된 항체에 결합하는 표지화된(labelled) 제2항체를 더 포함한다.
예를 들면, 상기 항체는 직접 그들이 고정화되는(immobilized) 고체 기재에 결합될 수 있다. 이들 고정화된 항체는 이어서 샘플 내에서 본 발명에 의한 N-말단 절두된 Aβ8-x 펩티드를 포획하고, 이후에 제2항체를 이용하여 검출된다.
다른 측면에서, 본 발명은 의약적으로 수용가능한 운반체(vehicle)와 함께, 활성 성분으로서 상기 정의된 항체 또는 상기 자유 N-절두 Aβ펩티드의 자유 N-말단부(free N-terminal-end)를 모사한 자유 N-말단부를 이용한 합성 펩티드를 포함하는 치료 조성물에 관한 것이다.
개별 피검체에 투여되거나 전달될 항체의 양은 상기 개별 피검체 내에서의 β아밀로이드 수준의 현저한 감소를 유발하기에 충분하여야 한다. 적절한 양은 다양한 파라메터(즉, 상기 사용되는 특정한 항체, 개별 피검체의 무게 및 내인성(endogenous) β아밀로이드의 수준)에 의존하며, 개별 케이스에 따라 달리 결정된다.
투여량 및 빈도는 또한 치료가 예방을 위한 것(prophylactic)인지 또는 치료용인지에 따라 달라진다.
바람직한 일 실시형태에서, 상기 정의된 치료 조성물은 개별 피검체에 대하여 1mg/kg/day 내지 200mg/kg/day의 투여량으로의 항체 투여에 적합하다.
치료에 적합한 환자는, 현재 징후를 보이는 환자뿐 아니라, 질병 위험에 노출되어 있기는 하지만 징후를 보이지 아니하는 개별 피검체를 포함한다. 알츠하이머 질병의 경우, 오래 산 환자인 경우, 가상적으로 누구나 알츠하이머 질병을 겪을 위험성에 노출되어 있다. 따라서, 본 항체는 대상 환자의 위험성에 대한 어떠한 사전평가 없이도, 예방차원에서 일반 대중에게 투여될 수 있다. 본 항체는 특히 알츠하이머 질병에 대한 알려진 유전학적 위험성을 지닌 자들에게 유용하다. 이러한 자들은 상기 질병을 경험한 친족들을 가진 자들 및 그들의 위험성이 유전학적 또는 생화학적 표지물질(marker)의 분석에 의하여 판별된 자들을 포함한다.
본 발명에 의한 항체의 개별 피검체에 대한 투여는 정맥투여(intravenous administration)에 의하여 수행될 수 있다.
상기 뇌에 전달하는 다른 방법은, 본 발명에 의한 항체를 상기 개별 피검체의 뇌 내에 직접 투여(direct infusion )하는 방법에 따른다.
다른 측면에서, 본 발명은, 의약적으로 수용가능한 운반체와 함께, 활성 성분으로서 상기 정의된 항체, 절편 또는 이들의 유도체, 또는 자유 N-절두 Aβ펩티드의 자유 N-말단부(free N-terminal-end)를 모사한 자유 N-말단부를 이용한 합성 펩티드를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.
바람직한 일 실시형태에서, 상기 정의된 백신 조성물은 개별 피검체에 대하여 1mg/kg/day 내지 200mg /kg/day의 항체 투여량으로의 투여에 적합하다.
본 발명에 의한 상기 백신 또는 치료 조성물은 본 발명에 의한 특이성 N-말단 절두된 Aβ8-x 펩티드에 대한 면역 반응을 유도한다.
다른 측면에서, 본 발명은 알츠하이머 질병의 예방 또는 치료를 목적으로 하는 의약품 또는 백신의 제조를 위한 상기 정의된 적어도 하나의 항체의 용도에 관한 것이다.
본 발명에서, "질병의 예방"은 질병의 발달을 억제하거나, 반전시키는 것, 질병(즉, Aβ변형체의 형성 및/또는 응집)의 초기 징후(initial sign)를 억제하거나 반전시키는 것, 질병의 임상적 징후(clinical symptom)의 발현을 억제하는 것을 의미한다.
본 발명에서, "질병의 치료"는, 질병을 실질적으로 억제하는 것, 질병의 진행을 실질적으로 늦추거나 반전시키는 것, 질병의 임상적 징후를 실질적으로 개선시키는 것, 또는 질병의 임상학적 징부의 발현을 실질적으로 예방하는 것을 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 β아밀로이드 침적물의 제거를 위하여 의도된 의약품 또는 백신의 제조를 위한 상기 정의된 적어도 하나의 항체의 용도에 관한 것이다.
"β아밀로이드 침적물의 제거"라는 용어는, β아밀로이드 침적물이 뇌 조직에서 제거되는 것을 의미한다. Aβ펩티드에 대한 접종(vaccination)을 이용하여, AD 환자의 뇌에서 아밀로이드 침적을 제거하는 것은 치료의 관점을 열어주는 새로운 시도이다(Schenk et al., 2001, Immunotherapy with beta-amyloid for Alzheimer's disease: a new frontier. DNA Cell Biol. 20: 679-681).
다른 측면에서, 본 발명은 포유류 내에서 β아밀로이드 침적물을 제거하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 상기 포유류에 상기 정의된 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 알츠하이머 질병에 감염되거나 상기 질병의 진행에 민감한 포유류 내에서 상기 정의된 펩티드 조성물의 면역반응 유도로의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 알츠하이머 질병 환자들의 체내에서의 아밀로이드 로드에 대항하는 우수한 치료 효과를 제공할 수 있다.
도 1은 APP770의 아미노산 서열을 나타낸 것으로서, α-, β-, 및 γ-세크리타아제 분할 사이트 표지된 Aβ의 아미노산 서열을 보인다.
도 2A 및 도 2B는 펩티드 제제의 복강 내 주사(intraperitoneal injections)(2A) 및 각 블리딩(bleeding) (2B)에 대하여 측정된 항체 역가(titer)의 스케줄을 나타낸다.
x-축: 혈청 희석
y-축: 광학밀도(optical density)
도 3A 내지 3D는 면역화된 마우스 혈청을 이중(double) 형질전환된 APPxPS1 마우스들의 뇌 조직 내에서의 아밀로이드 침적 검출 여부에 사용하는 것을 나타낸 도면:
도 3A 및 3B: 대응하지 않는 마우스 혈청(각각 배율: x25 및 x100)
도 3C 및 3D: Trunc8 면역화된 마우스 혈청(각각 배율: x25 및 x100)
도 4A 및 도 4B는 면역화된 마우스들 및 대조 마우스 내에서의 웨스턴-블로팅에 의하여 측정된 Aβ축적(load)(4A) 및 대조조건(PBS)에 대한 Aβ-42 축적이 백분율로 표현된 면역의 효율성을 나타내는 히스토그램
도 5는 경쇄 및 중쇄 프라이머 위치의 도시에 의하여 나타낸 개요
도 6은 인간 알츠하이머 두뇌의 포름산 추출물 및 온전한 크기(full-size)의 합성 Aβ펩티드(Aβ2-42, Aβ3-42, Aβ4-42, Aβ5-42, Aβ7-42, Aβ8-42, Aβ9-42) 혼합물에 대한 2D 겔 분석(Sergeant et al. (2003), TeiA 1.1, TeiA 1.8, and TeiA 2b.6에 개시된 바와 같이, 21F12 (Aβ1-42)에 대한 균등물 7G12를 이용하여 얻어진 이뮤노블롯(immunoblots))
도 7은 4D7A3(42-C-말단 특이성 항체) 와, TeiA 2b.6, TeiA1.8, TeiA1.7 및 TeiA1.6의 면역-포획 항체(immuno-capture antibody)를 나타낸 도면
도 8A 및 8B는 단일클론 항체 TeiA1.6의 실질 아밀로이드(parenchymal amyloid)에 대한 특이성을 나타낸 도면.
8A: 전형적인(classical) Aβ항체 6E10를 이용한 실질(parenchymal, 화살표) 및 맥관(vascular, 화살 머리) 내 아밀로이드 침적의 라벨링.
8B: 8-절두된 Aβ(TeiA1.6)를 이용한 주변 뇌 영역에서의 맥관주위(perivascular) 침적(화살머리)이 배제된 실질(화살표) 아밀로이드만의 침적의 라벨링.
