JP3954016B2 - 固定化酵素 - Google Patents

Description

本発明は、油脂（モノ、ジ又はトリグリセライド）若しくはエステルの加水分解、又は油脂のエステル交換反応若しくは脂肪酸とアルコール類のエステル化反応における触媒として使用される固定化酵素、及びその製造方法、並びに当該固定化酵素を用いた油脂の加水分解方法及び油脂の製造方法に関する。

酵素を触媒として用いた反応は温和な条件で行われ、副反応や反応対象物の熱によるダメージ等を起こすことがないため有用な方法である。一方で、酵素はコストが高いため、酵素を回収するという目的から酵素を固定化し、さらにその活性を高めるために脂肪酸等で固定化担体を処理する技術が知られている（特許文献１参照）。しかし、固定化担体は回収できたとしても、反応中又は回収作業により固定化された酵素の一部は脱離し、回収と再利用を繰り返すうちに徐々に活性が低下する。

そこで、酵素の脱離を抑制する方法として、酵素（プロテアーゼ、アミラーゼ）を担体に吸着した後にトランスグルタミナーゼにより架橋し、耐久性を向上させるという技術がある（特許文献２参照）。また、多孔性基材膜の膜孔表面に導入されたグラフト高分子鎖に、サイクロイソマルトオリゴ糖グルカノトランスフェラーゼを吸着法により固定化した後、該酵素間をトランスグルタミナーゼにより架橋した酵素固定多孔膜を製造するという技術がある（特許文献３参照）。しかし、トランスグルタミナーゼによる処理を行うと、耐久性は向上するが、初期の酵素の活性が低下し、反応効率が低下するというのが現実である。
特開平１−１５３０９０号公報 特開平６−４６８５５号公報 特開２００２−５１７７２号公報

本発明は、酵素の活性を高め、さらにこれを維持する固定化酵素、及びその製造方法を提供することを目的とする。

そこで本発明者は、酵素活性を高める手段と、耐久性を高める手段とを検討した結果、脂溶性脂肪酸等による固定化酵素の処理と、トランスグルタミナーゼによる処理の組合せが、それぞれの欠点を発現させることなく、酵素活性を高めかつ耐久性を向上させる効果を発揮することを見出した。また、このようにして固定化された酵素は反応の至適温度が上昇し、反応速度をさらに向上させることができることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、次の成分（Ａ）〜（Ｄ）を有する固定化リパーゼであって、予め成分（Ａ）で処理した成分（Ｂ）に、成分（Ｃ）を吸着固定化した後、成分（Ｄ）を作用させて得られる固定化リパーゼを提供するものである。
（Ａ）脂溶性脂肪酸又はその誘導体、
（Ｂ）固定化担体、
（Ｃ）リパーゼ、
（Ｄ）トランスグルタミナーゼ。
また、本発明は、予め脂溶性脂肪酸又はその誘導体で処理した固定化担体に、リパーゼを吸着固定化した後、トランスグルタミナーゼを作用させる固定化リパーゼの製造方法も提供するものである。
さらにまた、本発明は、上記固定化リパーゼを用いる油脂の加水分解法、及び油脂の製造方法を提供するものである。

本発明によれば、酵素活性を非常に高くでき、耐久性を向上させ、かつ反応温度を上昇させることができることから、油脂（モノ、ジ又はトリグリセライド）若しくはエステルの加水分解、又は油脂のエステル交換反応若しくは脂肪酸とアルコールのエステル化反応において、高い製造効率で、かつ低コストで目的物を製造することが可能となる。

本発明において使用する固定化担体は、セライト、ケイソウ土、カオリナイト、シリカゲル、モレキュラーシーブス、多孔質ガラス、活性炭、炭酸カルシウム、セラミックス等の無機担体、セラミックスパウダー、ポリビニルアルコール、ポリプロピレン、キトサン、イオン交換樹脂、疎水吸着樹脂、キレート樹脂、合成吸着樹脂等の有機高分子等が挙げられるが、特に保水力の点からイオン交換樹脂が好ましい。また、イオン交換樹脂の中でも、大きな表面積を有することにより酵素のより大きな吸着量を得ることができるという点から、多孔質であることが好ましい。

