JP6491600B2 - アルカリ水溶液を用いた多孔質セルロースビーズの製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、第１の態様において、多孔質セルロースビーズの製造方法に関し、より具体的には、液−液分散を利用した、多孔質セルロースビーズ製造方法に関する。また本発明は、第２の態様において、多糖類多孔質ビーズからなるリガンド固定化用担体およびそれを用いた吸着体に関する。

（１）多孔質セルロースビーズ（第１の態様）に関して
セルロースは酸、塩基性溶媒に耐性があり、修飾することで様々な置換基を付加させることができる。そのためセルロース多孔質ビーズは、様々な物質の吸着体として利用されている（特許文献１、２）。

セルロースを溶解できる溶媒はほとんどなく、一般的にはチオシアン酸カルシウムなど毒性が高い溶媒に溶解し、セルロース多孔質粒子を製造している。しかしながら、このような製造方法によってセルロース多孔質ビーズを製造するには、腐食性や安全性の面で、取扱いが困難であり、設備化が容易ではないのが現状である。

一方で、近年、不揮発性かつ広い温度域で液体となる特徴を持つイオン液体が注目されている。イオン液体は主に、機能性溶媒やイオニクスデバイス、ポリペプチドなど生体由来材料の溶媒として適用されている。近年、このイオン液体は、セルロースも溶解することがわかり、繊維の製造などに適用されている（特許文献３）。しかし、イオン液体は高価であり、セルロースを安価な方法で成形することは容易ではない。

このような状況のもと、安価、かつ簡易な方法でセルロースビーズを成形する方法（特許文献４）が報告されている。しかしながら特許文献４にはセルロースビーズの細孔径、粒子径等について、具体的な制御方法については記載がない。そのため、様々な物質の吸着体等として利用するためには、さらなる改良が必要である。

（１）リガンド固定化用担体（第２の態様）に関して
上述した様に多孔質セルロースビーズは、その製造方法について改善の余地がある。さらに、こういった多孔質セルロースビーズを含む多糖類多孔質ビーズは、それを用いてリガンド固定化用担体にする際にも解決課題を有する。すなわち、多糖類多孔質ビーズはリガンド固定化用担体として有用であり、例えば、非特許文献１は、多孔質セルロースビーズ担体にアフィニティリガンドを固定化して吸着体として使用することを教示する。この様なリガンドを固定した多糖類多孔質ビーズは、一般にカラムに充填され、このカラムに処理対象を通液することで対象物が吸着される。しかし、リガンド固定化用担体の強度が低いと、送液圧力によって担体の圧密化が生じたり、圧損が大きくなるなどの不具合が生じる。特に処理スケールの大型化や高線速化が進むほど、作用圧が増大するため、リガンド固定化用担体の高強度化が強く求められる。

リガンド固定化用担体の強度を高める方法として、多糖類多孔質ビーズを架橋する方法が知られている。例えば、特許文献５では、セルロース系ビーズ担体を架橋することで強度を高めており、特許文献６ではアガロース系ビーズ担体を架橋することで強度を高めている。

しかし、言うまでもなく、リガンド固定化用担体は、強度のみならずリガンドを固定化した時の吸着量も良好であることが望ましい。

特開平１−２７８５３４号公報 特開平１１−１５８２０２号公報 特開２００８−２４８４６６号公報 国際公開ＷＯ２０１２−１２１２５８号 特開２００８−２７９３６６号公報 特表２０００−５０８３６１号公報

"アフィニティクロマトグラフィー"、笠井献一ら著、東京化学同人、１９９１年

本発明の目的は、その第１の態様（多孔質セルロースビーズの改善）の場合、様々な物質の吸着体として利用可能な多孔質のセルロースビーズをチオシアン酸カルシウムなどの毒性が高い溶媒を使わず、安全かつ簡便に製造し、セルロースビーズのビーズ特性を制御する方法を提供することである。

本発明の目的は、その第２の態様（リガンド固定化用担体の改善）の場合、多糖類多孔質ビーズをリガンド固定化用の担体として使用する時に、強度を高めるだけでなく、リガンドによる吸着量も維持・改善することにある。

１．第１の態様（多孔質セルロースビーズの改善）の場合
本発明者らは、第１の態様（多孔質セルロースビーズの改善）について前記課題に基づき鋭意検討を行った結果、下記発明（１）のようにすると上記課題が解決することを見出し、第１態様（多孔質セルロースビーズの改善）に関する発明を完成させるに至った。好ましくは下記発明（２）以降であってもよい。
（１）ａ）低温のアルカリ水溶液とセルロースとを混合して作製したセルロース微分散液に、ｂ）水を加えてセルローススラリーとした後、ｄ）凝固溶媒に接触させることを特徴とする、多孔質セルロースビーズの製造方法。
（２）前記ｂ）工程の後、ｃ）セルローススラリーを昇温し、その後、前記ｄ）工程を行う前記（１）記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。

（３）前記セルロース微分散液のアルカリ濃度が８ｗｔ％以上１０ｗｔ％以下である、前記（１）または（２）記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。

（４）セルローススラリーのアルカリ濃度が５ｗｔ％以上である、前記（１）〜（３）のいずれかに記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。

（５）セルローススラリーを作製する温度が４℃以上２０℃以下である、前記（１）〜（４）のいずれかに記載のセルロース多孔質ビーズの製造方法。

（６）前記セルローススラリーを分散媒である非水溶性液体に液―液分散し液滴を作製した後、該液―液分散液を凝固溶媒に接触させることを特徴とする、前記（１）〜（５）のいずれかに記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。

（７）前記セルローススラリーのセルロースの濃度が１〜７ｗｔ％であることを特徴とする、前記（１）〜（６）のいずれかに記載のセルロースビーズの製造方法。

（８）前記セルロースが再生セルロース、結晶性セルロース、微結晶性セルロース、または酢酸セルロースであることを特徴とする、前記（１）〜（７）のいずれかに記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。

（９）前記セルロースの重合度が１０００以下であることを特徴とする、前記（８）に記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。

（１０）前記非水溶性液体がジクロロベンゼン、ヘキサン、酢酸エチル、炭素数６〜１２の直鎖状飽和脂肪酸、炭素数１６〜２４の不飽和脂肪酸、融点が１００℃以下の動植物油脂類、水素添加動植物油、動植物油脂類やその水素添加物の高融点画分を分別精製した分別油、飽和脂肪酸トリグリセリド類、食用ワックス類、微細藻類由来油脂類、微生物油脂類、中鎖脂肪酸トリグリセリド類、または不飽和脂肪酸トリグリセリド類であることを特徴とする、前記（１）〜（９）のいずれかに記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。

（１１）前記凝固溶媒がアルコール類またはグリコール類を含有することを特徴とする、前記（１）〜（９）のいずれかに記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。

（１２）前記アルコール類がイソブタノール、２−ブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、２−メチル−２−プロパノール（すなわちｔｅｒｔ−ブタノール）、１−プロパノール、２−プロパノール、エタノール、メタノールからなる群より選択される１種以上であることを特徴とする、前記（１１）に記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。

（１３）前記グリコール類がグリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコールからなる群より選択される１種以上であることを特徴とする、前記（１１）に記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。

（１４）排除限界分子量が１．０×１０⁶〜１．０×１０¹¹であることを特徴とする前記（１）〜（１３）のいずれかに記載の製造方法で得られた多孔質セルロースビーズ。

（１５）メジアン粒子径が５０μｍから１００μｍであることを特徴とする前記（１４）に記載の多孔質セルロースビーズ。

２．第２の態様（リガンド固定化用担体の改善）の場合
また本発明者らは、前記第２態様の課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、特定の強度向上手段が、担体の強度のみならず、意外なことにリガンドによる吸着量をも維持・改善することを知見した。具体的には、多糖類多孔質ビーズを収縮処理すると、圧縮強度が向上し、それによって圧密化や圧損を防止できるだけでなく、リガンドを固定化した場合の吸着量も維持・改善されること、好ましくは改善されることを見出し、第２態様（リガンド固定化様担体の改善）に関する発明も完成した。

すなわち、第２態様（リガンド固定化様担体の改善）に関する発明は、以下の通りである。
（１６）多糖類多孔質ビーズを下記式によって定まる収縮率で１０％以上収縮させ、架橋することによって得られるリガンド固定化用担体。
収縮率（％）＝（１−Ｖ₂／Ｖ₁）×１００
（式中、Ｖ₁は収縮前の多糖類多孔質ビーズのゲル体積を示し、Ｖ₂は収縮後の多糖類多孔質ビーズのゲル体積を示す。）
（１７）多糖類多孔質ビーズを水溶性有機溶媒、およびアルカリ水と接触させる架橋工程を経て製造される前記（１６）に記載のリガンド固定化用担体。
（１８）前記収縮工程で架橋剤を共存させ、収縮させつつ架橋することによって製造される、或いは
前記収縮工程後、得られた収縮ビーズを架橋する架橋工程を実施することよって製造される前記（１７）に記載のリガンド固定化用担体。
（１９）前記架橋工程によって得られるビーズに対して、該ビーズを架橋剤およびアルカリ水と接触させる追加架橋工程を１回以上実施する前記（１８）に記載のリガンド固定化用担体。
（２０）前記多糖類がセルロースまたはアガロースである前記（１６）〜（１９）のいずれかに記載のリガンド固定化用担体。
（２１）前記水溶性有機溶媒が、アルコール溶媒、スルホキシド溶媒、アミド溶媒、ケトン溶媒、およびエーテル溶媒から選択される少なくとも１種である前記（１７）〜（２０）のいずれかに記載のリガンド固定化用担体。
（２２）追加架橋工程でアルコール溶媒を用いない前記（１９）〜（２１）のいずれかに記載のリガンド固定化用担体。
（２３）前記（１６）〜（２２）のいずれかに記載の担体にリガンドを固定化した吸着体。
（２４）前記リガンドがアフィニティリガンドである前記（２３）に記載の吸着体。
（２５）前記アフィニティリガンドが、プロテインＡ、プロテインＧ、またはプロテインＬである前記（２４）に記載の吸着体。
（２６）アフィニティクロマトグラフィーによる抗体の精製方法であって、前記（２４）又は（２５）に記載の吸着体に、供給原料を接触させて抗体を吸着させ、吸着体に吸着した抗体を適宜洗浄する段階、吸着体から抗体を遊離させる溶出液を添加し、溶出液から抗体を回収する段階を含んでなる方法。

なお本明細書で並列列挙される具体例は、特に断りが無い限り、１種以上を適宜組み合わせて使用できる。

１．第１の態様（多孔質セルロースビーズの改善）の場合
第１態様に関する本発明の製造方法によれば、溶液温度、水酸化ナトリウム濃度を変更することにより、セルロースビーズの粒子径、内部構造を変化させることが可能であり、様々な物質の吸着体として利用可能な多孔質セルロースビーズを提供することが可能となる。

２．第２の態様（リガンド固定化用担体の改善）の場合
第２態様に関する本発明では、多糖類多孔質ビーズを架橋するだけでなく、所定量以上収縮させているため、圧縮強度を向上できる。このようにして圧縮強度を向上させた多糖類多孔質ビーズを担体としてリガンドを固定させると、強度のみならず、吸着量も維持・改善、好ましくは改善できる。

