KR20140017513A

KR20140017513A - 아밀로이드 플라크 관련 증상을 치료하는 조성물과 방법

Info

Publication number: KR20140017513A
Application number: KR1020137016719A
Authority: KR
Inventors: 데이비드 홀츠만; 정수 김; 홍 지앙; 아담 엘토라이
Original assignee: 워싱톤 유니버시티
Priority date: 2010-12-02
Filing date: 2011-12-02
Publication date: 2014-02-11
Also published as: EP2646053A2; ZA201303996B; NZ611614A; BR112013013723A2; US20160355581A1; MX2013006116A; US20140037638A1; WO2012075422A2; AU2011336360A1; CA2819679A1; RU2013130002A; WO2012075422A3; SG190952A1; CN103338786A; JP2014502276A; EP2646053A4

Abstract

본 발명은 A 플라크 관련 증상의 하나 이상의 증상 또는 징후를 효과적으로 치료하고 또는 아밀로이드 플라크 로드를 감소시키는 조성물 및 방법을 포괄한다. 본 방법은 인간에게처럼 살아있는 포유류 생물계에 유효량의 항-ApoE 항체를 투여하는 것을 포함한다.

Description

아밀로이드 플라크 관련 증상을 치료하는 조성물과 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING AMYLOID PLAQUE ASSOCIATED SYMPTOMS}

본 발명은 NIH가 수여한 AG013956 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 일정 권리를 가진다.

본 발명은 대상자에서의 알츠하이머병 (AD)과 관련된 것과 같은, Aβ 플라크 관련 증상을 지연하거나 예방하는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 대상자 뇌에서의 아밀로이드-β(Aβ)의 농도를 조절하는 것에 관한 것이다.

알츠하이머병 (AD)은 치매의 가장 흔한 원인이며 증가하는 공중 보건 문제이다. 이것은 현재 미국에서 500만 명을 괴롭히고 있는 것으로 추정되며 2050 년까지 1300만 명으로 증가할 것으로 예상된다. 알츠하이머병은 기억, 인지 기능의 상실 및 궁극적으로 독립성 상실로 이어진다. 이것은 대상자 및 가족에게 심한 인력 및 금전적 비용이 들게 한다. 인구 집단 내에서의 질환의 심각성 및 증가하는 유병률 때문에 더 나은 치료법이 개발되는 것이 시급하다.

생화학적, 유전학적, 및 동물 모델 증거는 아밀로이드-β (Aβ)를 AD에서의 병원성 펩티드로 암시한다. AD의 신경병리학적 및 신경화학적 특징은 시냅스 손실, 선택적 신경 세포 사멸, 특정 신경전달물질의 감소, 및 신경 내 (신경섬유 덩어리, neurofibrillary tangle)와 세포외 공간 (뇌혈관, 광범위 및 신경성 플라크) 안의 이상 단백질성 침착물의 존재를 포함한다. 이러한 플라크의 주요 구성요소는 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)로부터 절단된 38-43 아미노산 서열 펩티드인, Aβ이다.

수용성 Aβ가 일생에 걸쳐 주로 신경에서 분비되나 다른 세포 유형에서도 역시 분비된다. 과도한 Aβ 침착은 가족성 조기 발병 AD에서 일어나는 것처럼 Aβ 합성 증가, 또는 뇌에서의 Aβ 청소율 감소로부터 기인할 수 있다. Aβ 생산이, 더 흔한 형태의 후발성 AD에서 일어난다는 강력한 증거가 부족한 것은 불충분한 Aβ 청소율이 Aβ 침착 및 아밀로이드 플라크 형성 역시 이끌어낼 수 있다는 것을 나타낸다.

아포지방단백질 E (ApoE) 유전자는 더 이른 연령의 발병뿐만 아니라 3-15 배의 더 높은 위험성을 가지는 E4 대립유전자 수송체와 함께 후발성 AD에 대해 가장 널리 복제되는 유전적 위험성 인자로 남아 있다. 뇌에서 ApoE 는 아밀로이드 플라크를 둘러싸고 있는 것으로 여겨지는 소교세포와 성상교세포에 의해 주로 합성되고 분비된다. 본 발명은 AD 마우스 모델에서 아밀로이드 플라크 로드를 줄이는 데 효과적인 ApoE 항체를 제공한다.

본 발명의 한 측면은 살아 있는 인간 대상자에게 유효량의 항-ApoE 항체를 투여하는 것을 포함하여 하나 이상의 임상적으로 발견할 수 있는 Aβ 플라크 관련 증상을 치료하는 데 효과적인 방법을 포괄한다. 다른 측면에서, 본 발명은 이러한 치료에 유용한 항체를 포괄한다. 예를 들어, 살아있는 포유 동물에서의 Aβ 펩티드의 독성 효과를 치료적으로 약화하는 항체.

본 발명의 다른 측면은 하나 이상의 항-ApoE 항체를 포함하는 조성물을 포괄한다. 한 측면에서, 본 발명은 하이브리도마 HJ6.1, HJ6.2, HJ6.3, HJ6.4, 또는 이들의 조합으로부터 생산되는 하나 이상의 항-ApoE 항체를 포함하는 조성물을 포괄한다. 한 측면에서 본 발명은 하나 이상의 항-ApoE 항체를 포함하는 의약 조성물을 포괄한다. 한 측면에서, 본 발명은 하이브리도마 HJ6.1, HJ6.2, HJ6.3, HJ6.4 또는 이들의 조합으로부터 생산되는 하나 이상의 항-ApoE 항체를 포함하는 의약 조성물을 포괄한다.

본 발명의 또 다른 측면은 하나 이상의 임상적으로 발견할 수 있는 Aβ 플라크 관련 증상을 치료하는 데 유용한 의약 조성물을 포괄한다. 조성물은 살아있는 인간 대상자에게 투여하기에 적당한 의약적 유효량의 항-ApoE 항체를 포함한다. 한 측면에서 이러한 치료에 유용한 항체는 살아있는 포유 동물에서의 Aβ 펩티드의 독성 효과를 치료적으로 약화하는 항체를 포함한다. 한 측면에서, 의약 조성물은 살아있는 대상자에게 효과적으로 투여된다.

본 발명의 또 다른 측면은 살아있는 인간 대상자에게 투여하기에 적당한 의약적 유효량의 항-ApoE 항체의 기능적 치료 의약 조성물을 함유하는 용기 및 상기 투여에 사용하기 위한 임의의 의약용 장치를 포함하는 의약용 키트를 포괄한다. 한 측면에서 이러한 치료에 유용한 항체는 살아있는 포유 동물에서의 Aβ 펩티드의 독성 효과를 치료적으로 약화하는 항체를 포함한다

본 발명의 다른 측면과 반복은 이하에서 상술한다.

도 1은 3 개월부터 시작하여 7 개월까지 항-Aβ 항체 (HJ3.4) 또는 두 개의 항-ApoE 항체 (HJ6.2 또는 HJ6.3) 중 하나로 일주일에 한 번 10 mg/kg 복강 투여 처리한 PS/APP 마우스의 해마 샘플에서, 항-ApoE 항체의 강한 아밀로이드 플라크 로드의 감소 효과를 그래프로 묘사한다. 대조군은 인산염 완충 염수 (PBS)로 처리하였다. 평가한 동물 숫자는 N=7 (PBS), N=16 (HJ3.4), N=16 (HJ6.2), N=16) 이다.
도 2는 항-Aβ 항체 (HJ3.4) 또는 두 개의 항-ApoE 항체 (HJ6.2 또는 HJ6.3) 중 하나로 일주일에 한 번 10 mg/kg 복강 투여 처리한 PS/APP 마우스의 대뇌 피질 샘플에서, 항-ApoE 항체의 강한 아밀로이드 플라크 로드의 감소 효과를 그래프로 묘사한다. 대조군은 PBS로 처리하였다. 평가한 동물 숫자는 N=7 (PBS), N=16 (HJ3.4), N=16 (HJ6.2), N=16) 이다.
도 3은 ELISA 분석법을 이용하여 항-apoE 항체 HJ6.1, HJ6.2, HJ6.3 및 HJ6.4의 인간 apoE와의 결합을 그래프로 묘사한다.
도 4는 (A) 항-apoE 항체 HJ6.1, HJ6.2, HJ6.3, 및 HJ6.4의 혈장에서의 인간 apoE와의 결합, 및 (B) HJ6.1, HJ6.2, HJ6.3 및 HJ6.4 항체를 받은 동일한 마우스에서의 콜레스테롤 레벨을 그래프로 묘사한다.
도 5는 말초 투여 후 중추 신경계에서의 항-apoE 항체 HJ6.1, HJ6.2, HJ6.3 및 HJ6.4의 존재를 그래프로 묘사한다.
도 6은 10 일에 걸쳐 HJ6.2 및 HJ6.3 (항-apoE 항체), 및 HJ3.4 (항-Aβ 항체)를 마우스에 단기 투여한 후의 소교세포 활성화를 그래프로 묘사한다.
도 7은 (A) HJ6.1 중쇄 가변 영역 및 제1 불변 영역 (서열 4); (B) HJ6.1 경쇄 가변 영역 및 불변 영역 (서열 2); (C) HJ6.2 중쇄 가변 영역 및 제1 불변 영역 (서열 8); (D) HJ6.2 경쇄 가변 영역 및 불변 영역 (서열 6); (E) HJ6.3 중쇄 가변 영역 및 제1 불변 영역 (서열 12); (F) HJ6.3 경쇄 가변 영역 및 불변 영역 (서열 10); (G) HJ6.4 중쇄 가변 영역 및 제1 불변 영역 (서열 16); (H) HJ6.4 경쇄 가변 영역 및 불변 영역 (서열 14)의 아미노산 서열을 묘사한다. CDR을 포함하는 영역은 강조되어 있다.