樹脂の粒子径は１００〜１０００μmが好ましく、特に２５０〜７５０μmが好ましい。細孔径は１０〜１５０nmが好ましい。材質としては、フェノールホルムアルデヒド系、ポリスチレン系、アクリルアミド系、ジビニルベンゼン系等が挙げられ、特にフェノールホルムアルデヒド系樹脂（例えば、Rohm and Hass社製Duolite A-568）が好ましい。

本発明において使用する脂溶性脂肪酸又はその誘導体のうち、脂溶性脂肪酸としては、炭素数４〜２４、好ましくは８〜１８の飽和又は不飽和の、直鎖又は分岐鎖の、水酸基が置換していてもよい脂肪酸が挙げられる。具体的には、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、リノール酸、α-リノレン酸、リシノール酸、イソステアリン酸等が挙げられる。またその誘導体としては、これらの脂肪酸と一価又は多価アルコールとのエステル、リン脂質、及びこれらのエステルにエチレンオキサイドを付加した誘導体が挙げられる。具体的には、上記脂肪酸のメチルエステル、エチルエステル、モノグリセライド、ジグリセライド、それらのエチレンオキサイド付加体、ポリグリセリンエステル、ソルビタンエステル、ショ糖エステル等が挙げられる。これらの脂肪酸及びその誘導体はいずれも常温で液状であることが工程上好ましい。これらの脂溶性脂肪酸又はその誘導体としては、上記２種以上を併用してもよく、大豆脂肪酸などの天然由来の脂肪酸を用いることもできる。

本発明において使用する酵素は特に限定はされないが、脂溶性脂肪酸等による活性の向上効果が高い点から、油脂分解用酵素としてのリパーゼが好ましい。リパーゼは、動物由来、植物由来のものはもとより、微生物由来の市販リパーゼを使用することもできる。微生物由来リパーゼとしては、リゾプス（Rizopus）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、ムコール（Mucor）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、ジオトリケム（Geotrichum）属、ペニシリウム（Penicillium）属、キャンディダ（Candida）属等の起源のものが挙げられる。

本発明において使用するトランスグルタミナーゼは、トランスグルタミナーゼ活性を有していれば、動物由来、植物由来、微生物由来のいずれでも良く、例えば微生物由来の市販製剤であるアクティバTG-S（味の素社製）を使用することができる。

本発明においては、酵素が固定化されていることが必須である。酵素の固定化を行う温度は、酵素の特性によって決定することができるが、酵素の失活が起きない０〜６０℃、特に５〜４０℃が好ましい。また固定化時に使用する酵素溶液のpHは、酵素の変性が起きない範囲であればよく、温度同様酵素の特性によって決定することができるが、pH３〜９が好ましい。このpHを維持するためには緩衝液を使用するが、緩衝液としては、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等が挙げられる。上記酵素溶液中の酵素濃度は、固定化効率の点から酵素の飽和溶解度以下で、かつ十分な濃度であることが望ましい。また酵素溶液は、必要に応じて不溶部を遠心分離で除去した上澄や、限外濾過等によって精製したものを使用することもできる。また用いる酵素質量はその酵素活性によっても異なるが、担体質量に対して５〜１０００％、特に１０〜５００％が好ましい。