図１は、第１態様に関する実施例１により得られた本発明（第１態様）のセルロースビーズのＳＥＭ写真である。 図２は、第１態様に関する比較例１により得られたセルロースのＳＥＭ写真である。 図３は、第１態様に関する実施例１から実施例４より得られたセルロースビーズの粒子径分布である。 図４は、第１態様に関する実施例１から実施例４より得られたセルロースビーズのＫ_av値である。 図５は第２態様に関する図であり、収縮架橋工程における収縮率と収縮架橋したビーズの２０％圧縮応力との関係を示すグラフである。

以下、多孔質セルロースビーズの改善（第１の態様）、リガンド固定化用担体の改善（第２態様）の順に本発明を説明する。
１．多孔質セルロースビーズの改善（第１の態様）
（１）セルロース微分散液
本発明（第１の態様）の製造方法では、セルロースをまず、アルカリ水溶液と混合して低温のセルロース微分散液にする。低温に保持することが、優れた多孔質セルロースビーズの製造に貢献する。この微分散液調製工程では、例えば、アルカリ濃度１０ｗｔ％以下、７．５ｗｔ％以上（好ましくは、８ｗｔ％以上、特に９〜８ｗｔ％）、温度−５〜１０℃程度（好ましくは０℃〜４℃）のアルカリ水溶液に微分散させる。或いはアルカリ水溶液と混合して、混合液（微分散液）のアルカリ濃度及び温度を、例えば、前記範囲にする。アルカリ水溶液には水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液が挙げられる。

セルロース微分散液におけるセルロースの濃度は、例えば、５．５ｗｔ％以上であり、８ｗｔ％以上であってもよい。またセルロース濃度の上限は、例えば、２０ｗｔ％以下、好ましくは１０ｗｔ％以下である。

前記セルロースとしては、種々のセルロースが使用でき、例えば、再生セルロース、結晶性セルロース、微結晶性セルロース、酢酸セルロースのいずれであってもよい。
またセルロースの重合度は、例えば、１０００以下、好ましくは５００以下、さらに好ましくは３００以下である。重合度の下限は、例えば、１０以上、好ましくは１００以上、さらに好ましくは２００以上である。

また前記セルロースのメジアン粒子径は、例えば、１０μｍ以上、好ましくは２０μｍ以上、４５μｍ以上であり、その上限は、例えば、５００μｍ以下、さらに好ましくは３００μｍ以下、より好ましくは２００μｍ以下である。

（２）セルローススラリー
アルカリ水溶液にセルロースを微分散させた後、水を添加し、スラリー温度を上昇させることが好ましい。この昇温工程は必須ではなく、温度を変更することなく水を添加してセルローススラリーを調製してもよいが、いずれにしても水添加して微分散液をスラリーにすると、優れた多孔質セルロースビーズが製造される。
セルローススラリーのアルカリ濃度は、例えば、３ｗｔ％以上であり、５ｗｔ％以上、９ｗｔ％以下が好ましく、更に好ましくは５ｗｔ％以上、８ｗｔ％以下（特に７ｗｔ％以下）である。本発明において、アルカリ濃度を低くするほどビーズ粒子径を小さくすることが出来るが、アルカリ濃度が５ｗｔ％以下（特に３ｗｔ％未満）になるとセルロースが微分散しなくなる。
セルローススラリーのセルロースの濃度は、例えば、１ｗｔ％以上、好ましくは２ｗｔ％以上であり、その上限は、例えば、７ｗｔ％以下、好ましくは５．４ｗｔ％以下である。
セルローススラリーにおいて、微分散液から存在する水の量（初期水量）と、添加される水の量（加水量）との質量比は、例えば、９５：５〜３０：７０、好ましくは９０：１０〜４０：６０である。
またセルローススラリー温度は、高くするほどビーズの粒子径を小さくすることが可能であり、高くするほどビーズの細孔径を大きくすることが可能である。具体的温度範囲として、セルローススラリーの温度は４℃以上２５℃以下が好ましく、更に好ましくは４℃以上２０℃以下である。セルローススラリーの温度が上限以上となるとセルロースが微分散しなくなる。
微分散液を昇温してスラリーにする場合、スラリーと微分散液の温度差は、例えば、１℃以上、好ましくは５℃以上、さらに好ましくは１０℃以上であり、その上限は、例えば、３０℃以下、好ましくは２５℃以下、さらに好ましくは２０℃以下である。

（３）液滴作製工程
上記の様にして得られるセルローススラリーは、その後、凝固液に接触させることで多孔質セルロースビーズにすることが可能であるが、必要に応じて、凝固液に接触させる前にセルローススラリーをセルロースを含有する液滴（水相）を他の液（油相）に分散した液滴を調製してもよい。液滴を形成してからセルロースを凝固することによって、多孔質セルロースビーズの特性がさらに改善される。この液滴作製工程では、セルロース多孔質ビーズを形成させるために、非水溶性を示す液体にセルローススラリーを分散させ、非水溶性液体中にセルロース液滴を形成させる。
前記非水溶性液体としては、ジクロロベンゼンなどのハロゲン化炭化水素類、ヘキサンなどの脂肪族炭化水素類、酢酸エチルなどのエステル類（特に酢酸エステル類）、炭素数６〜１２の直鎖状飽和脂肪酸、炭素数１６〜２４の不飽和脂肪酸、融点が１００℃以下の動植物油脂類、水素添加動植物油、動植物油脂類やその水素添加物の高融点画分を分別精製した分別油、飽和脂肪酸トリグリセリド類、食用ワックス類、微細藻類由来油脂類、微生物油脂類、中鎖脂肪酸トリグリセリド類、不飽和脂肪酸トリグリセリド類などが挙げられる。これら非水溶性液体は、単独で又は２種以上組み合わせて使用できる。好ましい非水溶性液体は、ハロゲン化炭化水素類、脂肪族炭化水素類、エステル類など、特にハロゲン化炭化水素類である。
非水溶性液体の量は、セルローススラリーの液滴相を分散可能である限り特に限定されないが、例えば、セルローススラリー１００質量部に対して、５０質量部以上、好ましくは１００質量部以上、より好ましくは２００質量部以上であり、その上限は、例えば、５０００質量部以下、好ましくは２０００質量部以下、より好ましくは１０００質量部以下である。
前記液滴作製時には、必要に応じて、界面活性剤を使用してもよい。界面活性剤を使用することによって、セルローススラリーの液滴相を安定して形成できる。界面活性剤としては、ノニオン系界面活性剤が好ましく、特にソルビタンラウレート、ソルビタンステアレート、ソルビタンオレエート、ソルビタントリオレエートなどのソルビタン脂肪酸エステルが例示できる。これら界面活性剤は、単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせてもよい。界面活性剤の量は特に限定されず、例えば、セルロース１００質量部に対して、１０質量部以上、好ましくは３０質量部以上、さらに好ましくは５０質量部以上であり、その上限は、例えば、１０００質量部以下、好ましくは３００質量部以下、より好ましくは２００質量部以下である。
前記界面活性剤は、例えば、これを非水溶性液体に加えて混合液にした後、この混合液をセルローススラリーと接触させてもよい。
セルローススラリーの分散方法は特に限定しないが、例えば攪拌翼を用いた攪拌やホモジナイザーを用いた攪拌により、非水溶性液体にセルロース液滴を均一に分散させることが可能である。さらに静止型ミキサーも用いることができる。この際の攪拌強度を強くすると、セルロース液滴が小さくなるため、得られるセルロースビーズの粒径は小さくなる。
液滴作製時の温度は、例えば、前記セルローススラリーの温度範囲と同じ範囲で設定できる。この温度範囲を維持する限り、セルローススラリーから液滴作製時には降温してもよく昇温してもよいが、セルローススラリーと液滴作製時の温度差（液滴作製時温度−セルローススラリー温度）は、通常、−５℃以上、好ましくは−３℃以上、より好ましくは−１℃以上であり、その上限は、例えば、５℃以下、好ましくは３℃以下、より好ましくは１℃以下であり、最も好ましい温度差は０℃である。
液滴作製時の温度を前記範囲に調整するには、非水溶性液体（必要により、界面活性剤を含有していてもよい）の温度を、セルローススラリーと混合する前に予め調整しておくことが望ましい。この場合、セルローススラリーと非水溶性液体の温度差（非水溶性液体の温度−セルローススラリー温度）は、通常、−５℃以上、好ましくは−３℃以上、より好ましくは−１℃以上であり、その上限は、例えば、５℃以下、好ましくは３℃以下、より好ましくは１℃以下であり、最も好ましい温度差は０℃である。

（４）凝固工程
このようにして形成させたセルローススラリー又はセルロース液滴分散液体を、セルローススラリーとは混和可能であるがセルロース凝固性を示す液体、すなわち凝固溶媒に接触させる。分散液とセルロース凝固性液体の混合中に、セルロース液滴とセルロース凝固性液体が接触し、セルロースビーズが形成される。その後、形成されたセルロースビーズを回収する。
この凝固工程でのセルローススラリー又はその液滴分散液体と凝固溶媒との混合は、前記液滴作製時と同様の攪拌状態で実施することが推奨される。またこの混合（凝固）時の温度は、セルローススラリー又はその液滴分散液体の温度と同等であるのが好ましく、セルローススラリー又はその液滴分散液体の温度に対して、例えば、±１０℃以内、好ましくは±５℃以内、より好ましくは±２℃以内である。
前記凝固溶媒としては、例えば、アルコール類、グリコール類などが使用できる。前記アルコール類としては、例えば、イソブタノール、２−ブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、２−メチル−２−プロパノール（すなわちｔｅｒｔ−ブタノール）、１−プロパノール、２−プロパノール、エタノール、メタノールなどが使用でき、これらは単独で用いても２種以上を組み合わせてもよい。
また前記グリコール類としては、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコールなどが例示でき、これらは単独で用いても２種以上を組み合わせてもよい。

（５）単離工程
本第一態様の発明により得られるセルロースビーズは多孔質ビーズであり、その孔の大きさ、粒子径は、上述したとおり、セルローススラリー温度、アルカリ濃度を変えることで制御することが可能である。
得られた多孔質ビーズは、前記凝固液から濾過、遠心分離などの適当な方法で固液分離し、必要に応じて乾燥することによって単離できる。この単離操作においては、多孔質セルロースビーズを適当な溶媒（水；アルコールなどの水溶性溶媒など）で洗浄してもよい。
この様にして得られる多孔質ビーズのメジアン粒径は、例えば、５０μｍ以上、好ましくは７０μｍ以上であり、その上限は、例えば、１００μｍ以下、９５μｍ以下である。
また前記多孔質セルロースビーズの排除限界分子量は、例えば、１．０×１０⁶以上、好ましくは２．３×１０⁶以上、より好ましくは１．０×１０⁷以上であり、その上限は、例えば、１．０×１０¹¹以下、好ましくは８．０×１０¹⁰以下である。
（６）その他
以上のようにして得られる多孔質セルロースビーズは、様々な物質の吸着体として利用できる。またリガンドを固定化するための担体としても利用できる。担体として使用する場合、多孔質セルロースビーズは架橋されているのが好ましい。多孔質セルロースビーズの架橋方法としては、後述する第２の態様（収縮した後の架橋、または収縮しながらの架橋など）に係る発明をそのまま実施してもよく、公知の架橋方法を実施してもよい。
公知の架橋方法を実施する場合、架橋剤としては、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、ジクロロヒドリンなどのハロヒドリン；２官能性ビスエポキシド（ビスオキシラン）；グリセロールポリグリシジルエーテルなどの多官能性ポリエポキシド（ポリオキシラン）を挙げることができる。なかでも、特開２００８−２７９３６６号に示される方法を特に好適に用いることができる。この公報は、本願に参考文献として援用される。
なお多孔質セルロースビーズは、架橋前又は架橋後に分級してもよい。分級後の多孔質セルロースビーズの粒径の下限は、例えば、１０μｍ、好ましく２０μｍ、より好ましくは３０μｍであり、上限は、例えば、２００μｍ、好ましくは１５０μｍ、より好ましくは１２５μｍである。
さらに前記架橋担体には、適宜、リガンドを固定してもよい。リガンドの種類や固定化法は公知の範囲から適宜実施でき、また後述する第２の実施態様と同様にしてもよい。

