CN100340664C

CN100340664C - 高稳定性固定化酶的制备方法

Info

Publication number: CN100340664C
Application number: CNB2005100608380A
Authority: CN
Inventors: 宋锡瑾; 王杰
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2005-09-21
Filing date: 2005-09-21
Publication date: 2007-10-03
Anticipated expiration: 2025-09-21
Also published as: CN1766103A

Abstract

本发明公开了一种高稳定性固定化酶的制备方法。该方法首先采用脂肪酶、水、表面活性剂、有机溶剂、单体或预聚物、以及交联剂等构建微乳体系，然后加入少量反应底物诱导出脂肪酶的活性构象，通过加热、紫外光照或直接辐射等方式引发自由基聚合，实现脂肪酶在高度交联载体中的包埋固定化。该方法具有制备工艺简单、酶活收率高、稳定性好、适用环境范围广、制作成本低以及所制得的固定化酶机械强度大等一系列优点。

Description

高稳定性固定化酶的制备方法

技术领域

本发明涉及一种高稳定性固定化酶的制备方法。

背景技术

众所周知，酶是一种高效专一的生物催化剂。许多难以进行的有机化学反应采用酶作催化剂时，在常温、常压的温和条件下就能顺利地进行，而且可以避免或减少副反应发生。因此，自古以来酶就被人们广泛应用于酿造、食品、医药等领域。特别是在近代，由于生物化学的发展，酶的作用机制日益明了，新的酶源不断开发，酶的应用更加活跃起来。但是，酶是由蛋白质组成的，在大多数情况下，对热、强酸、强碱、有机溶媒等均不够稳定，即使在酶反应的最适条件下，也往往会很快失活，故酶通常仅限于在水溶液中使用，而且回收和重复使用困难，对于现代工业来说还不是一种理想的催化剂。

而固定化酶是目前提高酶使用效率和实现操作连续化最有效的手段之一，用于水相酶促反应已有许多成功之例，但在有机相中的应用目前还处于探索阶段。尤其是在疏水有机相中，如何使酶载体的结构特征符合酶能充分发挥活力的最适宜微环境，并使酶活力保持较高的稳定性，一直是生物催化剂多相化的一个难题，也是功能高分子领域具有挑战性的一个课题。而以石油化工为主体的现代化学工业，70％以上的生产过程都离不开催化剂，并且以非水相多相催化体系为主。因此，若不能从根本上解决生物催化体系的多相化问题，则生物技术对已经形成巨大生产能力、且高度连续化和自动化的传统化学工业的冲击将无从谈起。

酶的固定化方法可大致分为吸附法、共价法、交联法和包埋法等4种。吸附法是指通过载体表面和酶表面间的次级键相互作用固定化酶的方法，视吸附剂的特点又可分为物理吸附和离子交换吸附。该法具有操作简便、条件温和及吸附剂可反复使用等优点，但也存在吸附力弱，容易解吸脱落的缺点。共价法是通过偶联反应使酶以共价键结合于载体的固定化方法，故表现出良好的稳定性，有利于酶的连续使用，但因通常偶联反应条件苛刻，会引起酶蛋白高级结构发生变化，因此这一类固定化酶的比活较低。交联法是加入交联剂使酶与载体之间、酶与酶之间发生交联反应而形成的固定化酶，由于反应条件激烈，故酶活收率一般较低。包埋法包括网格包埋、微囊型包埋和脂质体包埋等，包埋法中因酶本身不参与化学结合反应，故可获得较高的酶活力回收，但所制得的固定化酶通常机械强度较差。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用包埋法制备高稳定性固定化酶的方法，该方法具有制备工艺简单、酶活收率高、稳定性好、适用环境范围广、制作成本低以及所制得的固定化酶机械强度大等优点。

本发明采用的技术方案如下：该方法首先采用脂肪酶、水、表面活性剂、有机溶剂、单体或预聚物、以及交联剂构建微乳体系，然后加入反应底物诱导出脂肪酶的活性构象，通过加热、紫外光照或直接辐射方式引发自由基聚合，实现脂肪酶在高度交联载体中的包埋固定化。