本発明においては、予め脂溶性脂肪酸又はその誘導体で処理した固定化担体に、酵素を吸着固定化した後、トランスグルタミナーゼを作用させて得られる固定化酵素が好ましい。

酵素を固定化する場合、担体と酵素を直接吸着してもよいが、高活性を発現するような吸着状態にするため、酵素吸着前にあらかじめ担体を脂溶性脂肪酸又はその誘導体で処理することが好ましい。脂溶性脂肪酸又はその誘導体と担体の接触法としては、水又は有機溶剤中にこれらを直接加えてもよいが、分散性を良くするため、有機溶剤に脂溶性脂肪酸又はその誘導体を一旦分散、溶解させた後、水に分散させた担体に加えてもよい。この有機溶剤としては、クロロホルム、ヘキサン、エタノール等が挙げられる。脂溶性脂肪酸又はその誘導体の使用質量は、担体質量に対して１〜５００％、特に１０〜２００％が好ましい。接触温度は０〜１００℃、特に２０〜６０℃が好ましく、接触時間は５分〜５時間程度が好ましい。この処理を終えた担体は、ろ過して回収するが、乾燥してもよい。乾燥温度は室温〜１００℃が好ましく、減圧乾燥を行ってもよい。

酵素を固定化した後、トランスグルタミナーゼを添加し酵素同士を架橋させるのが好ましい。トランスグルタミナーゼを作用させる温度は、酵素及びトランスグルタミナーゼの失活が起きない範囲であれば良く、０〜６０℃、特に３０〜４０℃が好ましい。また作用させるpHも同様に、５〜９が好ましい。トランスグルタミナーゼの使用量は、担体／酵素／トランスグルタミナーゼの質量比が、１／０．４〜１０／０．００１〜０．０５であることが好ましく、１／０．７〜５／０．００２〜０．０２であることがより好ましい。

油脂を加水分解する際に、本発明による固定化酵素を使用して、油脂と水を反応させることにより行うことが、製造効率が高い点から好ましい。また、脂肪酸とアルコール類をエステル化反応して油脂を製造するため、又は油脂のエステル交換反応を行うためにも、本発明による固定化酵素を使用することが、製造効率が高い点から好ましい。その際の反応温度は２０〜８０℃が好ましく、３０〜７０℃であることがより好ましく、３５〜６０℃であることが特に好ましい。

〔固定化酵素の製造〕
本発明品
Duolite A-568（Rohm and Hass社製）１００ｇをＮ／１０のNaOH溶液１Ｌ中で１時間攪拌した。濾過後、１Ｌの蒸留水で洗浄し、５００mMのリン酸緩衝液（pH７）１ＬでpHを平衡化した。その後５０mMのリン酸緩衝液（pH７）１Ｌで２時間ずつ２回、pH平衡化を行った。濾過して担体を回収した後、エタノール５００mLで置換を３０分行った。濾過後、リシノール酸を１００ｇ含むエタノール溶液５００mLと担体を３０分間接触させた。濾過後、５０mMのリン酸緩衝液（pH７）５００mLで０．５時間ずつ４回緩衝液置換を行った。濾過後、１０％濃度のリパーゼAY「アマノ」３０G（天野エンザイム社製）溶液１０００mLと室温で２時間接触させ、酵素の吸着を行った。その後、アクティバTG-S（味の素社製のトランスグルタミナーゼ、純分１％）を１００ｇ添加し、３０℃で２時間、架橋反応を行った。酵素架橋後、濾過を行い、５０mMのリン酸緩衝液（pH７）５００mLで０．５時間洗浄した。洗浄後濾過によって固定化酵素を回収した。この固定化酵素に４００ｇの菜種油を添加し、４０℃、２時間攪拌した後、濾過して固定化酵素を得た。

比較品Ａ
アクティバTG-Sによる架橋反応をを行わない以外は、本発明品と同様の方法で固定化酵素を製造した。

比較品Ｂ
リシノール酸による固定化担体の前処理を行わない以外は、本発明品と同様の方法で固定化酵素を製造した。

比較品Ｃ
リシノール酸による固定化担体の前処理、及びアクティバTG-Sによる架橋反応を行わない以外は、本発明品と同様の方法で固定化酵素を製造した。

〔油脂の加水分解〕
固定化酵素として、実施例１及び２においては本発明品、比較例１及び２においては比較品Ａ、比較例３においては比較品Ｂ、比較例４においては比較品Ｃを、それぞれ乾燥重量として１ｇ計量し、１００mL容の四つ口フラスコに仕込んだ。そこへ菜種油を５０ｇと蒸留水を３０ｇ添加し、窒素気流下で攪拌しながら４０あるいは５０℃下で加水分解反応を行った。