２．リガンド固定化用担体の改善（第２態様）
次にリガンド固定化用担体の改善（第２態様）について説明する。
（１）多糖類多孔質ビーズ
第２態様の発明のリガンド固定化用担体は、多糖類多孔質ビーズを架橋することによって得られる架橋ビーズである。多糖類多孔質ビーズに使用される多糖類には、アガロース、セルロース、デキストリン、キトサン、キチン、及びこれらの誘導体が含まれる。好ましい多糖類はセルロース、アガロースであり、特に好ましくはセルロースである。

架橋する前の多糖類多孔質ビーズは、市販品でもよく、多糖類を用いた公知の製法によって得られるものでもよい。例えばセルロース多孔質ビーズは、セルロースを適当な溶液に溶解または分散させた後、造粒したり、凝固したりする方法によって入手可能である（例えば、特表２００９−２４２７７０号公報、ＷＯ２９９６／０２５３７１号、米国特許第４６３４４７０号公報、米国特許第５４１００３４号公報、ＷＯ２０１２／１２１２５８号）。勿論、上記第１態様の発明によって得られる架橋前の多孔質セルロースビーズを用いてもよい。

多糖類多孔質ビーズの排除限界分子量の下限は、例えば、１．０×１０⁵、好ましくは５．０×１０⁵、よりは好ましくは１．０×１０⁶であり、上限は、例えば、１．０×１０¹²、好ましくは５．０×１０¹¹、より好ましくは１．０×１０¹¹である。上記の様な排除限界分子量の大きい多糖類多孔質ビーズを使用することにより、抗体などの分子量の大きな物質の分離にも適した吸着体が得られる。

前記排除限界分子量は、以下の様にして決定できる。すなわち多糖類多孔質ビーズをカラムに充填し（充填したビーズ容量をＶ_tとする）に、ブルーデキストラン２００の他、種々の分子量のマーカーを含む溶液を通液する。ブルーデキストラン２００を通液して最初のピークが検出されるのに必要な液量（Ｖ₀）と各マーカーを通液して最初のピークが検出されるのに必要な液量（Ｖ_R）をそれぞれ求め、下記式（１）に基づいて各マーカーのゲル相分配係数（Ｋ_av）を求める。分配係数（Ｋ_av）を縦軸とし、分子量の自然対数を横軸とするグラフに各マーカーでの測定結果をプロットし、直線性を示す部分に基づいて下記式（２）を求める（式中、ｋ及びｂは定数である）。この式（２）において分配係数（Ｋ_av）が０になる時の分子量を排除限界分子量とする。
Ｋ_av＝（Ｖ_R−Ｖ₀）／（Ｖ_t−Ｖ₀） （１）
Ｋ_av＝ｋ×Ｌn（分子量）＋ｂ （２）

（２）収縮工程
そして本第２態様（リガンド固定化用担体の改善）に関する発明では前記多糖類多孔質ビーズを収縮させている点に特徴がある。収縮を利用することで圧縮強度を適切に高めることができる。

前記収縮の程度は、下記式によって定まる収縮率によって評価できる。
収縮率（％）＝（１−Ｖ₂／Ｖ₁）×１００
（式中、Ｖ₁は収縮前の多糖類多孔質ビーズのゲル体積を示し、Ｖ₂は収縮後の多糖類多孔質ビーズのゲル体積を示す。なお本発明では後述する様に、架橋剤の存在下でビーズを収縮させる場合がある。その様な場合には、前記Ｖ₁は収縮架橋前の多糖類多孔質ビーズのゲル体積を示し、Ｖ₂は収縮架橋後の多糖類多孔質ビーズのゲル体積を示す。）
本発明において前記収縮率の下限は、１０％、好ましくは１５％、より好ましくは２０％であり、上限は６０％、好ましくは５０％である。収縮率を大きくするほど、担体の圧縮強度（圧縮応力）を高めることができる。

前記ゲル体積とは、ビーズが沈降した時の沈降部分の体積をいう。具体的には、収縮前又は収縮後のビーズ含有液（反応液）を洗浄し、ＲＯ水で置換することで調製したサンプルスラリーを使用して求める。サンプルスラリーの濃度は、そのサンプルスラリーのゲル体積濃度（ゲル体積／サンプルスラリー体積）が３０〜７０体積％となる程度の濃度とし、このサンプルスラリーを入れた５０ｍＬ遠沈管を２５℃にて小型振動器（SINFONIA TECHNOLOGY社製、VIBRATORY PACKER、VP-4D。または相当品)上に固定し、ビーズの沈降が止まるまで振動した後のビーズ部分の体積を遠沈管の目盛りから読み取ることで、サンプルスラリーにおけるゲル体積を決定できる。上記式中のゲル体積Ｖ₁、Ｖ₂は、いずれも収縮工程に用いたビーズ全量のゲル体積を表しており、反応液から一部を採取してサンプルスラリーを調製した場合には、サンプルスラリーのゲル体積と採取割合とからビーズ全量のゲル体積Ｖ₁、Ｖ₂を求める。

多糖類多孔質ビーズを所定量以上収縮させるには、多糖類多孔質ビーズを水溶性有機溶媒、アルカリおよび水と接触させることが推奨される。アルカリと接触させることで収縮が開始する。そして水溶性有機溶媒を存在させておくと、そうでない場合に比べて収縮率が著しく大きくなる。

第２態様で使用するこのような水溶性有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノールなどのアルコール溶媒；ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド溶媒；ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンなどのアミド溶媒；アセトンなどのケトン溶媒；ジオキサン、テトラヒドロフランなどのエーテル溶媒；エチレングリコール、ジエチレングリコールなどのグリコール溶媒などが挙げられる。

好ましい水溶性有機溶媒は、アルコール溶媒、スルホキシド溶媒、アミド溶媒、ケトン溶媒、エーテル溶媒であり、より好ましくはメタノール、エタノール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、アセトン、ジオキサンであり、最も好ましくはエタノール、ジメチルスルホキシドである。これらは２種以上の混合溶媒として用いることもできる。

アルカリ水に用いるアルカリとしてはアルカリ金属含有化合物が好ましく、例えば、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ金属水酸化物が使用できる。これらアルカリは単独で用いてもよく、適宜組み合わせて使用してもよい。好ましいアルカリは、水酸化ナトリウムである。なおアルカリ水は水溶液が好ましいが、分散液であってもよい。また通常はアルカリ水を予め調製してから反応液に加えるが、必要により、反応液中で調製してもよい。

（３）架橋
本発明では前記多糖類多孔質ビーズの収縮を、架橋と組み合わせている点にも特徴がある。収縮による圧縮強度の向上と架橋による圧縮強度の両方を利用して強度を向上させた多糖類多孔質ビーズを担体としてリガンドを固定させると、吸着量をも維持・改善できる。

具体的には、前記収縮工程において架橋剤を共存させ、収縮させつつ架橋することが好ましいが（すなわち前記収縮工程が架橋工程を兼ねた収縮架橋工程であるのが好ましいが）、前記収縮工程の後、得られた収縮ビーズを公知の架橋方法によって架橋してもよい。この収縮工程後の架橋でも、架橋剤を使用することができる。いずれにしても収縮工程に使用する多糖類多孔質ビーズの架橋度が低い（特に全く架橋されていない）ことが推奨される。収縮工程前の多糖類多孔質ビーズの架橋度が高くなるほど、収縮工程時に、多糖類多孔質ビーズが収縮し難くなり、所望の収縮率を達成し難くなる。

なお前記架橋剤としては、ジクロロヒドリンなどのハロヒドリン、またはエポキシ化合物が好ましく使用でき、エポキシ化合物としては、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリンなどのモノエポキシ化合物；ビスオキシラン、ジグリシジルエーテル類などのジエポキシ化合物；ポリオキシラン、ポリグリシジルエーテル類などのポリエポキシ化合物が例示できる。

（４）収縮単独工程、収縮架橋工程
前記収縮工程が架橋工程を兼ねない場合（収縮単独工程という）、この工程は、上述した様に、多糖類多孔質ビーズを水溶性有機溶媒、アルカリおよび水と接触させることで実施できる。また前記収縮工程が架橋工程を兼ねる場合（収縮架橋工程）、この工程は、多糖類多孔質ビーズを水溶性有機溶媒、架橋剤、およびアルカリ水と接触させることによって実施できる。これら多糖類多孔質ビーズ、水溶性有機溶媒、アルカリ水、及び必要により架橋剤を接触させる時の手順、量、温度などは適宜設定できる。収縮架橋工程では、好ましくは多糖類多孔質ビーズと架橋剤と水溶性有機溶媒とで分散液を調製し、そこにアルカリ水溶液を加える。アルカリ水溶液を加えて所定時間反応させた後、さらにアルカリ水溶液を１回以上追加してもよい。なおアルカリ水溶液を追加する場合、追加前の架橋反応を本収縮架橋反応という場合がある。

前記収縮単独工程における反応液中のスラリー濃度（多糖類多孔質ビーズ濃度）、及び前記収縮架橋工程における本収縮架橋反応（アルカリ水溶液を追加する前の反応）液中のスラリー濃度（多糖類多孔質ビーズ濃度）の下限は、例えば、１０体積％、好ましくは２０体積％、より好ましくは２５体積％であり、上限は、例えば、７０体積％、好ましくは６０体積％、より好ましくは５０体積％である。なおスラリー濃度とは、ゲル体積／総液量（体積）の意味である。

前記収縮単独工程における反応液中の水溶性有機溶媒比率、及び前記収縮架橋工程における本収縮架橋反応（アルカリ水溶液を追加する前の反応）液中の水溶性有機溶媒比率の下限は、例えば、０．３０、好ましくは０．４０、より好ましくは０．５０であり、上限は、例えば、０．９０、好ましくは０．８０、より好ましくは０．６５である。なお水溶性有機溶媒比率とは、有機溶媒体積／（有機溶媒体積＋アルカリ水体積）の意味であり、この有機溶媒体積は多糖類多孔質ビーズのゲル化の為に使用される有機溶媒の体積も含む。例えば多糖類多孔質ビーズの水性ゲルの水を有機溶媒に置換した場合には、有機溶媒置換後のビーズの体積は、通常、有機溶媒の体積に等しい。

本収縮架橋反応液中の架橋剤濃度（架橋剤の体積／反応液の総液量（体積））の下限は、例えば、５体積％、好ましくは１０体積％であり、上限は、例えば、５０体積％、好ましくは４０体積％、より好ましくは３０体積％である。

前記収縮単独工程における反応液中のアルカリ濃度、及び前記収縮架橋工程における本収縮架橋反応液中のアルカリ濃度のそれぞれの下限は、例えば、０．１Ｍ、好ましくは０．３Ｍ、より好ましくは０．５Ｍであり、それぞれの上限は、例えば、２．０Ｍ、好ましくは１．５Ｍ、より好ましくは１．２Ｍである。なおアルカリ濃度を算出するに当たって、分母の体積は、有機溶媒体積とアルカリ水体積の合計を指す。