도 9A 내지 9J는 4G8 항체(상업적 단일클론 항체)의 no 47, 7월령의 마우스의 두개(頭蓋) 내 주사(intracranial injection)(우측 해마) 에 의한 결과를 나타낸 도면
9A, 9D 및 9G: 주사 포인트에 대한 뇌 영역의 위치
9B, 9E 및 9H: "노출된(revealing)" 항체 6E10에 의하여 검출되는 아밀로이드 펩티드 침적을 나타내는, 대응하는 뇌 영역의 면역조직화학(immunohistochemistry) 이미지
9C, 9F 및 9I: 각 반구 내의 서로 다른 뇌의 하부 영역에서, 각각 9B, 9E 및 9H의 이미지로부터 산출된 아밀로이드 펩티드 침전물(Hipp: 해마, Cx1: 피질영역(등 부위(dorsal)), Cx2: 피질영역 2(측면(lateral)), Cx3: 피질영역 3(배의 측면(latero-ventral)), Th: 시상(thalamic)). 비율: 착색된 넓이/해당 영역의 모든 부분.
L: 좌측, R: 우측(주사된 부분).
9J: 뇌 영역 H 내에서만의 면역화학에 의하여, 각 반구 내의 해마이행부(subiculum) 내에서 산출된 아밀로이드 펩티드 로드(load)
도 10A 내지 10J는 TeiA1.6 항체의 no 47, 7월령의 마우스 두개(頭蓋) 내로의 주사(intracranial injection)(우측 해마) 에 의한 결과를 나타낸 도면
10A, 10D 및 10G: 주사 포인트에 대한 뇌 영역의 위치
10B, 10E 및 10H: "노출된(revealing)" 항체 4G8에 의하여 검출되는 아밀로이드 펩티드 침적을 나타내는, 대응하는 뇌 영역의 면역조직화학(immunohistochemistry) 이미지
10C, 10F 및 10I: 각 반구 내의 서로 다른 뇌의 하부 영역에서, 각각 10B, 10E 및 10H의 이미지로부터 산출된 아밀로이드 펩티드 침전물(침전로드)(Hipp: 해마, Cx1: 피질영역(등 부위(dorsal)), Cx2: 피질영역 2(측면(lateral)), Cx3: 피질영역 3(배의 측면(latero-ventral)), Th: 시상(thalamic)). 비율: 착색된 넓이/해당 영역의 모든 부분.
L: 좌측, R: 우측(주사된 부분).
10J: 뇌 영역 B 및 E 내에서만의 면역화학에 의하여, 각 반구 내의 해마이행부(subiculum) 내에서 산출된 아밀로이드 펩티드 로드(load)
도 11은 TeiA1.6 단일클론 항체의 두개(頭蓋) 내 주사(우측 해마) 후, 서로 다른 뇌 내 하부 영역((Hipp: 해마, Cx1: 피질영역(등 부위(dorsal), Cx2: 피질영역 2(측면(lateral)), Cx3: 피질영역 3(배의 측면(latero-ventral)), Th: 시상(thalamic)) 내에서 주사된(TeiA1.6 항체) 것 및 비주사된(대조) 것의 아밀로이드 로드의 비율을 나타낸 도면. 상기 비율은 4 마리 동물의 각각 정량화된 3개의 뇌 영역(데이터는 +/- SEM 방법(means +/- SEM)에 의하여 제공됨)에 대한 비율의 평균이다.
도 12A 내지 12J는 TeiA1.6 단일클론 항체의 no 58, 7 월령의 마우스에 대한 두개(頭蓋) 내 주사(우측 해마)를 나타낸 도면
12A, 12D 및 12G: 주사 포인트에 대한 뇌 영역의 위치
12B, 12E 및 12H: "노출된(revealing)" 항체 4G8에 의하여 검출되는 아밀로이드 펩티드 침적을 나타내는, 대응하는 뇌 영역의 면역조직화학(immunohistochemistry) 이미지
12C, 12F 및 12I: 각 반구 내의 서로 다른 뇌의 하부 영역에서, 각각 12B, 12E 및 12H의 이미지로부터 산출된 아밀로이드 펩티드 침전물(침전로드)(Hipp: 해마, Cx1: 피질영역(등 부위(dorsal)), Cx2: 피질영역 2(측면(lateral)), Cx3: 피질영역 3(배의 측면(latero-ventral)), Th: 시상(thalamic)). 비율: 착색된 넓이/해당 영역의 모든 부분.
L: 좌측, R: 우측(주사된 부분).
12J: 뇌 영역 H 내에서만의 면역화학에 의하여, 각 반구 내의 해마이행부(subiculum) 내에서 산출된 아밀로이드 펩티드 로드(load)
도 13은 TeiA1.8 단일클론 항체의 두개(頭蓋) 내 주사(우측 해마) 후, 서로 다른 뇌 내 하부 영역((Hipp: 해마, Cx1: 피질영역(등 부위(dorsal), Cx2: 피질영역 2(측면(lateral)), Cx3: 피질영역 3(배의 측면(latero-ventral)), Th: 시상(thalamic)) 내에서 주사된(TeiA1.8 항체) 것 및 비주사된(대조) 것의 아밀로이드 로드의 비율을 나타낸 도면. 상기 비율은 4 마리 동물의 각각 정량화된 3개의 뇌 영역(데이터는 +/- SEM 방법(means +/- SEM)에 의하여 제공됨)에 대한 비율의 평균이다.
실시예 1: N- trunc 8 펩티드를 이용한 이중 형질전환 마우스들의 면역화 및 뇌 아밀로이드 로드에 대한 결과
Double APP Swedish London x Presenilin 1 형질전환 마우스들 (Blanchard et al., 2003 Exp Neurology 184:247; WO0120977)에게 3주에 한번 씩 50㎍의 N-Trunc 8 펩티드 주사를 투여하였다 (도 2A). 전체 접종(면역) 기간은 21주였다. 음성 및 양성 대조군으로서, 일련의 마우스들에게 phosphate buffer saline 또는 응집된 Aβ1-42 펩티드를 각각 주사하였다. N-Trunc 8 펩티드에 대한 직접 ELISA에 의하여 항체 역가(antibody titer)를 결정하였다(도 2B).
면역화된 마우스들 중 다섯번째 블리딩(bleeding)으로부터의 혈청들(sera)을 사용하여 조직 아밀로이드 플라크 면역반응(TAPIR)을 수행하였다(Christoph Hock, Roger M. Nitsch, Clinical Observations with AN-1792 Using TAPIR Analyses Neurodegenerative Diseases 2005;2:273-276) (도 3). 비 대응 마우스로부터(non-responding mouse)의 혈청은 음성 대조군으로 사용하였다. Trunc 8 펩티드로 면역화된 마우스들로부터 얻어진 혈청을 이용하여 아밀로이드 침적을 검출하였다.
Aβ펩티드의 포름산 추출물 및 상술한 웨스턴-블로팅법에 의한 검출을 이용하여 Aβ로드(load)에 대한 면역화 결과를 검토하였다(Casas et al., 2004) (도 4A). 전체 Aβ-42의 양을 측정하여 대조 조건(PBS)와 비교하고, 이를 대조 조건(100%)에 대한 백분율로 표현하였다. 히스토그램은 각 실험 조건에 대한 정량화 결과를 나타낸다(도 4B).
실시예 2: 하이브리도마의 IGH524 , IGH525 , IGH521 , IGH522 , IGH523 유래의 단일클론 항체 가변영역의 특성화
DNA 서열 분석의 결과를 아미노산 서열에 대한 적절한 오픈 리딩 프레임(open reading frame)의 해석 및 항체 중쇄 및 경쇄 구조체 영역 컨센서스를 이용한 배열에 의하여 평가하였다.
데이터 분석
시퀀싱 분석 소프트웨어 V5.2(Applied Biosystems) 및 KB basecaller v1.2 (Applied Biosystem)를 이용하여 기초 시퀀싱 데이터(DNA 크로마토그램)를 생성하고, Sequencher 4.1.2.를 이용하여 해석 및 편집하였다. 일반적으로, 이중 나선형 시퀀싱 결과(double-stranded sequencing)를 취합하고, 서열 컨센서스를 Innogenetics Lotus Notes Custom Sequencing Service Request (CSSR) 데이터베이스에 연결하여, CSSR 프로젝트 번호를 부여하여 저장하였다.
결과
RNA 분리, RT-PCR, 클로닝 및 침적.