출원인은 Aβ 플라크 관련 증상을 효과적으로 치료하기 위한 항체와 그 이용 방법을 발견하였다. 이 방법은 약리학적 유효량의 항-ApoE 항체를 살아있는 대상자에게 효과적으로 투여하는 것을 포함한다. 본 발명은 항-ApoE 항체가 Aβ 플라크 관련 증상에 걸린 대상자에 대한 치료법을 제공한다는 발견을 포괄한다. 따라서, 본 발명은 Aβ 플라크 관련 증상의 징후 및 증상이 적어도 일부는 ApoE의 유해한 영향 때문일 수 있다는 증거를 제공한다. 한 측면에서 하나 이상의 전임상적 또는 임상적 증상 또는 징후가 그 대상자에게서 나타난다. 한 측면에서 이러한 치료에 유용한 항체는 살아있는 포유 동물에서 Aβ 펩티드의 독성 효과를 치료적으로 약화하는 항체를 포함한다. 한 측면에서 이러한 치료에 유용한 항체는 ApoE 내의 에피토프 (epitope)에 결합하는 것들을 포함한다.

한 측면에서, 항-ApoE 항체는 하나 이상의 적절한 상용성 아쥬반트 또는 부형제와 부가 혼합하여 Aβ 플라크 관련 증상으로 괴로워하는 사람과 같이 살아있는 대상자에게 훌륭하게 그리고 효과적으로 투여되는(주어지는) 치료 의약 조성물이 된다. 통상적으로 이것은 고순도의 수성 조성물이다.

여기서 사용될 때, "치료하다" 또는 "치료"라는 용어는 Aβ 플라크 관련 증상의 하나 이상의 증상 또는 징후의 예방, 약화, 역전 또는 개선을 포함한다.

여기서 사용될 때, "치료적으로 약화하다"는 변화를 유도하거나 그로부터 기인하는 유리한 긍정적 효과를 가지는 것을 포함한다.

Aβ 플라크 관련 증상에 대한 하나의 정의는 아밀로이드 원섬유라 불리는 일정하게 배열되어 있는 원섬유 응집체를 포함하는 아밀로이드 플라크의 형성에 의해 발생하는 임의의 증상을 말한다. Aβ 플라크 관련 증상을 가지는 예시적 장애는 알츠하이머병, 루이체 치매, 및 대뇌 아밀로이드 혈관병증을 포함하나 이에 국한되지 않는다.

예시적인 Aβ 플라크 관련 증상은 손상된 인지 기능, 행동 변화, 감정 조절 곤란, 발작, 손상된 신경계 구조 또는 기능, 및 알츠하이머 발병 위험성 증가를 포함할 수 있다. 손상된 인지 기능은 기억, 주의, 집중, 언어, 추상적 생각, 창의성, 실행 기능, 계획성 및 조직성에 있어서의 어려움을 포함할 수 있으나 이에 국한되지 않는다. 행동 변화는 육체적 또는 언어적 공격성, 충동성, 억제력 감소, 무관심, 주도성 감소, 성격 변화, 알코올, 담배 또는 약물의 남용, 및 다른 중독과 관련된 행동을 포함할 수 있으나 이에 국한되지 않는다. 감정 조절 곤란은 우울, 근심, 조증, 과민, 및 감정 실조를 포함할 수 있으나 이에 국한되지 않는다. 발작은 전신성 강직성-간대성 발작, 복합 부분 발작, 비간질성, 심인성 발작을 포함할 수 있으나 이에 국한되지 않는다. 손상된 신경계 구조 또는 기능은 수두증, 파킨슨증, 수면 장애, 정신병, 균형과 협응의 손상을 포함할 수 있으나 이에 국한되지 않는다. 이는 단부전마비, 반신부전마비, 사지마비, 운동실조, 발리스무스 (ballismus) 및 떨림과 같은 운동 손상을 포함할 수 있다. 이는 또한 후각, 촉각, 미각, 시각 및 청각 감각을 포함하는 감각 손실 또는 기능부전을 포함할 수 있다. 또한, 이는 장 및 방광 기능부전, 성기능부전, 혈압 및 체온 조절 곤란과 같은 자율 신경계 손상을 포함할 수 있다. 마지막으로 이는 성장호르몬, 갑상선자극호르몬, 황체형성호르몬, 여포자극호르몬, 생식선자극호르몬 방출 호르몬, 프로락틴, 및 수많은 다른 호르몬과 조절제의 부족 및 조절 곤란과 같은 시상하부 및 하수체의 기능부전에 기여하는 호르몬 손상을 포함할 수 있다. 알츠하이머병 발병 위험성 증가는 대상자 연령, 가족력, 유전적 상태 및 다른 공지된 위험 요소를 고려할 때 예상되는 위험성에 비해 상승된 위험성을 포함한다.

Aβ 펩티드는 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)이라 불리는 더 큰 단백질의 카르복시 말단의 영역으로부터 유래하는 것이다. APP를 코딩하는 유전자는 21번 염색체상에 위치한다. 독성 효과를 가질 수 있는 많은 형태의 Aβ가 있다: Aβ 펩티드는 그것의 전체 크기를 변화시키는 절단 및 변형을 가질 수 있지만 통상적으로 38-43 아미노산 서열 길이이다. 이들은 가용성 및 불용성 구획에서, 단량체, 올리고머, 및 응집체 형태로, 세포내 또는 세포외로, 그리고 다른 단백질 또는 분자와 복합되어 나타날 수 있다. Aβ의 역효과 또는 독성 효과는 위에 나타난 임의의 또는 모든 형태 뿐만 아니라 특정하여 기재하지 않은 다른 것 때문일 수 있다.

한 실시태양에서, 본 발명은 대상자의 뇌에서의 아밀로이드 플라크 로드를 감소하는 방법을 제공한다. 이 방법은 대상자에게 ApoE에 특이적으로 결합하는 치료 유효량의 항체를 투여하는 것을 포함한다. 적절한 항체는 여기 개시된 것들을 포함한다. 예시적인 실시태양에서 적절한 Ab는 아래 표 A에 기술한 항체를 포함한다. 본 발명의 방법은 대상자의 해마에서 아밀로이드 플라크 로드를 감소시킬 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 대상자의 대뇌 피질에서 아밀로이드 플라크 로드를 감소시킬 수 있다. 각각의 상기 실시태양에서 아밀로이드 플라크 로드는 무처리 또는 음성 대조군 처리 대상자와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 % 이상만큼 감소할 수 있다. 일부 실시태양에서, 아밀로이드 플라크 로드는 무처리 또는 음성 대조군 처리 대상자와 비교하여 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 또는 95 % 이상만큼 감소할 수 있다. 다른 실시태양에서, 아밀로이드 플라크 로드는 무처리 또는 음성 대조군 처리 대상자와 비교하여 100, 125, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 또는 450 % 이상만큼 감소할 수 있다. 아밀로이드 플라크 로드를 측정하는 방법은 당해 분야에 알려져 있다.

여기서 유용한 항-ApoE 항체는 Aβ의 역효과 또는 독성 효과를 치료적으로 약화하는 모든 항체를 포함한다. 유용한 항체는 ApoE 코딩 서열 내 에피토프에 특이적으로 결합하는 것을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 여기서 유용한 항-ApoE 항체는 또한 Aβ의 역효과 또는 독성 효과를 약화하고 ApoE의 특정 영역 및 다른 형태의 ApoE에 결합하는 항체를 포함한다. ApoE의 특정 영역은 C-말단, N-말단 및 다른 중심 도메인을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 다른 형태의 ApoE는 절단되고, 변형되고, 가용성, 불용성, 세포내, 세포외, 단량체 ApoE, 올리고머 ApoE, 원섬유성, 응집된 ApoE 또는 다른 단백질 또는 분자와 복합된 ApoE를 포함하나 이에 국한되지 않는다.

한 측면에서, 여기서 유용한 항체는 분리하고, 특징화하고, 정제하였으며, 기능적이고, 그리고 Aβ 플라크 관련 증상을 가지는 살아있는 대상자에 투여하는 기능적 치료 조성물에 이용하기 위해 회수 (수득)한 그러한 항체를 포함한다.

"단일 클론 항체"는 예를 들어, 임의의 진핵, 원핵, 또는 파지 클론을 포함하여 단일 카피 또는 클론으로부터 얻은 항체를 말한다. "단일 클론 항체"는 하이브리도마 기술을 통해 생산된 항체에 국한되지 않는다. 단일 클론 항체는 예를 들어, 재조합 기술 뿐만 아니라 당해 분야에 잘 알려진 하이브리도마 기술, 파지 디스플레이 기술, 합성 기술 또는 이러한 기술들의 조합 그리고 당해 분야에 쉽게 알려진 다른 기술을 이용하여 생산할 수 있다. 또한, 단일 클론 항체는 당해 분야에 알려진 방법에 따라 검출가능한 표지로 표지, 고체상에 고정화하고/하거나 이종 화합물 (예를 들어, 효소 또는 독소)과 접합할 수 있다.