収縮架橋工程においてアルカリ水を加えて多糖類多孔質ビーズの架橋と収縮を進行させる時の温度の下限は、例えば、０℃、好ましくは２０℃、さらに好ましくは３０℃であり、上限は、例えば、８０℃、好ましくは７０℃、さらに好ましくは５０℃である。収縮単独工程においても、上記温度範囲を適用できる。

（５）追加架橋工程
本発明では、前記収縮反応時の架橋（収縮架橋工程）又は収縮反応後の架橋で多糖類多孔質ビーズを架橋した後、得られた架橋ビーズをさらに架橋する追加架橋工程を実施してもよい。この追加架橋工程は１回でもよく、複数回繰り返してもよい。追加架橋工程を１回以上実施することによって架橋ビーズの圧縮強度をさらに高めることができる。

追加架橋工程では、水溶性有機溶媒を使用してももはや収縮現象が殆ど生じない場合がある。追加架橋工程は水溶性有機溶媒の使用が任意である以外は、前述の収縮架橋工程と同様に実施できる。従って用いる架橋剤、アルカリ水の具体例、手順、使用量も同様である。なお前述の収縮架橋工程における水溶性有機溶媒の使用量は、追加架橋工程では、好ましい範囲として読み替えて適用する。

追加架橋工程では、アルコール溶媒を用いないのが好ましい。この好ましい態様には、プロトン性有機溶媒を用いない態様、水溶性有機溶媒を用いない態様が含まれ、水溶性有機溶媒として非プロトン性水溶性有機溶媒を用いる態様も含まれる。アルコール溶媒を使用しない場合、アルコール溶媒を使用する場合に比べて、架橋反応が進行しやすく強度をより高めることができる。なお非プロトン性水溶性有機溶媒は、上述の水溶性有機溶媒の中から非プロトン性のものを単独でまたは組み合わせて使用できる。

（６）前架橋工程
さらに前記収縮工程（収縮架橋工程を含む）に先立って、本発明では、予備的に多糖類多孔質ビーズを架橋する前架橋工程を実施してもよい。前架橋工程は、その架橋の程度（架橋剤濃度など）が小さい点を除けば、前記追加架橋工程と同様の操作を実施できる。前架橋工程を実施することなく、前記収縮工程（収縮架橋工程を含む）を実施することが本発明では好ましい。

前記前架橋工程、収縮架橋工程、収縮工程後の架橋、及び追加架橋工程では、必要に応じて反応促進剤、例えば水素化ホウ素ナトリウムなどの還元剤や無機塩を使用しても良い。無機塩を用いると、架橋ビーズの圧縮応力をさらに高めることができる。無機塩としては、アルカリ金属またはアルカリ土類金属の塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩及びホウ酸塩を挙げることができ、特に硫酸ナトリウムが好ましい。これら無機塩は単独で用いてもよく、２種以上を併用することもできる。また架橋終了後、必要に応じて養生処理をしてもよい。養生処理では、例えば、オートクレーブを用いた加圧・加熱処理が簡便である。

（７）架橋ビーズ（リガンド固定化用担体）
上記のようにして得られる架橋ビーズは、リガンド固定化用担体として使用できる。該架橋ビーズの２０％圧縮応力の下限は、例えば、０．０６ＭＰａ、好ましくは０．０７２ＭＰａ、より好ましくは０．０９２ＭＰａであり、上限は、例えば、０．２８ＭＰａ、好ましくは０．２０ＭＰａである。なお２０％圧縮応力は、孔径５．００μｍのフィルターの上のビーズ含有スラリーを、振動を与えてもそれ以上沈降しない程度にまで沈降した後、そこからさらに２０％圧縮するのに必要な応力のことをいう。

また架橋ビーズは、圧密化が生じる線速度が高いほど望ましい。本発明の架橋ビーズでは、圧密化線速が、例えば、７００ｃｍ／ｈ以上、好ましくは１０００ｃｍ／ｈ以上、より好ましくは１５００ｃｍ／ｈ以上である。なお圧密化線速度は、架橋ビーズを充填したカラムに通水し、入口圧が上昇し続け通液不能となる時の線速をいう。

なお架橋ビーズは必要に応じて篩などで分級してもよい。分級後の架橋ビーズの粒径の下限は、例えば、１０μｍ、好ましくは２０μｍ、より好ましくは３０μｍであり、上限は、例えば、２００μｍ、好ましくは１５０μｍ、より好ましくは１２５μｍである。

（８）リガンド
前記架橋ビーズを担体とし、これにリガンドを固定させることで吸着体が得られる。本発明の架橋ビーズ担体は、その強度のわりに、リガンドによる吸着量を維持・改善させることができる。
前記リガンドは吸着対象と親和性を有するものが適宜使用でき、アフィニティリガンド、荷電基、疎水性基などが例示でき、これらは単独で導入してもよく、複数を適宜組み合わせて導入してもよい。これらリガンドは、公知の方法によって導入でき、得られる吸着体は、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、キレートクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー用のカラム充填剤として好適に用いることが出来る。また本発明の架橋ビーズ担体は、その細孔径の大きさから、抗体を目的物質とする分離精製に適しており、アフィニティリガンド、荷電基、疎水基などを導入した前記吸着体は、抗体精製に好ましく使用できる。
本発明において好ましいリガンドは、アフィニティリガンドである。アフィニティリガンドとしては、標的分子として抗体等に特異的に結合しうる特徴を有していれば特に限定されないが、ペプチド性、蛋白質性、または、合成化合物が好ましい。標的分子に対する特異性の視点からペプチド性または蛋白質性リガンドが更に好ましく、その内、抗体アフィニティリガンドがプロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、プロテインＨ、プロテインＤ、プロテインＡｒｐ、プロテインＦｃγＲ、抗体結合性合成ペプチドリガンド及びそれら類縁物質であることが特に好ましい。なお本明細書においてリガンドとして使用するタンパク質は、それらの変異体も含む意味で使用する。天然物、遺伝子組み換え物等を制限なく使用することができ、一般に製造されている各種変異体を使用できる。抗体結合ドメイン及びその変異体を含むもの、融合蛋白質等であってもよい。例えば、抗体との結合性を改善するため、抗体結合性タンパク質が部位特異的に基材に固定化されるように配列を改変したもの（例えば、特許第４１７９５１７号公報、特開２００８−２１４３５０号公報に記載のリジン残基の位置や数を制御したタンパク質など）を使用することもできる。

また、菌体抽出物もしくは培養上清より、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー及び膜分離技術を用いた分子量分画、分画沈殿法等の手法から選択される精製法を組合せ、および／または繰り返すことにより製造された、タンパク質を用いることもできる。好ましいアフィニティリガンドは、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬおよびそれらの変異体であり、特にプロテインＡである。プロテインＡは、免疫グロブリン（ＩｇＧ）等を特異的に吸着、溶出できるリガンドとして注目されている。プロテインＡを固定化した吸着体は、リウマチ、血友病、拡張型心筋症の治療用吸着体として注目されている。また、抗体医薬精製の分野においては、ＩｇＧ等の抗体の精製を大スケール、高速、及び低コストで行える吸着体が望まれている。

一般にプロテインＡは、グラム陽性細菌スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）によって生産される細胞壁タンパク質の１種を指し、シグナル配列Ｓ、５つのＩｇＧ結合性ドメイン（Ｅドメイン、Ｄドメイン、Ａドメイン、Ｂドメイン、Ｃドメイン）、および、細胞壁結合ドメインであるＸＭ領域から構成されている（Ｈｏｂｅｒ Ｓ．他著、「Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． Ｂ」２００７年、８４８巻、４０−４７頁）。ＩｇＧアフィニティー精製用リガンドとして用いられるプロテインＡには、５つのＩｇＧ結合性ドメインのみからなるプロテイン（配列番号１）が汎用されている。本発明にいうプロテインＡは、前記一般のプロテインＡや前記Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃドメインのみからなるプロテインの他、Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃドメインのいずれか一つ以上のドメインを有するプロテインも含み、例えば、Ｃドメインを複数個（例えば、３〜８個。特に５個）を連続して有するもののみからなるプロテインであってもよい。

好ましいプロテインＡには、アルカリ耐性をもつものや配向制御型のものが含まれる。本発明の担体は、架橋等の効果によってアルカリ耐性が強化されているため、リガンドのアルカリ耐性も強化しておくことで吸着体としてのアルカリ耐性も向上できる。アルカリ耐性を有するプロテインＡには、前記プロテインＡのアルカリ感受性残基（アスパラギン残基、グルタミン残基などのいずれか）を欠失させるか、該アルカリ感受性残基をアルカリ耐性残基（例えば、アスパラギン残基、グルタミン残基以外の天然アミノ酸残基。好ましくは、さらにシステイン残基を除いた天然アミノ酸残基。より好ましくはリジン残基、アスパラギン酸残基、ロイシン残基など）に置換したプロテイン（例えば、特表２００２−５２７１０７号公報）；プロテインＡのＢドメインの２９位のグリシン残基をアラニン残基に置換したドメイン（Ｚドメイン）を有するプロテイン（例えば、特公平８−１１０６９号公報）；プロテインＡのＣドメインの２９位のグリシン残基をグリシン残基以外の天然アミノ酸残基（例えば、アラニン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基、トリプトファン残基、グルタミン残基、アルギニン残基、または、メチオニン残基。）に置換したプロテイン、及びこの２９位を置換したＣドメインのみを複数（特に５個）連結したプロテインなど（例えば、ＷＯ２０１０／１１０２８８号）が挙げられる。

配向制御型プロテインＡには、プロテインＡのＣ末端またはＮ末端にシステイン残基が付与（置換、付加など）されたプロテイン（例えば、特開２００８−１０１０２３号公報）；（Ａ）プロテインＡのリジン残基の１／２以上、好ましくは２／３以上、より好ましくは３／４以上、特に好ましくは全てが別のアミノ酸残基に置換されたプロテイン、（Ｂ）好ましくは前記（Ａ）のプロテインにおいて別のアミノ酸がアルギニン、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、イソロイシン、ヒスチジン、グリシンであるプロテイン、（Ｃ）より好ましくは前記（Ａ）または（Ｂ）のプロテインにおいて末端（特にＣ末端）に１個以上のリジン残基が付与（置換、付加など）されたプロテイン（例えば、ＷＯ２０１２／１３３３４９号）が挙げられる。 これらの改変を組み合わせ、アルカリ耐性をもつ配向制御型のプロテインＡを使用しても良い。

アフィニティリガンドの導入量の下限は、架橋ビーズ１ｍＬあたり、例えば、２ｍｇ、好ましくは４ｍｇ、さらに好ましくは１０ｍｇであり、上限は、架橋ビーズ１ｍＬあたり、例えば、４０ｍｇ、好ましくは３０ｍｇ、さらに好ましくは２０ｍｇである。
なおアフィニティリガンドの導入量は、公知の方法により求めることができる。

アフィニティリガンドを架橋ビーズに固定化するには、例えば、臭化シアン法、トリクロロトリアジン法、エポキシ法、トレシルクロリド法等の様々な公知の固定化法を適宜採用できる。安全性、固定化反応の容易さ、比較的容易な方法で産生されたタンパク質やペプチドを固定化できる等の理由から、架橋ビーズにホルミル基を導入し、このホルミル基とアフィニティリガンドのアミノ基とを反応させる方法（例えばＷＯ２０１０／０６４４３７号）が好ましい。

