JP4109059B2 - 固定化酵素の製造方法 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、油脂を加水分解して脂肪酸とグリセリンを生成する工程で触媒として用いられる、高活性の固定化酵素の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
脂肪酸のエステル化反応、油脂のエステル交換反応又は油脂の加水分解反応において、無機又は有機の担体に酵素を固定化した固定化酵素が用いられている。固定化酵素の製造においては、固定化後の酵素の失活をできるだけ防止するためには、水分の除去が望ましいことが知られている（例えば、特許文献１参照）。また、エステル化反応又はエステル交換反応に使用するためのリパーゼは、固定化する担体や固定化方法にもよるが、反応を効率よく行うために、酵素固定化後に乾燥させることが知られており、更には乾燥後の水分量をコントロールすることも知られている（例えば、特許文献２、３参照）。更に、油脂を加水分解する目的で使用する固定化酵素においても、固定化後に乾燥する方法が採られているものがある（例えば、特許文献４参照）。
【０００３】
上記の技術における固定化酵素の乾燥は、減圧式又は真空式により、温度的には酵素が失活しない条件で行われているが、それにもかかわらず、このような乾燥工程によって酵素の失活が起こりやすい。そのため、乾燥後の固定化酵素は、実際の活性発現時に吸着時の最大活性を発現しない場合が多い。
【０００４】
また、固定化酵素の乾燥を脂肪酸誘導体の接触下で行うことにより活性発現を高めるという技術もある（特許文献５参照）。しかし、この方法では、固定化酵素の乾燥に高価な設備が必要である上に、緩慢乾燥の条件設定等が複雑であり、実用的・効率的でない。更に、酵素を固定化用担体に吸着固定化した後、乾燥せずに速やかに直接反応基質と接触させてエステル化反応を行うという技術もある（特許文献６参照）。この方法によれば、初発の反応では水分の持ち込みにより反応が遅延するものの、２回目以降の反応においては高活性が達成できる。しかし反応基質に速やかに接触させる必要があり、固定化酵素の形態での保存には適していない。
【０００５】
【特許文献１】
特開昭60-232089号公報
【特許文献２】
特開平03-501922号公報
【特許文献３】
特開昭60-98984号公報
【特許文献４】
特開平01-174384号公報
【特許文献５】
特開昭62-134090号公報
【特許文献６】
特開2000-166589号公報
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
そこで本発明は、乾燥時における酵素の失活が少なく、高活性な油脂分解用固定化酵素を製造する方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、前記の技術における減圧式又は真空式による乾燥では、乾燥に16〜48時間と極めて長時間要しているため、酵素の失活を起こしてしまうことを見出した。そして、油脂分解用酵素を固定化担体に固定化した後の乾燥を短時間で行うことにより、酵素の失活を抑制し、高い活性を発現することができることを見出した。
【０００８】
すなわち本発明は、油脂分解用酵素を固定化担体に吸着固定化した後、８時間以内の乾燥時間で、水分量が４重量％以下となるまで乾燥する油脂加水分解用固定化酵素の製造方法を提供するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明で使用する固定化用担体は、セライト、ケイソウ土、カオリナイト、シリカゲル、モレキュラーシーブス、多孔質ガラス、活性炭、炭酸カルシウム、セラミックス等の無機担体、セラミックスパウダー、ポリビニルアルコール、ポリプロピレン、キトサン、イオン交換樹脂、疎水吸着樹脂、キレート樹脂、合成吸着樹脂等の有機高分子等が挙げられるが、特にイオン交換樹脂が望ましい。
【００１０】
