CN100347295C - 固定化酶的制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供油脂分解用酶在固定用载体吸附固定后,不进行干燥,通过与脂肪酸甘油三酯或脂肪酸部分甘油酯接触,调节酶水分,使残存的水量为相对载体重量的5-50重量%的酯化反应用固定化酶的制造方法,以及油脂分解用酶在固定用载体固定后,不直接进行干燥,通过一边与相对载体重量的20-3000重量%的脂肪酸、脂肪酸甘油三酯或脂肪酸部分甘油酯接触一边脱水,调节酶水分,使残存水量为相对载体重量的1-50重量%的酯化反应用固定化酶的制造方法。通过本发明方法,不进行导致酶失活的干燥,调节水分量,可制造高活性的酯化反应用固定化酶。
Description
技术领域
本发明涉及在脂肪酸与醇的酯化反应,或在油脂(甘油一、二或三酯)的酯交换反应中,作为催化剂使用的具有高活性的固定化酶的制造方法。
背景技术
脂肪酸与醇的酯化物和油脂(甘油一、二或三酯)的酰基进行交换制造新的甘油酯时,利用油脂分解用酶作为催化剂的情况增多了。特别在制造具有功能性的油脂时,多数情况下利用具有位置特异性的脂肪酶。作为这种酶的回收再利用方法有固定化酶的利用。
现在可得到的固定化酶,如Novozymes社出售的脂肪酶RM IM或脂肪酶TL IM、Novozym 435等,都以干燥物的形态提供。之所以制成干燥物的形态,是由于要考虑保存时的酶失活的抑制或处理性能的改进。但是,在固定化酶进行减压、真空或加热下的干燥过程中,易引起吸附的酶失活,在大多数情况下,实际的活性显现时,没有显现出吸附时的最大活性。
而且,特开2000-166589号公报提出了在酶被固定化用载体吸附固定后,不进行干燥迅速地直接与反应底物接触,进行酯化反应的方法。按照该方法,在反应初期,虽然因固定化酶含的大量水分的影响而反应进行缓慢,可是在2次以后的反应中可达到高活性。但是,必须与反应底物迅速的接触,且不适宜以固定化酶的形态保存。另外,特开昭62-134090号公报公开了通过在与脂肪酸衍生物接触下进行固定化酶干燥提高活性表达的方法。然而,该方法必须缓慢地进行干燥,效率不高,同时其条件设定等复杂,另外还需要高价的设备,因而没有实用性。
发明内容
本发明提供了酯化反应用固定化酶的制造方法,其中在油脂分解用酶被固定化用载体吸附固定后,不进行干燥,通过与脂肪酸甘油三酯或脂肪酸部分甘油酯接触,调节酶水分,使残存的水分量相对载体重量为5-50重量%。
另外,本发明还提供了酯化反应用固定化酶的制造方法,其中在油脂分解用固定化酶被固定化用载体吸附固定后,不直接进行干燥,通过一边与相对载体重量的20-3000重量%的脂肪酸、脂肪酸甘油三酯或脂肪酸部分甘油酯接触一边进行脱水,调节酶水分,使残存水量为相对载体重量的1-50重量%。
通过上述的本发明的方法,不进行引起酶失活的干燥,调整水分量,可制造高活性的酯化反应用的固定化酶。
具体实施方式
之所以在将油脂分解用酶制成干燥的固定化酶时引起酶的失活,是由于通过干燥强制地除去水分,对酶产生了损坏(例如高次结构的破坏)。因此,本发明的目的是提供不进行引起酶失活的干燥,调整水分量,制造高活性酯化反应(包括酯交换反应)用的固定化酶的方法。
本发明者在制造酯化反应用固定化酶时,通过使用前述的方法调整固定化酶的残存水分量,成功地抑制了酶的失活,显现出高活性。
