DE69128732T2

DE69128732T2 - Affinitätstrennung mit mikroporösen aktivierten Polyamidmembranen

Info

Publication number: DE69128732T2
Application number: DE69128732T
Authority: DE
Inventors: Pamela A Feldhoff; Elias Klein
Original assignee: Akzo Nobel NV
Current assignee: Mat Adsorption Technologies & Co Kg 42103 W GmbH
Priority date: 1990-02-09
Filing date: 1991-02-11
Publication date: 1998-07-02
Anticipated expiration: 2011-02-12
Also published as: ATE162424T1; US5053133A; EP0441660B1; EP0441660A1; JPH08104773A; DE69128732D1; ES2112851T3

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die Affinitätsreinigung ("Affinitätschromatographie") bezeichnet im allgemeinen Trennungsmethoden, die auf einem relativ hohen Bindungsvermögen ("Affinität") eines zu reinigenden Zielmaterials, im allgemeinen als "Ligat" bezeichnet, gegenüber einem komplementären Liganden beruhen. Derartige Reinigungen können in Lösung durchgeführt werden, es ist jedoch üblicher, einen unter anderem hinsichtlich seiner Selektivität bezüglich des Zielmaterials ausgewählten Liganden auf einer Trägermatrix zu immobilisieren. Die in bezug auf das Ligat zu reinigende Lösung wird dann mit dem matrixgebundenen Liganden in Kontakt gebracht, der resultierende Ligat/Ligand-Komplex wird anschließend dissoziiert und das Ligat wird gegebenenfalls wiedergewonnen. Dieses Verfahren fand insbesondere in der Trennung biologischer Materialien Anwendung, vor allem bei biologischen Makromolekülen, wie z. B. Proteinen.
Während biologische Reinigungen auf der Grundlage solcher Affinitätstrennungen in der Theorie relativ einfach erscheinen, traten in der Praxis zahlreich Probleme auf, insbesondere im Hinblick auf die Herstellung von Matrixsystemen, die für eine schnelle Trennung sowie optimale Ausbeute und Reinheit des Zielmaterials angepaßt sind. Idealerweise sollten Matrizen für Ligandimmobilisierungen eine große Oberfläche besitzen und ein offenes und lockeres, poröses Netzwerk aufweisen, um die Wechselwirkung zwischen dem matrixgebundenen Liganden und dem Ligat während dem Trennungsprozeß zu maximieren. Die Matrix sollte chemisch und biologisch inert sein, zuallermindest gegenüber dem Liganden und dem Ligat; sie sollte für eine Ligandimmobilisierung angepaßt sein; und sie sollte unter den angewendeten Reaktionsbedingungen, z. B. während der Matrixaktivierung, Ligandbindung und der Komplexbildung zwischen Ligand und Ligat stabil sein, insbesondere im Hinblick auf das verwendete Lösungsmittel und Salz, den herrschenden pH und die verwendete Temperatur. Außerdem sollte die Matrix unter den üblichen Lagerungsbedingungen über eine vernünftige Zeitspanne stabil sein. Um Konkurrenz für das Zielmaterial zu minimieren und die Reinheit des wiedergewonnenen Produkts zu maximieren, sollten Träger für die Ligandimmobilisierung, vor allem bei biospezifischen Liganden, keine überschüssigen Positionen für den Ionenaustausch aufweisen und keine nicht- spezifischen Bindungen fördern. Matrizen, vor allem solche, die in unter Druck ausgeführten Affinitätstrenntechniken verwendet werden, sollten mechanisch stabil sein und zumindest den bei konventionellen Systemen verwendeten gemäßigten Drücken (z. B. bis zu ca. 5 bar) standhalten. Da Matrizen häufig derivatisiert sind, z. B. ,um eine Ligandimmobilisierung zu fördern oder eine verbesserte Wechselwirkung zwischen Ligand und Zielmaterial zu ermöglichen, sollte die Matrix darüberhinaus für diese Zwecke leicht derivatisierbar sein, vorzugsweise bei Raumtemperatur und in wässriger Lösung, ohne daß toxische Chemikalien verwendet werden müssen; auch die derivatisierte Matrix sollte die oben aufgeführten Kriterien erfüllen.
Seit die Prinzipien der Affinitätschromatographie zum ersten Mal veröffentlicht wurden, sind im Laufe der Jahre eine Reihe brauchbarer Matrixmaterialien entdeckt worden. Dazu gehören: Agarosegele, Cellulose, Dextran, Polyacrylamid, Hydroxyalkylmethacrylatgele, Polyacrylamid/Agarosegele, Ethylen- Copolymere, insbesondere mit Polyvinylacetat, Methacrylamid- Copolymere, Methylenbismethacrylamid, Glycidylmethacrylat und/oder Allyl-Glycidyl-Ether (wie Eupergit C, Röhm Pharma, Darmstadt, Deutschland) und diolsubstituiertes Siliciumdioxid.
Diese und ähnliche bekannte Matrixmaterialien sind in der Vergangenheit üblicherweise mit dem ausgewählten Liganden gekoppelt und in Form von Kügelchen in Chromatographiesäulen verteilt worden. Das zu reinigende Material wird dann durch die Säule gegeben; das Zielmaterial wird von den Kügelchen absorbiert und gegebenenfalls nacher durch Desorption des Ligats und Elution aus der Säule wiedergewonnen. Die heute verwendeten Kügelchen liegen in einem Größenbereich von ca. 60 bis ca. 300 mesh (U.S.-Standard) und müssen dementsprechend eine ausreichende Porosität aufweisen, um den Zutritt des Zielmaterials zu den im Innern gebundenen Liganden für eine effiziente Trennung zu ermöglichen; die Herstellung von Kügelchen, die sowohl eine gute Porosität als auch eine gute Stabilität besitzen, erwies sich als schwierig. Da Chromatographiesäulen aus Kügelchen darüberhinaus gerne mit biologischen Bruchstücken zusammenklumpen, was zu einem Druckanstieg und einem Kollaps der Kügelchen führt, müssen Partikel vor Durchführung der Affinitätstrennung aus dem zu reinigenden Material abfiltriert werden; dies führt häufig zu einem Verlust an Produkt und in vielen Fällen (z. B. wenn das Ligat aus einem genetisch manipulierten Mikroorganismus stammt), ist ein ausreichendes Entfernen von Partikeln aus der Rohpräparation schwierig oder unmöglich.
Um diese Probleme zu bewältigen, wurden in jüngster Zeit Techniken entwickelt, bei denen anstatt von Kügelchen mikroporöse Membranen oder Filme als bevorzugte Matrixform zur Immobilisierung von Liganden in Affinitätstrennungen verwendet werden. Bei Affinitätstrennsystemen, die mikroporöse Membranen verwenden, fließt die das Ligat enthaltende rohe Filtrationsflüssigkeit durch die Membran, üblicherweise unter Druck, mit Hilfe von Konvektionsprozessen, die das Ligat schnell unmittelbar in die Nachbarschaft der auf der Matrix immobilisierten Affinitätsliganden bringen; im Gegensatz dazu stehen die wesentlich langsameren Diffusionsprozesse, die den Fluß der Rohflüssigkeit über die Matrizen kennzeichnen, typisch für die oben beschriebenen konventionellen chromatographischen Trennungen mit Kügelchen. Zusätzlich sind die gebundenen Liganden dank der großen Oberfläche dieser Membranen den im zu reinigenden Material enthaltenen Ligaten in hohem Maße ausgesetzt.
In einem ersten Aspekt stellt die Erfindung eine Verbundmatrix zur Immobilisierung eines Liganden zur Verfügung, der in einer Affinitätstrennung verwendet werden kann, oder eine Verbindung, die in der Ionenaustauschchromatographie verwendbar ist, wobei die Verbundmatrix einen mikroporösen Polyamidfilm mit durch einen Aktivator aktivierten Aktivierungsstellen umfaßt und der Polyamidfilm zur Bildung der Verbundmatrix an den aktivierten Stellen des Films kovalent an eine Polyhydroxyverbindung gebunden ist.
Die Erfindung stellt auch eine Verbundmembran zur Affinitätstrennung zur Verfügung, die eine Verbundmatrix wie oben definiert umfaßt, bei der ein für die Affinitätstrennung angepaßter Ligand oder eine für die Ionenaustauschchromatographie angepaßte Verbindung an die Verbundmatrix gebunden ist.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer wie hier zuvor definierten Verbundmembran zur Immobilisierung eines Liganden zur Verfügung, der in der Affinitätstrennung verwendet werden kann oder einer Verbindung, die in der Ionenaustauschchromatographie verwendbar ist, umfassend: (1) Aktivierung von zumindest einigen der Aktivierungsstellen eines mikroporösen Polyamidfilms mit einem Aktivator, (2) Reaktion der aktivierten Gruppen mit einer Polyhydroxyverbindung, um die Polyhydroxyverbindung für die Bildung einer Verbundmatrix kovalent an den Polyamidfilm zu binden und anschließender (3) Aktivierung der Aktivierungsstellen der Verbundmatrix, die noch nicht reagiert haben, mit demselben oder einem anderen Aktivator, um die Bindung des Liganden oder der Verbindung zu fördern.
Die Erfindung stellt somit eine verbesserte Matrix zur Affinitätstrennung zur Verfügung, die eine aktivierte mikroporöse Polyamidmembran umfaßt zur Immobilisierung von Liganden, die ausgewählt sind, ein Ziel-Ligat zu komplexieren. Die Membran kann ein im wesentlichen inertes aliphatisches (d. h. nicht-aromatisches) semikristallines Polyamid durchschnittlicher Porengröße umfässen, das festes Material oder Partikel in der Substratflüssigkeit zurückhält, gelöstes Material, einschließlich des Zielligat-Materials, jedoch durchläßt, um eine maximale Wechselwirkung des Ligats mit dem gebundenen Liganden und eine Abtrennung von Partikeln ohne einen vorhergehenden Filtrationsschritt zu ermöglichen. Die Aktivierung der Membran gemäß der Erfindung liefert hohe Produktausbeuten, eine geringe nicht-spezifische Absorption (als Folge, z. B. einer Einführung überschüssiger Ladungen in konventionelle Membranen während der Verarbeitung) und die Bildung einer äußerst stabilen Bindung zwischen dem ausgewählten Liganden und der Membran. Die Matrix der Erfindung ist insbesondere für die Trennung von biologischem Material, insbesondere von Proteinen und vor allem zur Wiedergewinnung oder Entfernung ausgewählter Blutproteine, wie pathologischer Antigene und Antikörper geeignet.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