イオン交換樹脂としては、多孔質の陰イオン交換樹脂が好ましい。このような多孔質担体は、大きな表面積を有するため、酵素のより大きな吸着量を得ることができる。樹脂の粒子径は100〜1000μmが好ましく、細孔径は10〜150nmが好ましい。材質としては、フェノールホルムアルデヒド系、ポリスチレン系、アクリルアミド系、ジビニルベンゼン系等が挙げられ、特にフェノールホルムアルデヒド系樹脂（例えば、Rohm and Hass社製Duolite A-568）が望ましい。
【００１１】
本発明で使用する油脂分解用酵素としては、リパーゼが好ましい。リパーゼは、動物由来、植物由来のものはもとより、微生物由来の市販リパーゼを使用することもできる。微生物由来リパーゼとしては、リゾプス（Rizopus）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、ムコール（Mucor）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、ジオトリケム（Geotrichum）属、ペニシリウム（Penicillium）属、キャンディダ（Candida）属等の起源のものが挙げられる。
【００１２】
これらの酵素を固定化する場合、担体と酵素を直接吸着してもよいが、高活性を発現するような吸着状態にするため、酵素吸着前にあらかじめ担体を脂溶性脂肪酸又はその誘導体で処理して使用してもよい。使用する脂溶性脂肪酸としては、炭素数８〜18の飽和又は不飽和の、直鎖又は分岐鎖の、水酸基が置換していてもよい脂肪酸が挙げられる。具体的には、カプリン酸、ラウリン酸、ミスチリン酸、オレイン酸、リノール酸、α-リノレン酸、リシノール酸、イソステアリン酸等が挙げられる。またその誘導体としては、これらの脂肪酸と一価又は多価アルコールとのエステル、リン脂質、及びこれらのエステルにエチレンオキサイドを付加した誘導体が挙げられる。具体的には、上記脂肪酸のメチルエステル、エチルエステル、モノグリセライド、ジグリセライド、それらのエチレンオキサイド付加体、ポリグリセリンエステル、ソルビタンエステル、ショ糖エステル等が挙げられる。これらの脂溶性脂肪酸又はその誘導体は、２種以上を併用してもよい。
【００１３】
これらの脂溶性脂肪酸又はその誘導体と担体の接触法としては、水又は有機溶剤中にこれらを直接加えてもよいが、分散性を良くするため、有機溶剤に脂溶性脂肪酸又はその誘導体を一旦分散、溶解させた後、水に分散させた担体に加えてもよい。この有機溶剤としては、クロロホルム、ヘキサン、エタノール等が挙げられる。脂溶性脂肪酸又はその誘導体の使用量は、担体重量に対して１〜500％、特に10〜200％が好ましい。接触温度は０〜100℃、特に20〜60℃が好ましく、接触時間は５分〜５時間程度が好ましい。この処理を終えた担体は、ろ過して回収するが、乾燥してもよい。乾燥温度は室温〜100℃が好ましく、減圧乾燥を行ってもよい。
【００１４】
酵素の固定化を行う温度は、酵素の特性によって決定することができるが、酵素の失活が起きない０〜60℃、特に５〜40℃が好ましい。また固定化時に使用する酵素溶液のpHは、酵素の変性が起きない範囲であればよく、温度同様酵素の特性によって決定することができるが、pH３〜９が好ましい。このpHを維持するためには緩衝液を使用するが、緩衝液としては、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等が挙げられる。
【００１５】
上記酵素溶液中の酵素濃度は、固定化効率の点から酵素の飽和溶解度以下で、かつ十分な濃度であることが望ましい。また酵素溶液は、必要に応じて不溶部を遠心分離で除去した上澄や、限外濾過等によって精製したものを使用することもできる。また用いる酵素量は、担体重量に対して５〜1000％、特に10〜500％が好ましい。
【００１６】
本発明においては、油脂分解用酵素を固定化用担体に吸着固定化した後、８時間以内、好ましくは５時間以内、更に好ましくは2.5時間以内、特に好ましくは２時間以内の乾燥時間で、水分量が４重量％以下となるまで乾燥を行う。この乾燥に８時間を超える時間をかけると、酵素の失活を招き、低活性な油脂分解用固定化酵素となってしまう。
【００１７】
固定化後の乾燥を短時間で行うためには、減圧下で乾燥することが好ましく、なおかつ、固定化後の粒子が互いに固着しないよう、外力を作用させながら乾燥することが好ましい。その条件を満たすものとして、特に、減圧式回転乾燥器を使用することが好ましい。乾燥温度は特に限定されず、８時間以内の乾燥時間で４重量％以下に乾燥できる条件であれば、常温下で乾燥しても加熱下で乾燥してもよい。また、乾燥は、無溶媒系で行うことが好ましい。
