KR100985423B1 - 고정화 효소의 제조방법 - Google Patents

고정화 효소의 제조방법 Download PDF

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Abstract

유지분해용 효소를 고정화용 담체에 흡착 고정화시킨 후, 건조시키지 않고 지방산 트리글리세라이드 또는 지방산 부분 글리세라이드에 접촉시킴으로써, 담체 중량에 대하여 5∼50중량% 의 잔존 수분량이 되도록 효소 수분을 조정하는 에스테르화 반응용 고정화 효소의 제조방법, 및 유지분해용 효소를 고정화용 담체에 흡착 고정화시킨 후, 직접 건조시키지 않고, 담체 중량에 대하여 20∼3000중량% 의 지방산, 지방산 트리글리세라이드 또는 지방산 부분 글리세라이드에 접촉시키면서 탈수시킴으로써, 담체 중량에 대하여 1∼50중량% 의 잔존 수분량이 되도록 효소 수분을 조정하는 에스테르화 반응용 고정화 효소의 제조방법.
본 발명 방법에 의하여, 효소의 실활 (失活)을 초래하는 건조를 실시하지 않고 수분량을 조정하여, 고활성의 에스테르화 반응용 고정화 효소를 제조할 수 있다.

Description

고정화 효소의 제조방법{A PROCESS FOR PREPARING AN IMMOBILIZED ENZYME}
본 발명은 지방산과 알콜의 에스테르화 반응 또는 유지 (모노, 디 또는 트리글리세라이드) 의 에스테르 교환반응에서의 촉매로서 사용되고, 높은 활성을 갖는 고정화 효소를 제조하는 방법에 관한 것이다.
지방산과 알콜의 에스테르화물 및 유지 (모노, 디 또는 트리글리세라이드) 의 아실기를 교환하여 새로운 글리세라이드를 제조할 때, 촉매로서 유지분해용 효소를 이용하는 케이스가 증가하고 있다. 특히 기능성을 가진 유지를 제조하는 경우, 위치 특이성을 갖는 리파아제를 이용하는 경우가 많다. 이 효소를 회수 재이용하는 방법으로서 고정화 효소를 이용한다.
현재 입수 가능한 고정화 효소는 Novozymes 사가 시판하고 있는 Lipozyme RM IM 이나 Lipozyme TL IM, Novozym 435 등과 같이, 모두 건조물로서의 형태로 제공되고 있다. 건조물의 형태로 하고 있는 것은 보존시의 효소 실활 (失活)의 억제나 핸들링성의 용이함을 고려했기 때문이다. 그러나, 고정화 효소를 감압, 진공 또는 가열하에서 건조시키는 공정에서는 흡착된 효소의 실활이 일어나기 쉽고, 실제의 활성 발현시에 흡착시의 최대 활성을 발현하지 않는 경우가 많다.
그래서, 효소를 고정화용 담체에 흡착 고정화시킨 후, 건조시키지 않고 신속히 직접 반응기질과 접촉시켜 에스테르화 반응을 실시하는 방법이 제안되어 있다 (일본 공개특허공보 2000-166589 호). 이 방법에 의하면, 초발 반응에서는 고정화 효소에 함유되는 다량의 수분의 영향으로 반응이 지연되지만, 2 회째 이후의 반응에 있어서는 고활성을 달성할 수 있다. 그러나 반응기질에 신속히 접촉시킬 필요가 있어, 고정화 효소의 형태로의 보존에는 적합하지 않다. 또한, 고정화 효소의 건조를 지방산 유도체의 접촉하에서 실시함으로써 활성 발현을 높이는 방법이 제안되어 있다 (일본 공개특허공보 소62-134090 호). 그러나, 이 방법에서는 완만히 건조시킬 필요가 있어, 비효율적인 동시에, 그 조건 설정 등이 복잡하고, 또한 고가의 설비가 필요하게 되어 실용적이지 않다.