なお架橋ビーズへのホルミル基は、多糖類に含まれるα，β−ジオール単位中のＣ−Ｃ結合を切断することによって導入できる。またエピクロロヒドリンなどのエポキシ化合物を架橋剤として用いる場合には、エポキシ基を加水分解して得られるジオールを酸化開裂することによってもホルミル基を導入できる。前記ホルミル基量は、架橋ビーズ１ｍＬあたり、下限は、例えば１μｍｏｌ、好ましくは５μｍｏｌ、さらに好ましくは１０μｍｏｌ、特に好ましくは２０μｍｏｌ、最も好ましくは３０μｍｏｌであり、上限は、例えば５００μｍｏｌ、好ましくは２５０μｍｏｌ、さらに好ましくは１２５μｍｏｌ、特に好ましくは６０μｍｏｌ、最も好ましくは５０μｍｏｌである。なおアフィニティリガンド導入後に残った活性基は、不活化処理される。

本発明によれば、圧縮化によって担体の強度が高められているため、アフィニティリガンドを固定した吸着体の吸着性能も維持・改善されている。アフィニティリガンドとしてプロテインＡを用いた場合、吸着体の吸着特性は、例えば、ヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ）の５％動的吸着量（ＤＢＣ）によって評価できる。滞留時間（レジデンスタイム。ＲＴ）３分で吸着処理を行う場合、５％ＤＢＣの下限は、吸着体１ｍＬあたり、例えば、２０ｍｇ、好ましくは３０ｍｇ、より好ましくは４０ｍｇであり、上限は、例えば、１００ｍｇ、好ましくは６０ｍｇである。
なお前記５％ＤＢＣは、吸着体を充填したカラムにｐＨ７．４のリン酸塩緩衝液を通液した後、濃度１ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ水溶液を通液することによって測定できる。

前記吸着体は、種々の目標物質を精製するのに利用できる。必要により、カラムに充填して使用してもよい。一実施形態では、前記吸着体はクロマトグラフィーカラムに充填される。このカラムは、従来の液体クロマトグラフィー装置などを使用して、アフィニティクロマトグラフィーに使用できる。

また本発明は、混合物（供給原料）から抗体を精製する方法を提供する。この方法は、抗体が本発明で得られる吸着体に選択的に結合するような条件下で、抗体を含む混合物（供給原料）に接触（負荷）させる段階、および、場合により、１つ以上の条件（ｐＨ、塩強度など）を変更することによって調整された溶出液（好ましくは溶出緩衝液）を適用（通液）することによって、吸着体から抗体を溶出する段階を含むことができる。この溶出液から抗体を回収可能である。

前記溶出緩衝液は、より具体的には、抗体を含む混合物（負荷液）と接触させた時とは異なるｐＨ、或いは、より高濃度の塩を使用することができる。この方法は、場合により１回以上の洗浄段階を含むことができる。この洗浄段階は、例えば、抗体が吸着体と結合した後であり、抗体を吸着体から溶出する前に行うことができる。本発明による抗体の吸着および溶出は、従来の市販品で推奨されているような標準的条件下で容易に実施でき、例えば、ＧＥヘルスケア社のホームページ等を参照できる。
また上記精製方法は、他のクロマトグラフィーと組み合わせることで、抗体の精製純度を更に高めることができる。

本願は、２０１３年９月２７日に出願された日本国特許出願第２０１３−２０２００７号及び２０１３年１０月８日に出願された日本国特許出願第２０１３−２１１４５３号に基づく優先権の利益に基づく優先権の利益を主張するものである。２０１３年９月２７日に出願された日本国特許出願第２０１３−２０２００７号及び２０１３年１０月８日に出願された日本国特許出願第２０１３−２１１４５３号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。

以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。

１．多孔質セルロースビーズの改善（第１の態様）に関する実施例
（実施例１）
粉末状のセルロース（旭化成ケミカルズ社製局方セルロースＰＨ−Ｆ２０ＪＰ）８．６５ｇを１１２ｇの水に分散させ、４℃で保持した。そこに３４．５ｗｔ％水酸化ナトリウム（ナカライテスク株式会社製）水溶液３５ｇを添加し撹拌し、セルロース微分散液を得た。２０分撹拌した後、水を１６ｇ添加し、水酸化ナトリウム濃度を７．０ｗｔ％、セルロース濃度を５．０ｗｔ％とし、１５℃まで昇温し、セルローススラリーを得た。ソルビタンモノオレエートを９．２ｇ含有した１５℃の１，２−ジクロロベンゼン８９０ｇに得られたセルローススラリーを分散させ、セルロース液滴分散液を形成した。セルロース液滴分散液は内径８５ ｍｍの円筒型容器に入れ、撹拌には翼径４５ｍｍの２段タービン翼を用い、その翼間隔は７５ｍｍとした。６００ｒｐｍで分散液を１０分撹拌し、メタノールを１５０ｍｌ添加し、ビーズ状のセルロースを得た。なおこのビーズ形成時の温度は、セルロース液滴分散液の形成時の温度と同じにした。得られたビーズの粒子径はレーザ回折／散乱式粒子径分布測定装置（堀場社製ＬＡ−９５０）を用いてメジアン粒径を求めたところ９０．２μｍを示した。得られたセルロースビーズはメタノールで洗浄した後、水で洗浄した。回収したセルロースビーズの一部を２−メチル−２−プロパノールで置換し、凍結乾燥後、走査型電子顕微鏡（日立製作所Ｓ−８００、以下ＳＥＭと称する）にて解析した。その結果、セルロースビーズは図１に示したような多孔質ビーズであることが確認された。
得られた残りのセルロースビーズを櫛目開き３８μｍと櫛目開き９０μｍメッシュを用いて篩分けし、３８μｍから９０μｍの範囲のビーズを集め、後述の方法で架橋反応を行った。得られた架橋セルロースビーズについて、後述の方法でカラム充填および測定を行うことによりゲル分配係数（Ｋ_av）を算出した。マーカー分子量１２４００のＫ_av値は０．７２３、マーカー分子量６７０００のＫ_av値は０．６４６、マーカー分子量１１５０００のＫ_av値は０．５９５、マーカー分子量４４００００のＫ_av値は０．５２５を示した。各Ｋ_av値から排除限界分子量を計算したところ、６．０×１０¹⁰を示した。

（実施例２）
セルローススラリー温度を１０℃まで上昇させることと１，２−ジクロロベンゼン温度を１０℃とする以外は実施例１と同様の方法、条件により多孔質セルロースビーズを得た。その結果、得られたビーズの粒子メジアン径は９１．４μｍを示した。実施例１と同様の方法で架橋反応を行い、Ｋ_avを算出した。マーカー分子量１２４００のＫ_av値は０．５６２、マーカー分子量６７０００のＫ_av値は０．４２９、マーカー分子量１１５０００のＫ_av値は０．３７７、マーカー分子量４４００００のＫ_av値は０．３０７、マーカー分子量６６００００のＫ_av値は０．２６１を示した。各Ｋ_av値から排除限界分子量を計算したところ、２．４×１０⁷を示した。

（実施例３）
セルローススラリー温度を２０℃まで上昇させることと１，２−ジクロロベンゼン温度を２０℃とする以外は実施例１と同様の方法、条件により多孔質セルロースビーズを得た。その結果、得られたビーズの粒子メジアン径は８０．３μｍを示した。実施例１と同様の方法で架橋反応を行い、Ｋ_avを算出した。マーカー分子量１２４００のＫ_av値は０．６４５、マーカー分子量６７０００のＫ_av値は０．５２８、マーカー分子量１１５０００のＫ_av値は０．４８７、マーカー分子量４４００００のＫ_av値は０．４００、マーカー分子量６６００００のＫ_av値は０．３７４を示した。各Ｋ_av値から排除限界分子量を計算したところ、１．５×１０⁸を示した。

（実施例４）
セルローススラリー温度と１，２−ジクロロベンゼン温度を４℃とする以外は実施例１と同様の方法、条件により多孔質セルロースビーズを得た。その結果、得られたビーズの粒子メジアン径は９６．３μｍを示した。実施例１と同様の方法で架橋反応を行い、Ｋ_avを算出した。マーカー分子量６７０００のＫ_av値は０．３７７、マーカー分子量１１５０００のＫ_av値は０．３３５、マーカー分子量４４００００のＫ_av値は０．１７９、マーカー分子量６６００００のＫ_av値は０．１４６を示した。各Ｋ_av値から排除限界分子量を計算したところ、２．４×１０⁶を示した。
図３に実施例１から実施例４の粒子径分布を示したが、ビーズ形成温度が高くなるほどビーズ径は小さくなる。ビーズ形成温度を制御することで簡易に粒子径を制御することができた。また、図４に実施例１から実施例４のＫ_av値を示したが、ビーズ形成温度によりＫ_av値、排除限界分子量を制御することができた。Ｋ_av値はマーカータンパク質のビーズ内への拡散挙動を示しており、Ｋ_av値が大きいほどビーズ内にタンパク質が拡散しやすい。タンパク質拡散挙動はビーズ細孔径を反映しており、Ｋ_av値が大きいほど細孔径が大きいことを示している。よって、実施例１から実施例４はビーズ形成温度によりビーズ細孔径が制御できることを示している。

（実施例５）
粉末状のセルロース８．６５ｇを６０ｇの水に分散させ、４℃で保持した。そこに３１．９ｗｔ％水酸化ナトリウム水溶液２７ｇを添加し撹拌した。２０分撹拌した後、水を７７ｇ添加し、水酸化ナトリウム濃度を５．０ｗｔ％、セルロース濃度５．０ｗｔ％とする以外は実施例４と同様の方法、条件により多孔質セルロースビーズを得た。その結果、得られたビーズの粒子メジアン径は８３．０μｍを示した。

（比較例１）
粉末状のセルロース８．６５ｇを１２８ｇの水に分散させ、１５℃で保持し、そこに３４．５ｗｔ％水酸化ナトリウム水溶液３５ｇを添加し、水酸化ナトリウム濃度を７ｗｔ％とする以外は実施例１と同じ方法、条件によりセルロースを得た。その結果、得られたセルロースは図２に示したようにビーズ状にはならなかった。

（比較例２）
粉末状のセルロース８．６５ｇを１１２ｇの水に分散させ、４℃で保持し、そこに３０．３ｗｔ％水酸化ナトリウム水溶液５１ｇを添加し、水酸化ナトリウム濃度を９ｗｔ％、セルロース濃度を５．０ｗｔ％とした。ソルビタンモノオレエートを９．２ｇ含有した１，２−ジクロロベンゼン８９０ｇ、４℃に得られたセルローススラリーを分散させ、セルロース液滴分散液を形成した。セルロース液滴分散液は内径８５ ｍｍの円筒型容器に入れ、撹拌には翼径４５ｍｍの２段タービン翼を用い、その翼間隔は７５ｍｍとした。６００ｒｐｍで分散液を１０分撹拌し、メタノールを１５０ｍｌ添加し、ビーズ状のセルロースを得た。この方法は国際公開ＷＯ２０１２−１２１２１５８号と同条件である。その結果、得られたビーズの粒子メジアン径は１１１．０μｍを示し、実施例1と同様の方法で架橋反応を行い、Ｋ_avを算出した。マーカー分子量１２４００のＫ_av値は０．５１８、マーカー分子量６７０００のＫ_av値は０．３５６、マーカー分子量１１５０００のＫ_av値は０．３１１、マーカー分子量４４００００のＫ_av値は０．１５２を示した。各Ｋ_av値から排除限界分子量を計算したところ、２．１×１０⁶を示した。得られたビーズのＫ_av値、排除限界分子量は実施例１から実施例４の条件で得られたビーズのＫ_av値、排除限界分子量よりも小さくなった。