在本发明中所使用的固定化用载体,可列举C盐、硅藻土、高岭土、硅胶、分子筛、多孔玻璃、活性炭、碳酸钙、陶瓷等无机载体;聚乙烯醇、聚丙烯、壳聚糖、离子交换树脂、疏水吸附树脂、螯合树脂、合成吸附树脂等有机高分子等,特别优选离子交换树脂。
离子交换树脂优选多孔的阴离子交换树脂。这样的多孔载体,由于具有大的表面积,可得到酶的更大的吸附量。树脂的粒径优选为100-1000微米,细孔径优选为10-150纳米。作为材质可列举酚醛型、聚苯乙烯型、丙烯酰胺型、聚乙烯基苯型等,特别优选酚醛型树脂(例如Rohm和Hass社制备的Duolite A-568)。
在本发明中使用的油脂分解用酶,优选脂肪酶。脂肪酶当然可使用来自动物、植物的脂肪酶,也可以使用来自微生物的市售脂肪酶。来自微生物的脂肪酶,可列举源自酒曲酶(Rizopus)属、曲霉属、毛霉属、假单胞菌属、地丝菌属、青霉属、念珠菌属等的脂肪酶。特别以制造功能性油脂为目的的情况下,优断用在甘油的目的位置可进行选择性结合的位置特异性的脂肪酶,即1,3位选择性的脂肪酶的酒曲酶属、曲霉属、毛霉属、假单胞菌属、地丝菌属、青霉菌属。
这些酶固定化时,既可以载体与酶直接吸附,为了成为显现高活性的吸附状态,也可以在酶吸附前,用脂溶性脂肪酸或其衍生物预先处理载体。所使用的脂溶性脂肪酸,可列举C8-C18的饱和或不饱和的、直链或支链的、也可以被羟基置换的脂肪酸。具体实例可列举癸酸、月桂酸、肉豆蔻(ミスチリン)酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸、蓖麻醇酸、异硬脂酸等。另外,作为其衍生物,可列举这些脂肪酸与一元或多元醇的酯、磷脂和这些酯与环氧乙烷加成的衍生物。具体地可列举上述脂肪酸的甲酯、乙酯、甘油一酯、甘油二酯、它们的环氧乙烷加成物、聚甘油酯、脱水山梨醇酯、蔗糖酯等。这些脂溶性脂肪酸或其衍生物可两种以上组合使用。
作为这些脂溶性脂肪酸或其衍生物与载体的接触方法,可以将它们直接加入水或有机溶剂中,但是为了使其分散性良好,可以当脂溶性脂肪酸或其衍生物在有机溶剂中一旦分散、溶解后,加入分散在水中的载体。这种有机溶剂,可列举氯仿、己烷、乙醇等。脂溶性脂肪酸或其衍生物的使用量,相对载体的重量为1-500%,特别优选为10-200%。接触温度为0-100℃,特别优选为20-60℃,接触时间优选约为5分钟-5小时。结束这种处理的载体,通过过滤回收,也可以进行干燥。干燥温度优选为室温-100℃,也可以进行减压干燥。
进行酶固定的温度,可根据酶的特性决定,但是是不引起酶失活的温度即优选0-60℃,特别优选为5-40℃。另外,在固定时使用的酶溶液的pH值只要是在不引起酶变性的范围即可,可和温度一样,根据酶的特性决定,但是,优选pH值在3-9的范围内。为了维持该pH值使用缓冲溶液,作为缓冲溶液,可列举乙酸缓冲液、磷酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液等。
上述酶溶液中的酶浓度,从固定效率的观点看在酶的饱和溶解度以下,而且优选更高的浓度。另外酶溶液,可使用根据要求通过离心分离除去不溶部分得到上清液,或通过超滤等精制的溶液。另外,使用的酶量,相对于载体重量优选为5-1000%,特别优选为10-500%。