발명의 개시
본 발명은 유지분해용 효소를 고정화용 담체에 흡착 고정화시킨 후, 건조시키지 않고 지방산 트리글리세라이드 또는 지방산 부분 글리세라이드에 접촉시킴으로써, 담체 중량에 대하여 5∼50중량% 의 잔존 수분량이 되도록 효소 수분을 조정하는 에스테르화 반응용 고정화 효소의 제조방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명은 유지분해용 효소를 고정화용 담체에 흡착 고정화시킨 후, 직접 건조시키지 않고, 담체 중량에 대하여 20∼3000중량% 의 지방산, 지방산 트리글리세라이드 또는 지방산 부분 글리세라이드에 접촉시키면서 탈수시킴으로써, 담체 중량에 대하여 1∼50중량% 의 잔존 수분량이 되도록 효소 수분을 조정하는 에스테 르화 반응용 고정화 효소의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 본 발명 방법에 의하여, 효소의 실활을 초래하는 건조를 실시하지 않고 수분량을 조정하여, 고활성의 에스테르화 반응용 고정화 효소를 제조할 수 있다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
유지분해용 효소를 건조시킨 고정화 효소로 한 경우에 효소의 실활이 일어나는 것은, 건조에 의하여 강제적으로 수분을 제거함으로써 효소에 손상 (예를 들면, 고차 구조의 파괴 등) 을 주기 때문인 것으로 여겨진다. 그래서 본 발명은 효소의 실활을 초래하는 건조를 실시하지 않고 수분량을 조정하여, 고활성의 에스테르화 반응 (에스테르 교환반응을 포함) 용 고정화 효소를 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자는 에스테르화 반응용 고정화 효소를 제조할 때, 전술한 방법을 이용하여 고정화 효소의 잔존 수분량을 조정함으로써 효소의 실활을 억제하고 높은 활성을 발현시키는데 성공하였다.
본 발명에서 사용하는 고정화용 담체는 셀라이트, 부식토, 카올리나이트, 실리카겔, 몰레큘러 시브스 (molecular sieves), 다공질 유리, 활성탄, 탄산칼슘, 세라믹스 등의 무기 담체, 폴리비닐알콜, 폴리프로필렌, 키토산, 이온 교환 수지, 소수 흡착 수지, 킬레이트 수지, 합성 흡착 수지 등의 유기 고분자 등을 들 수 있는데, 특히 이온 교환 수지가 바람직하다.
이온 교환 수지로는, 다공질의 음이온 교환 수지가 바람직하다. 이러한 다공질 담체는 큰 표면적을 가지므로 효소의 보다 큰 흡착량을 수득할 수 있다. 수지의 입자 직경은 100∼1000㎛ 가 바람직하며, 세공 직경은 10∼150㎚ 가 바람직하다. 재질로는, 페놀포름알데히드계, 폴리스티렌계, 아크릴아미드계, 디비닐벤젠계 등을 들 수 있으며, 특히 페놀포름알데히드계 수지 (예를 들면, Rohm and Hass 사 제조 Duolite A-568) 가 바람직하다.
본 발명에서 사용하는 유지분해용 효소로는 리파아제가 바람직하다. 리파아제는 동물 유래, 식물 유래의 것은 물론 미생물 유래의 시판 리파아제를 사용할 수도 있다. 미생물 유래 리파아제로는 리조푸스 (Rizopus) 속, 아스페르길루스 (Aspergillus) 속, 무코 (Mucor) 속, 슈도모나스 (Pseudomonas) 속, 지오트리켐 (Geotrichum) 속, 페니실리움 (Penicillium) 속, 캔디다 (Candida) 속 등의 기원의 것을 들 수 있다. 특히, 기능성 유지를 제조하는 것을 목적으로 하는 경우, 글리세린의 목적의 위치에 선택적으로 결합을 만들 수 있는 위치 특이성의 리파아제인 1,3 위(位) 선택성 리파아제인 리조푸스 (Rizopus) 속, 아스페르길루스 (Aspergillus) 속, 무코 (Mucor) 속, 슈도모나스 (Pseudomonas) 속, 지오트리켐 (Geotrichum) 속, 페니실리움 (Penicillium) 속을 이용하는 것이 바람직하다.