本发明的具体步骤如下：

①称取脂肪酶粉溶解在缓冲溶液中配制成质量百分比为0.05％～20％脂肪酶液备用；

②采用脂肪酶液、表面活性剂、有机溶剂、单体和交联剂构建微乳体系；

③在上述微乳体系中加入质量百分比为0.1％～10％的反应底物对脂肪酶的构象进行诱导；

④加入质量百分比为0.2％～3％的热引发剂或光引发剂，然后分别通过加热、紫外光照或直接辐射引发自由基聚合反应的方式完成脂肪酶呈活性状态下的固定化；

⑤待聚合物固化成型后，经破碎、研磨、分级筛选后得到粒状聚合物，置于Soxhlet提取器中用丙酮或石油醚抽提水和底物后，经真空干燥即可得到保留有脂肪酶活性构象的固定化酶。

所述的表面活性剂：为阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂或两性表面活性剂的一种或是任意两种混合物。

所述的有机溶剂：为正庚烷或环己醇。

所述的单体：为甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯或含有1个碳-碳双键的丙烯酸酯类化合物；交联剂为二乙烯基苯、聚乙二醇二丙烯酸酯、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、季戊四醇四丙烯酸酯、一些分子结构至少含有2个碳-碳双键的丙烯酸酯类化合物或任意两种混合物；两者含量占体系质量的10～98％。

本发明具有的有益的效果是：利用包埋法制备高稳定性固定化酶的方法，该方法具有制备工艺简单、酶活收率高、稳定性好、适用环境范围广、制作成本低以及所制得的固定化酶机械强度大等优点。

具体实施方式

具体过程如下：

(1)含酶微乳体系的构建。首先，将需要固定化的酶粉(如脂肪酶、酰化酶、淀粉酶、纤维素酶或蛋白酶等)溶解在缓冲溶液中备用；然后，取一容器，按比例加入水、表面活性剂(可以是阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂和两性表面活性剂的任一种或是其混合物)、有机溶剂(如正庚烷、环己醇等)，以及单体(如甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯)、交联剂(如二乙烯基苯、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、季戊四醇四丙烯酸酯等)等，搅拌均匀，随后加入一定量的酶水溶液静置至透明后即得微乳液。

(2)酶呈活性构象状态的固定化。将上述盛有酶的微乳液置于容器，加入少量反应底物(月桂酸、油酸、辛酸或其它脂肪酸)对酶的构象进行诱导，测得活性后，即可进行固定化操作。可以根据具体情况，加入热引发剂(如偶氮二异丁腈、过氧化苯甲酰、过硫酸盐等)，或光引发剂(如安息香甲醚、二苯酮等)，然后分别通过加热、紫外光照或直接辐射引发自由基聚合反应的方式，将呈活性构象状态下的酶包埋在高度交联的载体中实现固定化。待聚合物固化成型后，经一定程度的破碎、研磨、分级筛选后得到粒状聚合物，置于Soxhlet提取器中用甲醇和乙酸抽提水和底物后，经真空干燥即可得到保留有酶活性构象的固定化酶。

在本发明提供的工艺制备固定化酶的过程中，是将酶、水、有机溶剂、单体或预聚物以及交联剂等一起构筑微乳体系的，在这种条件下加入反应底物诱导出酶的活性构象，并迅速进行聚合反应实施固定化，能够使固定化后的酶保持同时适应水和相应有机溶剂的活性构象，拓展了酶的应用范围。而且由于体系中加入了大量的具有交联功能的单体和交联剂，大大提高了聚合物载体的结构稳定性，进而也提高了酶活性构象的稳定性，同时也使得固定化酶的机械强度得到增强。

实施例1

首先，称取脂肪酶粉溶解在缓冲溶液中配制成0.1％～2％的酶液备用，称取十二烷基磺酸钠(SDS)与去离子水配制成20％的水溶液备用。然后，量取20％的SDS水溶液10ml，依次加入正庚烷5ml、聚乙二醇二丙烯酸酯10g、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯10g、甲基丙烯酸甲酯23g和4ml酶液搅拌均匀后，静置。待溶液达到透明时，加入1％～3％的反应底物月桂酸，最后加入1～2g偶氮二异丁腈，在40～60℃聚合反应至体系固化成型，继续反应2h即可。聚合完成后取出聚合物，经破碎、研磨、分级筛选后得到粒状聚合物，置于Soxhlet提取器中用丙酮或石油醚有机溶剂抽提水和月桂酸，经真空干燥即得固定化酶产品。测得酶的活性收率为109％。在40～50℃条件下，固定化酶连续使用30天，酶的活性保持原有活性的95％。在80℃使用7天，聚合物载体不变形，酶活性稳定在80％～85％左右。

