JPH04335893A - 固定化酵素を用いるエステル合成方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、酵素を用いるエステル
結合の合成および交換反応に適した固定化酵素およびそ
れを用いたエステル合成反応に関する。

【０００２】

【従来の技術】エステル類の合成反応は、脂肪族１価ア
ルコールと脂肪酸によるワックスエステルの合成、モノ
グリセリド、ポリグリセリン脂肪酸エステル、糖エステ
ルといった多価アルコールと脂肪酸によるエステル合成
、コレステリルパルミテート等のステロイドエステル類
の合成、ゲラニルブチレート等のテルペンアルコール類
の合成方法として重要な技術である。

【０００３】脂質分解酵素の一種であるリパーゼは、温
和な条件で反応すること、位置選択性、アルキル選択性
等の特異性を有することを利用して油脂およびエステル
類の合成、交換反応に利用されている。しかし、これら
の反応はリパーゼ本来の作用である加水分解反応と異な
り、水分の限定された系、すなわち有機溶媒中で多く行
われている。そのため、酵素が不溶状態になることが多
く、通常の酵素反応と比較しても反応速度が著しく低下
する。したがって、酵素を不溶性担体表面に吸着固定化
することにより分散性を良くし、基質との接触を多くす
ることで反応速度を向上させ、また、固定化することに
より触媒として高価な酵素の回収も容易にさせ、エステ
ル合成反応または交換反応の工業的実施においても反応
装置の連続使用を容易にさせるという工夫が行われてき
た。

【０００４】しかし、この様な利点を有する固定化酵素
においても反応速度の点でまだ十分とはいいがたく、エ
ステル合成活性や交換活性を増大させる方法として、特
開昭６２−１３４０９０号公報に開示された脂肪酸誘導
体共存下において酵素を乾燥することにより活性の高い
固定化酵素を得る方法や、特開平１−１５３０９０号公
報に開示された脂肪酸およびその誘導体をあらかじめ吸
着処理した不溶性担体と、脂質分解酵素とを水性媒体中
で吸着固定化して得られる固定化酵素を用いて反応を行
う方法が開発されてきた。

【０００５】これらの方法では、酵素を不溶性担体に吸
着乾燥させる際に脂肪酸やリン脂質などの脂肪酸誘導体
を共存させることにより界面に配向し活性化した状態で
酵素が固定化されるために、反応速度が向上すると考え
られている。ところが、これらのエステル合成反応は多
くの場合有機溶媒中で行われるために、先述の脂肪酸や
脂肪酸誘導体を含有した固定化酵素を用いた場合、反応
中に溶媒によっては固定化酵素中の脂肪酸や脂肪酸誘導
体を少なからず溶解してしまう可能性があった。したが
って、短期間の反応においては十分な活性を発現するこ
とはあっても、長時間の反応においては固定化酵素内の
脂肪酸や脂肪酸誘導体が徐々に溶出してしまい、活性化
状態に固定化されていた酵素が徐々に通常の状態になり
、反応速度が徐々に低下してしまという問題を有してい
た。

【０００６】

【問題点を解決する手段】そこで、本発明者らは酵素を
用いるエステル合成および交換反応において、反応速度
が高く、しかもその高い活性が長期間にわたって安定し
て持続するような固定化酵素を得る方法について鋭意検
討した結果、酵素を不溶性担体に吸着乾燥させる際に脂
肪酸やリン脂質などの脂肪酸誘導体を共存させ活性化し
た状態で固定した酵素を、さらにグルタルアルデヒドな
どの多官能性架橋試薬によって架橋させることにより高
活性でしかも安定な固定化酵素が得られることを発見し
、本発明の完成に至ったのである。

【０００７】すなわち、本発明は、酵素を用いるエステ
ル合成および交換反応において反応速度が高く、しかも
その高い活性が長期間にわたって安定して続くような固
定化酵素を得る方法および、その固定化酵素を用いたエ
ステル合成および交換反応に関するものである。以下、
本発明の詳細を説明する。