이들 효소를 고정화시키는 경우, 담체와 효소를 직접 흡착시켜도 되나, 고활성을 발현하는 흡착 상태로 하기 위하여 효소 흡착 전에 미리 담체를 지용성 지방산 또는 그 유도체로 처리하여 사용해도 된다. 사용하는 지용성 지방산으로는 탄소수 8∼18 의 포화 또는 불포화의, 직쇄 또는 분기쇄의, 수산기가 치환되어 있어도 되는 지방산을 들 수 있다. 구체적으로는, 카프린산, 라우린산, 미스티린 산, 올레인산, 리놀산, α-리놀렌산, 리시놀산, 이소스테아린산 등을 들 수 있다. 또한, 그 유도체로는 이들 지방산과 일가 또는 다가 알콜과의 에스테르, 인지질 및 이들 에스테르에 에틸렌옥사이드를 부가한 유도체를 들 수 있다. 구체적으로는, 상기 지방산의 메틸에스테르, 에틸에스테르, 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 이들 에틸렌옥사이드 부가체, 폴리글리세린에스테르, 소르비탄에스테르, 자당 에스테르 등을 들 수 있다. 이들 지용성 지방산 또는 그 유도체는 2 종 이상을 병용해도 된다.
이들 지용성 지방산 또는 그 유도체와 담체의 촉매법으로는, 물 또는 유기용제 중에 이들을 직접 첨가해도 되는데, 분산성을 좋게 하기 위하여, 유기용제에 지용성 지방산 또는 그 유도체를 일단 분산, 용해시킨 후, 물에 분산시킨 담체에 첨가해도 된다. 이 유기용제로는 클로로포름, 헥산, 에탄올 등을 들 수 있다. 지용성 지방산 또는 그 유도체의 사용량은 담체 중량에 대하여 1∼500%, 특히 10∼200% 가 바람직하다. 접촉온도는 0∼100℃, 특히 20∼60℃ 가 바람직하고, 접촉시간은 5분∼5시간 정도가 바람직하다. 이 처리를 마친 담체는 여과하여 회수하는데, 건조시켜도 된다. 건조온도는 실온∼100℃ 가 바람직하고, 감압건조를 실시해도 된다.
효소의 고정화를 실시하는 온도는 효소의 특성에 따라 결정할 수 있는데, 효소의 실활이 일어나지 않는 0∼60℃, 특히 5∼40℃ 가 바람직하다. 또한, 고정화시에 사용하는 효소 용액의 pH 는 효소의 변성이 일어나지 않는 범위이면 되며, 온도 동일 효소의 특성에 따라 결정할 수 있는데, pH 3∼9 가 바람직하다. 이 pH 를 유지하려면 완충액을 사용하는데, 완충액으로는 아세트산 완충액, 인산 완충액, 트리스염산 완충액 등을 들 수 있다.
상기 효소 용액 중의 효소 농도는 고정화 효율 관점에서 효소의 포화 용해도 이하이고 충분한 농도인 것이 바람직하다. 또한, 효소 용액은 필요에 따라 불용부를 원심분리로 제거한 상청액이나 한외 여과 등에 의하여 정제한 것을 사용할 수도 있다. 또한, 사용하는 효소량은 담체 중량에 대하여 5∼1000%, 특히 10∼500% 가 바람직하다.
본 발명에 있어서는 유지분해용 효소를 고정화용 담체에 흡착 고정화시킨 후 건조시키지 않고, (A) 지방산 트리글리세라이드 또는 지방산 부분 글리세라이드에 접촉시킴으로써, 또는 (B) 지방산, 지방산 트리글리세라이드 또는 지방산 부분 글리세라이드에 접촉시키면서 탈수시킴으로써 잔존 수분량을 조정한다. 또한, 본 발명에 있어서 「건조시키지 않고」란, 「감압, 진공 또는 가열에 의한 건조를 실시하지 않고」란 의미이다.
잔존 수분량은 처리 (A) 에 의한 경우에는 5∼50중량% 로 조정되나, 15∼50중량% 가 바람직하다. 또한, 처리 (B) 에 의한 경우에는 1∼50중량% 로 조정되나, 1∼30중량% 가 바람직하다.