표 1은 RNA 추출에 사용되는 각 하이브리도마/MAb 원본 및 소스를 나타내며, 성공적으로 특이적인 클론가능한 PCR 절편으로 귀결되는 각 항체의 중쇄 또는 경쇄와, 대응하는 프라이머의 조합을 나타낸다.
서열 분석
각 가변 영역에 대하여, DNA 서열 분석 및 이어지는 배열은 각 하이브리도마/MAb에 대한 가능한 컨센서스를 밝혀준다. 상보성 결정 영역(CDR)은 하나의 가변영역을 특성화하는 모든 클론에 대하여 동일하였다.
전체적인 형태 및 얻어진 최종 컨센서스 서열의 배열은 부록 1에 나타내었다. 이론적으로 예측된 CDR 루프들(loops)을 표지하였다(컨센서스 서열 법칙에 근거함).
●컨센서스 서열 내에 표지된 상보성 결정 영역(CDR)은 Kabat definition (Reczko et al., 1995)으로부터의 공적 활용가능 법칙(public available rules) 또는 모델링을 위한 공적 활용가능 툴(Honegger et al. 2001)에 의거하여 할당하였다. 상기 CDR은 탐색적/정보취득을 위한 목적으로만 활용하였다.
IGH524 , TeiA 2b.6
하이브리도마 IGH524로부터 분리된 MAb TeiA 2b.6 (2.13E5E4)의 중쇄 및 경쇄에 대하여 얻어진 결과는, 주로 구조체 영역 내에 위치하는 사소한 모호성 및/또는 차이를 제외하곤 명확하였다. 정화된 항체의 N-말단 아미노산 시퀀싱에 의하여 완전 가변영역을 판별하고, 성숙 항체 두가지 모두의 사슬들의 (CDR1의 가장 큰 부분을 포함하는) N-말단부를 확인하였다.
IGH521 ( TeiA 1.6), IGH522 ( TeiA 1.7), IGH523 ( TeiA 1.8), IGH525 ( TeiA 1.1)
MAb TeiA 1.6 (2.6F4C2, IGH521), TeiA 1.7 (2.8A3F8, IGH522), TeiA 1.8 (1.3B12H3, IGH523) 및 TeiA 1.1 (3.46B10E7, IGH525)의 모든 중쇄 및 경쇄에 대한 결과 역시 명확하였다. 클로닝된 PCR 생성물의 8가지 서열을 배열하였으며, 최소 3개의 동일한 서열이 컨센서스 서열을 유도하였다. 하이브리도마 IGH524로부터 얻어진 서열을 이용한 배열에 의하여 완전 가변영역을 결정하였다.
PCR 프라이머
IG request # 명칭 올리고뉴클레이티드 서열(5'->3')
Oligonucleotide sequence 		참고문헌
1010500 Rev - CH - IgG1 -2a TGGACAGGGATCCAGAGTTC Kabat et al .
1009565 MLALT3 . RV GRAGTCACAKACYCAGGTCTTY Coloma et al .
18700 VH1BACK AGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG Orlandi et al .
18696 MJK2FONX CCGTTTTATTTCCAGCTTGGTCCC Orlandi et al .
19735 mIG1rev
( aa127 -134) 		AGTTTGGGCAGCAGATCC Kabat et al .
19736 mIgKappaRev ( aa120 -125) GTTAACTGCTCACTGCATGG
Kabat et al .
18698 VK2BACK GACATTGAGCTCACCCAGTCTCCA Orlandi et al
18694 MJK5FONX CCGTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCC Orlandi et al
Kabat et al. (Sequences of proteins of immunological interest. National Institutes of Health Publication No. 91-3242, 5th ed., 1991, United States Department of Health and Human Services, Bethesda, MD)
Coloma et al. (Novel vectors for the expression of antibody molecules regions generated by polymerase chain reaction. J. Immunol Methods, 1992; 152(1):89-104)
Orlandi et al. (Cloning immunoglobulin variable domains for expression by the polymerase chain reaction. Proc Natl Acad Sci U S A. 1989 May;86(10):3833-7)
IGH 명칭 Aβ 사슬 프라이머 페어( primer pair ) ICCG
524 TeiA 2b.6 (2.13 E5E4 ) 경쇄 1009565/18696 6152
중쇄 18700/1010500 6151
521 TeiA 1.6 (2.6F4C2) 경쇄 18698/18696 6233
중쇄 18700/19735 6232
522 TeiA 1.7 (2.8A3F8) 경쇄 18698/18696 6258
중쇄 18700/19735 6236
523 TeiA 1.8 (1.3B12H3) 경쇄 18698/18694 6235
중쇄 18700/1010500 6234
525 TeiA 1.1 (3.46B10E7) 경쇄 1009565/197368 6268
중쇄 18700/1010500 6231
부록 1:
IGH524 서열
경쇄 가변영역: CDR-L1 CDR-L2 SSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLFNSGRQTNYLTWFQQRPGQAPKLLIYWASTRGSGVP
CDR-L3
DRFTGSGSGTEFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYTYPLTFGAG (SEQ ID NO :7) 중쇄 가변영역:
CDR-H1 CDR-H2
GGLVQPGGSLRLSCATSGFTFTDFYMEWVRQPPGKRLEWIAASRNKANGYT
CDR-H3
TEYSASVKGRFIVSRDTSQGILYLQMSALRAEDTAIYYCAIYRYYAMDYWGQ
GTSVTVSS (SEQ ID NO : 8)
IGH521 서열
경쇄 가변영역:
CDR-L1 CDR-L2
SSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLAGRYQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWAST
CDR-L3
RDSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYTYPLTFAG
(SEQ ID NO : 1)
중쇄 가변영역:
CDR-H1 CDR-H2 GGLVQPGGSLRLSCAISGFTFSDFYMEWVRQPPGKRLEWIAASRNKANDYTT
CDR-H3
EYSASVKGRFIVSRDTSQSILYLQMNALRAEDTAIYYCATYHDYAMDYWGQ
GTSVTVSS (SEQ ID NO : 2)
IGH525 서열
경쇄 가변영역:
CDR-L1 CDR-L2
SSLTVTAGEKVTMSCTSSQSLFNSGTQTNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTR
CDR-L3
ESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYTYPLTFGAG (SEQ ID NO:9)
중쇄 가변영역:
CDR-H1 CDR-H2
GGLVQPGGSLRLSCATSGFTFSDFFIEWVRQPPGKRLEWITASRNKNYDYK
CDR-H3
TEYSASVKGRFIVSRDTSQSILYLQMNALRAEDTAIYYCAIYRHYAMDYWGQ
GTSVTVSS (SEQ ID NO : 10 )
IGH522 서열
경쇄 가변영역:
CDR-L1 CDR-L2
SSLTVTAGEKVTMNCKSSQNLLNSGNQVNYLTWFQQKPGQPPKLLITWAST