【００１８】
減圧式回転乾燥器の回転数は、８時間以内の乾燥時間であれば特に制限はないが、回転数が大きいほど乾燥を効率よく行うことができる。ただし、あまり大きすぎると固定化酵素の担体の磨耗が発生するため、装置の規模に応じて適宜、回転数を設定すればよい。
【００１９】
このように、本発明によれば、酵素固定化後の乾燥を８時間以内という短時間で行うことにより、乾燥による酵素の失活を、極力軽減することができる。このため、高い活性発現を有する固定化酵素を調製することが可能となる。
【００２０】
【実施例】
実施例１
(1)酵素の固定化
Duolite A-568（Rohm and Hass社製）10gをN/10のNaOH溶液100mL中で１時間撹拌した。濾過した後、100mLのイオン交換水で洗浄し、500mMの酢酸緩衝液（pH７）100mLでpHの平衡化を行った。その後、50mMの酢酸緩衝液（pH７）100mLで２時間ずつ２回pHの平衡化を行った。この後濾過を行い、担体を回収した後、エタノール50mLでエタノール置換を行った。濾過した後、リシノール酸を10ｇ含むエタノール50mLを加え、30分間リシノール酸を担体に吸着させた。その後、担体を回収し、50mMの酢酸緩衝液（pH７）50mLで30分ずつ４回洗浄し、エタノールを除去し、濾過して担体を回収した。
次いで、リパーゼ（リパーゼAYアマノ30，天野製薬社）3.88ｇを50mM酢酸緩衝液（pH７）180mLに溶解した酵素液と２時間接触させ、固定化を行った。この時、固定化後の残存活性と固定化前の酵素液の活性の差より固定化率を求めたところ、70％であった。固定化後に濾過して固定化酵素を回収した後、50mMの酢酸緩衝液（pH７）50mLで30分間洗浄を行い、固定化していない酵素や蛋白を洗浄した。洗浄後に濾過して湿潤状態の固定化酵素を回収した。以上の操作は全て20℃で行った。湿潤状態の固定化酵素は24ｇであり、水分量を測定したところ、約50重量％であった。
【００２１】
(2) 乾燥
湿潤状態の固定化酵素10ｇを300mLナスフラスコに入れ、減圧式回転乾燥器（内径150mm，回転数185rpm）により、40℃、30Torr下の条件で、水分量４重量％まで乾燥した。このときの乾燥時間は、１時間を要した。
100mL四つ口フラスコに、得られた乾燥固定化酵素５ｇ、大豆油50ｇ及び水30ｇを投入し、40℃、400rpmの条件で分解反応を行った。90％の分解率が得られるまでの所要時間は1.5時間であった。
【００２２】
実施例２
減圧式回転乾燥器の回転数を25rpmとする以外は全て実施例１と同様に行った。このときの乾燥時間は2.3時間を要した。
この乾燥固定化酵素を用いて、実施例１と同様に大豆油の加水分解を行ったところ、90％の分解率が得られるまでの所要時間は2.3時間であった。
【００２３】
比較例１
減圧式回転乾燥器の回転数を０rpmとする以外は全て実施例１と同様に行った。このときの乾燥時間は9.5時間を要した。
この乾燥固定化酵素を用いて、実施例１と同様に大豆油の加水分解を行ったところ、90％の分解率が得られるまでの所要時間は5.4時間であった。
【００２４】
比較例２
実施例１(1)で得られた湿潤状態の固定化酵素を、減圧式棚乾燥器により、水分量４重量％まで乾燥した。このとき、乾燥時間は30時間要した。
この乾燥固定化酵素を用いて、実施例１と同様に大豆油の加水分解を行ったところ、90％の分解率が得られるまでの所要時間は9.3時間であった。
【００２５】
【発明の効果】
本発明方法により、乾燥時における酵素の失活が少なく、高活性な油脂分解用固定化酵素を製造することができる。

Claims (1)

1. 多孔質の陰イオン交換樹脂からなる固定化担体を脂溶性脂肪酸又は脂溶性脂肪酸誘導体で処理し、次いで油脂分解用酵素を固定化担体に吸着固定化した後、減圧式回転乾燥器を用い、８時間以内の乾燥時間で、水分量が４重量％以下となるまで、減圧下で、固定化後の粒子が互いに固着しないように外力を作用させながら乾燥する油脂加水分解用固定化酵素の製造方法。