또한, "항체"는 기능적 단일 클론 항체, 또는 그것의 면역적으로 유효한 단편을 의미한다; 예를 들어, 그것의 Fab, Fab', 또는 F(ab')2 단편. 여기서 일부 문맥상, 강조를 위해 단편을 구체적으로 언급한다; 그럼에도 불구하고 단편이 특정되는지와 관계없이 "항체"라는 용어는 단일 사슬 형태뿐만 아니라 그러한 단편을 포함하는 것으로 이해할 것이다. 단백질이 그것의 의도한 목적물에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 한, 이것은 "항체"라는 용어 안에 포함된다. 또한 예를 들어, 보통 Fv로 명명하는, 이런 특이성을 가지는 항체의 단일 사슬 형태 영역이 "항체"의 정의 내에 포함된다. 통상적으로 적절한 특이성을 가지는 쥐의 또는 다른 비인간 항체의 조작이 이들을 인간화 형태로 전환하기 위해 요구되기 때문에 반드시는 아니지만 바람직하게 본 발견에서 유용한 항체는 재조합하여 생산한다. 글리코실화 항체가 바람직하기는 하지만 항체를 글리코실화 하거나 하지 않을 수 있다. 알려진 바와 같이 이황화 결합을 통해 항체를 적절히 가교한다.

여기서 유용한 항체의 기본적인 항체 구조 단위는 4량체를 포함한다. 각각의 4량체는 동일한 두 쌍의 폴리펩티드 사슬로 구성되며 각 쌍은 하나의 "경쇄" (약 25 kDa) 및 하나의 "중쇄" (약 50-70 kDa)를 포함한다. 각 사슬의 아미노 말단 부분은 주로 항원 인식을 담당하는 약 100 내지 110 또는 그 이상의 아미노산 서열의 가변 영역을 포함한다. 각 사슬의 카르복시 말단 부분은 주로 이펙터 기능을 담당하는 불변 영역을 정의한다.

여기서 유용한 항-ApoE 항체는 분리하고, 특징화하고, 정제하고, 기능적이며 그 제조를 위해 공정에서 회수 (수득)한, 그리고 이에 따라 치료적 및 의약적 충분량의 유용한 형태로 여기서 사용하는 데 이용가능한 것들을 포함한다.

경쇄는 감마, 뮤, 알파, 및 람다로 분류한다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 입실론으로 분류하며 항체의 이소형을 IgO, IgM, IgA, IgD 및 IgE 각각으로 정의한다. 경쇄 및 중쇄 내에서 가변과 불변 영역은 약 12 또는 그 이상의 아미노산 서열의 "J"영역에 의해 이어지며 중쇄는 또한 약 10 또는 그 이상의 아미노산 서열의 "D"영역을 포함한다.

각각의 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역은 항체 결합 부위를 형성한다. 따라서 완전 항체는 두 개의 결합 부위를 가진다. 사슬은 상보성 결정영역 (이하 "CDR"로 언급함)으로도 불리는 세 개의 초가변 영역으로 연결되는 상대적으로 보존된 프레임워크 영역 (FR)의 동일한 일반 구조를 나타낸다. 두 사슬로부터의 CDR은 프레임워크 영역에 의해 정렬되어 특정 에피토프에 결합하는 것을 가능하게 한다. N-말단부터 C-말단까지 경쇄 및 중쇄 모두는 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4 각각을 포함한다. 각 도메인에 아미노산 서열을 할당하는 것은 알려진 통념에 따른다. (문헌[Kabat "Sequences of Proteins of Immunological Interest" National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 and 1991]; 문헌[Chothia, et al, J. Mol. Bio. (1987) 196:901-917]; 문헌[Chothia, et al., Nature (1989) 342:878-883] 참조)

한 측면에서, 단일 클론 항-apoE 항체는 상기 포유동물의 항체-생산 세포로부터 하이브리도마를 형성하거나 그렇지 않으면 이것을 불멸화시키고, 적당한 특이성에 대해 이를 평가하기 위해 하이브리도마 또는 불멸화된 세포를 배양하는, 포유동물의 면역화 표준기술에 의해 적당한 특이성을 가지도록 만든다. 본 경우에서, 이러한 항체는 인간, 토끼, 래트 또는 마우스를 예를 들어, ApoE 단백질 코딩 서열 또는 그것의 적당한 부분영역을 포괄하는 에피토프를 나타내는 펩티드로 면역화함으로써 만들 수 있다. 재조합 조작을 위한 물질은 하이브리도마 또는 그것을 생산하는 다른 세포로부터 원하는 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 회수함으로써 수득할 수 있다. 이러한 뉴클레오티드 서열은 이후 조작하고 그리고 분리하고 특징화하고 정제하고, 그리고 원한다면 여기서 사용하기 위한 인간화 형태로 이를 제공하기 위해 회수할 수 있다.

여기서 사용될 때 "인간화 항체"는 비인간 상보성 결정영역 ("CDR")을 가지는 항체의 서열을 변경함으로써 인간 항체 생식선으로부터 얻어지는 아미노산 서열로 부분적으로 또는 완전히 구성되는 항-ApoE 항체를 포함한다. 가장 단순한 이러한 변경은 인간 항체의 불변 영역을 단순히 쥐의 불변 영역으로 치환하는 것을 포함할 수 있으며 이에 따라 제약학적 용도로 허용 가능한 충분히 낮은 면역원성을 가질 수 있는 인간/쥐 키메라를 야기한다. 그러나 바람직하게는 항체의 가변 영역 및 심지어 CDR 역시도 당해 분야에 현재까지 잘 알려져 있는 기술에 의해 인간화한다. 가변 영역의 프레임워크 영역을 상응하는 인간 프레임워크 영역으로 치환하여 비인간 CDR을 실질적으로 온전한 상태로 두거나 또는 심지어 CDR을 인간 게놈으로부터 얻어지는 서열로 치환한다. CDR은 또한 완전한 인간 생식선 프레임워크 영역 또는 실질적으로 인간인 프레임워크 영역의 경우에서 ApoE에 대한 결합 활성 및 친화도가 유지되거나 강화되도록 무작위로 돌연변이를 일으킬 수 있다. 실질적 인간 프레임워크는 알려진 인간 프레임워크 서열과 90 %, 95 % 또는 99% 이상의 서열 동일성을 가진다. 완전히 유용한 인간 항체는 그 면역 체계가 인간의 면역 체계와 일치하도록 변형된 유전적으로 변형된 마우스에서 생산한다. 위에 언급한 대로, 단일 사슬 형태를 나타내는 단편을 포함하여, 면역학적으로 특이적인 항체의 단편을 이용하는 것은 본 발견의 방법에 이용하기에 충분하다.

또한, 여기서 사용될 때 "인간화 항체"라는 용어는 인간 프레임워크, 비인간 항체로부터의 하나 이상의 CDR을 포함하고, 여기 존재하는 임의의 불변 영역이 인간 면역 글로불린 불변 영역과 실질적으로 동일한, 즉, 약 85-90 % 이상, 바람직하게는 95 % 이상 동일한 것인 항-ApoE 항체를 말한다. 따라서, 가능하면 CDR을 제외하고 인간화 항체의 모든 부분은 하나 이상의 본래 인간 면역 글로불린 서열의 상응하는 쌍과 실질적으로 동일하다.

필요하다면 인간화 면역 글로불린의 설계는 다음과 같이 수행할 수 있다. 아미노산 서열이 다음의 범주에 속할 때, 사용할 인간 면역 글로불린 (수용체 면역 글로불린)의 프레임워크 아미노산 서열은 CDR-제공 비인간 면역 글로불린 (공여체 면역 글로불린)으로부터의 프레임워크 아미노산 서열로 대체한다: (a) 수용체 면역 글로불린의 인간 프레임워크 영역에서의 아미노산 서열은 그 위치에서의 인간 면역 글로불린에 일반적이지 않으나, 공여체 면역 글로불린에서의 상응하는 아미노산 서열은 그 위치에서의 인간 면역 글로불린에 통상적이고; (b) 아미노산 서열의 위치는 CDR 중 하나에 바로 인접하고; 또는 (c) 프레임워크 아미노산 서열의 임의의 측쇄 원자는 3차원 면역 글로불린 모델에서 CDR 아미노산 서열의 임의의 원자 약 5-6 옹스트롬 (중심부터 중심까지) 내에 있다 (문헌[Queen, et al., op. cit., and Co, ct al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:2869]). 수용체 면역 글로불린의 인간 프레임워크 영역의 아미노산 서열 및 공여체 면역 글로불린의 상응하는 아미노산 서열 각각이 그 위치에서 인간 면역 글로불린에 일반적이지 않을 때, 이러한 아미노산 서열을 그 위치에서 인간 면역 글로불린에 통상적인 아미노산 서열로 대체한다.

