JP4768496B2 - 固定化酵素の製造方法 - Google Patents
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- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Description
・固定化担体100質量部に対する脂溶性脂肪酸等質量部=Z×100/Y
・固定化担体100質量部に対する有機溶剤質量部={X−W(X+Y+Z)}×100/Y
酵素の固定化を行う温度は、酵素の特性によって決定することができるが、酵素の失活が起きない0〜60℃、更に5〜40℃、特に20〜40℃が好ましい。また固定化時に使用する酵素溶液のpHは、酵素の変性が起きない範囲であればよく、温度同様酵素の特性によって決定することができるが、pH3〜9が好ましい。また、アルカリ性に至適pHを有する酵素を吸着させる場合には、pH7〜9とすることが好ましい。これらのpHを維持するためには緩衝液を使用するが、緩衝液としては、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等が挙げられる。
固定化担体としてDuolite A-568(Rohm and Haas社製)100gを用い、0.1NのNaOH溶液1L中で1時間攪拌した。濾過後、1Lの蒸留水で洗浄し、500mMの酢酸緩衝液(pH6)1LでpHを平衡化した。その後50mMの酢酸緩衝液(pH6)1Lで2時間ずつ2回、pH平衡化を行った。濾過して固定化担体を回収した後、エタノール500mLで置換を30分行った。濾過後、リシノール酸を100g含むエタノール溶液500mLと固定化担体を30分間接触させた。その後、陶器製ヌッチェに濾紙(No.2、東洋濾紙社製)を乗せ、吸引濾過により固定化担体を溶液から濾別した。この際、固定化担体のケーク中に5分間空気を流通させ、その量は固定化担体100体積部に対し8,000体積部、線速度は530mm/min、減圧度50kPa、濾過時間5minであった。その後、固定化担体をサンプリングし、水分量、エタノール量、リシノール酸量を測定した。結果を表1に示した。
次いで、固定化担体を、50mMの酢酸緩衝液(pH6)500mLで0.5時間ずつ4回緩衝液置換した。濾過後、3%濃度のリパーゼF-AP15(アマノエンザイム社製)溶液1000mLと室温で2時間接触させ、酵素の吸着を行った。吸着後、濾過を行い、50mMのリン酸緩衝液(pH6)500mLで0.5時間洗浄した。洗浄後濾過によって固定化酵素を回収した。
この固定化酵素に1000gの菜種油を添加し、40℃、2時間攪拌した後、濾過して固定化酵素を回収した。この時、固定化酵素に付着した油脂量(脂肪酸又は脂肪酸グリセライド量)は、固定化担体100質量部に対して32質量部であり、残存水分量は30質量部であった。
固定化酵素を乾燥重量として4g計量し、200mL容の四つ口フラスコに仕込んだ。そこへオレイン酸とグリセリンの混合物80g(モル比でオレイン酸/グリセリン=2.0)を添加し、50℃、400Paの減圧下でエステル化反応を行った。反応液を経時的にサンプリングし、グリセライド組成の経時変化を追跡した。なお、各反応液のグリセライド組成は、反応液をトリメチルシリル化した後、ガスクロマトグラフィーにて分析を行った。酵素活性の評価は、実施例1により製造した固定化酵素を使用し、前記反応条件でジグリセライド(DG)+トリグリセライド(TG)の合計が70質量%になるまでの時間をT0とし、各反応においてDG+TGの合計が70質量%になるまでの時間をTとし、下記の(1)式により酵素相対活性値として算出した。なお、DG+TGの合計が70質量%に達しなかったものについては「×」とした。結果を表1に示した。
酵素相対活性値=T0/T×100 (1)
濾過に供した固定化担体の体積は、乾燥固定化担体10gを50mLメスシリンダーに入れて体積を測定し、グラム当りの体積を求めて使用担体重量から固定化担体の体積を算出した。
吸引に用いたポンプの排気出口に気体流量計を取り付けて流通した気体の体積〔L〕を測定し、固定化担体100体積部に対する流通した気体の体積部を求めた。
気体量と濾過面積と気体流通時間から次式で算出した。
気体の線速度〔mm/min〕=(気体量〔L〕/(濾過面積〔cm2〕*気体流通時間〔min〕))*10