상기 수분 조정 처리 (A) 에 있어서의 고정화 효소와 접촉시키는 지방산 트리글리세라이드 및 지방산 부분 글리세라이드로는, 유채씨 기름, 대두유, 해바라기유 등의 식물성 액상 유지, 정어리 기름, 참치 기름, 가다랑어 기름 등의 생선 기름, 고래 기름 등의 해수(海獸) 기름, 이들로부터 유도되는 모노글리세라이드 및 디글리세라이드, 나아가서는 이들의 혼합물, 또한 이들의 유지로부터 수득되는 에스테르 교환 수지 등도 사용할 수 있다. 이들은 2 종 이상 병용해도 된다. 또한, 수분 조정 처리 (B) 에 있어서는 상기 지방산 트리글리세라이드 및 지방산 부분 글리세라이드는 물론 이들 화합물로부터 생성된 지방산을 이용할 수도 있다. 처리 (B) 에 있어서 사용되는 지방산으로는 유채씨 기름, 대두유, 해바라기유 등의 식물성 액상 유지 또는 정어리 기름, 참치 기름, 가다랑어 기름 등의 생선 기름으로부터 생성된 지방산이 바람직하다. 또한, 이들 처리 (A) 또는 (B) 에서 사용하는 지방산, 지방산 트리글리세라이드 또는 지방산 부분 글리세라이드는 본 발명 방법에 의하여 조제된 고정화 효소를 이용한 실제의 에스테르화 반응 또는 에스테르 교환 반응에 있어서, 유상(油相) 기질로 하는 것을 선택하는 것이 바람직하다.
처리 (A) 에서 사용되는 지방산 글리세라이드의 양은 고정화 효소와의 접촉을 충분히 하고, 또한 과잉량의 사용에 의한 낭비를 회피하는 관점에서, 담체 중량에 대하여 500∼5000% 가 바람직하며, 나아가서는 800∼4000%, 특히 1000∼3000% 가 바람직하다. 또한, 잔존 수분량이 담체 중량에 대하여 15∼50중량% 이면 되는 경우에는 사용되는 지방산 글리세라이드의 양은 담체 중량에 대하여 500∼3000%, 특히 800∼2500% 가 바람직하고, 잔존 수분량을 담체 중량에 대하여 5∼15중량% 까지 저감시키는 경우에는 사용되는 지방산 글리세라이드의 양은 담체 중량에 대하여 2000∼5000%, 특히 2500∼4000% 가 바람직하다. 또한, 처리 (B) 에서 사용되는 지방산 또는 지방산 글리세라이드의 양은 상기와 동일한 관점, 및 유동성을 높이고 탈수 효율을 향상시키는 관점에서, 담체 중량에 대하여 20∼3000% 가 되는데, 100∼1000% 가 바람직하다.
처리 (A) 에 있어서의 고정화 효소와 지방산 글리세라이드의 접촉방법은 침지, 교반, 고정화 효소를 충전시킨 칼럼에 펌프 등으로 통액시키는 등, 어느 방법이라도 상관없다. 접촉온도는 접촉 중에 유상이 응고되지 않는 온도이면 되며, 사용하는 지방산 글리세라이드의 특성과 효소의 특성에 따라 적절히 결정할 수 있는데, 5∼60℃, 특히 실온∼40℃ 가 바람직하다. 접촉시간은 0.1∼72시간이 적당한데, 상기 시간 이상 접촉시켜도 되며, 지방산 글리세라이드와 접촉시킨 상태에서 보존할 수도 있다. 또한, 처리 (B) 에 있어서 지방산 또는 지방산 글리세라이드와 접촉시키면서 탈수시키는 경우, 탈수시의 온도는 처리 (A) 의 경우와 동일하며, 탈수시간은 0.5∼24시간이 적당한데, 처리 (B) 의 경우에는 급격한 탈수가 가능하고, 1 시간당 수분 저하율을 50% 이상, 바람직하게는 60% 이상, 특히 70% 이상으로 함으로써 탈수 공정을 단시간에 완료할 수 있다. 탈수방법으로는 몰레큘러 시브스 등의 탈수제를 사용하는 방법, 감압계에서 처리하는 방법 등의 공지의 방법이 채용되는데, 탈수제를 사용하면 처리 후에 탈수제의 제거 등의 조작이 필요하게 됨을 고려하여 감압계에서 처리하는 것이 바람직하다.
효소를 담체에 흡착 고정화시켰을 때의 고정화 효소의 수분은 통상 120∼200% 대 담체 중량의 범위에 있는데, (A) 지방산 글리세라이드와 접촉시킴으로써 5∼50% 대 담체 중량까지 잔존 수분을 저감시킬 수 있다. 또한 (B) 지방산 또는 지방산 글리세라이드와 접촉시키면서 탈수시킨 경우에는 1∼50% 대 담체 중량까지 잔존 수분을 저감시킬 수 있다. 이 접촉처리 또는 탈수처리가 끝난 단계에서 또는 고정화 효소를 사용하기 전에 여과를 실시하여 고정화 효소를 회수하고 실제 반응에 사용한다.