在本发明中,油脂分解用酶被固定用载体固定后,不进行干燥,(A)通过与脂肪酸甘油三酯或脂肪酸部分甘油酯接触,或(B)通过一边与脂肪酸、脂肪酸甘油三酯或脂肪酸部分甘油酯接触一边进行脱水,调整残存的水分量。而且,在本发明中,所谓“不进行干燥”意指“不通过减压、真空或加热进行干燥”。
通过(A)处理的情况下,残存的水分量,调整为5-50重量%,优选为15-50重量%。另外,通过(B)处理的情况下,调整为1-50重量%,优选为1-30重量%。
在上述水分调整处理(A)中,与固定化酶接触的脂肪酸甘油三酯和脂肪酸部分甘油酯,可使用菜籽油、大豆油、葵花籽油等植物性液体油脂;沙丁鱼油、金枪鱼油、鲣鱼油等鱼油;鲸油等海兽油;从它们衍生的甘油一酯和甘油二酯,还可使用它们的混合物或从这些油脂得到的酯交换油脂等。这些油脂中可两种以上组合使用。另外在水分调整处理(B)中,不用说可以使用上述甘油三酯和脂肪酸部分甘油酯,也可使用从这些化合物生成的脂肪酸。在处理(B)中使用的脂肪酸,优选使用菜籽油、大豆油、葵花籽油等植物性液体油脂或从沙丁鱼油、金枪鱼油、鲣鱼油等鱼油生成的脂肪酸。而且,在处理(A)或处理(B)中使用的脂肪酸、脂肪酸甘油三酯或脂肪酸部分甘油酯,在用通过本发明的方法制备的固定化酶的实际的酯化反应或酯交换反应中,优选选择作为油相底物的物质。
在处理(A)中使用的脂肪酸甘油酯的量,从与固定化酶充分接触和回避过量使用带来的浪费的观点考虑,相对载体重量优选为500-5000%,更优选为800-4000%,特别优选为1000-3000%。另外,残存水分量相对载体重量为15-50重量%的情况下,使用的脂肪酸甘油酯的量相对载体重量为500-3000%,特别优选为800-2500%;在残存水分量相对载体重量降低到直到5-15重量%的情况下,使用的脂肪酸甘油酯的量相对载体重量为2000-5000%,特别优选为2500-4000%。另外,在处理(B)中使用的脂肪酸或脂肪酸甘油酯的量,从与上述相同的观点和提高流动性、提高脱水效率的观点考虑,相对载体重量为20-3000%,优选为100-1000%。
在处理(A)中固定化酶与脂肪酸甘油酯的接触方法,可使用浸渍、搅拌、用泵等通入到充填了固定化酶的柱中等的任何一种方法。接触温度只要是在接触中油相不凝固的温度即可,可根据使用的脂肪酸甘油酯的特性和酶的特性适当决定,但是优选5-60℃,特别优选室温-40℃。接触时间为0.1-72小时是适宜的,但是超过这个时间也行,可以在与脂肪酸甘油酯接触的状态下保存。再者,在处理(B)中一边与脂肪酸或脂肪酸甘油酯接触一边脱水的情况下,脱水时的温度与处理(A)的情况相同,脱水时间为0.5-24小时适宜,处理(B)的情况可高速进行脱水,每小时的水分下降率为50%以上,优选为60%以上,特别优选为70%以上,脱水过程可在短时间内完成。脱水方法可使用分子筛等脱水剂的方法、减压处理的方法等公知的方法,但是,考虑使用脱水剂处理后必须进行脱水剂的除去等操作,优选采用减压处理。
载体对酶进行吸附固定化时的固定化酶的水分相对载体重量通常为120-200%的范围,但是(A)与脂肪酸甘油酯接触,可将残存的水分量降低到相对载体重量的5-50%。而在(B)与脂肪酸或脂肪酸甘油酯一边接触一边进行脱水的情况下,可将残存的水分量降低到相对载体重量的1-50%。在该接触处理或脱水处理结束阶段,或固定化酶使用前,进行过滤回收固定化酶,在实际反应中使用。