CDR-L3
RESGVPDRFIGSGSGTDFTLTINSVQAEDLAVYYCQNDYRYPLTFGAG
(SEQ ID NO:3)
중쇄 가변영역:
CDR-H1 CDR-H2 GGLVQPGGSLRLSCATSGFTFSDFYMEWVRQPPGRRLEWIAASRDKAKDYTT
CDR-H3
EYSASVKGRFIVSRDTSQSIFYLQMNALRSEDTAIYYCATYFSYAMDYWGLG
TSVTVSS (SEQ ID NO : 4)
IGH523 서열
경쇄 가변영역:
CDR-L1 CDR-L2
SSLAVTAGERVTMSCKSSLTLLNSGSQTNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTR
CDR-L3
ESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPLTFGAG (SEQ ID NO:5)
중쇄 가변영역:
CDR-H1 CDR-H2
GGLVQPGGSLRLSCATAGFTFTDQYMSWVRQPPGKALEWLATIRNKAKGFT
CDR-H3
TEYSASVKGRFTISRDNSQSILYLQMSTLRAGDSATYYCAVYGNYAMDYWG
QGTSVNVSS (SEQ ID NO : 6 )
실시예 3: 클로닝 중의 N- 절두된 8-특이성 Aβ항체 및 (한정된) 특성화
열다섯 마리의 Balb-C 마우스에게 5 개의 짧은 합성 Aβ펩티드(한마리당 50㎍의 KLH-결합 펩티드)를 주사하였다. 한 마리의 마우스가 원인불명으로 죽었다. 펩티드들은 각각 Aβ1-8, Aβ5-13, Aβ6-14, Aβ8-15, 및 Aβ9-17의 처음 8개 N-말단 잔여물에 대응한다(표 2 참조). 펩티드들은 또한 KLH와의 결합을 위한 C-말단 잔여물을 함유한다. 5회의 주사 이후, 펩티드 혼합물의 "코팅 검정(coatings assay)"으로 상기 혈청들에 대한 적정(titration)을 수행하였다. 펩티드들을 스트렙타비딘-비오틴화된(streptavidine-biotinylated) 펩티드 복합체(펩티드(IGP-2258, 표 2 참조) 또는 BSA(bovine Serum Albumin)-펩티드 복합체 (PG-Nr, 표 2 참조))로서 코팅하고, HRP 결합된 항-마우스 항체(Jackson goat anti-mouse HRP, Cat No 115-035-071)를 검출에 사용하였다. 비록 역가(titer)가 낮지만(미도시), 첫번째 마우스를 희생시키고 융합을 수행하였다. 하이브리도마를 분비하는 특이성 항체는 분리되지 아니하였다.
따라서, 마우스 집합체를 '변형 펩티드(Modified peptides)'로 배양하였다(boosted). 세마리의 마우스에 원본 펩티드 혼합물(original peptide mixture)를 주사하고, 이중 두 마리에는 IGP-2119 KLH-결합 펩티드를 더 주사하였다(표 2 참조).
다섯개의 혼합물 중에서 Aβ8-15 에 대응하는 펩티드들은 더욱 큰 면역성을 가졌으며, 따라서, 세 개의 추가적인 펩티드들을 합성하였다. 그중 하나는 T-헬퍼 에피토프 및 KLH에 결합하기 위한 C-말단 시스테인 잔여물)에 융합된, Aβ1-8에 대응하는 것이다(PGPGP (Livingston et al., 2002); IGP-2406 (표 2)). 두 번째 펩티드 역시 다른 T-헬퍼 에피토프를 포함한다((DGDGD (McMillan et al., 1983); IGP-2258 (표 2)). 마지막으로, 결합을 위한 C-말단 시스테인을 함유하는 분지된(branched) 펩티드 역시 합성하였다(IGP-2407 (표 2)).
매회, 새로이 합성된 펩티드를 이용하여 두 마리의 마우스를 접종하였다. 상기 Aβ8-15 펩티드 역시 E1 입자에 결합되었으며(WO2004/013172), 마지막 두 마리의 마우스를 배양하기 위하여 사용되었다. "코팅 검정(coatings assay)"을 이용하여 재차 역치(titer)를 모니터하였다(결과는 나타내지 아니함). Aβ8-15에 대한 역치는 T-헬퍼 펩티드 및 분지된 펩티드를 이용하여 배양된 마우스의 경우에 현저하게 개선되었으며, 3 마리 생존한 마우스를 융합을 위하여 사용하기로 결정하였다. 상기 분지된 펩티드로 배양된 마우스들 중 한마리가 죽었다.
사용된 펩티드의 서열 및 그들의 Innogenetics 참조번호
명칭 Innogenetics 참조번호 서열(sequence)
(굵은 글씨의 Aβ서열)
Ab1 -8 IGP-2062 D1AEFRHDS8GC
Ab5 -12 IGP-2121 R5HDSGYEV12 GC
Ab6 -13 IGP-2120 H6DSGYEVH13GC
Ab8 -15 IGP-2119 S8GYEVHHQ15GC
Ab9 -16 IGP-2122 G9YEVHHQK16GC
Ab8 -15 DG IGP-2405 S8GYEVHHQ15DGDGDC
Ab8 -15 PG IGP-2406 S8GYEVHHQ15GPGPGC
Ab8 -15 분지(branched) IGP-2407 (S8GYEVHHQ15DGDGD)2KGC
Ab8 -15-bio IGP-2258 S8GYEVHHQ15GK-biotin
Ab6 -13-bio IGP-2259 H6DSGYEVH13GK-biotin
두 마리 모두의 마우스들의 비장(脾臟, spleen)을 준비하고, SP2/0 세포들에 융합하였다. 플레이팅(plating) 이후, 66 플레이트(±3000 클론)을 선별(screen)하였다. 하부클로닝(subcloning) 동안 24 개로 제한된 수의 클론을 비오틴화된 펩티드 IGP-2258 및 IGP-2259을 이용하여 브릿징 검정(bridging assay) 및 루미넥스 검정(Luminex assay)으로 특성화하였다. 브릿징 검정에서, BSA 연결된 펩티드 IGP-128, PG127(표 3 참조)은 항체의 결합 사이트를 포획하기 위하여 사용되었으며, 비오틴화된 펩티드를 이용하여 소위 브릿징 검정법으로 상기 포획된 항체를 검출하였다. 이러한 검정법은 항체의 친화성에 관련된 표지를 부여한다: 고도의 친화성 항체는 낮은 수준의 친화성 항체보다 더 높은 신호를 제공한다. 실제로, '2개 클래스'의 항체를 확인하였다.
항체의 특이성을 결정하기 위하여, 상기 Aβ8-15, Aβ6-13에 대한 비교용으로 2개 아미노산 N-말단 펩티드로 이동된(shifted) 펩티드를 사용하였다. 상기 비오틴화된 버전의 세 가지 펩티드는 아비딘 루미넥스 비드(avidin Luminex beads)에 이것을 효율적으로 포획하기 위하여 사용되었다. 세척 후, 상기 항체들을 항-마우스 해초-에리트린(anti-mouse phyco-erythrin) 항체에 의하여 확인하였다. 표 3에 나타낸 결과는 평균 형광강도(MFI)로 표현된 기본데이터(raw data)이다. 10 이하의 수치는 하부 배경(below background)을 의미하며, 따라서 '낮은 친화성'(브릿징 검정 OD<1)으로 테스트된 모든 항체에 대하여 , 비-특이적 펩티드(IGP-2259)상에서의 반응이 관찰되지 아니하였다.
'높은 친화성 항체'에 대하여, 비특이적 펩티드상에서 작은 신호가 측정가능하였다. 하지만 항체들 사이에는 작은 차이가 존재하였다. 항체들 중 상기 '높은 친화성 항체' 클래스로부터, 3개의 항체가 하부클로닝을 위하여 선택되었다. 하나의 IgG2b 서브타입과, 두 개의 IgG1이 그것이다. 반면 '낮은 친화성'항체들에서는 두개의 IgG1 항체가 선택되었으며, 따라서 완전 특성화(full characterization)를 위하여 5개의 항체들이 선택되었다.
클로닝 과정 중에서의 N-절두된 8-특이적 Aβ, TeiA (절두된 8개 아밀로이드), 항체의 특성화. 브릿징 검정에서의 반응성(높은 OD 수치는 높은 친화성을 의미한다) 및 아비딘 비드상에 포획된 바이오-펩티드상의 루미넥스 포멧으로의 특이성에 의하여 이소타입이 결정되었다. 추가적인 특성화를 위하여 사용된 마지막 하위클론(subclone) 역시 적용되었다.