이와 같이, 본 발명에 의하면 지방산 또는 지방산 글리세라이드를 이용하여 수분량을 조정함으로써, 통상 행해지는 건조와 같이 강제적인 수분의 제거시에 발생하는 효소에 대한 손상을 최대한 경감할 수 있다. 이로 인하여, 높은 활성 발현을 갖는 고정화 효소를 조제할 수 있게 된다. 또한, 고정화 효소를 지방산 글리세리드 등과 접촉시킴으로써 과잉 수분이 제거되고, 효소 근방이 반응에 적합한 반응장소를 형성하고 있는 것으로도 여겨진다. 또한 본 발명 방법에 의하여 수분량을 조정한 고정화 효소는 접촉시킨 지방산 글리세리드 등과 분리시킨 상태, 또는 접촉시킨 상태 중 어느 상태에서도 장기간에 걸쳐 보존할 수 있게 된다.
실시예
(실시예 1)
Duolite A-568 (Rohm and Hass 사 제조) 100g 을 N/10 의 NaOH 용액 1ℓ중에서 1 시간 교반하였다. 여과후, 1ℓ의 증류수로 세정하고, 500mM 의 아세트산 완충액 (pH 5) 1ℓ로 pH 를 평형화시켰다. 그 후 50mM 의 아세트산 완충액 (pH 5) 1ℓ로 2 시간씩 2 회 pH 평형화를 실시하였다. 여과하여 담체를 회수한 후, 에탄올 500㎖ 로 30분간 치환을 실시하였다. 여과후, 리시놀산을 100g 함유하는 에탄올 용액 500㎖ 와 담체를 30분간 접촉시켰다. 여과후, 50mM 의 아세트산 완충액 (pH 5) 500㎖ 로 0.5 시간씩 4 회 완충액 치환을 실시하였다. 여과후, 10% 농도의 리ㆍ리파아제 (나가세산업사 제조) 용액 1000㎖ 와 실온에서 4 시 간 접촉시켜 효소의 흡착을 실시하였다. 흡착후, 여과를 실시하고 50mM 의 인산 완충액 (pH 5) 500㎖ 로 0.5 시간 세정하였다. 세정후 여과에 의하여 고정화 효소를 회수하였다. 이 때의 고정화 효소의 잔존 수분량은 흡착 담체 중량에 대하여 168% 였다.
이 고정화 효소에 1000g 의 유채씨 기름을 첨가하고, 40℃, 24 시간 교반한 후, 여과하여 고정화 효소를 회수하였다. 고정화 효소의 잔존 수분량은 흡착 담체 중량에 대하여 29% 였다.
이렇게 수득된 고정화 효소를 건조 중량으로서 8g 계량하고, 200㎖ 용량의 4 구 플라스크에 주입하였다. 거기에 올레인산과 글리세린의 혼합물 80g (몰비로 올레인산/글리세린 = 2.0) 을 첨가하고, 40℃, 400Pa 의 감압하에서 에스테르화 반응을 실시하였다. 반응후, 반응액과 고정화 효소를 여과에 의하여 분리하고, 다시 상기 주입이 되도록 올레인산과 글리세린을 주입하고 반응을 실시하였다. 이 반응후, 동일한 방법으로 반응을 한번 더 실시하였다. 즉, 동일한 고정화 효소를 사용하여 합계 3 회의 에스테르화 반응을 실시하였다.
각 반응액의 글리세라이드 조성은 반응액을 트리메틸실릴화시키고 가스크로마토그래피로 분석하였다. 디글리세라이드 (DG) + 트리글리세라이드 (TG) 의 합계가 70% 가 된 시간을 표 1 에 나타낸다. 1 회째와 2 회째 이후의 반응시간은 각각 1.67시간, 1.53시간으로 충분히 빠르고 고활성이었다.
(실시예 2)
실시예 1 과 동일한 수법으로 효소를 흡착시키고, 완충액으로 세정하고, 여 과에 의하여 고정화 효소를 회수하였다. 이 고정화 효소에 3000g 의 유채씨 기름을 첨가하고, 40℃, 24 시간 교반한 후, 여과하여 고정화 효소를 회수하였다. 고정화 효소의 잔존 수분량은 흡착 담체 중량에 대하여 11% 였다.
