CN105238828A - 一种利用分子网布包埋β-葡萄糖苷酶提高纤维素水解效率并降低纤维素乙醇成本的方法 - Google Patents

Abstract

一种利用分子网布包埋β-葡萄糖苷酶提高纤维素水解效率并降低纤维素乙醇成本的方法涉及生物能源化工领域。将纤维素生物水解制备乙醇路线的最大问题是成本高。而这种高成本主要来自于三种催化酶——外切葡聚糖酶，内切葡聚糖酶以及β-葡萄糖苷酶的成本，β-葡萄糖苷酶的成本最高。本发明了利用聚乙二醇(PEG)网布将β-葡萄糖苷酶原位网包固定在聚合物基材上，将该固定有β-葡萄糖苷酶的复合基材与其它两种纤维素酶混合使用，不仅大大降低了纤维素酶水解过程中纤维二糖的抑制作用，提高了纤维素转化成葡萄糖的效率；还因PEG网布均匀而且不溶胀，固定化的β-葡萄糖苷酶不易泄露，操作稳定且易分离，可多次(12次)重复利用，可极大地降低纤维素乙醇的成本，有利于工业化生产。

Description

一种利用分子网布包埋β-葡萄糖苷酶提高纤维素水解效率并降低纤维素乙醇成本的方法

技术领域

本发明属于生物能源化工领域，具体涉及一种利用分子网布包埋β-葡萄糖苷酶提高水解纤维素效率并降低纤维素乙醇成本的方法。

背景技术

伴随着全球能源需求的日益增加以及化石能源的逐渐枯竭，人们对生产新型生物能源产生了越来越浓厚的兴趣。相比较于传统的生物能源生产模式(甘蔗乙醇和玉米乙醇)，“纤维素乙醇”旨在将所有的植被材料(包括没用的木材以及废弃的秸秆)转化成可以被利用的生物能源。

生产“纤维素乙醇”的关键在于将纤维素水解为可发酵糖类。在诸多的纤维素水解方法中，纤维素酶法水解具有反应条件温和而且环境友好的特点。现阶段酶法生产纤维素乙醇的主要瓶颈在于纤维素酶水解效率比较低而且生产成本比较高，在不增加过多成本的前提下提高酶水解效率成为现今亟待解决的难题之一。

纤维素酶是一种复合酶系，它由外切葡聚糖酶(破坏纤维素晶区，使纤维素变成大分子多糖)、内切葡聚糖酶(将大分子多糖转化为纤维二糖)以及β-葡萄糖苷酶(BG，将纤维二糖转化为葡萄糖)组成。由于纤维素酶中β-葡萄糖苷酶含量较少，在纤维素水解过程中产生大量的纤维二糖得不到及时分解，而纤维二糖是外切葡聚糖酶以及内切葡聚糖酶的抑制剂，从而造成纤维素的水解效率比较低。一般是在原纤维素酶的基础上添加额外的β-葡萄糖苷酶从而使抑制剂纤维二糖得到大量分解，对于提高纤维素转化率有着显著的作用。

但是，目前市面上β-葡萄糖苷酶的价格较高，约是纤维素酶价格的一百倍，导致“三酶生物催化法生产纤维素乙醇路线”的成本远远高于传统的甘蔗乙醇和玉米乙醇路线，一般每吨高约2200元，而β-葡萄糖苷酶约占这些酶成本的一半。因此，当务之急是降低β-葡萄糖苷酶的使用成本。