实施例2

首先，称取脂肪酶粉溶解在缓冲溶液中配制成1％～4％的酶液备用。然后，量取正庚烷10ml、加入二(2-乙基己基)琥珀磺酸钠(AOT)8～10g、酶液2～4ml、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯20g、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯10g搅拌至透明，加入1％～3％的反应底物辛酸，加入光引发剂安息香甲醚0.10～0.30g，搅拌均匀后倒入模具中，在紫外光照下，进行光引发聚合至体系固化成型，继续光照3～8s即可。聚合完成后取出聚合物，经破碎、研磨、分级筛选后得到粒状聚合物，置于Soxhlet提取器中用用丙酮或石油醚有机溶剂抽提水和底物后，经真空干燥即得固定化酶产品。测得酶的活性收率为182％。在40～50℃条件下，固定化酶连续使用30天，酶的活性保持原有活性的97％。在75℃使用7天，聚合物载体不变形，酶活性稳定在75～80％。

实施例3

首先，称取脂肪酶粉溶解在缓冲溶液中配制成0.05％～1％的酶液备用。然后，量取正庚烷5ml、加入Tween80 2～6g、酶液2～4ml、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯20g、季戊四醇四丙烯酸酯(PETA)20g搅拌至透明，加入2％的油酸，搅拌均匀后倒入安培辐照瓶中，抽真空或通高纯氮气封口，置于⁶⁰Coγ射线辐照场中辐照至体系固化成型即可。聚合完成后取出聚合物，经破碎、研磨、分级筛选后得到粒状聚合物，置于Soxhlet提取器中用丙酮或石油醚有机溶剂抽提水和底物后，经真空干燥即得固定化酶产品。测得酶的活性收率为133％。在40～50℃条件下，固定化酶连续使用30天，酶的活性保持原有活性的93％。在75℃使用7天，聚合物载体不变形，酶活性稳定在72～80％。

实施例4

首先，称取脂肪酶粉溶解在缓冲溶液中配制成10～20％的酶液备用。然后，量取正庚烷10ml、加入二(2-乙基己基)琥珀磺酸钠(AOT)8～10g、酶液1～4ml、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯30g、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯20g搅拌至透明，加入3％的月桂酸，加入光引发剂安息香甲醚0.20～0.50g，搅拌均匀后倒入模具中，在紫外光照下，进行光引发聚合至体系固化成型，继续光照5～10s即可。聚合完成后取出聚合物，经破碎、研磨、分级筛选后得到粒状聚合物，置于Soxhlet提取器中用用丙酮或石油醚有机溶剂抽提水和底物后，经真空干燥即得固定化酶产品。测得酶的活性收率为210％。在40～50℃条件下，固定化酶连续使用30天，酶的活性保持原有活性的94％。在75℃使用7天，聚合物载体不变形，酶活性稳定在75～85％左右。

Claims

1、高稳定性固定化酶的制备方法，其特征在于：该方法首先采用脂肪酶、水、表面活性剂、有机溶剂、单体或预聚物、以及交联剂构建微乳体系，然后加入反应底物诱导出脂肪酶的活性构象，通过加热、紫外光照或直接辐射方式引发自由基聚合，实现脂肪酶在高度交联载体中的包埋固定化。

2、根据权利要求1所述的高稳定性固定化酶的制备方法，其特征在于该方法的具体步骤如下：

3、根据权利要求2所述的高稳定性固定化酶的制备方法，其特征在于所述的表面活性剂：为阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂或两性表面活性剂的一种或是任意两种混合物。

4、根据权利要求2所述的高稳定性固定化酶的制备方法，其特征在于所述的有机溶剂：为正庚烷或环己醇。

5、根据权利要求2所述的高稳定性固定化酶的制备方法，其特征在于所述的单体：为甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯或含有1个碳-碳双键的丙烯酸酯类化合物；交联剂为二乙烯基苯、聚乙二醇二丙烯酸酯、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、季戊四醇四丙烯酸酯、一些分子结构至少含有2个碳-碳双键的丙烯酸酯类化合物或任意两种混合物；两者含量占体系质量的10～98％。

6、根据权利要求2所述的高稳定性固定化酶的制备方法，其特征在于所述的反应底物：为月桂酸、油酸或辛酸。

7、根据权利要求2所述的高稳定性固定化酶的制备方法，其特征在于所述的热引发剂：为偶氮二异丁腈、过氧化苯甲酰或过硫酸盐。

8、根据权利要求2所述的高稳定性固定化酶的制备方法，其特征在于所述的光引发剂：为安息香甲醚或二苯酮。