이렇게 수득된 고정화 효소를 이용하여, 실시예 1 과 동일하게 반응을 실시한 결과, 1 회째와 2 회째 이후의 반응시간은 각각 1.69시간, 1.52시간으로 충분히 빠르고 고활성이었다.
(실시예 3)
실시예 1 과 동일한 수법으로 효소를 흡착시키고, 완충액으로 세정하고, 여과에 의하여 고정화 효소를 회수하였다. 이 고정화 효소에 400g 의 올레인산을 첨가하고, 40℃, 400Pa 의 감압하, 0.5시간 교반한 후, 여과하여 고정화 효소를 회수하였다. 고정화 효소의 잔존 수분량은 흡착 담체 중량에 대하여 31% 였다.
이렇게 수득된 고정화 효소를 이용하여, 실시예 1 과 동일하게 반응을 실시한 결과, 1 회째와 2 회째 이후의 반응시간은 각각 1.63시간, 1.58시간으로 충분히 빠르고 고활성이었다.
(실시예 4)
실시예 1 과 동일한 수법으로 효소를 흡착시키고, 완충액으로 세정하고, 여과에 의하여 고정화 효소를 회수하였다. 이 고정화 효소에 400g 의 올레인산을 첨가하고, 40℃, 400Pa 의 감압하, 18시간 교반한 후, 여과하여 고정화 효소를 회수하였다. 고정화 효소의 잔존 수분량은 흡착 담체 중량에 대하여 2.4% 였다.
이렇게 수득된 고정화 효소를 이용하여, 실시예 1 과 동일하게 반응을 실시 한 결과, 1 회째와 2 회째 이후의 반응시간은 각각 1.45시간, 1.43시간으로 1 회째 반응부터 충분히 빠르고 고활성이었다.
(비교예 1)
실시예 1 과 동일한 수법으로 효소를 흡착시키고, 완충액으로 세정하고, 여과에 의하여 고정화 효소를 회수하였다. 이 때의 고정화 효소의 잔존 수분량은 담체 중량에 대하여 178% 였다. 이 고정화 효소를 그 상태에서 40℃, 100Pa 의 감압하, 24시간 건조시켰다. 건조후의 고정화 효소의 잔존 수분량은 흡착 담체 중량에 대하여 3% 였다.
이렇게 수득된 고정화 효소를 이용하여, 실시예 1 과 동일하게 반응을 실시한 결과, 1 회째와 2 회째 이후의 반응시간은 각각 2.27시간, 2.23시간으로 현저히 느리고, 실시예 1∼4 에 비하여 에스테르화 활성은 떨어졌다.
(비교예 2)
실시예 1 과 동일한 수법으로 효소를 흡착시키고, 완충액으로 세정하고, 여과에 의하여 고정화 효소를 회수하였다. 이 때의 고정화 효소의 잔존 수분량은 담체 중량에 대하여 178% 였다.
이렇게 수득된 고정화 효소를 이용하여, 실시예 1 과 동일하게 반응을 실시한 결과, 1 회째와 2 회째 이후의 반응시간은 각각 3.52시간, 1.88시간으로 2 회째 이후는 충분히 빠르고 고활성이었으나, 1 회째의 반응은 실시예 1∼4 에 비하여 느렸다.
완충액 세정후의 잔존수분(대 담체 중량) 수분량 저감처리조건 수분저감처리후의 잔존수분(대 담체중량) DG+TG=70%도달시간
지방산 또는 유지(대 담체 중량) 온도 처리
시간		 처리
압력		 1회째 2회째 3회째
실시예1 168% 1000%유채씨기름 40℃ 24시간 상압 29% 1.67시간 1.53시간 1.53시간
실시예2 168% 3000%유채씨기름 40℃ 24시간 상압 11% 1.69시간 1.52시간 1.52시간
실시예3 168% 400%올레인산 40℃ 0.5시간 400Pa 31% 1.63시간 1.58시간 1.58시간
실시예4 168% 400%올레인산 40℃ 18시간 400Pa 2.4% 1.45시간 1.43시간 1.43시간
비교예1 178% - 40℃ 24시간 100Pa 3% 2.27시간 2.23시간 2.23시간
비교예2 178% - - - - - 3.52시간 1.88시간 1.88시간
본 발명 방법에 의하여, 효소의 실활을 초래하는 건조를 실시하지 않고 수분량을 조정하여, 고활성의 에스테르화 반응용 고정화 효소를 제조할 수 있다.