降低β-葡萄糖苷酶的价格在纤维素乙醇中的比重有两大类方法：其一是寻找新的制备途径来降低β-葡萄糖苷酶价格，但目前还未看到根本性突破。另一种是将β-葡萄糖苷酶固定化，通过多次重复利用降低成本，这里最关键的是三个因素：一是固定化方法/工艺的简便性，使之不会大幅度提高固定化酶的成本；二是固定化的酶产品在糖化反应中稳定并便于每次反应后的分离和重复利用；三是重复利用的次数，有效重复次数越多，成本越低。目前文献和专利报道的对β-葡萄糖苷酶固定化的主要手段有吸附法、包埋法、交联法以及共价结合的方法。其中吸附法中酶与基材相互作用力弱，在使用过程中会导致大量的酶流失；交联法以及共价结合的方法往往会导致酶本身的化学结构发生改变从而导致β-葡萄糖苷酶的酶活性下降。与以上两种方法相比，包埋法可以将酶“物理包裹”在网络之中，既不像吸附法那样造成酶的大量流失，又不会引起酶的失活。在用于包埋β-葡萄糖苷酶的基材当中，水凝胶由于其良好的生物相容性以及亲水性是最具有优势的固定化基材；但是水凝胶本身环境敏感性强，机械强度弱，在水中易溶胀从而导致酶的部分泄漏。如Zheng等(ProcessBiochemistry,2013,48,683-687)利用Fe₃O₄和壳聚糖来制备了包埋β-葡萄糖苷酶的凝胶微球，有9.8％的酶发生了泄露，由于微球粒径较小，需要通过磁分离来实现重复使用，8个批次以后，酶膜的活性为初始活性的76.5％。Muhammad等(FoodChemistry,2016,190,1078-1085)使用乳胶聚合物固定化β-葡萄糖苷酶，有多达37％的酶在固定化之后泄露。奇香君等(CN102321707A)使用海藻酸钠凝胶球对β-葡萄糖苷酶进行交联-包埋固定化，固定化的酶活回收率最高为60％，仅可使用4-6个批次。上述方法在对β-葡萄糖苷酶进行固定后，均可实现对酶进行一定程度的重复利用。但是，将酶固定在微观的凝胶球之中，需要借助一定的辅助手段进行分离，而且在包埋后即有大量的酶发生泄漏。

因此，有必要设计出一种简单、条件温和、成本较低的方法将β-葡萄糖苷酶固定化，使包埋的β-葡萄糖苷酶不易泄漏从而可以长期重复利用。

发明内容

为克服上述现有技术的缺点，本发明提出一种新的β-葡萄糖苷酶固定化结构和制备方法。

结构设计：将β-葡萄糖苷酶固定在薄的柔性聚合物基材上，其优点如下：其一，固定化的酶层由于和底物是分开的，因此可以避免酶对反应底物的混合污染，增加酶的结构稳定性，不易失活；其二，与软的凝胶粒子相比，这种复合结构具有更好的机械稳定性和化学稳定性，在大的非均相糖化反应釜(固体纤维素/搅拌)中不被破坏并很方便地与反应液分离；其三，可以实现对酶的重复利用，从而大大降低生物法路线的成本。

制备方法：首先在紫外光照射下通过脱氢-偶联反应将光引发剂异丙基硫杂蒽酮(ITX)种植在聚合物基材表面形成ITX半频哪醇自由基(ITXSP)休眠种。接枝有休眠种的聚合物表面在可见光的照射下，休眠种发生断裂形成表面自由基和ITXSP，再加入可交联单体时，表面自由基可以引发表面接枝交联聚合，而ITXSP可以对聚合过程进行调控，从而形成的聚合物网络致密而均匀。当在聚合时将β-葡萄糖苷酶一同混入时，伴随着接枝交联聚合的进行，β-葡萄糖苷酶被原位包埋在新形成的致密而均匀的聚合物网络之中完成固定化。聚合物基材以无纺布为例，可聚合单体以聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)为例，反应流程图如图1所示。

为了达到上述目的，本发明按照以下技术方案实现:

(1)使用戊二醛对β-葡萄糖苷酶溶液交联处理10-90分钟得到交联的β-葡萄糖苷酶溶液；戊二醛在体系中的体积浓度为0.25％-5％；β-葡萄糖苷酶在体系中浓度为10-100g/L；所述体系为戊二醛与β-葡萄糖苷酶溶液的混合物；

(2)将0.5-5M的异丙基硫杂蒽酮丙酮溶液均匀地涂覆在聚合物基材上，然后将涂覆有溶液的基材置于两片石英片之间，随后将此体系置于汞灯下在室温下正反面各照射2-5分钟，得到携带表面休眠基的聚合物基材，其中光强为0.9mW/cm²-9mW/cm²；