1. Ausgangsmaterial

Das Ausgansmaterial für die Herstellung einer Matrix gemäß der Erfindung umfaßt eine mikroporöse Polyamidmembran oder einen entsprechenden Film, die wie weiter unten beschrieben aktiviert wird, um mit einem nach Affinität gegenüber dem Ziel- Ligat ausgewählten Liganden zu reagieren und diesen zu binden, oder aktiviert wird zur Herstellung einer mikroporösen Verbundmembran als Zwischenprodukt, die dann wiederum aktiviert wird, um mit dem ausgewählten Liganden zu reagieren und diesen zu binden.
Im allgemeinen umfassen brauchbare Ausgangspolyamidmembranen zur Aktivierung gemäß der Erfindung filmbildende, aliphatische, semikristalline, mikroporöse Polyamidfilme, die aus Polymeren oder Copolymeren natürlicher oder synthetischer Polyamide stammen, bei denen die aliphatische Komponente üblicherweise bis zu ca. 20 Kohlenstoffatome enthält und die verzweigt oder unverzweigt, gesättigt oder ungesättigt, substituiert oder unsubstituiert sind, wie in der Technik allgemein bekannt.
Die Filme besitzen eine durchschnittliche Porengröße, die ausreicht, im zu filtrierenden Material enthaltenes partikuläres Material zurückzuhalten, die jedoch den Durchgang von gelöstem Material einschließlich des Zielligats zuläßt; durchschnittliche Filmporengrößen von bis zu ca. 3 µ z. B. von ca. 0.6 µ bis zu ca. 3 µ, oder insbesondere z. B. von 2 µ bis 3 µ sind im allgemeinen für typische biologische Anwendungen geeignet. Für eine Aktivierung gemäß der Erfindung geeignete Ausgangsmembranen oder -filme sind im wesentlichen unlöslich in den Lösungsmitteln, mit denen sie während der Aktivierung, der Bindung des Liganden und/oder Verwendung in Kontakt kommen, insbesondere Wasser und gebräuchliche organische Lösungsmittel wie Acetonitril, Aceton, Ether, Kohlenwasserstoffe oder Ketone und weisen in Gegenwart von solchen organischen Lösungsmitteln oder anderen organischen Flüssigkeiten, mit denen sie in Kontakt kommen, eine weitgehende Resistenz in bezug auf den Verlust ihrer Porenstruktur, z. B. durch Quellung, auf. In den meisten Anwendungen ist eine niedrige nicht-spezifische Adsorption wünschenswert, um eine Beeinträchtigung der Reinheit des wiedergewonnenen Ligats zu vermeiden; die Membranen der Verbindung sind in dieser Hinsicht bensonders vorteilhaft, da die zugrundeliegenden Polyamide im wesentlichen nicht hydrophob sind, was normalerweise in konventionellen Affinitätsmembranen die Quelle nicht-spezifischer Adsorptionen darstellt. Die Größe der Polymere ist kein kritischer Faktor; als Beispiel können Zahlenmittel des Molekulargewichts von ca. 15 000 bis ca. 30 000 Dalton angeführt werden. Polyamide mit höheren Molekulargewichten (z. B. über ca. 20 000 Dalton) sind besonders dann von Nutzen, wenn die Reinheit des Produkts das Ziel ist, da hierdurch die Zahl terminaler Carboxyl- und Aminogruppen in der Membran reduziert wird; während die terminalen Aminogruppen gemäß der Erfindung als Aktivierungsstellen eingesetzt werden, die nach Wunsch vermehrt werden können, stellen terminale nicht blockierte Carboxylgruppen potentielle Ionenaustauschpositionen dar und können zu einer unerwünschten nicht-spezifischen Adsorption beitragen. Viele solcher aliphatischen Polyamidfilme oder - hohlfasern sind in der Technik für andere Zwecke bekannt und werden unter anderem anhand der nicht-aromatischen Polyamidfilme oder- hohifasern folgender Patente, beispielhaft aufgeführt: U.S.-Patente 4340480 (Erfinder Pall, veröffentlicht 20. Juli 1982), 4340479 (Erfinder Pall, veröffentlicht 20. Juli 1982), 4595503 (Erfinder Schindler et al., veröffentlicht 17. Juni 1986) oder 4482514 (Erfinder Schindler et al., veröffentlicht 13. November 1984), U.S.-Patent 3876738 (Erfinder Marinaccio, veröffentlicht 8. April 1975), U.S.-Patent 4247498 (Erfinder Castro, veröffentlicht 27. Januar 1981), U.S.-Patent 4519509 (Erfinder Castro, veröffentlicht 28. Mai 1985), die alle hiermit durch einen Verweis eingeschlossen sind.
Besonders interessante Polyamidfilme umfassen Polycaprolactame, insbesondere die verschiedenen Nylons wie Nylon 6, 66, 610, 612 und 666.
Die Zahl der in der mikroporösen Ausgangspolyamidmembran aktivierbaren primären Aminogruppen (d. h., der -NH&sub2;-Gruppen) ist wichtig, da diese Gruppen die Aktivierungsstellen des Ausgangspolyamids darstellen; bevorzugte mikroporöse Ausgangsmembranen umfassen solche, bei denen die Polyamidkomponenten eine durchschnittliche Zahl an aktivierbaren primären Aminogruppen von wenigstens ca. 20 µM NH&sub2; pro Gramm Polyamid aufweisen. Alternativ kann die Zahl aktivierbarer primärer Aminogruppen auf einer mikroporösen Ausgangspolyamidmembran, die weniger Aktivierungsstellen als gewünscht enthält, erhöht werden, um eine erweiterte für die Verwendung im Rahmen der Erfindung geeignete Polyamidmembran zu erhalten. Die saure Hydrolyse einer mikroporösen Polyamidausgangsmembran unter Bedingungen, unter denen die Morphologie der Ausgangsmembran, insbesondere im Hinblick auf Porengröße und Porosität, nicht wesentlich verändert wird, liefert beispielsweise zusätzliche aktivierbare primäre Aminogruppenaktivierungsstellen. Andere Techniken, die die Zahl der in der Ausgangsmembran vorhandenen aktivierbaren primären Aminogruppen erhöhen ohne deren Integrität wesentlich zu stören, sind ebenfalls für die Erhöhung der Zahl der Aktivierungsstellen im Ausgangspolyamid verwendbar.