모든 경우에서, 본 발명의 항체는 ApoE에 특이적으로 결합한다. 예시적인 실시태양에서, 본 발명의 항체는 인간 ApoE에 특이적으로 결합한다. 여기서 "특이적으로 결합한다"는 표현은 10^-4- 10^-6 M^-1 이상의 범위의 , 바람직하게는 10^-7- 10^-9 M^-1범위의 결합 상수로 항체가 단백질에 결합한다는 것을 의미한다. 다양한 종으로부터의 ApoE의 서열이 당해 분야에 알려져 있으며 항체가 ApoE에 결합하는지를 확인하는 방법이 당해 분야에 알려져 있다. 예를 들어, 실시예를 참고한다. 본 발명의 항체는 ApoE2, ApoE3, ApoE4 또는 이들의 대립유전자 변이체를 인식할 수 있다. 한 실시태양에서, 본 발명의 항체는 인간 ApoE4를 인식할 수 있다.

바람직한 항체는 HJ6.1 (ATCC 특허 기탁 지정번호 PT-11805), HJ6.2 (ATCC 특허 기탁 지정번호 PT-11806), HJ6.3 (ATCC 특허 기탁 지정번호 PT-11807), 또는 HJ6.4 (ATCC 특허 기탁 지정번호 PT-11808)로 명명된 하이브리도마로부터 얻은 마우스 항체의 인간화 형태이다. 여기 사용될 때, "로부터 얻은"이라는 용어는 "얻은" 항체가 HJ6.1, HJ6.2, HJ6.3, 또는 HJ6.4에 의해 생산된 항체로부터의 하나 이상의 CDR 영역을 포함하는 것을 의미한다. 달리 말하면, "얻은 항체"는 서열 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 및 39로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 CDR 영역을 포함한다.

한 실시태양에서, 본 발명의 항체는 하이브리도마 HJ6.1로부터 얻을 수 있고 서열 1의 경쇄 가변 영역과의 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99 %의 동일성을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩할 수 있고, 또는 서열 2의 중쇄 가변 영역과의 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99 %의 동일성을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩할 수 있다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 하이브리도마 HJ6.1로부터 얻을 수 있고 서열 3의 경쇄 가변 영역과 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99 % 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있고 또는 서열 4의 중쇄 가변 영역과 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99 % 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 각각의 위 실시태양에서 항체는 인간화할 수 있다.

또 다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 하이브리도마 HJ6.2로부터 얻을 수 있고 서열 5의 경쇄 가변 영역과의 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99 %의 동일성을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩할 수 있고, 또는 서열 6의 중쇄 가변 영역과의 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99 %의 동일성을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩할 수 있다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 하이브리도마 HJ6.2로부터 얻을 수 있고 서열 7의 경쇄 가변 영역과 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99 % 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있고 또는 서열 8의 중쇄 가변 영역과 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99 % 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 각각의 위 실시태양에서 항체는 인간화할 수 있다.

추가적인 실시태양에서, 본 발명의 항체는 하이브리도마 HJ6.3으로부터 얻을 수 있고 서열 9의 경쇄 가변 영역과의 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99 %의 동일성을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩할 수 있고, 또는 서열 10의 중쇄 가변 영역과의 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99 %의 동일성을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩할 수 있다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 하이브리도마 HJ6.3으로부터 얻을 수 있고 서열 11의 경쇄 가변 영역과 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99 % 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있고 또는 서열 12의 중쇄 가변 영역과 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99 % 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 각각의 위 실시태양에서 항체는 인간화할 수 있다.

또 다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 하이브리도마 HJ6.4로부터 얻을 수 있고 서열 13의 경쇄 가변 영역과 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99 % 동일한 핵산 서열 및 서열 14의 중쇄 가변 영역과 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99 % 동일한 핵산 서열을 가질 수 있다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 하이브리도마 HJ6.4로부터 얻을 수 있고 서열 15의 경쇄 가변 영역과 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99 % 동일한 아미노산 서열 또는 서열 16의 중쇄 가변 영역과 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99 % 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 각각의 위 실시태양에서 항체는 인간화할 수 있다.

항-apoE에 결합하는 본 발명의 항체의 예시적인 실시태양에서 항체는 서열 1의 경쇄 핵산 서열 및 서열 2의 중쇄 핵산 서열 [즉, 여기서 HJ6.1로 언급하는 단일 클론 항체]을 포함한다. 항-apoE에 결합하는 본 발명의 항체의 다른 예시적인 실시태양에서 항체는 서열 3의 경쇄 아미노산 서열 및 서열 4의 중쇄 아미노산 서열 [즉, 여기서 HJ6.1로 언급하는 단일 클론 항체]을 포함한다. 항-apoE에 결합하는 본 발명의 항체의 또 다른 예시적인 실시태양에서 항체는 서열 5의 경쇄 핵산 서열 및 서열 6의 중쇄 핵산 서열 [즉, 여기서 HJ6.2로 언급하는 단일 클론 항체]을 포함한다. 항-apoE에 결합하는 본 발명의 항체의 또 다른 예시적인 실시태양에서 항체는 서열 7의 경쇄 아미노산 서열 및 서열 8의 중쇄 아미노산 서열 [즉, 여기서 HJ6.2로 언급하는 단일 클론 항체]을 포함한다.

특정 실시태양에서, 본 발명의 항체는 서열 9의 경쇄 핵산 서열 및 서열 10의 중쇄 핵산 서열 [즉, 여기서 HJ6.3으로 언급하는 단일 클론 항체]에 의해 코딩한다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 서열 11의 경쇄 아미노산 서열 및 서열 12의 중쇄 아미노산 서열 [즉, 여기서 HJ6.3으로 언급하는 단일 클론 항체]에 의해 코딩한다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 서열 13의 경쇄 핵산 서열 및 서열 14의 중쇄 핵산 서열 [즉, 여기서 HJ6.4로 언급하는 단일 클론 항체]에 의해 코딩한다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 서열 15의 경쇄 아미노산 서열 및 서열 16의 중쇄 아미노산 서열 [즉, 여기서 HJ6.4로 언급하는 단일 클론 항체]에 의해 코딩한다.

한 실시태양에서, 본 발명의 항체는 표 A의 항체 1, 49, 97, 및 145와 같이 경쇄 CDR1을 포함할 수 있다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 표 A의 항체 4, 52, 100, 및 148과 같이 경쇄 CDR2를 포함할 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 표 A의 항체 6, 54, 102, 및 150과 같이 경쇄 CDR3를 포함할 수 있다. 대안의 실시태양에서, 본 발명의 항체는 표 A의 항체 2, 3, 5, 50, 51, 53, 98, 99, 101, 146, 147 및 149와 같이 둘 또는 세 개의 경쇄 CDR의 조합을 포함할 수 있다.

유사하게, 한 실시태양에서 본 발명의 항체는 표 A의 항체 7, 55, 103, 및 151과 같이 중쇄 CDR1을 포함할 수 있다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 표 A의 항체 10, 58, 106, 및 154와 같이 중쇄 CDR2를 포함할 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 표 A의 항체 12, 60, 108, 및 156과 같이 중쇄 CDR3를 포함할 수 있다. 대안의 실시태양에서, 본 발명의 항체는 표 A의 항체 8, 9, 11, 56, 57, 59, 104, 105, 107, 152, 153, 및 155와 같이 둘 또는 세 개의 중쇄 CDR의 조합을 포함할 수 있다.

대안으로서, 본 발명의 항체는 표 A의 항체 13-48, 61-96, 109-144, 및 157-192와 같이 하나 이상의 경쇄 CDR 및 하나 이상의 중쇄 CDR을 포함할 수 있다.

표 A

다양한 실시태양에서, 본 발명의 항체를 인간화한다. 예를 들어, 한 실시태양에서, 본 발명의 인간화 항체는 0 내지 2 개의 아미노산이 치환된 아미노산 서열, 서열 17의 CDR1, 0 내지 2 개의 아미노산이 치환된 아미노산 서열, 서열 18의 CDR2, 및 아미노산 서열 LSP의 CDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있고 또는 0 내지 2 개의 아미노산이 치환된 아미노산 서열, 서열 19의 CDR1, 0 내지 2 개의 아미노산이 치환된 아미노산 서열, 서열 20의 CDR2, 및 0 내지 2 개의 아미노산이 치환된 아미노산 서열, 서열 21의 CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 인간화 항체는 0 내지 2 개의 아미노산이 치환된 아미노산 서열, 서열 17의 CDR1, 0 내지 2 개의 아미노산이 치환된 아미노산 서열, 서열 18의 CDR2, 아미노산 서열 LSP의 CDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역, 0 내지 2 개의 아미노산이 치환된 아미노산 서열, 서열 19의 CDR1, 0 내지 2 개의 아미노산이 치환된 아미노산 서열, 서열 20의 CDR2, 및 0 내지 2 개의 아미노산이 치환된 아미노산 서열, 서열 21의 CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 예시적인 실시태양에서, 본 발명의 인간화 항체는 아미노산 서열, 서열 17의 CDR1, 아미노산 서열, 서열 18의 CDR2, 아미노산 서열 LSP의 CDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역, 아미노산 서열, 서열 19의 CDR1, 아미노산 서열, 서열 20의 CDR2, 및 아미노산 서열, 서열 21의 CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 서열 17, 18, 19, 20, 및 21의 상응하는 핵산 서열을 포괄하며 이는 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자가 쉽게 확인할 수 있고, 본 발명의 항체를 발현하기 위해 벡터 또는 염색체와 같은 다른 큰 DNA 분자에 혼입할 수 있다.