【０００８】本発明の固定化酵素を得る方法においては
、まず第一に脂肪酸やリン脂質などの脂肪酸誘導体を共
存させ活性化した状態で固定した酵素を得ることが必要
である。この方法としては、特開平１−１５３０９０号
公報に開示されたように、あらかじめ不溶性担体に脂肪
酸およびその誘導体を吸着させた後、乾燥もしくは乾燥
せずにそのまま酵素を含む溶液に添加し該不溶性担体に
吸着させて乾燥させても良いし、特開昭　６２−１３４
０９０号公報に開示されたように、酵素を含む水溶液に
脂肪酸またはその誘導体を添加し、不溶性担体を混合し
た後に吸着乾燥させてもよい。

【０００９】本発明に用いる不溶性担体としては、水お
よびアルコール等の各種有機溶剤、油脂類に不溶性の担
体ならいずれでもよく、例えば、セライト、けいそう土
、カオリナイト、多孔質ガラス、セラミックスなどの無
機担体、およびセルロースパウダー、ポリビニルアルコ
ール、キトサンなどの有機高分子のような酵素の活性に
影響を与えず、操作上から物理的・化学的に安定なもの
であればいずれも使用できる。また、担体の形状として
は、粉末状、顆粒状、繊維状、スポンジ状など種々あり
、いずれも使用できるが、表面積を大きくできる点から
微粉末状のものが好ましい。

【００１０】本発明に用いる酵素としては、エステル合
成活性をもつものであれば、動物、植物、微生物のいず
れによって生産されたものでもよく、例えばリパーゼ、
ホスホリパーゼ、コレステロールエステラーゼ、スフィ
ンゴミエリエーゼ及び各種のエステラーゼが挙げられる
。これらのうちリパーゼの例としては、シュードモナス
（Ｐｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄ
ｉｄａ）属などの微生物由来の酵素のほか、高等動物由
来の膵臓リパーゼなどが挙げられる。コレステロールエ
ステラーゼの例としては、キャンディダ属など微生物起
源のものがあげられる。これらの酵素は粗製、精製品い
ずれも使用できる。

【００１１】本発明に用いる脂肪酸としては、炭素数が
２〜３６のものが好ましく、さらに８〜１８のものが好
ましい。例えばラウリル酸、ミリスチン酸などの直鎖脂
肪酸、オレイン酸などの不飽和脂肪酸などがあげられる
。 本発明に用いられる脂肪酸誘導体としては、炭素数２〜
３６好ましくは８〜１８の脂肪酸と水酸基を有する化合
物とのエステルが挙げられ、一価アルコールエステル、
多価アルコールエステルおよびリン脂質などがあげられ
る。 一価のアルコールエステルの例としてはメチルエステル
およびエチルエステルなどが、多価アルコールエステル
の例としてはモノグリセリド、ジグリセリドおよびそれ
らの誘導体、ソルビタン脂肪酸エステル、蔗糖脂肪酸エ
ステルなどが挙げられる。リン脂質としては、例えば市
販大豆レシチン、卵黄レシチンなどの粗製および精製レ
シチンを用いてもよく、また、これらを分画して得たホ
スファジルコリン、ホスファジルセリン、ホスファジル
エタノールアミン、ホスファジルイノシトールなどを単
独または混合して用いてもよい。また各種合成法により
得た合成リン脂質およびこれらの誘導体を用いることも
できる。

【００１２】上記の脂肪酸および脂肪酸誘導体は単独で
用いてもよいが、適当な組み合わせにおいてもその効果
が発揮され、なかでも、リン脂質およびリン脂質誘導体
を用いた場合にその効果が著しい。本発明において脂肪
酸または脂肪酸誘導体の共存下で酵素を吸着乾燥すると
きの温度としては、酵素の失活の起きない温度であれば
よく、０〜６０℃、好ましくは２０〜４０℃がよい。ま
た、そのときの溶液のｐＨは酵素の変性が起きないよう
な範囲であればよく、これは通常ｐＨ３〜９であり、こ
のｐＨ範囲に調整するためには一般的な緩衝液である酢
酸緩衝液やリン酸緩衝液を用いることができる。