In einem Aspekt der Erfindung werden die primären Aminoaktivierungsstellen der Ausgangs- bzw. der erweiterten Polyamidmembran aktiviert, um eine Matrix gemäß der Erfindung zu erhalten, und der ausgewählte Ligand wird dann direkt an diese Stellen gebunden. Falls erwünscht, können die Aktivierungsstellen der Ausgangsmembran bzw. der erweiterten Membran gemäß der Erfindung aktiviert werden und zuerst mit einem Spacer- Molekül, wie einem Alkylendiamin (z. B. H&sub2;N-(CH&sub2;)n-NH&sub2;, wobei n eine Zahl zwischen ca. 1 und 5 darstellt) reagiert werden, um eine aminoterminale "Leine" zur Verfügung zu stellen, die an die Membran gebunden ist, um den Zugang des Ligats zum gebundenen Liganden, wie weiter unten im Detail erläutert, zu erleichtern; in diesem Fall wird die terminale Aminogruppe des Spacer-Moleküls zur Aktivierungsstelle der Ausgangsmembran. In einem anderen Aspekt der Erfindung werden die primären Aminoaktivierungsstellen entweder auf dem Ausgangs- oder dem erweiterten Polyamidmaterial gemäß der Verbindung aktiviert und ein Polyhydroxyl enthaltendes Material, beispielsweise ein Polysaccharid wird kovalent an die Ausgangspolyamidmembran gebunden durch Reaktion der aktivierten Stellen mit einem Teil der freien Hydroxylgruppen des Polyhydroxymaterials under ähnlichen, nicht-spaltenden Bedingungen zur Bildung einer Verbundmembran mit einer an die Ausgangspolyamidmembran gebundenen hydrophilen Schicht. Die in der Polyhydroxyschicht verbleibenden freien Hydroxylgruppen werden dann gemäß der Erfindung aktiviert, um die entsprechende Verbundmatrix zu bilden, und der ausgewählte Ligand wird an die aktivierten Hydroxylgruppen gebunden. Im ersten Fall erweitern eine saure Hydrolyse und ähnliche Methoden direkt die Ausgangspolyamidmembran, indem sie die Zahl der aktivierbaren primären Aminogruppen auf der Membran erhöhen. Im letzteren Fall wird die Ausgangsmembran indirekt durch das Polyhydroxymaterial erweitert, das die Funktion übernimmt, die Gesamtzahl an Aktivierungsstellen zu erhöhen, die Ligatdichte auf der Produktaffinitätsmembran zu erhöhen und den Abstand zwischen Ligandbindungsstelle und Membran zu vergrößern, um den räumlichen Zugang des Ligats zur Bindung des gebundenen Liganden zu erleichtern. Die hydrophile Schicht der Verbundmembran hat die zusätzliche Funktion, alle auf der Membran befindlichen Ionenaustauschstellen von den Zielligaten abzuschirmen.
Für die Erweiterung der Ausgangspolyamidmembran geeignete Polyhydroxymaterialien umfassen im wesentlichen wasserlösliche Oligomere oder Polymere, die eine Vielzahl von Hydroxylgruppen enthalten, die mit aktivierten Aminogruppen auf der Ausgangspolyamidmembran reagieren und aktivierbar sind gemäß dem Erfindungsprozeß, um einen Ligand zu binden zur Bildung einer stabilen, ungeladenen Verbundmatrix, wie im vorhergehenden Text beschrieben, unter Bedingungen, die das Ausgangsmaterial, das Polyhydroxymaterial oder den Ligand nicht destabilisieren. Verzweigtkettige Verbindungen, bei denen die Verzweigungen (Leinen) freie in Bezug zum Polymergerüst distal angeordnete Hydroxylgruppen tragen, sind bevorzugte Oligomere/Polymere und wirken als spacer zwischen dem Matrixkörper und den für die Ligandbindung aktivierbaren Hydroxylgruppen; wie aus der Technik bekannt, erleichtern solche Spacer den Zugang des gebunden Ligands zum Ligat und sind insbesondere dann von Nutzen, wenn die Affinität von komplementären stereochemischen Konfigurationen der Ligat- und Ligandmakromoleküle abhängt. Viele solcher Verbindungen sind für diesen Zweck in Verbindung mit Matrizen zur Affinitätstrennung bekannt; für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung besonders geeignete hydroxylhaltige Materialien umfassen z. B. natürliche Polysaccharide, insbesondere natürliche Polysaccharide auf Hexosebasis. Beispiele hierfür sind Polyglucose, Dextran, Stärke, Cellulose, Gummiarten, wie Glucane oder Xylane, oder chemische Derivate dieser Verbindungen, wie Hydroxyethylcellulose. Für die Reinheit des Produkts sind Polysaccharide, die keine Ionenaustauschstellen in die Membran einführen, wie z. B. Chitosan von besonderem Nutzen. Der Hydroxylgehalt der Materialien wird so gewählt, daß eine ausreichende Zahl von Hydroxylgruppen, die mit aktivierten Aminogruppen der Ausgangspolyamidmembran zur Bildung der Verbundmembran reagieren, zur Verfügung steht und, daß eine ausreichende Zahl von zusätzlichen aktivierbaren Hydroxylgruppen zur Verfügung steht, um die erwünschte Zahl an Aktivierungsstellen auf der Verbundmembran zu erhalten für eine anschließende Aktivierung zur Bildung der erfindungsgemäßen Verbundmatrix, an die ein Ligand gebunden wird. Durch Einführung der Hydroxylgruppen gemäß der Erfindung kommen Zunahmen der Aktivierungsstellen auf der Ausgangsmembran von bis zu ca. 500 % oder mehr in Betracht.