다른 실시태양에서, 본 발명의 인간화 항체는 0 내지 2 개의 아미노산이 치환된 아미노산 서열, 서열 22의 CDR1, 0 내지 2 개의 아미노산이 치환된 아미노산 서열, 서열 23의 CDR2, 및 0 내지 2 개의 아미노산이 치환된 아미노산 서열, 서열 24의 CDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있고 또는 0 내지 2 개의 아미노산이 치환된 아미노산 서열, 서열 25의 CDR1, 0 내지 2 개의 아미노산이 치환된 아미노산 서열, 서열 26의 CDR2, 및 0 내지 2 개의 아미노산이 치환된 아미노산 서열, 서열 27의 CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 인간화 항체는 0 내지 2 개의 아미노산이 치환된 아미노산 서열, 서열 22의 CDR1, 0 내지 2 개의 아미노산이 치환된 아미노산 서열, 서열 23의 CDR2, 0 내지 2 개의 아미노산이 치환된 아미노산 서열, 서열 24의 CDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 0 내지 2 개의 아미노산이 치환된 아미노산 서열, 서열 25의 CDR1, 0 내지 2 개의 아미노산이 치환된 아미노산 서열, 서열 26의 CDR2, 및 0 내지 2 개의 아미노산이 치환된 아미노산 서열, 서열 27의 CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 예시적인 실시태양에서, 본 발명의 인간화 항체는 아미노산 서열, 서열 22의 CDR1, 아미노산 서열, 서열 23의 CDR2, 아미노산 서열, 서열 24의 CDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역, 아미노산 서열, 서열 25의 CDR1, 아미노산 서열, 서열 26의 CDR2, 및 아미노산 서열, 서열 27의 CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 서열 22, 23, 24, 25, 26, 및 27의 상응하는 핵산 서열을 포괄하며 이는 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자가 쉽게 확인할 수 있고, 본 발명의 항체를 발현하기 위해 벡터 또는 염색체와 같은 다른 큰 DNA 분자에 혼입할 수 있다.

또 다른 실시태양에서, 본 발명의 인간화 항체는 0 내지 2 개의 아미노산이 치환된 서열 28의 아미노산 서열의 CDR1, 0 내지 2 개의 아미노산이 치환된 아미노산 서열, 서열 29의 CDR2, 및 0 내지 2 개의 아미노산이 치환된 아미노산 서열, 서열 30의 CDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있고 또는 0 내지 2 개의 아미노산이 치환된 아미노산 서열, 서열 31의 CDR1, 0 내지 2 개의 아미노산이 치환된 아미노산 서열, 서열 32의 CDR2, 및 0 내지 2 개의 아미노산이 치환된 아미노산 서열, 서열 33의 CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 인간화 항체는 0 내지 2 개의 아미노산이 치환된 서열 28의 아미노산 서열의 CDR1, 0 내지 2 개의 아미노산이 치환된 아미노산 서열, 서열 29의 CDR2, 0 내지 2 개의 아미노산이 치환된 아미노산 서열, 서열 30의 CDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 0 내지 2 개의 아미노산이 치환된 아미노산 서열, 서열 31의 CDR1, 0 내지 2 개의 아미노산이 치환된 아미노산 서열, 서열 32의 CDR2, 및 0 내지 2 개의 아미노산이 치환된 아미노산 서열, 서열 33의 CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 예시적인 실시태양에서, 본 발명의 인간화 항체는 서열 28의 아미노산 서열의 CDR1, 아미노산 서열, 서열 29의 CDR2, 아미노산 서열, 서열 30의 CDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역, 아미노산 서열, 서열 31의 CDR1, 아미노산 서열, 서열 32의 CDR2, 및 아미노산 서열, 서열 33의 CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 서열 28, 29, 30, 31, 32, 및 33의 상응하는 핵산 서열을 포괄하며 이는 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자가 쉽게 확인할 수 있고, 본 발명의 항체를 발현하기 위해 벡터 또는 염색체와 같은 다른 큰 DNA 분자에 혼입할 수 있다.

또 다른 실시태양에서, 본 발명의 인간화 항체는 0 내지 2 개의 아미노산이 치환된 아미노산 서열, 서열 34의 CDR1, 0 내지 2 개의 아미노산이 치환된 아미노산 서열, 서열 35의 CDR2, 0 내지 2 개의 아미노산이 치환된 아미노산 서열, 서열 36을 포함하는 CDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있고 또는 0 내지 2 개의 아미노산이 치환된 아미노산 서열, 서열 37을 포함하는 CDR1, 0 내지 2 개의 아미노산이 치환된 아미노산 서열, 서열 38을 포함하는 CDR2, 및 0 내지 2 개의 아미노산이 치환된 아미노산 서열, 서열 39를 포함하는 CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 인간화 항체는 0 내지 2 개의 아미노산이 치환된 아미노산 서열, 서열 34를 포함하는 CDR1, 0 내지 2 개의 아미노산이 치환된 아미노산 서열, 서열 35의 CDR2, 0 내지 2 개의 아미노산이 치환된 아미노산 서열, 서열 36을 포함하는 CDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역, 0 내지 2 개의 아미노산이 치환된 아미노산 서열, 서열 37을 포함하는 CDR1, 0 내지 2 개의 아미노산이 치환된 아미노산 서열, 서열 38을 포함하는 CDR2, 및 0 내지 2 개의 아미노산이 치환된 아미노산 서열, 서열 39를 포함하는 CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 예시적인 실시태양에서, 본 발명의 인간화 항체는 아미노산 서열, 서열 34를 포함하는 CDR1, 아미노산 서열, 서열 35를 포함하는 CDR2, 아미노산 서열, 서열 36을 포함하는 CDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역, 아미노산 서열, 서열 37을 포함하는 CDR1, 아미노산 서열, 서열 38을 포함하는 CDR2, 및 아미노산 서열, 서열 39를 포함하는 CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 서열 34, 35, 36, 37, 38, 및 39의 상응하는 핵산 서열을 포괄하며 이는 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자가 쉽게 확인할 수 있고, 본 발명의 항체를 발현하기 위해 벡터 또는 염색체와 같은 다른 큰 DNA 분자에 혼입할 수 있다.

한 측면에서, 면역적 반응성 단편을 포함하여 제약 등급의 바람직한 약리학적 유효량의 항체를 Aβ 플라크 관련 증상을 치료할 살아있는 대상자와 같은 대상자에게 투여한다. 투여는 표준의 효과적인 기술을 이용하여 수행하며 말초적으로 (즉, 중추 신경계로의 투여가 아님) 또는 중추 신경계에 국소적으로 하는 것을 포함한다. 말초 투여는 정맥내, 복강내, 피하, 폐, 경피, 근육내, 비강내, 협측, 설하, 또는 좌제 투여를 포함하나 이에 국한되지 않는다. 국소 투여는 직접 중추 신경계 (CNS)로 하는 것을 포함하여 요부, 심실내 또는 실질내 카테터를 통하는 것, 또는 외과적으로 이식한 제어 방출 제형을 이용하는 것을 포함하나 이에 국한되지 않는다.

효과적인 투여를 위한 제약 조성물은 선택된 투여 방식에 적절하도록 신중하게 고안하며 상용성 분산제, 완충제, 계면 활성제, 보존제, 가용화제, 등장화제, 안정화제 등과 같은 제약학상 허용되는 부형제를 적절하게 사용한다. 그 전체로서 여기에 참고문헌으로 삽입된 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton Pa., 16Ed ISBN: 0-912734-04-3, latest edition]은 전문가에게 보통 알려져 있는 제형 기술의 개요를 제시한다. 예를 들어 이를 리포좀에 캡슐화하거나 극성기를 차단함으로써 더 친유성으로 만들어서, 본 발견에서 유용한 항체의 용해도 특성을 바꾸는 것이 특히 유용할 수 있다.

정맥내 또는 복강내 또는 피하 주입에 의한 효과적인 말초 전신 전달은 살아있는 대상자에의 바람직한 투여 방법이다. 이러한 주입에 대한 적절한 비히클은 간단하다. 그러나, 또한, 투여는 비강 에어로졸 또는 좌제에 의해 점막을 통해 시행할 수 있다. 각각의 투여 방식에 대한 적절한 제형이 잘 알려져 있으며 통상적으로 교차막 수송 (cross-membrane transfer)을 촉진하는 계면활성제를 포함한다. 이러한 계면활성제는 종종 스테로이드로부터 얻거나 또는 N-[1-(2,3-디올레오일)프로필]-N,N,N-트리메틸 암모늄 클로라이드 (DOTMA)와 같은 양이온성 지질 또는 콜레스테롤 헤미숙시네이트, 포스파티딜 글리세롤 등과 같은 다양한 화합물이다.