（第１態様の評価方法）
＜セルロースビーズの架橋＞
各実施例にて得られた多孔質セルロースビーズ４０ｍLを反応容器に移し、２Ｎ ＮａＯＨ水溶液（ナカライテスク社製と蒸留水で調製）を２４．４ｍL加え、４０℃に調整した。ここに水素化ホウ素ナトリウム２４．４ｍｇ、架橋剤としてグリセロールポリグリシジルエーテルを含有するデナコールＥＸ−３１４（ナガセケムテックス社製）を６．０ｍL投入し、４０℃で５時間攪拌した。反応終了後、吸引濾過をしながら、ビーズの２０倍体積量以上の蒸留水で洗浄し、架橋セルロースビーズを得た。

＜ゲル分配係数（Ｋ_av）の測定＞
（１）カラム充填
上記多孔質セルロースビーズをＲＯ水に分散させ、１時間脱気した。脱気した多孔質セルロースビーズまたは吸着体を、線速１０５ｃｍ／ｈでカラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製Ｔｒｉｃｏｒｎ １０／３００）に充填した。その後、ｐＨ７．５の溶出液（１２９ｍＬ）を線速２６ｃｍ／ｈでカラムに通液した。
（２）マーカー添加
マーカーとして以下のものを用いた。
・Ｂｌｕｅ Ｄｅｘｔｒａｎ ２０００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＦＩｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）
・Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃ（Ｗａｋｏ社製），分子量１２４００
・Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ（Ｗａｋｏ社製），分子量６７０００
・ＩｇＧ ヒト由来（ＳＩＧＭＡ社製），分子量１１５０００
・フェリチン（ＳＩＧＭＡ社製），分子量４４００００
・Ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（ＳＩＧＭＡ社製），分子量６６００００
前記溶出液を線速２６ｃｍ／ｈでカラムに通液しながら、上記マーカーをｐＨ７．５のバッファーにて５ｍｇ／ｍＬに薄めたものを、各々１２μＬずつ注入した。なお、マーカーの濃度は都度微調整した。

（３）測定
測定器として、ＤＧＵ−２０Ａ３、ＳＣＬ−１０Ａ、ＳＰＤ−１０Ａ、ＬＣ−１０ＡＤ、ＳＩＬ−２０ＡＣ、ＣＴＯ−１０ＡＣ（それぞれＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）を用い、測定ソフトウェアとして、ＬＣＳｏｌｕｔｉｏｎを用いた。液量測定には５０ｍＬメスシリンダーを用いた。
マーカー注入と同時にＵＶモニターおよび液量の測定を開始し、
１）ブルーデキストランの最初のピークに対応する液量をＶ₀（ｍＬ）とした。
２）各マーカーのピークに対応する液量をＶ_R（ｍＬ）とした。
３）カラム内の多孔質セルロースビーズまたは吸着体のトータルボリュームをＶ_t（ｍＬ）とした。
４） 算出
各マーカーの分配係数（Ｋ_av）を次式で算出した。
Ｋ_av＝（Ｖ_R−Ｖ₀）／（Ｖ_t−Ｖ₀）
５）最大細孔径の算出
各マーカーのＫ_avと分子量の対数をプロットし、直線性を示す部分から下記式の傾きと切片を求めた。
Ｋ_av＝ｋ×Ｌ_n（分子量）＋ｂ
次いで、求めた傾きと切片からＫ_avが０の時の分子量、つまり排除限界分子量を求めた。

２．リガンド固定化用担体の改善（第２態様）に関する実施例
次にリガンド固定化用担体の改善（第２態様）に関する実施例を示す。第２態様に関する下記実施例において用いた又は得られたセルロース多孔質ビーズ、架橋ビーズ（以下、これらを総称して試料ビーズという場合がある）、及び架橋ビーズにリガンドを結合した吸着体の物性を以下のようにして決定した。

Ｉ：排除限界分子量
（１）カラム充填処理
試料ビーズをＲＯ水（逆浸透膜精製水）で調製）に分散し、１時間脱気した。脱気した試料ビーズを、線速１０５ｃｍ／ｈでカラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製Ｔｒｉｃｏｒｎ １０／３００）に充填した。その後、ｐＨ７．５の溶出液（１２９ｍＬ）を線速２６ｃｍ／ｈでカラムに通液した。

（２）使用マーカー
・Ｂｌｕｅ Ｄｅｘｔｒａｎ ２０００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＦＩｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）
・Ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（ＳＩＧＭＡ社製），ＭＷ６６０，０００
・フェリチン（ＳＩＧＭＡ社製），ＭＷ４４０，０００
・ＩｇＧ ヒト由来（ＳＩＧＭＡ社製），ＭＷ１１５，０００
・Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ（Ｗａｋｏ社製），ＭＷ６７，０００
・Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃ（Ｗａｋｏ社製），ＭＷ１２，４００
・Ｂａｃｉｔｒａｃｉｎ （Ｗａｋｏ社製），ＭＷ１，４００

（３）使用測定機器とソフトウェア
機器名：ＤＧＵ−２０Ａ３、ＳＣＬ−１０Ａ、ＳＰＤ−１０Ａ、ＬＣ−１０ＡＤ、ＳＩＬ−２０ＡＣ、ＣＴＯ−１０ＡＣ（いずれも島津製作所製）。
ソフトウェア名：ＬＣＳｏｌｕｔｉｏｎ

（４）測定
前記溶出液を線速２６ｃｍ／ｈでカラムに通液しながら、上記マーカーをｐＨ７．５のバッファーにて５ｍｇ／ｍＬに薄めたものを、各々１２μＬずつ注入した。なお、マーカーの濃度は都度微調整した。マーカー注入と同時にＵＶモニターおよび液量の測定を開始した。
ａ）ブルーデキストランの最初のピークに対応する液量をＶ₀（ｍＬ）とした。
ｂ）各マーカーのピークに対応する液量をＶ_R（ｍＬ）とした。
ｃ）カラム内の試料ビーズのトータルボリュームをＶ_t（ｍＬ）とした。

（５）計算
各マーカーのゲル相分配係数（Ｋ_av）を次式で算出した。
Ｋ_av＝（Ｖ_R−Ｖ₀）／（Ｖ_t−Ｖ₀）
各マーカーのＫ_avと分子量の対数をプロットし、直線性を示す部分から下記式の傾きと切片を求めた。
Ｋ_av＝ｋ×Ｌ_n（分子量）＋ｂ 次いで、求めた傾きと切片からＫ_avが０の時の分子量を求め、それを排除限界分子量とした。

II：収縮架橋反応時収縮率
収縮架橋反応前後のセルロース多孔質ビーズの全量を用いて、下記方法により、ゲル体積の総和を算出し、多糖類多孔質ビーズの収縮架橋前の多糖類多孔質ビーズのゲル体積Ｖ₁、収縮架橋後の多糖類多孔質ビーズのゲル体積Ｖ₂を求めた。
（ゲル体積測定法）
収縮架橋反応前または収縮架橋反応後の反応液を洗浄し、ＲＯ水で置換することでサンプルスラリーを調製した（ゲル体積濃度約３０〜７０体積％）。このスラリーを５０ｍＬ遠沈管に加え、これを小型振動器 (SINFONIA TECHNOLOGY社製、VIBRATORY PACKER、VP-4D)上に固定し、上記ビーズ体積の変化がなくなるまで温度２５℃で振動を与えた。その後、遠沈管の目盛りから上記ゲル体積Ｖ₁、Ｖ₂を測定し、上述の算出式に基づき、収縮率を求めた。

III：５％動的吸着量
（１）溶液調製
下記Ａ〜Ｅ液及び中和液を調製し、使用前に脱泡した。
Ａ液：シグマ社製「Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ」とＲＯ水（逆浸透膜精製水）で調製）を用いてｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液を調製した。
Ｂ液：酢酸、酢酸ナトリウム、およびＲＯ水を用いてｐＨ３．５の３５ｍＭ酢酸ナトリウム水溶液を調製した。
Ｃ液：酢酸とＲＯ水を用いて１Ｍ酢酸水溶液を調製した。
Ｄ液：バクスター社製ガンマガード（ポリクロナール抗体）と前記Ａ液を用いて濃度１ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ水溶液を調製した。
Ｅ液：尿素とＲＯ水で６Ｍ尿素水溶液を調製した。 中和液：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンとＲＯ水で２Ｍのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを調製した。

（２）充填、準備
カラムクロマトグラフィー用装置として、ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ１００（ＧＥヘルスケア社製）を用い、直径０．５ｃｍ、高さ１５ｃｍのカラムに、吸着体試料（架橋ビーズにリガンドを結合したもの）を３ｍＬ入れ、線速２３０ｃｍ／ｈで０．２ＭのＮａＣｌ水溶液（ＲＯ水使用）を１５分通液して充填した。フラクションコレクターに１５ｍｌの採取用チューブをセットし、溶出液の採取用チューブについては、あらかじめ中和液を入れておいた。

（３）ＩｇＧ精製
前記カラムにＡ液を１５ｍＬ通液し、次いでＤ液を１５０ｍＬ通液した。次いで、Ａ液を２１ｍＬ通液後、Ｂ液を１２ｍＬ通液してＩｇＧを溶出させた。次にＣ液を６ｍＬ、Ｅ液を６ｍＬ、Ａ液を１５ｍＬ通液した。なお各液の流速は１ｍＬ／分とし、吸着体との接触時間が３分となるようにした。
（４）動的吸着量
ＩｇＧが５％破過するまでに吸着体に吸着したＩｇＧ量と吸着体体積からＩｇＧの動的吸着量（５％ＤＢＣ）を求めた。

IV：２０％圧縮応力
（１）試料調製
試料ビーズに純水を加えてスラリー（濃度約５０体積％）を調製した。このスラリーの攪拌による均質化と、それに続く３０分以上の減圧による脱泡とからなる均質・脱泡操作を３回繰り返して実施し、脱泡スラリーを得た。この操作とは別に、処理対象を純水に変えて、前記均質・脱法操作を９０分以上実施し、脱泡水を得た。

（２）ビーズ充填シリンジ調製
５ｍＬのＨＡＮＫＥ ＳＡＳＳ ＷＯＬＦ社製ルアロック付ディスポーザブルシリンジ（商標名：ＮＯＲＭ−ＪＥＣＴ）の先端にディスポーザブルフィルター（孔径５．００μｍ、親水性）を取り付けた。シリンジのピストンを外し、シリンジ後端側から脱泡水を約３ｍＬ投入し、この脱泡水が０ｍLの標線を下回らないうちに、脱泡スラリーを投入した。ディスポーザブルフィルターの２次側にアスピレーターを接続し、液面がビーズ面を下まわらない様に注意しながら、前記脱泡スラリーを吸引した。ビーズ面の約０．５ｍＬ上まで液面が下がったところで吸引を停止した。以降の作業は、液面がビーズ面を下回らないよう、前記脱泡水を適宜追加しながら実施した。振動を与えながら前記脱泡スラリーを追加またはビーズを除去し、ビーズ面を３ｍＬの標線に合わせ、振動を与えてもビーズ面が低下しないことを確認した。ビーズが舞わないようゆっくり脱泡水を溢れるまで追加し、気泡が入らないように注意しながらピストンを挿入した（ビーズ充填シリンジ）。