클론
Ig 서브타입
결합검정
(OD450)		 루미넥스 검정
(MFI)
서브클론 IGH-

IGP-2258
 IGP-2259
2.13.E5 IgG2b 4 1686 51 2.13.E5.E4 TeiA2b .6 524
3.46.B10 IgG1 3.7592 1882 24 3.46.B10.E7 TeiA1 .1 525
2.6.F4 IgG1 2.6.F4.C2 TeiA1 .6 521
1.2.F4 3.5836 1921.5 7
2.15.A9 3.7124 1628 16
2.19.C6 2.9978 1707 14
2.25.H1 4 1503.5 32
2.28.H4 IgG1 4 1817 23
2.29.B4 IgG1 3.5506 1717.5 26
2.46.C10 IgG1 3.0215 1619 13
3.40.C3 4 1758 20.5
2.8.A3 IgG1 0.2216 1715 5 2.8.A3.F8 TeiA1 .7 522
1.3.B12 IgG1 1.3.B12.H3 TeiA1 .8 523
1.2.G12 IgG1 0.2051 1617 6
1.3.D12 0.1928
1.16.B8 0.8537 1616 4
2.1.G8 0.162 1583 4
2.28.F5 1632 4
2.14.C2 1704.5 5
2.14.D1 0.1441 1642.5 5
2.24.C4 0.2304 561 3
2.25.C4 0.8982 1795 5
2.28.B2 IgG1 0.1478 2451.5 3
1.3.G12 IgG1
실시예 4: N- 절두된 8개의 특이성 ( TeiA ) 항체의 특성화
Aβ상에서 이들 TeiA 항체의 특이성을 더 입증하기 위하여, 두가지 접근방법이 시도되었다:
(1) 인간 알츠하이머 질병을 갖는 뇌의 포름산 추출물의 2D gelanalysis 및 (2) SELDI 접근법(Merchant et al., 2000)에 사용되는 N-말단부에 차이가 있는 '온전한 크기(full-size)' 합성 Aβ펩티드들(Anaspec)의 혼합물이 그것이다.
이들 접근법의 결과는 도 6 및 도 7에 나타내었다. Sergeant et al (2003)에 제시되어 있는 바와 같이, 뇌 조직 샘플링 및 2D 분석을 필수적으로 수행하였다.
Aβ42의 위치를 파악하기 위하여, 신규 42-C-말단 특이성 항체 7G12H1(Sergeant et al (2003)에 제시되어 있는 바와 같이, 21F12의 균등물) 를 사용하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 상기 서로 다른 지점(spot)들은 상기 서로 다른 N-절두화(N-truncations)에 대응하도록 mass-spectrometry를 이용하여 특성화되었다.
실시예 5: mAb TeiA1 .6(AβN- trunc8 )은 실질 아밀로이드 침적에 특이적이며, 맥관 아밀로이드 침적은 인식하지 아니한다
수동적 면역의 부작용 중 하나는 미세출혈(microhemorrhages)의 빈번한 발생이다. 상기 수동적 면역의 부작용 중 하나는 미세출혈(microhemorrhages)의 빈번한 발생이다. 이러한 미세출혈 수의 증가는 주사된 항체의 혈관 벽(vessel walls) 내에서의 A β펩티드에 대한 고정에 의하여 설명될 수 있다 (Paris et al., 2000; Pfeifer et al., Cerebral Hemorrhage After Passive Anti-Aβ Immunotherapy, Science 15 November 2002; Vol. 298. no. 5597, p. 1379). 따라서, 절두된 Aβ종들은 아밀로이드 혈관병증(amyloid angiopathy) 내에서는 현저히 발견되지는 아니하기 때문에, 이들은 또한 근본적 타겟(original target)이 된다. 도 8A 및 8B에 나타낸 바와 같이, 근접한 AD 뇌 영역상에서, 전형적인(classical) Aβ항체는 실질 및 맥관 아밀로이드 침적물 모두를 표지한다(도 8A, 각각 화살표 및 화살머리, 6E10 항체).
절두된 8 항체(도 8B, 여기서는 TeiA1.6)를 사용하면, 오직 실질 아밀로이드 침적만 표지되지만(도 8B, 화살표), 맥관 아밀로이드 침적은 표지되지 아니한다(도 8B, 화살머리).
이와 더불어, 이들 데이터는 아미노 8-절두된 Aβ항체들은 특이적으로 실질 아밀로이드 침적을 타겟으로 하며, 다른 항-A베타 면역 접근에서도 관찰되며, 원인으로서 제시된 맥관주위 효과(perivascular effect)(헤모레프(hemorraghes), 뇌변증(encephalopathies))에 기인하여, 맥관 아밀로이드 침적과는 상호작용하지 아니한다는 것을 보여준다.
실시예 6: 형질전환 마우스들에 있어서, N-절두된 8 특이성 (Tei A) 항체의 두개(頭蓋) 내 투여는 아밀로이드 플라크 침전물(burden)의 감소를 유발한다.
TeiA 항체의 치료적 효능을 입증하기 위하여, 이를 뇌 내에 아밀로이드 플라크를 가진 형질전환 마우스의 해마 내에 주사하였다. 투입 7일 후, 뇌의(cerebral) 아밀로이드 펩티드 플라크 로드(load)를 면역조직화학(immunohistochemistry)에 의하여 정량화하였다. 간단하게, 뇌의 정위(定位)(stereotaxic) 조건하에서, 1 또는 2㎍의 항체를 ThyAPPSLxPS1M146L 마우스 의 우측 해마에 주사하였다(일측 주사(unilateral injection))(Blanchard et al., 2003 Exp Neurology 184:247; WO0120977). 주입된 항체는: 두개의 상업적 클래시컬 Aβ(4G8 및 6E10)와 TeiA 항체 TeiA 1.1, 1.6, 1.8 및 2b6였다.
주사 7일 후, 동물들을 안락사시키고 면역조직화학적 검사를 위하여 뇌를 처리하였다. 뇌에 대한 postfixation 이후, 40㎛ 관상 동결절편(coronal cryosection)을 수행하였으며, 400㎛ 섹션들은 별도로 "노출된(revealing)" 항체로서, 비오틴화된 4G8 항-Aβ로 착색하여 뇌 내에 존재하는 아밀로이드 로드를 평가하였다. 4G8 항체가 뇌에 주입된 경우, 상기 사용된 노출된 항체로는 에피토프의 마스킹(masking)을 피하기 위하여 비오틴화된 6E1O을 사용하였다. 비오틴화된 항체들은 표준 아비딘-퍼옥시다아제 검출 키트(Vectastain® ABC kit Vector Laboratories)를 이용하여 검출되었다.
각 뇌 섹션에서, 상기 아밀로이드 펩티드 로드는 5개의 서로 다른 뇌 하부영역(해마, 피질영역 1(등 부위(dorsal)), 피질영역 2(측면부(lateral)), 피질영역 3(배의 측면(latero-ventral)) 및 시상(thalamic)) 내의 각 반구 내에서(주입된 부분과 비주입된 부분) 산출되었다. Olympus scanner system상에서의 이미지의 수집 이후, Mercator ExploraNova system을 이용하여 준-자동적으로 정량화를 수행하였다. 각각의 동물에 대하여, 3개의 뇌 섹션들을 정량화하고, 주입점(injection point)에 대하여 매우 유사하게 위치시켰다: 하나는 주입점 근처에, 하나는 주입점의 두측(rostral) 부위에, 하나는 미측(caudal) 부위에 위치시켰다. 종래 기술된 바와 같이(Wilcock et al, 2003, J Neurosci 23:3745; Oddo et al, 2004, Neuron 43:321), 주입되지 않은 반구에 비하여, 주입된 반구 내에서 4G8의 주입은 아밀로이드 펩티드 침적물의 현저한 감소를 유도하였다(도 9). 이러한 효과는 이러한 항체의 국소 주사로부터 예측할 수 있는 바와 같이, 뇌 섹션들 사이에서 가변적이다. TeiA1.6 항체 역시, 피질영역 3 내에서의 이러한 일련의 실험에서 한층 더 잘 나타낸 바와 같이, 이것이 주입된 쪽에서의 뇌 아밀로이드의 현저한 감소를 유도한다(도 10 참조). 4마리 마우스(7개월령)에 대한 분석에서, 현저한 감소가 나타났다(도 11).
마찬가지로, TeiA1.8는 주입된 쪽에서의 뇌 아밀로이드의 현저한 감소를 유도하였으며, 이것은 피질영역 2 내에서의 이러한 일련의 실험에서 더욱 잘 나타었다(도 12). 4마리 마우스(7개월령)에 대한 분석에서, 현저한 감소가 나타났다(도 13).
이들 데이터는 짧은 시간의 투여 이후라도, TeiA 항체 1.6 및 1.8이 아밀로이드 로드를 감소시키며, 이들은 종래의 전형적인 항-Aβ 항체와 대조적임을 확인시켜준다. 여기서, 투여 당시 이미 동물의 체내에 현저한 아밀로이드 침적이 존재하였다는 사실은 염두에 둘만하다. 이로 인하여, TeiA 항체의 예방 측면의 효과뿐 아니라, 치료효과를 제시하고 있다.