(3)将交联的β-葡萄糖苷酶溶液与可聚合单体混合后，交联的β-葡萄糖苷酶溶液：可聚合单体体积比为1:4-4:1；均匀的涂敷在接枝有异丙基硫杂蒽酮的基材上，然后将涂覆有溶液的基材置于两片石英片之间，随后将此体系置于可见光灯下照射30-180分钟，得到固定有β-葡萄糖苷酶的聚合物膜，其中光强为0.9mW/cm²-9mW/cm²；

(4)将固定有β-葡萄糖苷酶的基材投入含有纤维素酶与纤维素底物的溶液中，在30-60℃，摇床转速40-200rpm下反应6-120小时，将纤维素底物转变成葡萄糖；其中纤维素酶与纤维素底物的质量比为1:10-10:1，纤维素酶与固定化的交联β-葡萄糖苷酶的质量比为1:5-5:1。

进一步，步骤(2)中所使用的聚合物基材为聚合物片材、多孔膜、纺织品或非织造织物。

进一步，步骤(3)中所用的光源为氙灯或LED灯。

进一步，步骤(3)中所用可聚合单体为聚乙二醇二丙烯酸酯，聚乙二醇双甲基丙烯酸酯或亚甲基双丙烯酰胺。

本发明的优点在于:

(1)将β-葡萄糖苷酶与纤维素酶混合使用，可以显著提高纤维素酶的水解效率。

(2)将β-葡萄糖苷酶包埋在网布中，与凝胶包埋相比，网布在反应体系中不溶胀，更有利于防止酶的泄露。

(3)固定化中使用的聚合物基材廉价易加工，固定流程简单温和，固定后的酶稳定性增加并且可重复利用，解决了β-葡萄糖苷酶价格过高而增加了纤维素水解成本的问题。

以下结合实例详述本发明。

附图说明

图1.固定化BG酶流程图。

(a)ITX通过脱氢-偶联反应种植在聚合物基材表面.(b)可见光引发可控活性接枝交联聚合原位包埋BG。

具体实施方式

实施例1:

将2mL，3mmol/mL的异丙基硫杂蒽酮丙酮溶液均匀地涂覆在4×4cm²聚丙烯无纺布上，然后将涂覆有溶液的无纺布置于两片石英片之间形成“三明治结构”，随后将此体系置于高压汞灯(波长254nm，9mW/cm²)下在室温下正反面各照射3分钟。紫外辐照完毕后，使用丙酮对无纺布抽提24小时，室温下晾干。

使用2μL的戊二醛(0.25％v/v)对800μL含有55mgβ-葡萄糖苷酶的柠檬酸缓冲液(0.05M,pH＝4.8)进行交联处理30分钟。将此溶液与400μL聚乙二醇二丙烯酸酯混合后，均匀的涂敷在接枝有异丙基硫杂蒽酮的无纺布上，然后将涂覆有溶液的无纺布置于两片石英片之间形成“三明治结构”，随后将此体系置于氙灯(波长420nm，3mW/cm²)下照射90分钟。之后将未经冲洗的固定化β-葡萄糖苷酶的无纺布浸泡在固定体积的柠檬酸缓冲溶液(0.05M，pH＝4.8)中，48小时后取一定体系的浸泡液使用非干扰型蛋白试剂盒对为固定化的酶量进行测试。经测定，只有不到2％(质量分数)的β-葡萄糖苷酶未被固定在基材上。

将浸泡48小时后的固定化β-葡萄糖苷酶无纺布继续浸泡在0.05M的柠檬酸缓冲液(pH＝4.8)中24小时，之后用大量缓冲液对包埋有酶的无纺布进行冲洗以去除未固定的β-葡萄糖苷酶。以4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(p-NPG)为底物对β-葡萄糖苷酶酶活进行测试，取面积为2×2cm²的酶膜置于5mL酶活测定底物溶液中(50mM醋酸钠缓冲液(pH＝4.8)，4mMp-NPG)，于40℃，摇床转速200rpm下反应30分钟，反应结束将固定化酶的无纺布取出后立即加入终止试剂(10mL1MNa₂CO₃)，使用紫外可见分光光度计测量溶液在405nm下的吸光度，1个单位β-葡萄糖苷酶酶活定义为：在上述条件下每分钟催化形成1μmol对硝基苯酚的酶量。经此种方法测定，酶膜的酶活为15.8U/g。