【００１３】本発明に用いる固定化酵素は、上述の様に
して脂肪酸またはリン脂質などの脂肪酸誘導体を共存さ
せて吸着固定化した酵素を、さらにグルタルアルデヒド
のような多官能性架橋試薬により架橋させることによっ
て、高い活性を有したまま繰り返し使用に絶えうるよう
な安定性を持たせたものである。本発明に用いる多官能
性架橋試薬としては、例えばグリオキザール、グルタル
アルデヒド、マロンアルデヒド、スクシニルアルデヒド
などのポリアルデヒド類が好ましく、ヘキサメチレンジ
イソアネート、Ｎ，Ｎ’−エチレンビスマレイミドなど
も使用可能である。

【００１４】架橋する方法としては、多官能性架橋試薬
を　０．１〜２０％含有する溶媒に、上述の脂肪酸また
は脂肪酸誘導体を共存させ吸着固定化した酵素を浸漬さ
せ、溶媒を除去し乾燥する方法を挙げることができる。 多官能性架橋試薬用の溶媒としては、適当な有機溶媒、
水またはこれらの混合溶媒を用いることができる。適当
な有機溶媒の例としては、ベンゼン、トルエン、ヘキサ
ン、酢酸エチル、１，４−ジオキサンなど任意の溶媒を
用いることができるが、高い酵素活性を発現させうる点
から、好ましくはエステル合成反応および交換反応に用
いる有機溶媒と同じ溶媒を用いることが望ましい。

【００１５】浸漬する時間は多官能性架橋試薬の種類、
含有量等によっても異なるが、酵素間が十分に架橋する
ことができかつ酵素活性が低下しなければ任意に時間を
選択することができる。適当な浸漬時間は１分〜２４時
間、好ましくは５分〜５時間程度である。浸漬時の温度
は、室温でもよいが０〜６０℃の範囲において酵素が失
活しなければ任意の温度を選択することができるが、好
ましく２０〜４０℃の範囲である。

【００１６】例えば多官能性架橋試薬としてグルタルア
ルデヒド、その溶媒として１，４−ジオキサンを用いる
場合、グルタルアルデヒド２５％水溶液を１，４−ジオ
キサンにより４倍に希釈した溶液に、脂肪酸または脂肪
酸誘導体を共存させ吸着固定化した酵素を４０℃で１０
〜１２０　分間浸漬した後、溶媒を除去し乾燥すること
により本発明の固定化酵素を得ることができる。

【００１７】溶媒の除去方法は特に限定されないが、余
分なグルタルアルデヒドなどの多官能性架橋試薬が残存
しないように、浸漬後に溶媒により固定化酵素を洗浄し
てもよい。乾燥方法にも特に限定されず、通常の減圧乾
燥などが用いられるが、酵素が失活しないような任意の
温度、好ましくは６０℃以下で乾燥することが望ましい
。

【００１８】本発明における固定化酵素を用いたエステ
ル合成反応の例として、通常のメタノール、エタノール
、オレイルアルコールなどの一価のアルコール、ないし
はプロピレングリコール、グリセリンなどの多価アルコ
ール、メントールなどのテルペンアルコール、あるいは
コレステロールなどのステロールと、炭素数が２〜３６
、好ましくは８〜２４の飽和もしくは不飽和の脂肪酸お
よびその低級アルコールエステルとのエステル化反応が
あげられる。またエステル交換反応の例としては、エス
テルと脂肪酸によるアシドリシス反応、エステルとアル
コールによるアルコリシス反応、エステル同志のインタ
ーエステル反応などがあげられる。これらの反応の中で
も特に、糖アルコール、アスコルビン酸などの糖関連物
質と脂肪酸とのエステル化反応において本発明の著しい
効果が発揮される。