TeiA 항체는 따라서 알츠하이머 질병 환자들의 체내에서의 아밀로이드 로드에 대항하는 우수한 치료 효과를 제공할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> INNOGENETICS N.V. <120> NEW ANTIBODIES SPECIFIC OF THE AMYLOID PEPTIDES AND THEIR USES AS DIAGNOSTIC AGENTS OR DRUGS <130> IOB 07 BE INO MYLO <160> 35 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 98 <212> PRT <213> mouse <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(98) <400> 1 Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys 1 5 10 15 Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Gly Arg Tyr Gln Lys Asn Tyr Leu Thr 20 25 30 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp 35 40 45 Ala Ser Thr Arg Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp 65 70 75 80 Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Asp Tyr Thr Tyr Pro Leu Thr Phe 85 90 95 Ala Gly <210> 2 <211> 111 <212> PRT <213> mouse <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(111) <400> 2 Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ile 1 5 10 15 Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe Tyr Met Glu Trp Val Arg Gln Pro 20 25 30 Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Ile 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Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp 65 70 75 80 Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Asp Tyr Thr Tyr Pro Leu Thr Phe 85 90 95 Gly Ala Gly <210> 8 <211> 111 <212> PRT <213> Mouse <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(110) <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(111) <400> 8 Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr 1 5 10 15 Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe Tyr Met Glu Trp Val Arg Gln Pro 20 25 30 Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Ile Ala Ala Ser Arg Asn Lys Ala Asn 35 40 45 Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Ile Val 50 55 60 Ser Arg Asp Thr Ser Gln Gly Ile Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ala Leu 65 70 75 80 Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Ile Tyr Arg Tyr Tyr 85 90 95 Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 9 <211> 99 <212> PRT <213> Mouse <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(99) <400> 9 Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Thr 1 5 10 15 Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser Gly Thr Gln Thr Asn Tyr Leu Thr 20 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Thr Arg Glu Ser Gly 1 5 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Mouse <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <400> 19 Gln Asn Asp Tyr Arg Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 20 <211> 8 <212> PRT <213> Mouse <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(8) <400> 20 Tyr Phe Ser Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 <210> 21 <211> 17 <212> PRT <213> Mouse <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(17) <400> 21 Lys Ser Ser Leu Thr Leu Leu Asn Ser Gly Ser Gln Thr Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Thr <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Mouse <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <400> 22 Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 23 <211> 10 <212> PRT <213> Mouse <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <400> 23 Gly Phe Thr Phe Thr Asp Gln Tyr Met Ser 1 5 10 <210> 24 <211> 19 <212> PRT <213> Mouse <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <400> 24 Thr Ile Arg Asn Lys Ala Lys Gly Phe Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 25 <211> 8 <212> PRT <213> Mouse <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(8) <400> 25 Tyr Gly Asn Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 <210> 26 <211> 17 <212> PRT <213> Mouse <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(17) <400> 26 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser Gly Arg Gln Thr Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Thr <210> 27 <211> 7 <212> PRT <213> Mouse <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(7) <400> 27 Trp Ala Ser Thr Arg Gly Ser 1 5 <210> 28 <211> 10 <212> PRT <213> mouse <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <400> 28 Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe Tyr Met Glu 1 5 10 <210> 29 <211> 19 <212> PRT <213> mouse <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <400> 29 Ala Ser Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 30 <211> 8 <212> PRT <213> mouse <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(8) <400> 30 Tyr Arg Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 <210> 31 <211> 17 <212> PRT <213> mouse <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(17) <400> 31 Thr Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser Gly Thr Gln Thr Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Thr <210> 32 <211> 10 <212> PRT <213> mouse <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <400> 32 Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe Phe Ile Glu 1 5 10 <210> 33 <211> 19 <212> PRT <213> mouse <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <400> 33 Ala Ser Arg Asn Lys Asn Tyr Asp Tyr Lys Thr Glu Tyr Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 34 <211> 8 <212> PRT <213> mouse <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(8) <400> 34 Tyr Arg His Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 <210> 35 <211> 19 <212> PRT <213> mouse <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <400> 35 Ala Ser Arg Asp Lys Ala Lys Asp Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly

Claims (31)

  1. Aβ8-x 펩티드(x는 11 내지 42)의 N-말단 영역에 특이적으로 결합하며, Aβ1-40 또는 Aβ1-42를 인식하지 아니하는 항체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 항체는 Aβ8-x 펩티드의 자유 N-말단부(free N-terminal-end)에 대하여 고도의 특이성을 나타내는 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 항체는 Aβ8-x 펩티드에 대하여 고도의 친화성(high affinity)을 나타내는 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체는, 뇌 내의 Aβ8-x 펩티드의 실질 아밀로이드 침적(parenchymal amyloid deposition)을 특이적으로 표적으로 삼고, 맥관의 아밀로이드 침적(vascular amyloid deposits)에는 상호작용하지 아니하는 항체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 x는, 15 내지 42이며, 특히 단일클론 항체(monoclonal antibody)인 항체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체의 가변영역(variable region)은, 각각 경쇄(light chain) 및 중쇄(heavy chain)에 대응하는, 다음 아미노산 서열 쌍 중 하나를 포함하는 항체.

    ●항체 TeiA 1.6 (IGH521하이브리도마에 의한 분비)
    경쇄 가변영역:
    CDR-L1 CDR-L2
    SSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLAGRYQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWAST
    CDR-L3
    RDSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYTYPLTFAG
    (SEQ ID NO : 1)

    중쇄 가변영역:
    CDR-H1 CDR-H2 GGLVQPGGSLRLSCAISGFTFSDFYMEWVRQPPGKRLEWIAASRNKANDYTT
    CDR-H3
    EYSASVKGRFIVSRDTSQSILYLQMNALRAEDTAIYYCATYHDYAMDYWGQ
    GTSVTVSS (SEQ ID NO : 2)

    ●항체 TeiA 1.7 (IGH522 하이브리도마에 의한 분비)
    경쇄 가변영역:
    CDR-L1 CDR-L2
    SSLTVTAGEKVTMNCKSSQNLLNSGNQVNYLTWFQQKPGQPPKLLITWAST
    CDR-L3
    RESGVPDRFIGSGSGTDFTLTINSVQAEDLAVYYCQNDYRYPLTFGAG
    (SEQ ID NO:3)

    중쇄 가변영역: CDR-H1 CDR-H2
    GGLVQPGGSLRLSCATSGFTFSDFYMEWVRQPPGRRLEWIAASRDKAKDYTT
    CDR-H3
    EYSASVKGRFIVSRDTSQSIFYLQMNALRSEDTAIYYCATYFSYAMDYWGLG
    TSVTVSS (SEQ ID NO : 4)

    ●항체 TeiA 1.8 (IGH523 하이브리도마에 의한 분비)
    경쇄 가변영역:
    CDR-L1 CDR-L2
    SSLAVTAGERVTMSCKSSLTLLNSGSQTNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTR
    CDR-L3
    ESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPLTFGAG
    (SEQ ID NO:5)

    중쇄 가변영역: CDR-H1 CDR-H2
    GGLVQPGGSLRLSCATAGFTFTDQYMSWVRQPPGKALEWLATIRNKAKGFT
    CDR-H3
    TEYSASVKGRFTISRDNSQSILYLQMSTLRAGDSATYYCAVYGNYAMDYWG
    QGTSVNVSS (SEQ ID NO : 6 )

    ●항체 TeiA 2b.6 (IGH524 하이브리도마에 의한 분비)
    경쇄 가변영역:
    CDR-L1 CDR-L2
    SSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLFNSGRQTNYLTWFQQRPGQAPKLLIYWASTR
    CDR-L3
    GSGVPDRFTGSGSGTEFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYTYPLTFGAG
    (SEQ ID NO :7)

    중쇄 가변영역:
    CDR-H1 CDR-H2
    GGLVQPGGSLRLSCATSGFTFTDFYMEWVRQPPGKRLEWIAASRNKANGYT
    CDR-H3
    TEYSASVKGRFIVSRDTSQGILYLQMSALRAEDTAIYYCAIYRYYAMDYWGQ
    TSVTVSS (SEQ ID NO : 8)

    ●항체 TeiA 1.1 (IGH525 하이브리도마에 의한 분비)
    경쇄 가변영역:
    CDR-L1 CDR-L2
    SSLTVTAGEKVTMSCTSSQSLFNSGTQTNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTR
    CDR-L3
    ESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYTYPLTFGAG
    (SEQ ID NO:9)
    중쇄 가변영역:
    CDR-H1 CDR-H2
    GGLVQPGGSLRLSCATSGFTFSDFFIEWVRQPPGKRLEWITASRNKNYDYK
    CDR-H3
    TEYSASVKGRFIVSRDTSQSILYLQMNALRAEDTAIYYCAIYRHYAMDYWGQ
    GTSVTVSS (SEQ ID NO : 10 )
  7. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 가변영역의 경쇄 및 중쇄의 상보성 결정 영역( CDR)은, 다음 아미노산 서열 중 하나를 포함하는 항체.
    ●항체 TeiA 1.6 ( IGH521 서열)
    경쇄 가변영역의 CDR :
    CDR-L1:
    KSSQSLLAGRYQKNYLT (SEQ ID NO : 11)
    CDR-L2:
    WASTRDSG (SEQ ID NO : 12)
    CDR-L3:
    QNDYTYPLT (SEQ ID NO : 13)
    중쇄 가변영역의 CDR :
    CDR-H1:
    GFTFSDFYME (SEQ ID NO : 14)
    CDR-H2:
    ASRNKANDYTTEYSASVKG (SEQ ID NO : 15)
    CDR-H3
    YHDYAMDY (SEQ ID NO : 16)

    ●항체 TeiA 1.7 ( IGH522 서열)
    경쇄 가변영역의 CDR :
    CDR-L1:
    KSSQNLLNSGNQVNYLT (SEQ ID NO : 17)
    CDR-L2:
    WASTRESG (SEQ ID NO : 18)
    CDR-L3:
    QNDYRYPLT (SEQ ID NO : 19)
    중쇄 가변영역의 CDR : CDR-H1:
    GFTFSDFYME (SEQ ID NO : 14)
    CDR-H2:
    ASRDKAKDYTTEYSASVKG (SEQ ID NO : 20)
    CDR-H3:
    YFSYAMDY (SEQ ID NO : 21)

    ●항체 TeiA 1.8 ( IGH523 서열)
    경쇄 가변영역의 CDR :
    CDR-L1:
    KSSLTLLNSGSQTNYLT (SEQ ID NO : 22)
    CDR-L2:
    WASTRESG (SEQ ID NO : 18)
    CDR-L3:
    QNDYSYPLT (SEQ ID NO : 23)
    중쇄 가변영역의 CDR :
    CDR-H1:
    GFTFTDQYMS (SEQ ID NO : 24)
    CDR-H2:
    TIRNKAKGFTTEYSASVKG (SEQ ID NO : 25)
    CDR-H3:
    YGNYAMDY(SEQ ID NO : 26)