将此固定有β-葡萄糖苷酶的无纺布投入含有120mg纤维素酶与20mg滤纸的柠檬酸缓冲溶液(0.05M，pH＝4.8)中，在50℃，摇床转速200rpm下反应48小时。经测定，滤纸水解为葡萄糖的转化率为95％。”

实施例2：

将200μL，5mmol/mL的异丙基硫杂蒽酮丙酮溶液均匀地涂覆在4×4cm²低密度聚乙烯膜上，然后将涂覆有溶液的低密度聚乙烯膜置于两片石英片之间形成“三明治结构”，随后将此体系置于高压汞灯(波长254nm，0.9mW/cm²)下在室温下正反面各照射3分钟。紫外辐照完毕后，使用丙酮对聚乙烯膜抽提24小时，室温下晾干。

使用4μL的戊二醛(2.5％,v/v)对200μL含有20mgβ-葡萄糖苷酶的柠檬酸缓冲液(0.05M,pH＝5.0)进行交联处理30分钟。将此溶液与50μL聚乙二醇双甲基丙烯酸酯混合后，均匀的涂敷在接枝有异丙基硫杂蒽酮的低密度聚乙烯膜上，然后将涂覆有溶液的膜置于两片石英片之间形成“三明治结构”，随后将此体系置于LED灯(光强0.3mW/cm²)下照射90分钟。之后将此固定有β-葡萄糖苷酶的酶膜投入含有120mg纤维素酶与20mg滤纸的柠檬酸缓冲溶液(0.05M，pH＝4.8)中，在50℃，摇床转速200rpm下反应48小时。经测定，滤纸水解为葡萄糖的转化率为93％。

酶活测定方法同实施例1，经此种方法测定，酶膜的酶活为13.6U/g。

对比实施例2：

将120mg纤维素酶加入含有20mg滤纸的柠檬酸缓冲溶液(0.05M，pH＝4.8)中，在50℃，摇床转速200rpm下反应48小时经测定，滤纸水解为葡萄糖的转化率为61％。

实施例3：

将400μL，4mmol/mL的异丙基硫杂蒽酮丙酮溶液均匀地涂覆在3×3cm²聚氯乙烯多孔膜上，然后将涂覆有溶液的多孔膜置于两片石英片之间形成“三明治结构”，随后将此体系置于高压汞灯(光强5mW/cm²)下在室温下正反面各照射2.5分钟。紫外辐照完毕后，使用丙酮对多孔膜抽提24小时，室温下晾干。

使用6μL的戊二醛(3％v/v)对200μL含有30mgβ-葡萄糖苷酶的柠檬酸缓冲液(0.3M,pH＝4.5)进行交联处理15分钟。将此溶液与150μL聚乙二醇二丙烯酸酯混合后，均匀的涂敷在接枝有异丙基硫杂蒽酮的多孔膜上，然后将涂覆有溶液的膜置于两片石英片之间形成“三明治结构”，随后将此体系置于氙灯下照射40分钟。之后将此固定有β-葡萄糖苷酶的酶膜投入含有180mg纤维素酶与30mg滤纸的柠檬酸缓冲溶液(0.4M，pH＝4.5)中，在55℃，摇床转速180rpm下反应48小时。经测定，滤纸水解为葡萄糖的转化率为90％。

酶活测定方法同实施例1，经此种方法测定，酶膜的酶活为12.7U/g。

实施例4：

将800μL，3mmol/mL的异丙基硫杂蒽酮丙酮溶液均匀地涂覆在5×5cm²聚乳酸膜上，然后将涂覆有溶液的聚乳酸膜置于两片石英片之间形成“三明治结构”，随后将此体系置于高压汞灯(光强3mW/cm²)下在室温下正反面各照射4分钟。紫外辐照完毕后，使用丙酮对聚乳酸膜抽提24小时，室温下晾干。