투여할 제형 중의 인간화 항체의 농도는 유효량이며 약 0.1 중량% 만큼 낮은 것부터 약 15 또는 약 20 중량% 만큼 많은 것까지 이르고, 원한다면 선택된 특정 투여 방식에 따라 주로 유체 부피, 점성 등에 기초하여 선택할 것이다. 살아있는 대상자에의 주입을 위한 통상적인 조성물은 인산염 완충 염수의 1 mL의 멸균 완충수 및 본 발견의 인간화 항체 중 임의의 하나 또는 조합 약 1-1000 mg을 함유하도록 구성할 수 있다. 제형은 그 제형을 만든 후에 멸균 필터링 할 수 있거나 그렇지 않으면 미생물학적으로 허용되도록 만들 수 있다. 정맥내 주입의 통상적인 조성물은 멸균 링거액과 같은 유체의 1-250 mL 사이의 부피, 및 항-ApoE 항체 농도 1-100 mg/ml 또는 그 이상을 가질 수 있다. 본 발명의 치료제는 저장을 위해 냉동 또는 동결건조할 수 있고 사용에 앞서 적절한 멸균 담체에서 재구성할 수 있다. 동결건조 및 재구성은 다양한 정도의 항체 활성 손실에 이를 수 있다 (예를 들어, 통상의 면역 글로불린에서 IgM 항체는 IgG 항체보다 더 큰 활성 손실을 가지는 경향이 있다). 투여하는 투여량은 유효 투여량이며 보상하도록 조정해야 할 수 있다. 제형의 pH는 보통 제약 등급의 질이며 항체 (화학적 및 물리적) 안정도 균형을 맞추고 투여할 때 대상자가 편하도록 선택할 것이다. 보통, 4와 8 사이의 pH가 허용된다. 용량은 성공적 투여를 받는 개인의 크기, 무게, 및 다른 생리생물학적 특성에 기초하여 개인에 따라 다를 것이다.

여기서 사용할 때, "유효량"이라는 용어는 물질을 투여받는 대상자에 대한 주목할만하고 유리한 효과, 즉 상당한 효능에 이르는 화합물과 같은 물질의 양을 의미한다. 이 발견에 따라서 투여하는 화합물의 유효량 또는 용량은 투여하는 화합물, 투여 경로, 치료할 증상의 상태 및 다른 고려사항 중 유사 대상자 및 투여 상황 고려사항을 포함하여 사례를 둘러싸는 상황들에 의해 결정할 것이다. 한 측면에서, 통상의 용량은 약 0.01 mg/kg부터 약 100 mg/kg까지의 여기 기술한 항-ApoE 항체를 함유한다. 용량은 약 0.05 mg/kg 부터 약 50 mg/kg까지, 더욱 바람직하게는 약 0.1 mg/kg 부터 약 25 mg/kg까지 이를 수 있다. 용량의 빈도는 증상을 효과적으로 치료하는 데 필요한 만큼 매일, 또는 한 주에 또는 한 달에 한 번, 두 번, 세 번 또는 그 이상일 수 있다.

질병 그 자체에 관한 치료의 투여 시기 및 치료의 지속기간은 사례를 둘러싸는 상황에 의해 결정할 것이다. 치료는 응급 의료 인력에 의해 투여할 때처럼 상해 장소와 같은 곳에서 바로 시작할 수 있다. 치료는 병원 또는 의원 자체에서 또는 병원에서 퇴원한 이후나 외래 의원 진찰을 본 후 나중에 시작할 수 있다. 치료의 지속기간은 한 번을 기초로 투여하는 단일 용량부터 평생 동안의 치료까지 이를 수 있다.

앞서 말한 방법이 인간화 항체와 같은 단백질을 투여하는 데에 가장 편리하고 가장 적절하며 효과적인 것으로 보이지만, 여기서 적절한 제형이 사용된다면 적절히 맞추어 심실내 투여, 경피 투여, 및 경구 투여와 같은 다른 효과적인 투여 기술을 이용할 수 있다.

또한 생분해성 필름 및 매트릭스, 또는 삼투압 소형 펌프, 또는 덱스트란 층, 알기네이트 또는 콜라겐 기반의 전달계를 이용하여 제어 방출 제형을 이용하는 것이 바람직할 수 있다.

통상적인 투여량 레벨은 표준 임상 기술을 이용하여 결정하고 최적화할 수 있으며 투여 방법에 따를 것이다.

다음의 실시예는 본 발명의 바람직한 실시태양을 증명하고자 포함하였다. 다음의 실시예에서 개시하는 기술은 본 발명의 실시에서 잘 기능하도록 발명자가 발견한 기술을 대표한다는 것을 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자는 알아야 한다. 그러나 본 개시를 고려하여 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자는 개시된 특정 실시태양에서 많은 변형이 있을 수 있고 본 발명의 사상과 범위를 벗어나지 않고 여전히 비슷하거나 유사한 결과를 얻을 수 있으며 따라서 첨부한 실시예 및 도면에 개진하거나 나타낸 모든 문제는 제한하는 의미가 아닌 예시적인 것으로 해석하여야 한다는 것을 알아야 한다.

실시예 :

다음의 실시예는 본 발명의 다양한 반복을 묘사한다.

ApoE 단백질에 특이적인 항체는 아래 실시예 1 및 2에서 기술하듯이 하이브리도마 기술을 이용하여 만들었다. 특히, 4 개의 하이브리도마를 만들었고 ApoE 항체를 하이브리도마로부터 얻었다. 하이브리도마 HJ6.1, HJ6.2, HJ6.3, 및 HJ6.4는 각각 ATCC 특허 기탁 지정번호 PTA-11805, PTA-11806, PTA-11807 및 PTA-11808이 부여되어 있다.

실시예 1: 하이브리도마의 제조

우선, 염수에서 100 ㎕의 항원 펩티드 (ApoE, 1 mg/ml)를 동일한 부피의 완전 프로인트 보조액과 혼합하고, 유화하고 마우스 (Balb/c, 6주령)의 등에 접종하였다. 2주 후, 마우스를 50 ㎕의 항원 펩티드 (ApoE, 1 mg/ml)의 염수 용액 및 불완전 프로인트 보조액 혼합물로 재면역화시켰고 초음파 처리로 유화하였으며 그 이후 매주 추가적인 면역화를 수행하였다. 면역화 40 일 후에 비장을 제거하였고 적혈구 세포를 제거하기 위해 PRM1640 배지 (페니실린 및 스트렙토마이신으로 보충)에서 림프구를 수거하였으며 0.17 M 염화암모늄으로 처리하였다. 하이브리도마 세포를 얻기 위해 분리한 림프구를 폴리에틸렌 글리콜 방법 (PEG4000)에 의해 마우스 골수 종양으로부터 얻은 골수종 세포 P3U1 주와 융합하였다. 이에 따라 얻은 하이브리도마 세포를 배양보조세포가 있는 HAT 배지에 현탁하였고 이후 96-웰 플레이트에 분배하였으며 15 일 동안 배양하였다.

실시예 2: 단일 클론 항체 스크리닝

실시예 1에서 얻은 하이브리도마 세포를 배양한 웰로부터 배양 배지 상청액을 회수하였고 효소결합 면역 측정법 (ELISA) 방법에 의해 항원 펩티드와 반응하는 단일 클론 항체를 선택하였다.

우선, 100 ㎕의 10 ㎍/ml 항원 펩티드를 96-웰 플레이트의 각 웰에 가하였고 밤새 4 ℃로 유지한 후에 고체상으로 고정하였고 밤새 37 ℃에서 200 ㎕의 10 % 송아지 혈청으로 블로킹하였다. 이후, 100 ㎕의 하이브리도마 세포 배양 배지 상청액을 각 웰에 가하였고 37 ℃에서 2시간 동안 반응하였으며 이후 1000배로 희석한 호스래디시 퍼옥시다아제 (HRP)-결합 항-마우스 항체를 가하였고 37 ℃에서 1 시간 동안 반응하였다. 색은 기질로서 테트라 메틸 벤지딘 마이크로웰 퍼옥시다제 기질 (Tetra Methyl Benzidine Microwell Peroxidase Substrate, TMB)을 이용하여 발현하였다.

100 ㎕의 4N 황산을 가하여 반응을 종결시킨 후 450 내지 540 nm에서의 흡광도를 측정하였고 약 3의 흡광도를 보인 단일 클론 항체를 선택하였으며 제한된 희석 방법으로 클로닝하였다.

7 일과 3 일 전에 복강내로 0.5 ml 프리스틴 (pristine) 주입한 마우스 (Balb/c)에 선택한 단일 클론 항체-생산 하이브리도마 세포를 복강내 접종하였으며 약 10 일 후 복수를 수집하였다. 수집한 복수는 30 분 동안 실온에서, 밤새 4 ℃에서 보관하였으며 10 분 동안 15,000×rpm으로 원심분리하였고 이후 상청액을 회수하였다.

선택된 단일 클론 항체의 역가를 ELISA 법에 의해 측정하였다. ApoE를 마이크로웰 플레이트 상에 고정하였고 단일 클론 항체를 가하였으며 반응 후 호스래디시 퍼옥시다제 (HRP)-결합 항-마우스 항체 및 TMB를 이용하여 색을 발현하였다. 이 결과는 선택된 단일 클론 항체가 농도-의존 방식으로 반응하였다는 것을 나타낸다.