【００１９】本発明のエステル合成を実施するに際して
は、該固定化酵素を反応溶媒中に懸濁し攪拌しながら反
応を行ってもよいし、該固定化酵素を充填したカラムに
反応媒体を少量ずつ流すことによっても行うことができ
る。反応に用いる溶媒は特に限定されるものではないが
、エステル合成や交換反応という反応の性質から、水分
量の限られた有機溶媒が望ましい。このときの水分量と
しては、エステル合成反応に影響を及ぼさない程度、好
ましくは５００００ｐｐｍ以下が望ましい。有機溶媒の
例としては、ベンゼン、トルエン、ヘキサン、酢酸エチ
ル、１，４−ジオキサンなど普通の溶媒をあげることが
できる。

【００２０】

【発明の効果】本発明の方法は、酵素を用いるエステル
合成および交換反応において、酵素と脂肪酸またはリン
脂質などの脂肪酸誘導体が共存している状態で不溶性担
体に吸着乾燥させることにより活性化した状態で不溶性
担体に吸着固定化している酵素を、さらにグルタルアル
デヒドなどの多官能性架橋試薬によって架橋させること
により、高活性でしかも安定な固定化酵素を得ることが
できる。この固定化酵素は繰り返しおよび長時間用いる
ことができ、工業的実施において今まで問題となってい
た酵素の価格を低減できる。さらに本発明により、高い
反応速度が長時間にわたって安定して続くようなエステ
ル合成および交換反応が可能となる。

【００２１】以下、実施例および比較例により本発明の
詳細を説明する。

【００２２】

【実施例１】アマノリパーゼＰＳ（天野製薬）１ｇ、大
豆レシチン０．８ｇ（日本製薬）およびけいそう土１０
ｇをリン酸塩緩衝液１／２０Ｍ　２５ｍｌに懸濁し、攪
拌後４０℃で減圧濃縮する。次いで室温で１晩乾燥して
固定化酵素を得る。 この固定化酵素１０ｇを、グルタルアルデヒド２５％水
溶液（和光純薬）をジオキサンで４倍に希釈した溶液４
０ｍｌ中に４０℃で１０分間浸漬したのち吸引濾過し、
溶媒を除去し、ジオキサン４０ｍｌに再び浸漬後、４０
℃で減圧乾燥してグルタルアルデヒド処理固定化酵素を
得る。

【００２３】この固定化酵素を用い、アスコルビン酸−
６−ステアレートのエステル合成を行った。ジオキサン
４０ｍｌにアスコルビン酸３ｇを懸濁し、該グルタルア
ルデヒド処理固定化酵素８ｇおよびステアリン酸８ｇを
添加し、４０℃で２４時間反応させた。２４時間の反応
時間の後、固定化酵素を沈降分離し、上清３０ｍｌを抜
液し、溶液中のアスコルビン酸−６−ステアレートの濃
度を測定したところ、１．７８％であった。

【００２４】沈降分離した固定化酵素溶液にジオキサン
３０ｍｌを添加して洗浄後、再び上清３０ｍｌを抜液し
、残留物にアスコルビン酸０．６ｇ、ステアリン酸１１
ｇおよびジオキサン２２．３ｍｌを添加し、２回目のエ
ステル合成を開始した。開始時のアスコルビン酸−６−
ステアレートの濃度は０．２６％であり、２４時間反応
後のアスコルビン酸−６−ステアレートの濃度は、２．
０５％であり、２４時間中に１．７９％が蓄積した。以
下、同様の操作を３回繰り返した。