使用40μL的戊二醛(5％v/v)对800μL含有60mgβ-葡萄糖苷酶的柠檬酸缓冲液(0.1M,pH＝4.8)进行交联处理25分钟。将此溶液与600μL亚甲基双丙烯酰胺混合后，均匀的涂敷在接枝有异丙基硫杂蒽酮的聚乳酸膜上，然后将涂覆有溶液的膜置于两片石英片之间形成“三明治结构”，随后将此体系置于氙灯(光强2mW/cm²)下照射60分钟。之后将此固定有β-葡萄糖苷酶的酶膜投入含有120mg纤维素酶与20mg滤纸的柠檬酸缓冲溶液(0.1M，pH＝4.8)中，在50℃，摇床转速220rpm下反应24小时。经测定，滤纸水解为葡萄糖的转化率为72％。

酶活测定方法同实施例1，经此种方法测定，酶膜的酶活为8.9U/g。

实施例5：

将1.8mL，0.5mmol/mL的异丙基硫杂蒽酮丙酮溶液均匀地涂覆在4×4cm²的棉布上，然后将涂覆有溶液的棉布置于两片石英片之间形成“三明治结构”，随后将此体系置于汞灯(光强7mW/cm²)下在室温下正反面各照射2分钟。紫外辐照完毕后，使用丙酮对棉布抽提24小时，室温下晾干。

使用8μL的戊二醛(0.4％v/v)对1mL含有80mgβ-葡萄糖苷酶的柠檬酸缓冲液(0.05M,pH＝4.5)进行交联处理30分钟。将此溶液与600μL亚甲基双丙烯酰胺混合后，均匀的涂敷在接枝有异丙基硫杂蒽酮的棉布上，然后将涂覆有溶液的棉布置于两片石英片之间形成“三明治结构”，随后将此体系置于氙灯(光强2.5mW/cm²)下照射60分钟。之后将此固定有β-葡萄糖苷酶的棉布投入含有240mg纤维素酶与50mg滤纸的柠檬酸缓冲溶液(0.05M，pH＝4.8)中，在45℃，摇床转速150rpm下反应48小时。经测定，滤纸水解为葡萄糖的转化率为90％。反应结束后使用大量柠檬酸缓冲溶液(0.05M，pH＝4.8)对固定β-葡萄糖苷酶的棉布进行冲洗，之后将固定有β-葡萄糖苷酶的棉布重复使用。经测定，在固定有β-葡萄糖苷酶的棉布重复使用15个批次以后，滤纸水解葡萄糖的效率为初始的87％。

实施例6：

将300μL，0.4mmol/mL的异丙基硫杂蒽酮丙酮溶液均匀地涂覆在3×3cm²的双向拉伸聚丙烯薄膜上，然后将涂覆有溶液的薄膜置于两片石英片之间形成“三明治结构”，随后将此体系置于汞灯(光强3mW/cm²)下在室温下照射3分钟。紫外辐照完毕后，使用丙酮对薄膜抽提24小时，室温下晾干。

使用2μL的戊二醛(0.67％v/v)对300μL含有20mgβ-葡萄糖苷酶的柠檬酸缓冲液(0.5M,pH＝4.5)进行交联处理30分钟。将此溶液与150μL聚乙二醇二丙烯酸酯混合后，均匀的涂敷在接枝有异丙基硫杂蒽酮的薄膜上，然后将涂覆有溶液的薄膜置于两片石英片之间形成“三明治结构”，随后将此体系置于氙灯(光强4mW/cm²)下照射30分钟。之后将此固定有β-葡萄糖苷酶的薄膜投入含有120mg纤维素酶与30mg滤纸的柠檬酸缓冲溶液(0.5M，pH＝4.8)中，在50℃，摇床转速200rpm下反应72小时。经测定，滤纸水解为葡萄糖的转化率为80％。反应结束后使用大量柠檬酸缓冲溶液(0.5M，pH＝4.8)对固定β-葡萄糖苷酶的薄膜进行冲洗，之后将固定有β-葡萄糖苷酶的薄膜重复使用。经测定，在固定有β-葡萄糖苷酶的双向拉伸聚丙烯薄膜重复使用10个批次以后，滤纸水解葡萄糖的效率为初始的84％。