如上所述,按照本发明,通过使用脂肪酸或脂肪酸甘油酯调整水分量,可大大减少通常进行干燥强制的除去水分时发生的酶损坏。因此,可制备具有高活性的固定化酶。另外,固定化酶与脂肪酸甘油酯等接触,除去过剩的水分,在酶周围形成适于反应的反应场。而且通过本发明调整水分量的固定化酶,与接触的脂肪酸甘油酯等成分离状态,或成接触的状态的任何一种状态,均可长期保存。
实施例
实施例1
100克Duolite A-568(Rohm和Hass社制)在1升N/10的氢氧化钠溶液中搅拌1小时。过滤后,用1升蒸馏水洗净,用1升500毫摩尔乙酸缓冲液(pH5)使pH值达到平衡。此后,用1升50毫摩尔乙酸缓冲液(pH5)进行pH值平衡,每2小时2次。过滤回收载体后,用500毫升乙醇进行置换30分钟。过滤后,用500毫升含100克的蓖麻醇酸的乙醇溶液与载体接触30分钟。过滤后,用500毫升50毫摩尔乙酸缓冲液(pH5)每0.5小时进行4次缓冲液置换。过滤后,与用1000毫升10%浓度的脂肪酶(リ·リパ一ゼ)(长濑产业社制)溶液在室温下进行接触4小时,进行酶吸附。吸附后,进行过滤,用500毫升50毫摩尔的磷酸缓冲液(pH5)洗涤0.5小时。洗涤后通过过滤回收固定化酶。此时固定化酶的残存水分量相对吸附载体重量为168%。
向该固定化酶添加1000克菜籽油,在40℃搅拌24小时后,过滤回收固定化酶。固定化酶残存水分量相对吸附载体重量为29%。
这样得到的8克(干重量)固定化酶置入200毫升4口烧瓶中。向其中添加油酸和甘油的混合物80克[油酸/甘油=2.0(摩尔比)]、于40℃、400帕的减压下进行酯化反应。反应后,通过过滤分离反应液和固定化酶,再次按上述置入的油酸与甘油进行反应。该反应后,用同样的方法再进行反应1次。即使用同一固定化酶合计进行3次酯化反应。
将反应液三甲基硅烷基化,用气相色谱分析各反应溶液的甘油酯组成。在表1示出了甘油二酯(DG)+甘油三酯(TG)合计达到70%的时间。第1次和第2次以后的反应时间分别为1.67小时、1.53小时,非常迅速且活性高。
实施例2
用与实施例1相同的方法,吸附酶,缓冲液洗净,通过过滤回收固定化酶。向该固定化酶添加3000克菜籽油,在40℃搅拌24小时后,过滤回收固定化酶。固定化酶残存水分量相对吸附载体重量为11%。
用这样得到的固定化酶,进行与实施例1同样反应的结果,第1次和第2次以后的反应时间分别为1.69小时、1.52小时,非常迅速且活性高。
实施例3
用与实施例1相同的方法吸附酶,缓冲液洗净,通过过滤回收固定化酶。向这样得到的固定化酶添加400克油酸,于40℃、400帕减压下搅拌0.5小时后,过滤回收固定化酶。固定化酶的残存水分量相对吸附载体重量为31%。
使用这样得到的固定化酶,与实施例1进行同样反应的结果,第1次和第2次以后的反应时间分别为1.63小时、1.58小时,非常迅速且活性高。
实施例4
用与实施例1相同的方法吸附酶,缓冲液洗净,通过过滤回收固定化酶。向这样得到的固定化酶添加400克油酸,于40℃、400帕减压下搅拌18小时后,过滤回收固定化酶。固定化酶的残存水分量相对吸附载体重量为2.4%。
使用这样得到的固定化酶,与实施例1进行同样反应的结果,第1次和第2次以后的反应时间分别为1.45小时、1.43小时,比第1次反应更迅速且活性高。
对比例1
用与实施例1相同的方法吸附酶,缓冲液洗净,通过过滤回收固定化酶。此时固定化酶的残存水分量相对载体重量为178%。这种固定化酶以其原状于40℃、100帕减压下干燥24小时。干燥后的固定化酶的残存水分量相对吸附载体重量为3%。