（３）測定
レオテック社のＦＵＤＯＨ ＲＨＥＯ ＭＥＴＥＲに１０Ｋのロードセルを取り付け、変位速度のダイヤルを２ｃｍ／ＭＩＮに合わせ、前記ビーズ充填シリンジをセットし、ピストンの変位を開始した。変位と応力との関係を記録し、下記式に基づき、２０％圧縮応力を求めた。
２０％圧縮応力＝充填ビーズが２０％圧縮された時の応力―ピストンがビーズ面に達する直前の応力

V：圧密化線速
（１）カラム充填処理
試料ビーズ８９．５ｍＬをＲＯ水に分散し、線速３００ｃｍ／ｈでカラム（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製、内径２．２ｃｍ）に充填した。
（２）測定
ＡＫＴＡｐｉｌｏｔ （ＧＥヘルスケア社製）にカラムを装填し、流速５ｍＬ／分（線速度７９ｃｍ／ｈｒ）でＲＯ水を通液した。以降、５ｍＬ／分ずつ流速を上げていき、カラム入口圧が上昇し続け通液不能となった時（本試験では２ＭＰａを超えた時）の線速度を圧密化線速とした。

製造例１
粉末状のセルロース（旭化成ケミカルズ社製局方セルロース「ＰＨ−Ｆ２０ＪＰ」）８．６５ｇを１１２ｇの水に分散させ、４℃で保持した。そこに３４．５ｗｔ％水酸化ナトリウム水溶液３５ｇを添加し撹拌した。２０分撹拌した後、水を１６ｇ添加し、水酸化ナトリウム濃度を７．０ｗｔ％とし、１５℃まで昇温した。ソルビタンモノオレエートを９．２ｇ含有する１，２−ジクロロベンゼン８９０ｇの溶液の温度を１５℃に保ち、この溶液に前記で得られたセルロース微分散液を分散させた。翼径４５ｍｍ、翼間隔７５ｍｍの２段タービン翼を備えた内径８５ｍｍの円筒型容器（以下、第１容器という）に前記分散液を入れ、速度６００ｒｐｍで１０分間撹拌し、ついでメタノールを１５０ｍｌ添加し、ビーズ状のセルロースを得た。得られたセルロースビーズをメタノールで洗浄した後、水で洗浄した。得られたセルロースビーズを櫛目開き３８μｍと櫛目開き９０μｍのメッシュを用いて篩分けし、３８μｍ〜９０μｍのセルロース粒子を取得した。

得られたセルロース多孔質ビーズを２−メチル−２−プロパノールで置換し、凍結乾燥後、走査型電子顕微鏡（日立製作所Ｓ−８００、以下ＳＥＭと称する）で観察し、多孔質ビーズであることを確認した。得られたビーズのゲル分配係数（Ｋａｖ）より排除限界分子量を計算したところ、６．０×１０¹⁰であった。

実施例６
（１）収縮架橋工程
製造例１で得られたセルロース多孔質ビーズ（水洗浄品）のゲル１００ｍＬをガラスフィルターの上に載せ、エタノールでリパルプした後、このエタノールを吸引除去する溶媒置換操作を４回実施した。エタノール量は、溶媒置換操作１回目〜３回目：２３３ｍＬ、溶媒置換操作４回目：１６７ｍＬとした。溶媒置換操作後、翼径３９ｍｍのパドル翼を備えた内径８５ｍｍの円筒型容器（以下、第２容器という）に移し、同じ溶媒を加えて全体が１４９ｍＬになる様に容量を調整した後、４０℃に加温した。さらにエピクロロヒドリンを８０ｍＬ加え、回転数２００ｒｐｍで３０分撹拌した。次いで１７ＭのＮａＯＨ水溶液１０ｍＬと水８６ｍＬからなる混合液を添加し、回転数３５０ｒｐｍで１時間３０分撹拌することでセルロース多孔質ビーズを収縮架橋させた（この反応を収縮架橋本反応という）。収縮架橋本反応液中のエピクロロヒドリン濃度は２４．６体積％であり、有機溶媒比率（エタノール比率）は０．６１であり、ＮａＯＨ濃度は０．７０Ｍであり、セルロース多孔質ビーズ濃度（スラリー濃度）は３０．８体積％であった。１７ＭのＮａＯＨ水溶液を９．６ｍＬ加えて回転数３５０ｒｐｍで１．５時間撹拌する追加処理を３回実施した後、濾過し、濾過物を２０％エタノール水で洗浄し、ついで水で洗浄することによって途中架橋ビーズを得た。この収縮架橋工程による収縮率を求め、下記表１に示した。

（２）追加架橋工程
得られた途中架橋ビーズ全量に水を加えて全体の容量を１１７ｍＬに調整し、収縮架橋工程で用いた第２容器に移した後、温度４０℃に加温した。硫酸ナトリウムを３８ｇ加え、回転数１５０ｒｐｍで１０分間撹拌した後、エピクロロヒドリン３３ｍＬを加え、回転数２５０ｒｐｍで１０分間撹拌した。次いで１７ＭのＮａＯＨ水溶液を２１ｍＬ加えて回転数３００ｒｐｍで２．５時間撹拌し、最後に１７ＭのＮａＯＨ水溶液５．１ｍＬを追加してさらに２．５時間撹拌した。反応物を濾過し、濾過物を水洗することによって架橋ビーズを得た。得られた架橋ビーズ全量を、ガラス製三角フラスコに入れ、ＲＯ水で希釈して全量を２００ｍＬとした後、開口部にアルミニウム箔２枚を重ねて蓋をし、オートクレーブを用いて１２７℃で６０分間加熱し、残存するエポキシ基をグリセリル基に変換した。室温まで放冷後、グラスフィルター上で２００ｍＬのＲＯ水で洗浄した。オートクレーブ後のビーズを櫛目開き３８μｍと櫛目開き９０μｍのメッシュを用いて篩分けし、３８μｍ〜９０μｍの架橋ビーズを取得した。

（３）プロテインＡ調製工程
ＷＯ２０１２／１３３３４９号を参照して、配向制御型プロテインＡとして、ＷＯ２０１２／１３３３４９号記載の改変Ｃドメイン５連結体を調製した。

（４）リガンド固定化工程
追加架橋工程で得られた架橋ビーズ３．５ｍＬを遠沈管に入れ、ＲＯ水を加えて、全量を６ｍＬとした。これを２５℃にてミックスローター（アズワン社製 ミックスローターＭＲ−３）上に取り付けた後、撹拌した。次に過ヨウ素酸ナトリウムをＲＯ水に溶解して、１１．１６ｍｇ／ｍＬの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を２．０ｍＬ加え、２５℃で１時間撹拌した。反応後、グラスフィルター（シバタ社製 １１ＧＰ１００）上で、濾液の電気伝導度が１μＳ／ｃｍ以下となるまでＲＯ水で洗浄し、ホルミル基含有架橋ビーズを得た。洗浄濾液の電気伝導度は、導電率計（ＥＵＴＥＣＨ ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ社製、ＥＣＴｅｓｔｅｒ１０ Ｐｕｒｅ＋）で測定した。

得られたホルミル基含有架橋多孔質セルロースビーズ３．５ｍＬをグラスフィルター（シバタ社製 １１ＧＰ１００）上で、ｐＨ１２の０．６Ｍクエン酸バッファー（ＲＯ水使用）で置換した。ｐＨ１２の０．６Ｍクエン酸バッファーを用い、置換後のホルミル基含有架橋多孔質セルロースビーズを遠沈管に入れ、総体積量７．５ｍＬとなるように液量を調整した。ここにプロテインＡ調製工程で得られた配向制御型プロテインＡが入った水溶液（プロテインＡの濃度が５３．８ｍｇ／ｍＬ）を０．９８ｇ加えた後、６℃にて２３時間、ミックスローター（アズワン社製 ミックスローターＭＲ−３）を用い、攪拌させながら反応した。

その後、反応液を回収（反応液１）し、ｐＨ８の０．１Ｍクエン酸ナトリウム水溶液（ＲＯ水使用）で置換して、６℃で４時間ミックスローター（アズワン社製 ミックスローターＭＲ−３）を用いて、攪拌した。引き続き、５．５質量％濃度のジメチルアミンボラン水溶液（ＲＯ水使用）を１．９３ｍＬ加えて、６℃で１時間攪拌した後、反応温度を２５℃に上昇し、２５℃で１８時間、ミックスローター（アズワン社製 ミックスローターＭＲ−３）を用いて攪拌しながら反応した。反応後、反応液を回収した（反応液２）。反応液１及び２の２７８ｎｍ付近の吸収極大のＵＶ吸光度を測定し、仕込んだリガンド量から差し引くことで、プロテインＡ固定化量を算出した。結果を表１に示す。

反応後のビーズをグラスフィルター（シバタ製 １１ＧＰ１００）上で、ビーズの３倍体積量のＲＯ水で洗浄した。次いで、３倍体積量の０．１Ｎクエン酸水溶液（ＲＯ水使用）を加え、当該ビーズに０．１Ｎクエン酸水溶液（ＲＯ水使用）を加えて全量を３０ｍＬ以上とし、遠沈管に入れ、２５℃で３０分間攪拌しながら、酸洗浄を行った。

酸洗浄後、ビーズをグラスフィルター（シバタ製１１ＧＰ１００）上で、ビーズの３倍体積量のＲＯ水で洗浄し、次いで、３倍体積量の０．０５Ｍ濃度の水酸化ナトリウムと１Ｍ濃度の硫酸ナトリウムを含む水溶液（ＲＯ水使用）を加えた。次に、当該ビーズに、０．０５Ｍ濃度の水酸化ナトリウムと１Ｍ濃度の硫酸ナトリウムを含む水溶液を加えて全量を３０ｍＬ以上とし、遠沈管に入れ、室温で３０分間攪拌しながら、アルカリ洗浄を行った。

アルカリ洗浄後、ビーズをグラスフィルター（シバタ製 １１ＧＰ１００）上で、ビーズの２０倍体積量のＲＯ水で洗浄した。次に、ビーズの３倍量の０．１Ｎクエン酸ナトリウム水溶液（ＲＯ水使用）を加え、濾液が中性になっていることを確認した後、ＲＯ水を用いて、洗浄濾液の電導度が１μＳ／ｃｍ以下になるまで洗浄し、目的とする配向制御型プロテインＡを固定化した吸着体を得た。洗浄濾液の電導度は導電率計（ＥＵＴＥＣＨ ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ社製、ＥＣＴｅｓｔｅｒ１０ Ｐｕｒｅ＋）で測定した。

上記のようにして得られた架橋ビーズ（追加架橋工程後）の圧密化線速と２０％圧縮応力、および吸着体の５％動的吸着量（接触時間３分）を測定した。架橋ビーズの圧密化線速は、１６５８ｃｍ／ｈｒであった。残りの結果を表１に示す。

実施例７〜８
収縮架橋工程で使用したエタノールを表１に示す各有機溶媒に変更し、収縮架橋工程における有機溶媒比率、エピクロロヒドリン濃度、ＮａＯＨ濃度、スラリー濃度（セルロース多孔質ビーズ濃度）を表１に示す値に変更する以外は実施例６と同様にした。結果を表１に示す。