    ●항체 TeiA 2b.6 ( IGH524 서열)
    경쇄 가변영역의 CDR : CDR-L1:
    KSSQSLFNSGRQTNYLT (SEQ ID NO : 27)
    CDR-L2:
    WASTRGS (SEQ ID NO : 28)
    CDR-L3: QNDYTYPLT (SEQ ID NO : 13)
    중쇄 가변영역의 CDR :
    CDR-H1:
    GFTFTDFYME (SEQ ID NO : 29)
    CDR-H2:
    ASRNKANGYTTEYSASVKG (SEQ ID NO : 30)
    CDR-H3: YRYYAMDY (SEQ ID NO : 31)
    ●항체 TeiA 1.1 ( IGH525 서열)
    경쇄 가변영역의 CDR :
    CDR-L1:
    TSSQSLFNSGTQTNYLT (SEQ ID NO : 32)
    CDR-L2:
    WASTRESG (SEQ ID NO :18)
    CDR-L3: QNDYTYPLT (SEQ ID NO : 13) 중쇄 가변영역의 CDR :
    CDR-H1:
    GFTFSDFFIE (SEQ ID NO : 33)
    CDR-H2:
    ASRNKNYDYKTEYSASVKG (SEQ ID NO : 34)
    CDR-H3:
    YRHYAMDY (SEQ ID NO : 35)
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체는,
    방사성 핵종(核種) (radionuclide), 플루오르(fluor), 효소라벨(enzyme label), 효소기질(enzyme substrate), 효소 공요소(enzyme co-factor), 효소 저해제(enzyme inhibitor) 및 합텐(hapten)을 포함하는 군에서 선택되는 화합물을 이용하여 라벨링되는 항체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체는, 인간화된 항체(humanised antibody)인 항체.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 의한 항체를 생산하는 하이브리도마(hybridoma).
  11. 제10항에 있어서,
    상기 하이브리도마는,
    2007.8.23일자로,
    BCCM / LMBP Plasmid Collection에, 다음 Accession No로 기탁된 것:
    TeiA 1.6 or 2.6F4C2 (IGH521) --> LMBP 6594CB
    TeiA 1.7 or 2.8A3F8 (IGH522) --> LMBP 6595CB
    TeiA 1.8 or 1.3B12H3 (IGH523) --> LMBP 6596CB
    TeiA 2b.6 or 2.13E5E4 (IGH524) --> LMBP 6597CB
    TeiA 1.1 or 3.46B10E7 (IGH 525) --> LMBP 6598CB
    인 하이브리도마.
  12. 아밀로이드 침적물을 감소시키고, 항체를 분리(isolate)하는데 있어서 효율적인 항체의 생성을 유발하는 면역반응을 발생시키며,
    Aβ8-x 모사 펩티드: SGYGVHHGC-KLH로이루어진, 펩티드 제제(peptide preparation).
  13. 제1항 내지 제9항에 의한 항체의 제조방법에 있어서,
    상기 항체는, Aβ8-x펩티드(x는 11 내지 42, 특히 15 내지 42)의 자유 N-말단 영역에 특이적으로 결합하고, Aβ1-42를 인식하지 않으며, 고도의 특이성을 제공하며,
    Aβ8-x펩티드 및 T-헬퍼 에피토프, 특히 T-헬퍼 에피토프와 함께 융합된 Aβ8-x펩티드, 또는 Aβ8-x 분지 펩티드(branched peptide), 특히 Aβ8-15 펩티드를 이용하여 적절한 동물을 면역화하는 단계를 포함하는 항체의 제조방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 항체는, Aβ8-15 펩티드의 N-말단 영역에 특이적으로 결합하며, Aβ1-42를 인식하지 아니하고, 웨스턴 블롯(Western Blot) 상에서 결정되는 바와 같이, Aβ8-15 펩티드에 대한 고도의 친화성을 나타내는, 항체의 제조방법.
  15. 제13항 또는 제14항의 제조방법에 의하여 얻어지며,
    Aβ8-x 펩티드의 N-말단 영역에 특이적으로 결합하는 항체.
  16. 포유류에 있어서의 아밀로이드 침적(amyloid burden)을 in vitro에서 진단하기 위한 방법에 관한 것으로서,
    (i) 제1항 내지 제9항, 또는 제15항 중 어느 한 항에 의한 항체를 이용하여, 상기 포유류 체액 내의 N-말단 절두Aβ8-x (N-terminal truncated Aβ8-x) 펩티드 수준을 정량화하는 단계,
    (ⅱ) 상기 포유류의 항체의 수준과 대조 포유류에서 얻어진 항체 수준을 비교하는 단계, 및
    (ⅲ) 상기 (ⅱ) 단계로부터, 만약 바이오마커(biomarker) 수준이 상기 대조 포유류에서 측정된 수준에 대하여 수정되는 경우, 특히 상기 대조 포유류에서 측정된 수준보다 높은 경우, 상기 포유류가 신경계 질병을 지니고 있음을 추론하는 단계를 포함하는 진단방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 포유류는 인간인, 진단방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서,
    상기 항체의 Aβ8-42에 대한 특이성(specificity) 및 민감도(sensitivity)는 63% 이상, 바람직하게는 63 내지 100%이며, 더욱 바람직하게는 75 내지 85%이고, 또는 더욱 바람직하게는 85 내지 100%인 진단방법.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 체액은, 중추 신경계 유체(cerebrospinal fluid, CSF) 또는 혈액인 진단방법.
  20. 포유류에 있어서, 알츠하이머 질병과 같은 β-아밀로이드 형성 및/또는 응집과 관련된 질병에 대한 민감성(susceptibility)을 판별하는 방법, 포유류에 있어서, 알츠하이머 질병과 같은 β-아밀로이드 형성 및/또는 응집에 연관된 질병 진행의 위험성을 판별하는 방법, 포유류에 있어서, β-아밀로이드 침적의 제거를 선별(screening)하는 방법 또는 포유류에 있어서의 β-아밀로이드 침적 수준을 예측하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은,
    (i) 상기 포유류에서, 제1항 내지 제9항, 또는 제15항 중 어느 한 항에 의한 항체를 이용하여 Aβ8-x 펩티드의 양을 결정하는 단계,
    (ii) 상기 (i) 단계에서 결정된 양과 대조 포유류 내에서의 상기 Aβ8-x 펩티드의 N-말단영역에 특이적인 항체의 양을 비교하는 단계, 및
    (ⅲ) 상기 (ii) 단계에서의 비교 결과로부터, 상기 포유류가 알츠하이머 질병과 같은 β-아밀로이드 형성 및/또는 응집과 관련된 질병에 대하여 민감한지, 상기 포유류가 알츠하이머 질병과 같은 β-아밀로이드 형성 및/또는 응집에 연관된 질병 진행의 위험성에 노출되어 있는지, 상기 포유류 내의 β-아밀로이드 침적이 제거되었는지, 또는 상기 포유류 내의 β-아밀로이드 수준은 어느 정도인지를 결정하는 단계를 포함하는 질병의 민감성, 위험성 판별, 선별 또는 예측방법.
  21. 제20항에 있어서,
    Aβ8-x 펩티드의 N-말단 영역에 대한 특이성을 갖는 상기 항체의 양은, 상기 포유류로부터 얻어진 조직 샘플상에서 결정되는 질병의 민감성, 위험성 판별, 선별 또는 예측방법.
  22. 적어도 하나의 버퍼(buffer), 및 적어도 하나의 검출 화합물, 적어도 하나의 제1항 내지 제9항, 또는 제15항 중 어느 한 항에 의한 N-절두된 Aβ8-x 특이성 항체를 포함하는 키트.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 키트는, 제1항 내지 제9항, 또는 제15항 중 어느 한 항에 의한 항체에 결합하는 표지화된(labelled) 제2항체를 더 포함하는, 키트.
  24. 의약적으로 수용가능한 운반체(vehicle)와 함께, 활성 성분으로서 제1항 내지 제9항, 또는 제15항 중 어느 한 항에 의한 항체 또는 상기 자유 N-절두 Aβ펩티드의 자유 N-말단부(free N-terminal-end)를 모사한 자유 N-말단부를 이용한 합성 펩티드를 포함하는 치료 조성물.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 치료 조성물은, 개별 피검체에 대하여 1mg/kg/day 내지 200mg/kg/day의 투여량으로의 항체 투여에 적합한 치료 조성물.
  26. 의약적으로 수용가능한 운반체와 함께, 활성 성분으로서 제1항 내지 제9항, 또는 제15항 중 어느 한 항에 의한 항체, 절편(fragments) 또는 이들의 유도체, 또는 자유 N-절두 Aβ펩티드의 자유 N-말단부(free N-terminal-end)를 모사한 자유 N-말단부를 이용한 합성 펩티드를 포함하는 백신 조성물.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 백신 조성물은, 개별 피검체에 대하여 1mg/kg/day 내지 200mg/kg/day의 투여량으로의 항체 투여에 적합한 백신 조성물.
  28. 알츠하이머 질병의 예방 또는 치료를 목적으로 하는 의약품 또는 백신의 제조를 위한 제1항 내지 제9항, 또는 제15항 중 어느 한 항에 의한 적어도 하나의 항체의 용도.
  29. β아밀로이드 침적물의 제거를 위하여 의도된 의약품 또는 백신의 제조를 위한 제1항 내지 제9항, 또는 제15항 중 어느 한 항에 의한 적어도 하나의 항체의 용도.
  30. 포유류에 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 의한 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 포유류 내에서 β아밀로이드 침적물(burden)을 제거하는 방법.
  31. 알츠하이머 질병에 감염되거나 상기 질병의 진행에 민감한 포유류 체내에서 면역반응 유도를 위한, 제24항에 의한 치료 조성물 또는 제26항에 의한 백신 조성물의 용도.
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