2. HERSTELLUNG DER MATRIX

Die Matrizen gemaß der Erfindung werden aus einer Ausgangsmembran wie im vorhergehenden Text beschrieben hergestellt, indem Positionen auf der Membran (entweder Hydroxyl- oder Aminoaktivierungsstellen) aktiviert werden, gefolgt von der Bindung des ausgewählten Liganden an die aktivierte Stelle. Aktivatoren, die für diesen Zweck geeignet sind, werden nach ihrer Reaktivität gegenüber den auf der Ausgangsmembran, die wahlweise aminoterminale Leinen enthält, befindlichen Aminogruppen ausgewählt oder nach der Reaktivität gegenüber den auf der Verbundmembran befindlichen Hydroxylgruppen und nach der Aktivierung dieser Stellen, um die Reaktivität der Membran mit dem ausgewählten Liganden zu fördern. Im allgemeinen ist jeder Ligand, der mit einer aktivierten Position zur Bindung des Liganden an die Membran, wie im nachfolgenden Text beschrieben, reagiert, für die Verwendung in Verbindung mit den Aktivatoren geeignet, um die Affinitätsmembran gemäß der Erfindung zu erhalten.
Zur Bildung der Matrix wird eine Verbindung, die mit den primären Aminoaktivierungsstellen der mikroporösen Polyamidmembran (direkt erweitert oder mit "Leinen", falls erwünscht) oder den Hydroxylgruppen der Verbundmembran reagiert und die Membran für die Bindung eines ausgewählten Liganden (hier als "Aktivator" bezeichnet) aktiviert, mit der Ausgamgsmembran zur Reaktion gebracht. Der Aktivatorrest (d. h. der Anteil an Aktivator, der während der Reaktion in die Membran eingeführt wurde) fördert während der Ligandbindung die Reaktion des Liganden mit den aktivierten Stellen der Matrix und kann entweder vollständig durch direkte Bindung des Liganden an die Membran ersetzt oder während der Ligandbindung nur teilweise ersetzt werden unter Bildung einer Brückengruppe zwischen Ligand und Matrix. Das heißt, der Ligand kann den Aktivatorrest während der Ligandbindung entweder vollständig ersetzen oder mit dem Aktivatorrest reagieren und an ihn binden.
Die Aktivatoren gemäß der Erfindung umfassen Aktivatoren, die sowohl mit der Membran als auch mit dem Ligand unter Bedingungen reagieren, unter denen die Funktion der Membran als Affinitätsmembran nicht wesentlich beeinträchtigt wird; die die theoretische Affinität des Liganden gegenüber dem Ligat nicht wesentlich reduzieren; die Produktausbeute und - reinheit fördern; die in Lösungsmitteln löslich sind, die die Membraneigenschaften, insbesondere Porenabmessungen bzw. Porosität, nicht wesentlich beeinflussen; die im wesentlichen keinen unerwünschten Nebenreaktionen unterliegen; und die geeignete Ligatbindungsstellen (d. h. ein an die aktivierten Membranstellen gebundener Ligand fungiert als Bindungsstelle für das Ligat) zur Verfügung stellen. Desweiteren reagieren Aktivatoren, die eine Brückengruppe zum Ligand bilden, vorzugsweise leicht mit dem Liganden, und sie reagieren mit der Membran und dem Liganden, um Bindungen zwischen Matrix und Ligand zu bilden, die im wesentlichen stabil und ungeladen sind; Aktivatoren, die durch einen Liganden ersetzt werden sollen, sind solche, die an die Membran gebundene Reste bilden können, die gute Abgangsgruppen darstellen und somit leicht vom Liganden unter Bedingungen, die die Membran nicht spalten, verdrängt werden. Aktivatoren zur Bindung von Liganden oder Leinen, die nudeophile Gruppen, wie Amino-, Thiol- oder Hydroxylgruppen enthalten, insbesondere Polyamide oder Proteinliganden schließen solche ein, die folgende Einheiten zur Verfügung stellen: a) stabile und ungeladene (nicht-ionische) Ligand-Y- -X-Membran-Bindungen enthalten, wie Ureylen- (-NR- -NR-), Thioureylen-(-S- -NR-), Carbamyl-(-NR- -O-) oder Thiolourethan- (-S- -O) Bindungen zwischen Membran und Ligand, b) stabile und ungeladene, direkte -NR- (Amino), -S- (Thioether) oder -O- (Ether) Bindungen zwischen Membran und Ligand und c) stabile und ungeladene Cyanurchlorid-
Bindungen zwischen Membran und Ligand; X ist dabei O oder NR; Y ist ein nucleophiler Rest, insbesondere NR, O oder S; R ist H oder substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl, typischerweise von ca. C&sub1; - C&sub5;- Alkyl. In den oben erwähnten Bindungen, bezieht sich "Ligand-Y" auf verbindende Einheiten, die sich z. B. eher von reaktiven Amino-, Thiol- oder Hydroxylgruppen des Liganden ableiten als vom Aktivator oder von der Membran; weitere entsprechende Bindungen Y werden im Rahmen der Erfindung aus anderen nudeophilen Liganden erhalten, wobei Y der nucleophile Rest ist. "-X-Membran" bezieht sich auf Membranbindungen, bei denen sich X entweder von Amino- oder Hydroxylgruppenaktivierungsstellen der Membran ableitet. Als Beispiele sind Aktivatoren zur Aktivierung von Aktivierungsstellen auf der Ausgangspolyamid- bzw. Verbundpolyamidmembran mit anschließender Bindung eines ausgewählten Liganden geeignet, die folgende Verbindungen umfassen: 1,1'-Carbonyldiimidazol (CDI) oder ein reaktives Derivat dieser Verbindung, die bei Reaktion mit der Membran einen entsprechenden Monoimidazolrest bilden und von einem reaktiven nucleophilen Liganden teilweise verdrängt werden; 2- Fluoro-1-methyl-pyridinium(+)toluol-4-sulfonat(-) (FMP) oder ein reaktives Derivat dieser Verbindung, die bei der Membranaktivierung ein Fluoratom verlieren und von einem reaktiven nucleophilen Bindungsliganden vollständig verdrängt werden; und Trichlorotriazin (CyCl&sub3;) oder einem reaktiven Derivat dieser Verbindung, insbesondere ein Dichlorotriazinderivat, wie weiter unten ausführlich beschrieben, die bei der Aktivierung der Membran ein Chloratom verlieren und ein weiteres bei der Reaktion mit einem reaktiven nucleophilen Liganden; all dies wird in den folgenden Beispielen beschrieben. Während CDI ziemlich reaktiv ist und vor allem aus diesem Grund verwendet wird, sind auch andere Reagenzien verwendbar, die stabile und ungeladene Bindungen bieten, wie z.B. substituierte aromatische oder aliphatische Chloroformiate, p-Nitrophenylchloroformiat, N-Hydroxysuccinimidchloroformiat oder Trichlorophenylchloroformiat sind Beispiele. Wie aus der Technik bekannt, werden diese Chloroformiate dazu eingesetzt, nitrofunktionelle oder hydroxyfunktionelle Reste an eine Membran zu binden; die Nitrogruppe kann dann reduziert werden, um eine zusätzliche Aminoaktivierungsstelle bereit zustellen und sowohl die Hydroxyl- als auch die Aminochloroformiat-Reste können anschließend wie hier beschrieben aktiviert werden. Zusätzliche im Verfahren gemäß der Erfindung verwendbare Chlorotriazine umfassen Cy(NR)Cl&sub2;, wobei R ein Alkylrest wie oben definiert ist.
Die angegebenen Aktivatoren werden nach chemischer Reaktivität, Güte des Produkts und Wirtschaftlichkeit ausgewählt; äquivalente Reaktanten, die den oben genannten Zielen mit derselben Wirtschaftlichkeit dienen, finden ebenfalls Verwendung.