〔酵素活性の測定法〕
加水分解の反応液を経時的にサンプリングし、遠心分離（1,000×ｇ、５分）後、油相部の酸価（ＡＶ）を測定し、分解率（＝油相部のＡＶ／原料菜種油のケン化価（ＳＶ）×１００）を算出した。分解率が９０％に到達するまでの時間を活性値の指標とし、基準値に対する相対活性の％で示した。結果を表１に示す。

〔酵素の耐久性試験法〕
固定化酵素として、本発明品、比較品Ａ〜Ｃをカラムに充填し、長期通液運転を行った。分解率が９０％以上に到達した時点で基質を入れ替えることを繰り返し、７２０時間の連続通液運転を行った。最初の反応において分解率が９０％以上に達した時点までの時間をもって初期活性の指標とし、７２０時間運転後の反応における分解率が９０％に到達するまでの時間をもって酵素の残存活性の指標とし、初期活性を１００％とした場合の残存活性の％をもって酵素の耐久性の指標とした。結果を表１に示す。

固定化酵素として、リシノール酸による固定化担体の前処理、及びアクティバTG-Sによる架橋反応を行っていない比較品Ｃにより加水分解を行った比較例４に比べ、アクティバTG-Sによる架橋反応のみを行った比較品Ｂにより加水分解を行った比較例３は、耐久性は５２％から６９％に向上するものの、初期相対活性が１００％から５３％へと低下し、結果として残存相対活性が低下しており、架橋反応を行うことによる生産性の向上というメリットが認められなかった。また、比較例４に比べ、リシノール酸による固定化担体の前処理のみを行った比較品Ａにより加水分解を行った比較例１は、初期相対活性が１００％から３０３％へ向上するものの、耐久性は変化がなく、残存活性については特許文献１記載の技術から予期される結果であった。
一方、リシノール酸による固定化担体の前処理のみを行った比較品Ａにより加水分解を行った比較例１に比べ、比較品ＡにさらにアクティバTG-Sによる架橋反応を行った本発明品により加水分解を行った場合は、初期活性の低下が起こっていないことが分かった。即ち、リシノール酸による固定化担体の前処理により、比較例４に対する比較例３の結果のような、アクティバTG-Sによる架橋反応による初期活性低下のデメリットが見られなかった。加えてアクティバTG-Sによる架橋反応により耐久性が向上し、結果として生産性の大幅な向上が達成されていることが分かった。
さらに、本発明品により加水分解を行った場合のみ、反応の至適温度が５０℃へ上昇し、その結果初期活性の向上に加えて反応速度が大幅に向上し、極めて高い生産性が達成されることが分かった。

Claims (6)

1. 次の成分（Ａ）〜（Ｄ）を有する固定化リパーゼであって、予め成分（Ａ）で処理した成分（Ｂ）に、成分（Ｃ）を吸着固定化した後、成分（Ｄ）を作用させて得られる固定化リパーゼ。
   （Ａ）脂溶性脂肪酸又はその誘導体、
   （Ｂ）固定化担体、
   （Ｃ）リパーゼ、
   （Ｄ）トランスグルタミナーゼ。
2. （Ｂ）の固定化担体がイオン交換樹脂である請求項１記載の固定化リパーゼ。
3. 予め脂溶性脂肪酸又はその誘導体で処理した固定化担体に、リパーゼを吸着固定化した後、トランスグルタミナーゼを作用させる固定化リパーゼの製造方法。
4. 固定化担体がイオン交換樹脂である請求項３記載の固定化リパーゼの製造方法。
5. 請求項１又は２記載の固定化リパーゼ、又は請求項３又は４記載の方法により製造された固定化リパーゼを用い、油脂と水を反応させる油脂の加水分解方法。
6. 請求項１又は２記載の固定化リパーゼ、又は請求項３又は４記載の方法により製造された固定化リパーゼを用い、油脂をエステル交換反応若しくは脂肪酸とアルコール類をエステル化反応させる油脂の製造方法。