실시예 3: 항- ApoE 항체는 플라크 로드의 감소를 야기한다

알츠하이머병 대상자에서 관찰되는 것과 유사하게 연령과 관련된 아밀로이드 플라크 형성을 보이는 PS/APP 마우스를 알츠하이머병에 대한 마우스 모델로서 사용한다. PS/APP 마우스를 항-Aβ 항체 (HJ3.4) 또는 두 개의 항-ApoE 항체 (HJ6.2 또는 HJ6.3) 중 하나로 일주일에 한번 10 mg/kg 복강 투여 처리하였다. 다른 군을 대조군으로서 PBS로 처리하였다. 3-7 개월 연령으로부터 처리하였다. 해마 (도 1) 및 피질 (도 2) 모두에서 증명되듯이 Aβ 플라크 로드의 감소와 관련된 항-ApoE 항체의 강한 효과가 있었다.

실시예 4: 인간 apoE 에 항- ApoE 항체의 결합.

인간 apoE에 항-apoE HJ6.1, HJ6.2, HJ6.3 및 HJ6.4 항체의 결합을 측정하기 위해 ELISA 샌드위치 분석법을 이용하였다. 인간 apoE에 결합하는 단일 클론 항체 WUE4를 처음에 ELISA 플레이트 상에서 코팅하였다. 이후 인간 apoE4의 농도 변화를 적용하였다. 바이오티닐화 항-apoE 항체 HJ6.1, HJ6.2, HJ6.3, 및 HJ6.4를 마지막에 적용하였고 플레이트 리더 (plate reader)로부터 광학 밀도 (OD)를 읽었다 (도 3).

이러한 결과는 효력이 감소하는 ELISA 포맷에서 항-apoE 항체 HJ6.1, HJ6.2 및 HJ6.3이 인간 apoE에 결합한다는 것을 보여준다. 그러나, 항-apoE 항체 HJ6.4는 이 분석법에서 인간 apoE에 결합하지 않는다.

실시예 5: 항- apoE 항체가 혈장에서 인간 apoE 에 결합하나 혈장 콜레스테롤에 영향을 미치지 않는다.

이러한 실험에 있어서, 혈장 apoE/항체 복합체를 측정하기 위해 인간 ApoE4 노크인 마우스를 사용하였다. 500 마이크로그램의 바이오티닐화 HJ6 mAb를 ApoE4 노크인 마우스에 복강내 투여하였다. 24 시간 후, 혈장을 희석 (1:1000)하였고 5 ㎍/ml WUE4로 코팅된 ELISA 플레이트에 로딩하였으며 이것이 인간 apoE에 결합한다. ApoE/항체 복합체를 1:5000 희석 HRP40으로 검출하였다. 광학 밀도 (OD)를 플레이트 리더에서 읽었다 (도 4A). 이러한 결과는 HJ6.1, HJ6.2 및 HJ6.3 항체가 혈장에서 인간 apoE에 결합하는 반면 HJ6.4는 혈장에서 인간 apoE에 결합하지 않았다는 것을 보여준다. 이 실험을 apoE-/- 마우스에서 수행했을 때는 아무런 신호를 얻지 않았다.

총 혈장 콜레스테롤 역시 500 마이크로그램의 HJ6 시리즈 단일 클론 항체 HJ6.1, HJ6.2, HJ6.3 및 HJ6.4를 복강내 주입받은 동일한 apoE4+/+마우스에서 측정하였다. 인산염 완충 염수를 받은 동물에 대해 혈장 콜레스테롤은 변화하지 않았다 (도 4B).

실시예 6: 말초 투여 후에 중추 신경계 ( CNS )에서 발견되는 인간 apoE 에 대한 HJ6 시리즈 항체.

HJ6 시리즈 mAb 또는 PBS를 받은 ApoE4+/+ 또는 ApoE4-/- 마우스 (도 4 참고)의 뇌척수액 (CSF)을 희석하였고 (1:23) CSF 안의 apoE4/바이오티닐화 항체 복합체를 WUE4로 포획하였고 이후 HRP40으로 검출하였다. 결과는 CSF에 apoE4와 항-apoE 항체 HJ6.1B, HJ6.2B 또는 HJ6.3B의 복합체가 있다는 것을 증명하며 (도 5), apoE mAb의 분획이 CNS 구획에 들어가서 apoE에 결합할 수 있었다는 것을 제시한다. OD₆₅₀ 은 HJ6.1B>HJ6.2B=HJ6.3B>>>HJ6.4B의 순서를 따랐으며, 이는 이러한 항체가 ELISA 플레이트에서 (도 3) 그리고 혈장에서 (도 4) apoE에 결합하는 능력에 대해 보이는 패턴과 일치한다.

실시예 7: HJ6 시리즈 항체를 투여한 마우스에서의 소교세포 활성화.

PBS에서 희석된 10 mg/kg의 HJ6.2, HJ6.3 및 HJ3.4 항체 또는 동일한 부피의 PBS를 시점 0, 3일, 6일, 및 9일에 복강내로 PSAPP 마우스에 주입하였다. 10일에, 뇌를 제거하였고, 고정하였고 그리고 활성화된 소교세포를 표시하는 항체 CD45로 염색하였다. HJ6.3 및 HJ3.4를 주입한 마우스에서 활성화된 소교세포로 덮인 피질 양의 증가가 있었다. 이 실험에서 PSAPP 마우스는 마우스 apoE를 나타낸다. 이러한 결과는 이미 10 일에 걸쳐 아밀로이드 플라크를 가지는 6 개월 된 PSAPP 마우스에 HJ6.3 (항-apoE 항체) 및 HJ3.4 (항-Aβ 항체)를 단기 투여하는 것이 소교세포 활성화를 일으키는 반면, 한 항-apoE 항체 (HJ6.2)는 이러한 효과를 나타내지 않는다는 것을 보여준다 (도 6).