3. AKTIVIERUNG DER MATRIX

Im allgemeinen wird die Aktivierung der Matrix vorzugsweise unter Verwendung organischer Lösungsmittel durchgeführt, da viele der oben beschriebenen Aktivatoren, wie CDI und FMP labil gegenüber Wasser sein können; Aceton, Dioxan, Cyclohexan, Fluorchlorkohlenwasserstoffe wie FREON (Dupont, Wilmington, DE) und Acetonitril sind geeignet; auch Dimethylsulfoxid (DMSO) kann verwendet werden; eine Verwendung deutlich oberhalb Raumtemperatur kann jedoch unerwünschte Veränderungen in der Membranmorphologie zur Folge haben. Die Aktivierung wird entsprechend chemischen Standardtechniken, wie sie unter Fachleuten bekannt sind, durchgeführt.
Die Aktivierungsbedingungen können je nach verwendeter Membran und/oder Ligand unterschiedlich sein; insbesondere im Fall des gut reaktiven CyCl&sub3; wird jedoch empfohlen, die Aktivierung wasserfrei auszuführen; im Fall von Trichlorotriazinderivaten CyCl&sub2; wird empfohlen, die Reaktion unter basischen Bedingungen durchzuführen, z.B. bei einem pH von ca. 6.5 bis 9.5, insbesondere von ca. 8.0 bis ca. 8.5. Diese Bedingungen fördern die Verdrängung eines einzelnen Chlors aus dem Chlorotriazinaktivator, so daß eine stabile Bindung zwischen der Matrix und dem Chlorotriazinrest entsteht. Vorzugsweise wird zuerst durch Reaktion mit der Ausgangsmembran in einem aprotischen Lösungsmittel in der Gegenwart eines Akzeptors für das entstehende HCl, wie z.B. einem tertiären Amin, ein erstes Chloratom aus Trichlorotriazin verdrängt; das matrixgebundene CyCl&sub3; wird dann günstigerweise mit dem Liganden in einem wässrigen Carbonat-Bicabonat-System zur Reaktion gebracht, um ein zusätzliches Chloratom zu verdrängen und den Liganden zu binden. Um sicherzustellen, daß das verbleibende Halogen keine geladenen Positionen zur Verfügung stellt, die einer nicht-spezifischen Bindung förderlich wären, ist es wünschenswert, diese Stelle zu blockieren, wie durch Reaktion der ligandgebundenen Matrix mit einem Alkanolamin, wie Ethanolamin. Alternativ hierzu wird das Trichlorotriazin zuerst derivatisiert, um ein erstes aktives Chloratom zu eliminieren, wie weiter unten unter Beispiele beschrieben.
Liganden, die in der Erfindung verwendbar sind, umfassen Liganden, die in vielen Bereichen der Affinitätschromatographie verwendet werden, eine Affinität gegenüber einem Zielligat besitzen und die mit den oben beschriebenen Aktivierungsstellen der Polyamidmatrix unter Bildung einer Ligatbindungsstelle, d. h. einer Stelle, an die der Ligand chemisch gebunden ist und biologisch aktiv im Hinblick auf die Bindung des Ligats ist, reagieren. Liganden für die Verwendung in Reinigungsprozessen gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen sowohl Liganden, die mit komplementären Zielligaten biospezifisch wechselwirken (üblicherweise als "Affinitätsreinigung" oder "Immunoaffinitätsreinigung" in Antikörper/Antigen-systemen bezeichnet) als auch Liganden, die mit Ziel-Gegenionen ionisch wechselwirken, z.B. durch van der Waals-Anziehung (üblicherweise als "Ionenaustauschreinigung" bezeichnet). Vorzugsweise besitzt der Ligand eine hohe Affinität gegenüber dem Ligat und für eine optimale Isolierung und Reinigung des Ligats eine hohe Biospezifität; diese Eigenschaften sollten bei Bindung des Liganden an die Matrix nicht wesentlich verschlechtert werden, z. B., sollte er durch die hier beschriebenen Kopplungsprozesse chemisch nicht wesentlich verändert werden oder sterisch durch seine Orientierung in bezug auf die Matrix, falls die Affinität von der räumlichen Orientierung von Ligat und Ligand abhängt. Der Ligand wird im allgemeinen nach seiner Fähigkeit ausgewählt, das Ligat aus der biologischen Mutterlösung heraus zu insolubilisieren und, sofern Isolierung und Konzentration des Ligats erwünscht ist, mit dem Ligat einen leicht dissoziierbaren, nicht-spaltenden Komplex zu bilden.
Wie im vorhergehenden Text erwähnt, umfassen besonders brauchbare Liganden solche, die nucleophile Gruppen enthalten, die mit CDI, FMP oder einem Di- oder Trichlorotriazin aktivierte Stellen zur Bindung eines Liganden reagieren, insbesondere nucleophile primäre oder sekundäre Aminogruppen, Thiolgruppen oder Hydroxylgruppen; oder, als Alternative carboxylterminale Liganden, die mit den obenbeschriebenen aminoterminalen Leinen reagieren, z. B. unter Verwendung eines wässrigen Katalysators, wie in der Technik bekannt. Ganz besonders umfassen solche Liganden Verbindungen, die für die Affinitätsreinigung biologischer Makromoleküle, vor allem Proteine oder Glycoproteine, geeignet sind; dazu gehören: Enzyme, Hormone, Wachstumsfaktoren wie EGF und FGF, Immunglobuline einschließlich monoclonaler und polyclonaler Antikörper, Antigene, Lectine, Protein A, Protein G, Lymphokine einschließlich Interferone und Interleukine, Blutkomponenten, z.B. Erythropoetine oder Plättchenfaktor, oder Plasmakomponenten wie Fibrin, Fibrinogen, Fibronectin, Thrombine, Thromboplastine, Prothrombine oder Faktoren VII-XIII, vor allem VIII und IX; Liganden, die für die Verwendung in der Affinitätsreinigung von Nukleinsäuren, vor allem RNA und DNA, geeignet sind; auch Zellen können an die erfindungsgemäße Matrix gebunden werden. Liganden, die in solchen Reinigungen eine Affinität gegenüber Zielligaten aufweisen, sind in der Affinitätschromatographie wohl bekannt und alle diese Liganden, einschließlich derer, die aus gentechnisch manipulierten Organismen erhalten werden, die mit den Aktivierungsstellen auf der erfindungsgemäßen Matrix unter Bildung von Ligatbindungsstellen, wie hier beschrieben, reagieren, kommen in Betracht. Als Beispiele für Affinitätspaare, die in konventionellen Affinitätstrennverfahren verwendet werden, seien folgende aufgeführt: Antigen/komplementärer Antikörper; Protein A/Immunoglobulin; Lectin/Oligosaccharid; Hormon/komplementärer Rezeptor; Enzym/komplementäres Substratanaloges; Inhibitor/komplementäres Farbpigment; Nukleinsäure/Histon; all diese Systeme können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Liganden, die für eine Plasmapherese mit der Affinitätsmembran der Erfindung verwendbar sind, umfassen insbesondere Liganden, die für eine Entfernung pathologischer Proteine aus dem Blutplasma, vor allem pathologischer für Autoimmunerkrankungen charakteristischer Immunglobuline, angepaßt sind. Liganden von besonderem Interesse in solchen Anwendungen umfassen Protein A und G, die eine Biospezifität gegenüber Immunglobulinen wie IGG und IGM aufweisen und Immunglobuline, die für die Isolierung und Wiedergewinnung von Protein A und G aus biologischen Flüssigkeiten (z. B. rekombinanten Systemen) zur Verwendung in anderen Reinigungen gemäß der Erfindung, angepaßt sind. Insbesondere kommen kinisch-therapeutische und -diagnostische Anwendungen in Betracht
Die Ligandanbindung an die Polyamidmatrix wird günstigerweise in wässriger Umgebung oder in einem organischen Lösungsmittelsystem durchgeführt, je nachdem, was erforderlich ist, um den ausgewählten Liganden zu lösen; vorausgesetzt das System denaturiert oder destabilisiert weder Matrix noch Ligand, erweisen sich eine Reihe von Systemen (z. B. DMSO/Wasser) als zufriedenstellend, ohne daß eine Störung der Ligandanbindung auftritt.
Der Grad der Ligandanbindung (d. h., die Zahl der gebundenen Liganden) an die Aktivierungsstellen hängt von mehreren Faktoren ab, einschließlich Ligand/Ligand- und Ligand/Aktivator-Wechselwirkungen, z. B. Ladungs- und sterische Effekte. Die Aufnahme kleiner Liganden in der Verbundmatrix scheint ein wenig von dem Ausmaß der indirekten Erweiterung mit dem Polyhydroxylmaterial abzuhängen, d. h., von der Zahl der für die Bindüng mit dem Liganden vorhandenen Hydroxylgruppen; größere Liganden wie BSA (Rinderserumalbumin) scheinen diese Abhängigkeit zu keinem signifikanten Grad aufzuweisen. Der Anbindungsgrad wird auch je nach Art des Ausgangspolyamidmaterials und des eingesetzten Aktivators verschieden sein. Ein Überschuß an Ligand muß vermieden werden, da dies zu einer Anhäufung, vor allem bei großen Liganden, führen kann und die Ligatwiedergewinnung stört. Die Affinitätsmembran kann in jeder gebräuchlichen Form für die oben beschriebenen kombinierten Affinitätsreinigungen und Filtrationen verwendet werden. Besonders in Betracht kommen Formen, die eine Cross-Flow - Geometrie aufweisen, wie z. B. Hohlfasermembranen. Systeme die unter Druck arbeiten (z. B. bis zu 5 bar) sind von besonderem Interesse. Insbesondere Membranen mit einer Dicke von ca. 10 bis ca. 200 µ sind für die Verwendung in Systemen, die unter Druck arbeiten, besonders geeignet. Die Membranen können in einem Gehäuse, wie z. B. einer Spritze, einer Patrone oder einem Zentrifugenröhrchen untergebracht werden, um den Durchgang des Filtrats durch die Membran, üblicherweise unter Druck, zu erleichtern, wie in der Technik bekannt.