用这样得到的固定化酶,进行与实施例1相同反应的结果,第1次和第2次以后反应时间分别为2.27小时、2.23小时,显著慢,与实施例1-4相比酯化活性差。
对比例2
用与实施例1相同的方法吸附酶,缓冲液洗净,通过过滤回收固定化酶。此时固定化酶的残存水分量相对载体重量为178%。
用这样得到的固定化酶,进行与实施例1相同反应的结果,第1次和第2次以后反应时间分别为3.52小时、1.88小时,第2次以后反应时间非常迅速,活性高,但是第1次反应与实施例1-4相比慢。
表1
缓冲液洗净后的残存水分(相对载体重量) | 水分量降低处理条件 | 水分降低处理后的残存水分(相对载体重量) | DG+TG=70%到达时间 | ||||||
脂肪酸或油脂(相对载体重量) | 温度 | 处理时间 | 处理压力 | 第1次 | 第2次 | 第3次 | |||
实施例1 | 168% | 1000%菜籽油 | 40℃ | 24小时 | 常压 | 29% | 1.67小时 | 1.53小时 | 1.53小时 |
实施例2 | 168% | 3000%菜籽油 | 40℃ | 24小时 | 常压 | 11% | 1.69小时 | 1.52小时 | 1.52小时 |
实施例3 | 168% | 400%油酸 | 40℃ | 0.5小时 | 400帕 | 31% | 1.63小时 | 1.58小时 | 1.58小时 |
实施例4 | 168% | 400%油酸 | 40℃ | 18小时 | 400帕 | 2.4% | 1.45小时 | 1.43小时 | 1.43小时 |
对比例1 | 178% | - | 40℃ | 24小时 | 100帕 | 3% | 2.27小时 | 2.23小时 | 2.23小时 |
对比例2 | 178% | - | - | - | - | - | 3.52小时 | 1.88小时 | 1.88小时 |
Claims (6)
1.固定化酶的制造方法,其包括以下的步骤:
将油脂分解用酶通过吸附固定到载体,
不进行干燥,将固定化酶与脂肪酸甘油三酯、脂肪酸部分甘油酯或其混合物接触,
调节酶水分,使残存的水分量相对载体重量为5-50重量%,其中所述酶用于酯化反应。
2.按权利要求1记载的固定化酶的制造方法,其中脂肪酸甘油三酯、脂肪酸部分甘油酯或其混合物的量,相对载体重量为800-5000%。
3.酯化反应用固定化酶的制造方法,其包括以下的步骤:
将油脂分解用酶通过吸附固定到载体,
不直接进行干燥,将固定化酶与相对载体重量的100-1000重量%的脂肪酸、脂肪酸甘油三酯、脂肪酸部分甘油酯或其混合物接触,从而使所述固定化酶脱水,其中固定化酶的残存水量为相对载体重量的1-50重量%,并且所述酶用于酯化反应。
4.按权利要求3记载的固定化酶的制造方法,其中与固定化酶接触的脂肪酸、脂肪酸甘油三酯或脂肪酸部分甘油酯是酶的油相底物。
5.按权利要求1记载的固定化酶的制造方法,其中与固定化酶接触的脂肪酸甘油三酯或脂肪酸部分甘油酯是酶的油相底物。
6.按权利要求2记载的固定化酶的制造方法,其中与固定化酶接触的脂肪酸甘油三酯或脂肪酸部分甘油酯是酶的油相底物。
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