SEQUENCE LISTING <110> THE WASHINGTON UNIVERSITY HOLTZMAN, David KIM, Jungsu JIANG, Hong ELTORAI, Adam <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING AMYLOID PLAQUE ASSOCIATED SYMPTOMS <130> 047563-434951 <150> US 61/419,060 <151> 2010-12-02 <150> US 61/548,542 <151> 2011-10-18 <160> 39 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 687 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> based on mus musculus <400> 1 atggagtcag acacactcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ctccactggt 60 gacattgtgc tcacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagagccacc 120 atctcctgca gagccagtga aagtgttgaa tattatggca caagtttaat gcagtggtac 180 caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ctgcatccaa cgtagaatct 240 ggggtccctg ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcagcct caacatccat 300 cctgtggagg aggatgatat tgcaatgtat ttctgtcagc aaagtaggaa ggttccgtgg 360 acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc 420 atcttcccac catccagtga gcagttaaca tctggaggtg cctcagtcgt gtgcttcttg 480 aacaacttct accccaaaga catcaatgtc 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Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly 165 170 175 Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser 180 185 190 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp 195 200 205 Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr 210 215 220 Ser Thr Ser Pro Ile 225 <210> 4 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> based on mus musculus <400> 4 Met Ser Ser Pro Gln Thr Leu Asn Thr Leu Thr Leu Thr Met Gly Trp 1 5 10 15 Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Glu Thr Ala Gly Val Leu Ser 20 25 30 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 35 40 45 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 50 55 60 Asn Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 65 70 75 80 Gly Tyr Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 85 90 95 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asn Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 100 105 110 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 115 120 125 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Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro 130 135 140 Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe 145 150 155 160 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp 165 170 175 Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp 180 185 190 Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys 195 200 205 Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys 210 215 220 Thr Ser Thr Ser Pro Ile 225 230 <210> 8 <211> 223 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> based on mus musculus <400> 8 Met Asp Trp Val Trp Thr Leu Leu Phe Leu Ile Ala Ala Ala Gln Ser 1 5 10 15 Ala Gln Ala Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Glu Tyr Pro Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Asp Phe 50 55 60 Lys Trp Met Gly Met Ile Tyr Thr Asp Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala 65 70 75 80 Glu Glu Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Asn 85 90 95 Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr 100 105 110 Tyr Phe Cys Val Gly Gly Tyr Leu Phe Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro 130 135 140 Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly 145 150 155 160 Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn 165 170 175 Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 180 185 190 Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr 195 200 205 Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser 210 215 220 <210> 9 <211> 681 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> based on mus musculus <400> 9 atggacatga ggacccctgc tcagtttctt ggaatcttgt tgctctggtt tccaggtatc 60 aaatgtgaca tcaaactgac ccagtctcca tcttccatgt atgcatctct aggagagaga 120 gtcactatca cttgcaaggc gagtgaggac attaatagct atttaagctg gttccagcag 180 aaaccaggga aatctcctaa gaccctgatc tatcgtgcaa acagattggt agatggggtc 240 ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg caagattatt ctctcaccat cagcagcctg 300 gagtatgaag atatgggaat ttattattgt ctacagtatg atgagtttcc tctcacgttc 360 ggtgctggga ccaagctgga gctgacacgg gctgatgctg caccaactgt atccatcttc 420 ccaccatcca gtgagcagtt aacatctgga ggtgcctcag tcgtgtgctt cttgaacaac 480 ttctacccca aagacatcaa tgtcaagtgg aagattgatg gcagtgaacg acaaaatggc 540 gtcctgaaca gttggactga tcaggacagc aaagacagca cctacagcat gagcagcacc 600 ctcacgttga ccaaggacga gtatgaacga cataacagct atacctgtga ggccactcac 660 aagacatcaa cttcacccat t 681 <210> 10 <211> 398 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> based on mus musculus <400> 10 atggcagcag ctcaaagtat ccaagcacag atccagttgg tgcagtctgg acctgagctg 60 aagaagcctg gagagacagt caagatctcc tgcaaggctt ctgggtatac cttcacaact 120 gctggaatgc agtgggtgca aaagatgcca ggaaagggtt ttaagtggat tggctggata 180 aacacccact ctggagagcc aaaatatgca gaagatttca agggacggtt tgccttctct 240 ttggaaacct ctgccagcac tgcctattta cagataagca acctcaaaaa tgaggacacg 300 gctacgtatt tctgtgcgag aatgggaggc tatgctatgg actactgggg tcaaggaacc 360 tcagtcaccg tctcctctgc caaaacaaca cccccatc 398 <210> 11 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> based on mus musculus <400> 11 Met Asp Met Arg Thr Pro Ala Gln Phe Leu Gly Ile Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Phe Pro Gly Ile Lys Cys Asp Ile Lys Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 Met Tyr Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser 35 40 45 Glu Asp Ile Asn Ser Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys 50 55 60 Ser Pro Lys Thr Leu Ile Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Ser Leu Glu Tyr Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln 100 105 110 Tyr Asp Glu Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 115 120 125 Thr Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser 130 135 140 Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn 145 150 155 160 Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu 165 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<213> Artificial Sequence <220> <223> based on mus musculus <400> 13 atggaatcac agactcaggt cttcctctcc ctgctgctct gggtatctgg tacctgtggg 60 aacattatga tgacacagtc gccatcatct ctggctgtgt ctgcaggaga aaaggtcact 120 atgagctgta agtccagtca aagtgtttta tacagttcaa atcagaagaa ctacttggcc 180 tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tctactgggc atccactagg 240 gaatctggtg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt tactcttacc 300 atcaccaatg tacaagctga agacctggca gtttattact gtcatcaata cctctcctcg 360 tacacgttcg gaggggggac caagttggaa ataaaacggg ctgatgctgc accaactgta 420 tccatcttcc caccatccag tgagcagtta acatctggag gtgcctcagt cgtgtgcttc 480 ttgaacaact tctaccccaa agacatcaat gtcaagtgga agattgatgg cagtgaacga 540 caaaatggcg tcctgaacag ttggactgat caggacagca aagacagcac ctacagcatg 600 agcagcaccc tcacgttgac caaggacgag tatgaacgac ataacagcta tacctgtgag 660 gccactcaca agacatcaac ttcacccatt 690 <210> 14 <211> 670 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> based on mus musculus <400> 14 atggattggg tgtggacctt gctattcctg atagcagctg cccaaagtgc ccaagcacag 60 atccagttgg tgcagtctgg acctgagctg aagaagcctg gagagacagt caagatctcc 120 tgcaaggctt ctgggtatac cttcacagaa tatccaatgc actgggtgaa gcaggctcca 180 ggaaagggtt tcaagtggat gggcatgata tacaccgaca ctggagagcc aacatatgtt 240 gaagagttca agggacggtt tgccttctct ttggagacct ctgccagcac tgcctatttg 300 cagatcaaca acctcaaaaa tgaggacacg gctacatatt tctgtgtagg tggttacttg 360 ttttcttact ggggccaagg gactctggtc actgtctctg cagccaaaac gacaccccca 420 tctgtctatc cactggcccc tggatctgct gcccaaacta actccatggt gaccctggga 480 tgcctggtca agggctattt ccctgagcca gtgacagtga cctggaactc tggatccctg 540 tccagcggtg tgcacacctt cccagctgtc ctgcagtctg acctctacac tctgagcagc 600 tcagtgactg tcccctccag cacctggccc agccagaccg tcacctgcaa cgttgcccac 660 ccggccagca 670 <210> 15 <211> 230 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> based on mus musculus <400> 15 Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Phe Leu Ser Leu Leu Leu Trp Val Ser 1 5 10 15 Gly Thr Cys Gly Asn Ile Met Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala 20 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<220> <223> based on mus musculus <400> 16 Met Asp Trp Val Trp Thr Leu Leu Phe Leu Ile Ala Ala Ala Gln Ser 1 5 10 15 Ala Gln Ala Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Glu Tyr Pro Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Phe 50 55 60 Lys Trp Met Gly Met Ile Tyr Thr Asp Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Val 65 70 75 80 Glu Glu Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr 100 105 110 Tyr Phe Cys Val Gly Gly Tyr Leu Phe Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro 130 135 140 Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly 145 150 155 160 Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn 165 170 175 Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 180 185 190 Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser 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17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> based on mus musculus <400> 23 Met Ile Tyr Thr Asp Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 24 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> based on mus musculus <400> 24 Gly Tyr Leu Phe Ser Tyr 1 5 <210> 25 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> based on mus musculus <400> 25 Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 26 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> based on mus musculus <400> 26 Trp Ala Ser Ala Arg Lys Ser 1 5 <210> 27 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> based on mus musculus <400> 27 His Gln Tyr Leu Ser Ser Tyr Thr 1 5 <210> 28 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> based on mus musculus <400> 28 Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Ala Gly Met Gln 1 5 10 <210> 29 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> based on mus musculus <400> 29 Trp Ile Asn Thr His Ser Gly Glu Pro Lys Tyr Ala Glu Asp Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 30 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> based on mus musculus <400> 30 Met Gly Gly Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 <210> 31 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> based on mus musculus <400> 31 Lys Ala Ser Glu Asp Ile Asn Ser Tyr Leu Ser 1 5 10 <210> 32 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> based on mus musculus <400> 32 Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp 1 5 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> based on mus musculus <400> 33 Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Leu Thr 1 5 <210> 34 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> based on mus musculus <400> 34 Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Pro Met His 1 5 10 <210> 35 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> based on mus musculus <400> 35 Met Ile Tyr Thr Asp Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Val Glu Glu Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 36 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> based on mus musculus <400> 36 Gly Tyr Leu Phe Ser Tyr 1 5 <210> 37 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> based on mus musculus <400> 37 Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 38 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> based on mus musculus <400> 38 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 39 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> based on mus musculus <400> 39 His Gln Tyr Leu Ser Ser Tyr Thr 1 5

Claims

항체가 특이적으로 ApoE에 결합하고 HJ6.1 (ATCC 특허 기탁 지정번호 PT-11805), HJ6.2 (ATCC 특허 기탁 지정번호 PT-11806), HJ6.3 (ATCC 특허 기탁 지정번호 PT-11807), 및 HJ6.4 (ATCC 특허 기탁 지정번호 PT-11808)로 이루어진 군으로부터 선택된 하이브리도마로부터 얻은 것인, 단리된 항체.
제1항에 있어서, 항체가 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12, 서열 14 및 서열 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 단리된 항체.
제1항에 있어서, 항체가 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9, 서열 11, 서열 13, 및 서열 15로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 핵산 서열로 코딩되는 것인, 단리된 항체.
제1항에 있어서, 항체가 단일 사슬 항체, 항체 단편, 키메라 항체, 또는 인간화 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 단리된 항체.
항체가 특이적으로 ApoE에 결합하고 0 내지 2 개의 아미노산이 치환된 서열 21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 것인, 단리된 항체.
항체가 특이적으로 ApoE에 결합하고 0 내지 2 개의 아미노산이 치환된 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 것인, 단리된 항체.
항체가 특이적으로 ApoE에 결합하고 0 내지 2 개의 아미노산이 치환된 서열 33의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3를 포함하는 것인, 단리된 항체.
대상자에게 유효량의 하나 이상의 항-ApoE 항체를 투여하는 것을 포함하는, 대상자에서 Aβ 플라크 관련 증상의 하나 이상의 증상 또는 징후를 치료하는 방법.
제8항에 있어서, 치료가 대상자에서 Aβ 플라크 관련 증상의 하나 이상의 증상 또는 징후를 예방, 약화, 역전 또는 개선하는 것을 포함하는 것인 방법.
제8항에 있어서, Aβ 플라크 관련 증상의 증상 또는 징후가 손상된 인지 기능, 행동 변화, 이상 언어 기능, 감정 조절 곤란, 발작, 손상된 신경계 구조 또는 기능, 및 알츠하이머병 또는 대뇌 아밀로이드 혈관 병증의 발병 위험성 증가를 포함하는 것인 방법.
제8항에 있어서, 항-ApoE 항체가 ApoE 코딩 서열 내의 에피토프에 결합하는 것인 방법.
제8항에 있어서, 투여가 효과적인 전신 투여 경로를 포함하는 것인 방법.
제8항에 있어서, 투여가 중추 신경계 내로 직접 하는 것을 포함하여 효과적인 국소 투여 경로를 포함하는 것인 방법.
대상자에게 유효량의 하나 이상의 항-ApoE 항체를 투여하는 것을 포함하는, 그 대상자의 뇌에서 아밀로이드 플라크 로드를 감소시키는 방법.
제14항에 있어서, 항-ApoE 항체가 ApoE 코딩 서열 내의 에피토프에 결합하는 것인 방법.
제14항에 있어서, 투여가 효과적인 전신 투여 경로를 포함하는 것인 방법.
제14항에 있어서, 투여가 중추 신경계 내로 직접 하는 것을 포함하여 효과적인 국소 투여 방법을 포함하는 것인 방법.
제14항에 있어서, 해마에서 아밀로이드 플라크 로드가 감소하는 것인 방법.
제14항에 있어서, 피질에서 아밀로이드 플라크 로드가 감소하는 것인 방법.