BEISPIELE

Methoden und Materialien

In den folgenden Beispielen handelt es sich bei den verwendeten Ausgangspolyamidmembranen um eine reine Polycaprolactam(Nylon 6)-Membran, die als Polyamid "386" käuflich zu erwerben ist und einem Sulfonsäurederivat, das als Polyamid "390"zu kaufen ist (AKZO Fiber und Polymer Div, 5600 Wuppertal, Deutschland). Das reine Polycaprolactam in den unten aufgeführten Beispielen wird für die Isolierung und Reinigung von Ligaten bevorzugt, da das Sulfonsäurederivat möglicherweise über die Sufonsäurereste nicht-spezifische Bindungsstellen in die Membran einführt. CDI, FMP und CyCl&sub3; können von Sigma Chemical, St. Louis MO, USA (CDI) und Aldrich Chemical, Milwaukee WI, USA (FMP und CyCl) gekauft werden. Polyglucose M 100 wurde von Grain Processing Corp., Muscatine, IO, USA erhalten. CyCl&sub3;-Derivate, bei denen eines der Chloratome zur Bildung des Ausgangsmaterials ersetzt ist (es bleiben zwei reaktive Chloratome) kann problemlos anstelle des als Beispiel aufgeführten CyCl&sub3; eingesetzt werden, insbesondere CyCl&sub2;NR kann verwendet werden, bei dem ein Chloratom durch ein Alkylamin NR ersetzt ist, bei dem z. B. R gleich C&sub1;-C&sub5;-Alkyl ist, zur Bildung des entsprechenden N-Alkylderivats von CyCl&sub3;; oder bei dem eines der Chloratome durch ein Alkanolamin NR ersetzt ist, bei dem z. B. R ein hydroxysubstituiertes C&sub1;-C&sub5;-Alkyl ist, insbesondere Ethanolamin, zur Bildung der entsprechenden N- Hydroxyalkylderivate; solche Reaktionen sind beispielhaft für die Ciba Farbstoffchemie, die darauf abzielt, Reaktivfarbstoffe wie Cibachrom-Farbstoffe (z. B. Cibachrom 37A, Ciba-Geigy Corp., Basel, Schweiz), die bei der Färbung üblicher Substratmaterialien verwendet werden und die sich auch bei der Bindung von Ligaten wie BSA an ein Affinitätssubstrat als nützlich erwiesen haben.