実施例1において固定化担体をヌッチェ濾過する際、固定化担体のケーク中に空気を5分間流通させる替わりに、乾燥窒素を2分間流通させた以外は実施例1と同じ方法で固定化酵素を製造した。この時、流通させた乾燥窒素の量は、固定化担体100体積部に対し3,200体積部、線速度は530mm/min、減圧度50kPa、濾過時間0.5minであった。
実施例1において固定化担体をヌッチェ濾過する際に、固定化担体のケーク中に空気を流通させる時間を2分間とした以外は実施例1と同様の方法で固定化リパーゼを製造した。この時、流通させた空気の量は、固定化担体100体積部に対し3,200体積部、線速度は530mm/min、減圧度50kPa、濾過時間2minであった。
固定化担体を濾別する際に、実施例1におけるヌッチェ濾過の替わりに、筒の先に金網のストレーナーを装着して吸引し、溶液のみ濾別した以外は実施例1と同様の方法で固定化リパーゼを製造した。減圧度70kPa、濾過時間0.5min
実施例1において、固定化担体をヌッチェ濾過の際、固定化担体のケーク中に空気を流通させず、それ以外は実施例1と同様の方法で固定化リパーゼを製造した。減圧度50kPa、濾過時間0.5min
実施例1において、リシノール酸を5g含むエタノール溶液500mLと固定化担体を30分間接触させた以外は実施例1と同様の方法で固定化リパーゼを製造した。
実施例1において、固定化担体をヌッチェ濾過した後、固定化担体のケークにエタノール1000mLを通液した以外は実施例1と同様の方法で固定化リパーゼを製造した。
実施例1において、リシノール酸を1000g含むエタノール溶液1500mLと固定化担体を30分間接触させた以外は実施例1と同様の方法で固定化リパーゼを製造した。
実施例2において、固定化担体をヌッチェ濾過した後、固定化担体のケークにエタノール1000mLを通液した以外は実施例2と同様の方法で固定化リパーゼを製造した。
実施例2において、リシノール酸を1000g含むエタノール溶液1500mLと固定化担体を30分間接触させた以外は実施例2と同様の方法で固定化リパーゼを製造した。
実施例3において、固定化担体をヌッチェ濾過した後、固定化担体のケークにエタノール1000mLを通液した以外は実施例3と同様の方法で固定化リパーゼを製造した。
実施例3において、リシノール酸を1000g含むエタノール溶液1500mLと固定化担体を30分間接触させた以外は実施例3と同様の方法で固定化リパーゼを製造した。
一方、固定化担体を濾過により回収する際、固定化担体のケーク中に気体を流通させても、固定化担体に吸着したリシノール酸量が固定化担体100質量部に対して20質量部未満、又は100質量部超とした場合には、酵素活性及び耐熱性のいずれも高める効果は低かった。
Claims (6)
- 酵素固定化用担体に脂溶性脂肪酸又はその誘導体を吸着させた後、油脂分解用酵素を吸着固定化する固定化酵素の製造方法であって、酵素固定化用担体に脂溶性脂肪酸又はその誘導体を吸着させるに際し、脂溶性脂肪酸又はその誘導体及び有機溶剤又は水と有機溶剤の混合物を酵素固定化用担体に接触させ、酵素固定化用担体をケーク濾過により回収する際、酵素固定化用担体のケーク中に気体を流通させ、酵素固定化用担体100質量部に対し脂溶性脂肪酸又はその誘導体の吸着量を20〜100質量部とする固定化酵素の製造方法。
- 酵素固定化用担体のケーク中に流通させる気体の量が、酵素固定化用担体100体積部に対し300〜1,700,000体積部である請求項1記載の固定化酵素の製造方法。
- 酵素固定化用担体のケーク中に流通させる気体の線速度が50〜5,300mm/minである請求項1又は2に記載の固定化酵素の製造方法。
- 酵素固定化用担体に脂溶性脂肪酸又はその誘導体を吸着させる際の酵素固定化用担体/脂溶性脂肪酸又はその誘導体の質量比が1/0.1〜1/20である請求項1〜3のいずれか1項に記載の固定化酵素の製造方法。
- 酵素固定化用担体に脂溶性脂肪酸又はその誘導体を吸着させる際の脂溶性脂肪酸又はその誘導体/有機溶剤又は水と有機溶剤の質量比が1/0.1〜1/20である請求項1〜4のいずれか1項に記載の固定化酵素の製造方法。
- 酵素固定化用担体のケーク中に気体を流通させた後の酵素固定化用担体のケーク中の有機溶剤の量が、酵素固定化用担体100質量部に対し40質量部以下である請求項1〜5のいずれか1項に記載の固定化酵素の製造方法。
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