实施例7：

将1mL，0.5mmol/mL的异丙基硫杂蒽酮丙酮溶液均匀地涂覆在5×5cm²的尼龙布上，然后将涂覆有溶液的尼龙布置于两片石英片之间形成“三明治结构”，随后将此体系置于汞灯(光强1mW/cm²)下在室温下照射5分钟。紫外辐照完毕后，使用丙酮对尼龙布抽提24小时，室温下晾干。

使用4μL的戊二醛(0.44％v/v)对900μL含有50mgβ-葡萄糖苷酶的柠檬酸缓冲液(0.2M,pH＝4.7)进行交联处理40分钟。将此溶液与900μL亚甲基双丙烯酰胺混合后，均匀的涂敷在接枝有异丙基硫杂蒽酮的尼龙布上，然后将涂覆有溶液的尼龙布置于两片石英片之间形成“三明治结构”，随后将此体系置于LED灯(光强0.4mW/cm²)下照射90分钟。之后将此固定有β-葡萄糖苷酶的尼龙投入含有240mg纤维素酶与60mg滤纸的柠檬酸缓冲溶液(0.2M，pH＝4.7)中，在55℃，摇床转速250rpm下反应24小时。经测定，滤纸水解为葡萄糖的转化率为81％。反应结束后使用大量柠檬酸缓冲溶液(0.2M，pH＝4.7)对固定β-葡萄糖苷酶的尼龙布进行冲洗，之后将固定有β-葡萄糖苷酶的尼龙布重复使用。经测定，在固定有β-葡萄糖苷酶的尼龙布重复使用10个批次以后，滤纸水解葡萄糖的效率为初始的86％。

Claims (4)

1.一种利用原位网布包埋β-葡萄糖苷酶提高水解纤维素效率并降低纤维素乙醇成本方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)使用戊二醛对β-葡萄糖苷酶溶液交联处理10-90分钟得到交联的β-葡萄糖苷酶溶液；戊二醛在体系中的体积浓度为0.25％-5％；β-葡萄糖苷酶在体系中浓度为10-100g/L；所述体系为戊二醛与β-葡萄糖苷酶溶液的混合物；

(2)将0.5-5M的异丙基硫杂蒽酮丙酮溶液均匀地涂覆在聚合物基材上，然后将涂覆有溶液的基材置于两片石英片之间，随后将此体系置于汞灯下在室温下正反面各照射2-5分钟，得到携带表面休眠基的聚合物基材，其中光强为0.9mW/cm²-9mW/cm²；

(3)将交联的β-葡萄糖苷酶溶液与可聚合单体混合后，交联的β-葡萄糖苷酶溶液：可聚合单体体积比为1:4-4:1；均匀的涂敷在接枝有异丙基硫杂蒽酮的基材上，然后将涂覆有溶液的基材置于两片石英片之间，随后将此体系置于可见光灯下照射30-180分钟，得到固定有β-葡萄糖苷酶的聚合物膜，其中光强为0.9mW/cm²-9mW/cm²；

(4)将固定有β-葡萄糖苷酶的基材投入含有纤维素酶与纤维素底物的溶液中，在30-60℃，摇床转速40-200rpm下反应6-120小时，将纤维素底物转变成葡萄糖；其中纤维素酶与纤维素底物的质量比为1:10-10:1，纤维素酶与固定化的交联β-葡萄糖苷酶的质量比为1:5-5:1。

2.根据权利要求1中所述的利用原位网布包埋β-葡萄糖苷酶提高水解纤维素效率并降低纤维素乙醇成本的方法，其特征在于步骤(2)中所使用的聚合物基材为聚合物片材、多孔膜、纺织品或非织造织物。

3.根据权利要求1所述的利用原位网布包埋β-葡萄糖苷酶提高水解纤维素效率并降低纤维素乙醇成本的方法，其特征在于步骤(3)中所用的光源为氙灯或LED灯。

4.根据权利要求1所述的利用原位网布包埋β-葡萄糖苷酶提高水解纤维素效率并降低纤维素乙醇成本的方法，其特征在于步骤(3)中所用可聚合单体为聚乙二醇二丙烯酸酯，聚乙二醇双甲基丙烯酸酯或亚甲基双丙烯酰胺。