Beispiel 1 Erweiterung der Aktivierungsstellen auf einer Polyamidmembran durch saure Hydrolyse

Die Ausgangsmembran (Nylon 386 oder 390) wurde mit 1 N HCl 72 Stunden lang bei Raumtemperatur hydrolysiert (@ RT). (Ähnliche Hydrolysierungsbedingungen, z. B. 1 N HCl @ 45ºC, 2 N HCl @ RT, 3,5 N HCl @ RT oder vergleichbare Stärken von Ameisensäure während vergleichbarer Anwendungsdauern lieferten ähnliche Ergebnisse). Die Zunahme der Aminoaktivierungsstellen wurde durch Standard-Ninhydrinreaktion bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle I aufgeführt. Es ist offensichtlich, das eine saure Hydrolyse die Zahl der primären in der Membran befindlichen Aminogruppen wesentlich erhöht. Die chemische und mechanische Integrität der Membran blieb erhalten. Tabelle I

Beispiel 2 Herstellung der Verbundmembran (Aktivierung des Polyamids)

A. Die Ausgangspolyamidmembran (Nylon 386 oder 390) wurde mit 1 % Cyanurchlorid (CyCl&sub3;) in einem Aceton/Triethylamin-Lösungsmittelsystem (einem nichtwässrigen basischen System) für 15 min. bis 16 h bei RT aktiviert, um die primären Aminogruppen der Membran entsprechend folgendem Schema zu aktivieren:
Dann wurde Polyglucose M-100 mit der aktivierten Membran zur Reaktion gebracht, um das Polysaccharid zur Bildung einer Verbundmmembran kovalent an die Polyamidmembran entsprechend folgendem Schema zu binden:
CyCl&sub2;-NH-Membran + Polyglucose-CH&sub2;OH -> Polyglucose-CH&sub2;O- CyCl-NH-Membran.
Sowohl chemische als auch mechanische Integrität der erhaltenen Verbundmembran blieben intakt.
B. Das Verfahren von Beispiel 2A wurde wiederholt, wobei entweder Stärke oder Dextran als Polysaccharid eingesetzt wurden; die Ergebnisse waren ähnlich.
C. Das Verfahren von Beispiel 2A wurde wiederholt, wobei entweder CDI oder FMP statt CyCl&sub3; als Aktivator eingesetzt wurden, die Ergebnisse waren vergleichbar.
Wie in Tabelle 2 gezeigt, wurde die Polysaccharidaufnahme (Polyglucose M-100) in diesen Experimenten quantifiziert (Die Neutralzuckerbestimmung erfolgte durch die Standard-Phenolschwefel-Bestimmung nach DuBois). Die Erweiterung der Polyamidmembran wird in UM Glucose/g Polyamid angegeben. Auf Basis der Einführung von Glucoseeinheiten wurde die größte Erweiterung dann erreicht, wenn die Membran mit Aceton getrocknet, mit CyCl&sub3; aktiviert (in der Tabelle als CyCl angegeben), mit Aceton gewaschen und mit Polyglucose zur Reaktion gebracht wurde (Experiment 1 von Tabelle 2). Tabelle 2

Beispiel 3 Aktivierung der Polyamidmembran oder Polyamidverbundmembran mit CDI

A. CDI (1,1'-Carbonyldiimidazol) wurde in einem nicht- wässrigen Lösungsmittel ca. 15 bis 20 Minuten lang bei RT mit der Ausgangs- bzw. der erweiterten Polyamidmembran und der Polyglucoseverbundmembran aus den oben aufgeführten Beispielen 1 bzw. 2 nach folgendem Schema zur Reaktion gebracht, um eine aktivierte Matrix zur Ligandbindung zu erhalten:
Dabei ist PA ein Polyamid, HO-PA ist die Verbundmembran von Beispiel 2 und NH&sub2;-PA ist die Ausgangspolyamidmembran für die erweiterte PA-Membran von Beispiel 1.
B. Der verbleibende Imidazolring wurde dann durch einen NH&sub2;-terminalen Liganden wie im unten aufgeführten Beispiel 4C beschrieben nach folgendem Schema ersetzt, um eine Urethan- bzw Harnstoffbrücke zu erhalten:
[Ligand-NH&sub2;] -> Ligand-NH- -O-PA bzw. Ligand-NH- -NH-PA
Entsprechende Schemen, bei denen Ligand-NH&sub2; gleich Ligand-Y und Y eine nucleophile Gruppe wie oben beschrieben, z. B. -OH, -SH oder -NHR liegen ebenfalls im Rahmen der Erfindung.

Beispiel 4 Aktivierung der Polyamid oder Polyamidverbundmembran mit CyCl&sub3;

Sowohl die Ausgangs- bzw. die erweiterte Polyamidmembran aus oben angeführtem Beispiel 1 als auch die Polyglucoseverbundmembran aus oben angeführtem Beispiel 2 wurden mit Cyanurchlorid entsprechend folgendem Schema aktiviert:
Dabei ist PA ein Polyamid, OH-PA die Verbundmembran aus Beispiel 2, NH&sub2;-PA ist die Ausgangspolyamidmembran bzw. die erweiterte Membran aus Beispiel 1 und X ist -O- oder -NH-, entsprechend der reagierenden Membran.

A. Aktivierung der Ausgangspolyamidmembran mit CyCl&sub3;

Die Membran wurde entsprechend des in Beispiel 2 beschriebenen Aktivierungsverfahrens für die Herstellung der Verbundmembran aktiviert.

B. Aktivierung der Verbundmembran mit CyCl&sub3;

Beispiel 5 Aktivierung der Polyamid- oder der Polyamidverbundmembran mit FMP

Sowohl die Ausgangs- bzw. die erweiterte Polyamidmembran aus Beispiel 1 als auch die Polyglucoseverbundmembran aus Beispiel 2 (siehe oben) wurden mit FMP entsprechend folgendem Schema aktiviert:
Ligand Y mit Y gleich -NH&sub2; wurde anschließend mit dem membrangebundenen 1-Methylpyridiniumtoluol-4-sulfonat entsprechend folgendem Schema zur Reaktion gebracht:

Beispiel 6 Anbindung des Liganden an die Polyamidmembran

A. Anbindung von Lysin an CyCl&sub3;-aktivierte Membranen

Die aktivierten Membranen von Beispiel 4 wurden mit Lösungsmittel gespült und mit einem nucleophilen Liganden (Lysin, bezogen von Sigma) in Kontakt gebracht und je nach Experiment 2 - 24 h lang bei RT und 4ºC in Bicarbonatpuffer aufgelöst. Ungebundener Ligand wurde durch Spülen mit einem oder mehreren der folgenden Lösungen entfernt: Bicarbonatpuffer, Ethanolamin in Bicarbonatpuffer, Natriumacetatpuffer, destilliertes Wasser oder phosphatgepufferte Kochsalzlösung Der Membran-Lysin-Gehalt wurde durch Ninhydrinbestimmung bestimmt (siehe oben). Der bindende Ligand ersetzte einen der verbleibenden Chloratome des Dichlorotriazins entsprechend folgendem Schema:
Dabei sind X, Y und PA wie oben definiert.
Die verbleibenden Chloratome wurden blockiert, um eventuelle Positionen für nichtspezifische Bindungen zu verringern, indem die ligandgebundene Membran über Nacht bei einem pH> 8,5 mit 2-Aminoethanol behandelt wurde (das letzte Chloratom ist reaktionsträge). B. Anbindung von Lysin an eine CyCl&sub3;-, CDI- oder FMP- aktivierte Membran
Der Ligand (Lysin) wurde wie in Beispiel 4C beschrieben an die CyCl&sub3;-, CDI- oder FMP-aktivierte Membran der Beispiele 1, 3, 4 und 5 (siehe oben) gebunden. In den Experimenten 6A und 6B wurde Lysin als ein Beispiel für ein kleines Ligandmolekül ausgewählt, das leicht Zugang zu den aktivierten Stellen der Membran findet mit einer geringen sterischen Behinderung. Die Ergebnisse der Lysinzugabe zu CDI-, CyCl&sub3;- und FMP-aktivierten Membranen sind in Tabelle 3 zusammengefaßt: TABELLE 3 ANBINDUNG DES LYSINLIGANDEN