【００２５】得られた結果を表１に示す。 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　表　　１　　────────────
──────────────────────　　　
　反応回数　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　１回　　　　２回　　　　３回　　　　４回　
　　　５回　　　　────────────────
──────────────────　　　　開始時
の　ＡＳＴ＊　濃度（Ａ）　　（％）　　　　　　　０
　　　　０．２６　　　　０．３０　　　　０．３５　
　　　０．３２　　　　２４時間後の　ＡＳＴ＊　濃度
（Ｂ）（％）　　　　１．７８　　　　２．０５　　　
　２．０７　　　　２．１０　　　　２．１０　　　　
蓄積濃度（Ａ−Ｂ）　　　　　　　　　　（％）　　　
　１．７８　　　　１．７９　　　　１．７７　　　　
１．７５　　　　１．７８　　　　─────────
─────────────────────────
　　　　残存活性　　　　　　　　　　　　　　　（％
）　　　　　１００　　　１００．６　　　　９９．４
　　　　９８．３　　　　　１００　　　　─────
─────────────────────────
────　　　　　　　　＊ＡＳＴ　　　アスコルビン
酸−６−ステレアート　　これらの結果から明らかによ
うに、５回反応を繰り返したが、活性の低下はほとんど
認められなかった。

【００２６】〔比較例１〕実施例１と同様に操作し、た
だしグルタルアルデヒド処理を行わない固定化酵素８ｇ
を用いてアスコルビン酸−６−ステアレートの合成反応
を行った。得られた結果を表２に示す。 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　表　　２　　────────────
──────────────────────　　　
　反応回数　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　１回　　　　２回　　　　３回　　　　４回　
　　　５回　　　　────────────────
──────────────────　　　　開始時
の　ＡＳＴ＊　濃度（Ａ）　　（％）　　　　　　　０
　　　　０．２８　　　　０．３１　　　　０．２９　
　　　０．２７　　　　２４時間後の　ＡＳＴ＊　濃度
（Ｂ）（％）　　　　１．９０　　　　１．８３　　　
　１．７６　　　　１．６７　　　　１．４７　　　　
蓄積濃度（Ａ−Ｂ）　　　　　　　　　　（％）　　　
　１．９０　　　　１．５５　　　　１．４５　　　　
１．３８　　　　１．２０　　　　─────────
─────────────────────────
　　　　残存活性　　　　　　　　　　　　　　　（％
）　　　　　１００　　　　８１．６　　　　７６．３
　　　　７２．６　　　　６３．２　　　　─────
─────────────────────────
────　　　　　　＊ＡＳＴ　　　アスコルビン酸−
６−ステレアート　　表２は５回の使用後に４０％近く
も酵素活性が低下したことを示している。

【００２７】

【実施例２】実施例１と同様に操作して得られたグルタ
ルアルデヒド処理固定化酵素８ｇをジオキサン溶液４０
ｍｌに添加し、４０℃で５００時間攪拌した後、酵素を
回収し、この固定化酵素をアスコルビン酸パルミテート
の合成に用いた。アスコルビン酸３ｇをジオキサン４０
ｍｌに懸濁し、上述の回収酵素およびパルミチン酸８ｇ
を添加し、２４時間４０℃で攪拌反応させたところ、ア
スコルビン酸パルミテートが　１．９％蓄積した。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　脂肪酸またはその誘導体と脂質分解酵
   素をあらかじめ不溶性担体に吸着処理した固定化酵素を
   、さらに多官能性架橋試薬により架橋して得られた固定
   化酵素を用いて反応を行うエステル合成法。
2. 【請求項２】　　脂肪酸およびその誘導体がリン脂質で
   ある固定化酵素を用いる請求項１記載のエステル合成法
   。
3. 【請求項３】　　多官能性架橋試薬がグルタルアルデヒ
   ドである固定化酵素を用いる請求項１記載のエステル合
   成法。
4. 【請求項４】　　エステルがアスコルビン酸及び糖アル
   コールの脂肪酸エステルである請求項１記載のエステル
   合成法。