実施例９〜１０、比較例３
（１）収縮架橋工程
製造例１で得られたセルロース多孔質ビーズ（水洗浄品）のゲル１５ｍＬをガラスフィルターの上に載せ、表２に示す特定の溶媒１５ｍＬでリパルプした後、この特定溶媒を吸引除去する溶媒置換操作を３回実施した。溶媒置換操作後、ゲル全量を遠沈管に入れ、同じ特定溶媒を加えて全体が１７．５ｍＬになる様に容量を調整し、さらにエピクロロヒドリンを８．７ｍＬ加えて一晩撹拌した。次いで水１０．３ｍＬと１７ＭのＮａＯＨ水溶液２．１ｍＬを添加し、温度４０℃で１時間３０分撹拌することでセルロース多孔質ビーズを収縮架橋させた（収縮架橋本反応）。収縮架橋本反応液中のエピクロロヒドリン濃度、有機溶媒比率、ＮａＯＨ濃度、セルロース多孔質ビーズ濃度（スラリー濃度）を下記表２に示した。１７ＭのＮａＯＨ水溶液を１．０５ｍＬ加えて１．５時間撹拌し、ついで１７ＭのＮａＯＨ水溶液を１．０５ｍＬ加えて２時間撹拌する追加処理を実施した後、濾過し、濾過物を２０％の特定溶媒水溶液で洗浄し、ついで水で洗浄することによって途中架橋ビーズを得た。この収縮架橋工程による収縮率を求め、下記表２に示した。

（２）追加架橋工程
得られた途中架橋ビーズ全量を遠沈管に入れ、水を加えて全体の容量を１７．５ｍＬに調整し、温度４０℃に加温した。硫酸ナトリウム５．６７ｇ、エピクロロヒドリン４．９５ｍＬ、１７ＭのＮａＯＨ水溶液３．１４ｍＬ加えて温度４０℃で２．５時間撹拌し、最後に１７ＭのＮａＯＨ水溶液０．７６ｍＬを追加してさらに２．５時間撹拌した。反応物を濾過し、濾過物を水洗することによって架橋ビーズを得た。得られた架橋ビーズ全量を、ガラス製三角フラスコに入れ、ＲＯ水で希釈して全量を５０ｍＬとした後、開口部にアルミニウム箔２枚を重ねて蓋をし、オートクレーブを用いて１２７℃で６０分間加熱した。室温まで放冷後、グラスフィルター上で５０ｍＬのＲＯ水で洗浄し、残存するエポキシ基をグリセリル基に変換した。オートクレーブ後のビーズを櫛目開き３８μｍと櫛目開き９０μｍのメッシュを用いて篩分けし、３８μｍ〜９０μｍの吸着体を取得した。

（３）プロテインＡ調製工程
ＷＯ２０１１／１１８６９９号の実施例を参照して、改変型プロテインＡとして、ＷＯ２０１１／１１８６９９号記載のアルカリ耐性を有する改変Ｃドメイン５連結体を調製した。

（４）リガンド固定化工程
追加架橋工程で得られた架橋多孔質セルロースビーズ５ｍＬを遠沈管に入れ、ＲＯ水を加えて、全量を７．５ｍＬとした。これを２５℃にてミックスローター（アズワン社製 ミックスローターＭＲ−３）上に取り付けた後、撹拌した。次に過ヨウ素酸ナトリウムをＲＯ水に溶解して、１２．８４ｍｇ／ｍＬの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を２．５ｍＬ加え、２５℃で１時間撹拌した。反応後、グラスフィルター（シバタ社製 １１ＧＰ１００）上で、濾液の電気伝導度が１μＳ／ｃｍ以下となるまでＲＯ水で洗浄し、ホルミル基含有架橋多孔質セルロースビーズを得た。洗浄濾液の電気伝導度は、導電率計（ＥＵＴＥＣＨ ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ社製、ＥＣＴｅｓｔｅｒ１０ Ｐｕｒｅ＋）で測定した。

得られたホルミル基含有架橋多孔質セルロースビーズ５ｍＬをグラスフィルター（シバタ社製 １１ＧＰ１００）上で、０．２５Ｍクエン酸バッファー（クエン酸三ナトリウム二水和物とＲＯ水を用いて調整）で置換した。０．２５Ｍクエン酸バッファーを用い、置換後のホルミル基含有架橋多孔質セルロースビーズを遠沈管に入れ、総体積量７．５ｍＬとなるように液量を調整した。ここにプロテインＡ調製工程で得られたアルカリ耐性型プロテインＡが入った水溶液（プロテインＡの濃度が７０．３ｍｇ／ｍＬ）を２．１３ｇ加え、０．０８Ｎの水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを１２に調整した後、６℃にて２３時間、ミックスローター（アズワン社製 ミックスローターＭＲ−３）を用い、攪拌させながら反応した。

その後、反応液のｐＨが５になるまで２．４Ｍクエン酸水溶液（クエン酸一水和物とＲＯ水を用いて調整）を加え、６℃で４時間ミックスローター（アズワン社製 ミックスローターＭＲ−３）を用いて、攪拌した。引き続き、５．５重量％濃度のジメチルアミンボラン水溶液（ＲＯ水を使用）を１．１３ｍＬ加えて、６℃で１時間攪拌した後、反応温度を２５℃に上昇し、２５℃で１８時間攪拌しながら反応した。反応後、反応液を回収し、２７８ｎｍ付近の吸収極大のＵＶ吸光度を測定し、仕込んだリガンド量から差し引くことで、プロテインＡ固定化量を算出した。

以下の工程は実施例６のリガンド固定化工程と全く同じ操作を繰り返すことで、反応後のビーズを洗浄（酸洗浄、アルカリ洗浄、中性化）し、目的とするアルカリ耐性型プロテインＡを固定化した吸着体を得た。

上記のようにして得られた架橋ビーズ（追加架橋工程後）の２０％圧縮応力と、吸着体１ｍＬ当たりのプロテインＡ固定化量と吸着体の５％動的吸着量（接触時間３分）を測定した。結果を表２に示す。

実施例１１〜１７
収縮架橋工程で使用する溶媒を表３に示すものに変更する以外は、実施例９〜１０と同様に実施した。結果を表３に示す。また収縮率と２０％圧縮応力の関係を図５に示す。

比較例４
（１）架橋工程１回目
製造例１で得られたセルロース多孔質ビーズ（水洗浄品）のゲル２０ｍＬをガラスフィルターの上に乗せ、ＲＯ水でリパルプした後、ＲＯ水を吸引除去した。このビース全量を遠沈管に入れ、２ＭのＮａＯＨ水溶液を１２．２ｍＬ加え混合した。さらにグリセロールポリグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ３１４）６．６ｍＬと硫酸ナトリウム７．６ｇを加えて、温度４０℃で５時間撹拌することでセルロース多孔質ビーズを架橋させた。その後、濾過し、濾過物を水で洗浄することによって途中架橋ビーズを得た。

（２）架橋工程２回目
得られた途中架橋ビース全量を遠沈管に入れ、２ＭのＮａＯＨ水溶液を１２．２ｍＬ加え混合した。さらにグリセロールポリグリシジルエーテル６．６ｍＬと硫酸ナトリウム７．６ｇを加えて、温度４０℃で５時間撹拌後、濾過し、濾過物を水で洗浄することによって架橋ビーズを得た。得られた架橋ビーズ全量を、ガラス製三角フラスコに入れ、ＲＯ水で希釈して全量を５０ｍＬとした後、開口部にアルミニウム箔２枚を重ねて蓋をし、オートクレーブを用いて１２７℃で６０分間加熱した。室温まで放冷後、グラスフィルター上で５０ｍＬのＲＯ水で洗浄し、残存するエポキシ基をグリセリル基に変換した。オートクレーブ後のビーズを櫛目開き３８μｍと櫛目開き９０μｍのメッシュを用いて篩分けし、３８μｍから９０μｍの架橋ビーズを取得した。架橋後の収縮率は０％であった。

以下、実施例９〜１０と同様に（４）リガンド固定化工程を実施し、目的とするアルカリ耐性型プロテインＡを固定化した吸着体を得た。

上記のようにして得られた架橋ビーズ（架橋工程２回目後）の２０％圧縮応力と、吸着体１ｍＬ当たりのプロテインＡ固定化量と吸着体の５％動的吸着量（接触時間３分）を測定した。２０％圧縮応力は０．０８４ＭＰａ、固定化量は１４．８ｍｇ／ｍＬ−ｇｅｌ、５％動的吸着量（ＤＢＣ）は２２．０ｍｇ／ｍＬ−ｇｅｌであった。

第１の態様に関する多孔質セルロースビーズは、様々な置換基を付加させることで様々な物質の吸着体として利用できる。また第２の態様に関するリガンド固定化用担体は、リガンドを固定させることで吸着体にすることができる。

Claims (15)

1. ａ）アルカリ水溶液とセルロースとを混合して−５℃〜１０℃のセルロース微分散液を作製し、
   ｂ）セルロース微分散液に水を加えてセルローススラリーとした後、
   ｃ）セルローススラリーを昇温し、
   ｄ）昇温したセルローススラリーを凝固溶媒に接触させ、
   セルロース微分散液とセルローススラリーの温度差が１℃以上、３０℃以下であることを特徴とする、多孔質セルロースビーズの製造方法。
2. 凝固時の温度が、セルローススラリーまたはセルローススラリーの液滴分散液体の温度に対して、±１０℃以内である請求項１に記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。
3. セルロース微分散液のアルカリ濃度が８ｗｔ％以上１０ｗｔ％以下である、請求項１または２に記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。
4. セルローススラリーのアルカリ濃度が５ｗｔ％以上である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。
5. セルローススラリーを作製する温度が４℃以上２０℃以下である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。
6. 前記セルローススラリーを分散媒である非水溶性液体に液―液分散し液滴を作製した後、該液―液分散液を凝固溶媒に接触させる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。
7. 前記セルローススラリーのセルロースの濃度が１〜７ｗｔ％である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。
8. 前記セルロースが再生セルロース、結晶性セルロース、微結晶性セルロース、または酢酸セルロースである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。
9. 前記セルロースの重合度が１０００以下である、請求項８に記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。
10. 前記非水溶性液体がジクロロベンゼン、ヘキサン、酢酸エチル、炭素数６〜１２の直鎖状飽和脂肪酸、炭素数１６〜２４の不飽和脂肪酸、融点が１００℃以下の動植物油脂類、水素添加動植物油、動植物油脂類やその水素添加物の高融点画分を分別精製した分別油、飽和脂肪酸トリグリセリド類、食用ワックス類、微細藻類由来油脂類、微生物油脂類、中鎖脂肪酸トリグリセリド類、または不飽和脂肪酸トリグリセリド類である、請求項６〜９のいずれか一項に記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。
11. 前記凝固溶媒がアルコール類またはグリコール類を含有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。
12. 前記アルコール類がイソブタノール、２−ブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、２−メチル−２−プロパノール、１−プロパノール、２−プロパノール、エタノール、及びメタノールからなる群より選択される１種以上である、請求項１１に記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。
13. 前記グリコール類がグリセロール、エチレングリコール、及びプロピレングリコールからなる群より選択される１種以上である、請求項１１に記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。
14. 排除限界分子量が１．０×１０⁶〜１．０×１０¹¹である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。
15. メジアン粒子径が５０μｍから１００μｍである、請求項１４に記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。