C. Anbindung von BSA (Rinderserumalbumin) an eine CyCl&sub3;-, CDI- oder FMP-aktivierte Membran

BSA wurde als Ligand wie in Beispiel 6A für Lysin beschrieben gebunden. Der Membran-BSA-Gehalt wurde mit dem Standard-Dichinchonsäureverfahren bestimmt. BSA verdeutlicht die Zugänglichkeit und Bindung größerer Moleküle zur erfindungsgemäßen Membran. Die Ergebnisse der BSA-Zugabe zu CDI-, CyCl&sub3;- und FMP- aktiverten Membranen sind in Tabelle 4 zusammengefaßt: TABELLE 4 ANBINDUNG DES BSA-LIGANDEN

D. Anbindung von Cibacron Blau-Farbstoff an eine CyCl&sub3;-, CDI- oder FMP-aktivierte Membran

Cibacron Blau-Farbstoff wurde als Ligand an eine CyCl&sub3;-erzeugte Polyamidverbundmembran und eine CDI-erzeugte Polyamidverbundmembran gebunden; beide Verbundmembranen wurden dann mit CDI aktiviert, um Aktivierungsstellen für den Farbstoff, wie oben beschrieben, zu erhalten. Cibacron Blau-Farbstoff wurde auch als Ligand an eine CDI-aktivierte Polyamidmembran gebunden, wie oben beschrieben.

E. Anbindung von Lectin (Con A) an eine CDI-erzeugte, nachträglich mit CDI aktivierte Polyamidverbundmembran (Beispiel 2C, siehe oben) und an eine CDI-aktivierte Ausgangsmembran (Beispiel 3, siehe oben)

Die aktivierte Membran wurde gespült und mit Con A- Lectin (Sigma Chemical) in Kontakt gebracht, das in Bicarbonatpuffer aufgelöst und über Nacht bei RT inkubiert worden war. Ungebundener Ligand (Lectin) wurde am darauffolgenden Tag durch Spülen mit einem oder mehreren der folgenden Lösungsmittel entfernt: Bicarbonatpuffer, Ethanolamin in Bicarbonatpuffer, Natriumacetatpuffer, destilliertes Wasser oder phosphatgepufferte Kochsalzlösung. Das an die Membran gebundene Lectin wurde mit dem Dichinchonsäureverfahren (siehe oben) bestimmt.

Beispiel 7 Affinitätsaustausch

A. Wiedergewinnung von BSA

Die Affinitätsmembran von Beispiel 6D (Cibacron Blau) wurde zur Wiedergewinnung von BSA eingesetzt. Die Membran wurde mit 1 % BSA (Sigma Chemical) je nach Experiment 2 bis 24 h lang bei RT bzw. 4ºC inkubiert und anschließend wurde die Membran mit 2M NaCl eluiert. Die Wiedergewinnung von BSA wurde mit der Dichinchonsäuremethode (siehe oben) bestimmt und lag zwischen 0,01-0,17 µM BSA/g Membran mit einem Mittelwert von 0,14 als Ergebnis.

B. Wiedergewinnung von Glucose

Die Affinitätsmembran von Beispiel 6D wurde zur Wiedergewinnung von Glucose eingesetzt, womit die Brauchbarkeit der Membran in der Wiedergewinnung zuckerhaltiger Plasmamembranen demonstriert wurde.
Die Con A-Affinitätsmembran wurde mit a) 0,1M Acetatlösung (pH 6), die 1M NaCl, 1mM CaCl&sub2;, 1mM MgCl&sub2; und 1mM MnCl&sub2; enthielt, und b) 1,0M NaCl/0,05M phosphatgepufferter Kochsalzlösung aquilibriert. H-Glucose wurde in Lösung (b) hergestellt und mit der Con A-Membran in Kontakt gebracht. Die Membran wurde mit Lösung (b) gespült. Die gespülte Membran wurde mit 0,1M α-Methyl-D-glykosid in 1M NaCl/0,05M phosphatgepufferter Kochsalzlösung eluiert.

Claims

1. Eine Verbundmatrix zur Immobilisierung eines Liganden, der in einer Affinitätstrennungverwendet werden kann, oder einer Verbindung, die in der Ionenaustauschchromatographie verwendbar ist, wobei die Verbundmatrix einen mikroporösen Polyamidfilm mit durch einen Aktivator aktivierten Aktivierungsstellen umfaßt und der Polyamidfilm zur Bildung der Verbundmatrix kovalent an eine Polyhydroxyverbindung gebunden ist.

2. Die Matrix nach Anspruch 1, bei der die Polyhydroxyverbindung ein Oligomer oder ein Polymer ist.

3. Die Matrix nach Anspruch 1, bei der die Polyhydroxyverbindung ein Polysaccharid ist.

4. Die Matrix nach Anspruch 1, bei der der Ligand für die Affinitätsreinigung einer biologischen Flüssigkeit angepaßt ist.

5. Die Verbundmatrix nach Anspruch 1, bei der das Polyamid ein Nylon ist.

6. Eine Verbundmembran zur Affinitätstrennung, die eine Verbundmatrix, wie in Anspruch 1 definiert, umfaßt, wobei ein für die Affinitätschromatographie angepaßter Ligand oder eine für die Ionenaustauschchromatographie angepaßte Verbindung an die Verbundmatrix gebunden ist.

7. Die Verbundmembran nach Anspruch 6, bei der der Ligand für die Affinitätsreinigung einer biologischen Flüssigkeit angepaßt ist.

8. Die Verbundmembran nach Anspruch 6, bei der die Polyhydroxyverbindung ein Polysaccharid ist.

9. Die Verbundmembran nach Anspruch 8, bei der das Polysaccharid eine Polyglucose, Dextran oder Stärke ist.

10. Die Verbundmembran nach Anspruch 6, bei der das Polyamid ein Nylon ist.

11. Die Verbundmembran nach Anspruch 6, bei der der Ligand für die Affinitatsreinigung von Blutplasma angepaßt ist.

12. Die Verbundmembran nach Anspruch 6, bei der der Ligand an freie Hydroxylgruppen des Polysaccharids gebunden ist.

13. Ein Verfahren zur Herstellung der Verbundmembran nach Anspruch 6 zur Immobilisierung eines Liganden, der in der Affinitätstrennung verwendet werden kann oder einer Verbindung, die in der Ionenaustauschchromatographie verwendbar ist, einschließlich: (1) Aktivierung von zumindest einigen der Aktivierungsstellen eines mikroporösen Polyamidfilms mit einem Aktivator, (2) Reaktion der aktivierten Gruppen mit einer Polyhydroxyverbindung, um die Polyhydroxyverbindung für die Bildung einer Verbundmatrix kovalent an den Polyamidfilm zu binden und anschließender (3) Aktivierung der Aktivierungsstellen der Verbundmatrix, die noch nicht reagiert haben, mit einem Aktivator, um die Bindung des Liganden oder der Verbindung zu fördern.

14. Das Verfahren nach Anspruch 13, bei dem die Polyhydroxyverbindung ein Polysaccharid ist.

15. Das Verfahren nach Anspruch 14, bei dem die Polyhydroxyverbindung eine Polyglucose, Dextran oder Stärke ist.