Claims (5)

  1. 유지분해용 효소를 고정화용 담체에 흡착 고정화시킨 후, 건조시키지 않고, 담체 중량에 대하여 800∼5000% 의 지방산 트리글리세라이드 또는 지방산 부분 글리세라이드에 접촉시킴으로써, 담체 중량에 대하여 5∼50중량% 의 잔존 수분량이 되도록 효소 수분을 조정하는 에스테르화 반응용 고정화 효소의 제조방법.
  2. 삭제
  3. 유지분해용 효소를 고정화용 담체에 흡착 고정화시킨 후, 직접 건조시키지 않고, 담체 중량에 대하여 20∼3000중량% 의 지방산, 지방산 트리글리세라이드 또는 지방산 부분 글리세라이드에 접촉시키면서 탈수시킴으로써, 담체 중량에 대하여 1∼50중량% 의 잔존 수분량이 되도록 효소 수분을 조정하는 에스테르화 반응용 고정화 효소의 제조방법.
  4. 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서, 효소를 흡착시킨 후 고정화 효소와 접촉시키는 지방산, 지방산 트리글리세라이드 또는 지방산 부분 글리세라이드가 효소의 유상 기질인 고정화 효소의 제조방법.
  5. 제 3 항에 있어서, 탈수를 감압에 의해 실시하는, 에스테르화 반응용 고정화 효소의 제조방법.
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Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR0302166A (pt) * 2002-07-02 2004-09-08 Kao Corp Processo para preparação de enzima imobilizada
CA2575731C (en) * 2003-12-24 2014-07-15 Chemica Technologies, Inc. Dialysate regeneration system for portable human dialysis
JP4220957B2 (ja) 2004-11-12 2009-02-04 花王株式会社 固定化酵素の製造方法
CN100340664C (zh) * 2005-09-21 2007-10-03 浙江大学 高稳定性固定化酶的制备方法
JP4465537B2 (ja) * 2007-06-14 2010-05-19 Ｓｍｃ株式会社 電磁弁
JP5242230B2 (ja) * 2008-04-21 2013-07-24 花王株式会社 固定化酵素の製造方法
US10000731B2 (en) 2010-03-01 2018-06-19 Trans Bio-Diesel Ltd. Enzymatic transesterification/esterification processes employing lipases immobilized on hydrophobic resins in the presence of water solutions
CN105754982B (zh) * 2014-12-15 2021-12-07 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 固定化脂肪酶以及固定化脂肪酶的制备方法
CN106929502B (zh) * 2015-12-30 2021-12-21 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 固定化脂肪酶颗粒

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1008647A2 (en) * 1998-12-07 2000-06-14 Kao Corporation A process for preparing an immobilized enzyme

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH066058B2 (ja) 1985-12-07 1994-01-26 不二製油株式会社 酵素剤の製造法
GB8729890D0 (en) * 1987-12-22 1988-02-03 Unilever Plc Improvements in & relating to fat processes
US5177013A (en) 1989-07-31 1993-01-05 Ajinomoto Co., Inc. Preparation of an immobilized lipase having a low water content without drying
US5445955A (en) * 1992-05-25 1995-08-29 The Nisshin Oil Mills, Ltd. Immobilization of lipase on a polymer carrier containing epoxy and tertiary amino groups
EP0706578B1 (en) * 1993-07-02 1998-09-09 Unichema Chemie B.V. Process for the esterification of carboxylic acids with tertiary alcohols
US6258575B1 (en) * 1998-11-26 2001-07-10 Kao Corporation Hydrolyzing fats and oils using an immobilized enzyme column and substrate-feeding chamber that separates phases
JP3720205B2 (ja) 1998-12-07 2005-11-24 花王株式会社 部分グリセライドの製造方法
BR0302166A (pt) * 2002-07-02 2004-09-08 Kao Corp Processo para preparação de enzima imobilizada
JP4220957B2 (ja) * 2004-11-12 2009-02-04 花王株式会社 固定化酵素の製造方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1008647A2 (en) * 1998-12-07 2000-06-14 Kao Corporation A process for preparing an immobilized enzyme

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