DE2215512B2 - Vernetzte Copolymerisate - Google Patents

Description

Die covalente Bindung von Substanzen an unlösliche polymere Träger hat in den letzten Jahren zunehmend an Bedeutung gewonnen. Besondere Vorteile bietet die Fixierung von katalytisch wirksamen Verbindungen, z. B. Enzymen, da sie in dieser Form nach beendeter Umsetzung leicht abgetrennt und mehrfach wiederverwendet werden können.

Als Träger mit reaktiven Gruppen wurden bereits mehrfach Copolymerisate aus Maleinsäureanhydrid und Vinylverbindungen vorgeschlagen. Copolymere des Maleinsäureanhydrids mit Äthylen und Monovinylverbindungen werden jedoch bei der Umsetzung mit wäßrigen Enzymlösungen mehr oder weniger wasserlöslich, so daß vor oder während der Umsetzung zweckmäßig ein zusätzlicher Vernetzer z. B. ein Diamin zugesetzt wird. So erhaltene Enzympräparate sind relativ schlecht filtrierbar und besitzen lösliche Anteile, was zu Verlusten an gebundenem Enzym führt (vergL E Katchalski, Biochemistry 3, (1964), Seiten 1905 -1919).

Ferner wurden Copolymerisate aus Acrylamid und Maleinsäure beschrieben, die durch nachträgliches Erhitzen, in die Anhydridform überführt werden. Diese Produkte sind relativ schwach vernetzt, quellen sehr stark in Wasser und besitzen eine nur mäßige mechanische Stabilität, was zu Abriebsverlusten bei der Anwendung dieser Harze führt (vergL DE-OS

is 19 08 290).

Außerdem wurden stark vernetzte Trägerpolymere durch Copolymerisation von Maleinsäureanhydrid mit Divinyläthern hergestellt Aufgrund der alternierenden Copolymerisationsart der Monomeren enthalten diese Polymeren einen sehr hohen Anteil an Anhydridgruppen — in den angegebenen Beispielen jeweils über 50 Gew.-% Maleinsäureanhydrid —, der durch das Molekulargewicht des Vinyläthermonomeren bestimmt wird und daher nur in relativ engen Grenzen dem jeweiligen Verwendungszweck angepaßt werden kann (vergl.DE-OS20 08 996).

Aufgabe der Erfindung war es, neue, stark vernetzte, in Wasser quellfähige Copolymerisate mit stark variierbarem Gehalt an cyclischen Dicarbonsäureanhy dridgruppen und ein Verfahren zu ihrer Herstellung aufzufinden. Bezüglich ihrer Verwendung zur Fixierung von Substanzen, die mit Anhydridgruppen reagieren können, sollten sie die Nachteile der bisher bekannten Trägermaterialien nicht bzw. in geringerem Maße aufweisen.

Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß nach den Methoden der Perl- oder Fällungspolymerisation Anhydride «^-monoolefinisch ungesättigter Dicarbonsäuren, Di- oder Poly-(Meth)Acrylate von Di- oder Polyolen und mindestens ein weiteres hydrophiles Monomeres zu statistisch aufgebauten Copolymerisaten polymerisiert wurden.

Gegenstand der Erfindung sind somit vernetzte Copolymerisate bestehend aus copolymerisierten Ein heitenvon

A 0,1 bis 30 Gew.-%, vorzugsweise 2 bis 20 Gew.-% «^-monoolefinisch ungesättigten Dicarbonsäureanhydriden mit 4 bis 9 Kohlenstoffatomen,

B 35bis90Gew.-%, vorzugsweise50bis85Gew-% Di- und/oder Poly-(Meth)Acrylaten von Di- und/oder Polyolen und

C 5 bis 60 Gew.-%, vorzugsweise 10 bis 50 Gew.-% mindestens eines nicht unter B genannten hydrophilen Monomeren,

wobei die Summe der Prozentgehalte A bis C 100 beträgt und wobei die vernetzten Copolymerisate

Schüttvolumina von 1,4 bis 30, vorzugsweise 2 bis

20 ml/g und spezifische Oberflächen von 0,1 bis 500, vorzugsweise von 1 bis 400 m²/g besitzen und nach der

Verseifung der Anhydridgruppen 0,02 bis i 1 Milliäqui-

fe5 valente Säure pro Gramm enthalten.

Die spezifische Oberfläche werden nach der BET-Methode (DIN 66131 und 66132) bestimmt. Zur Bestimmung des Säuregehaltes nach Verseifung der

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Anhydridgruppen werden 1 g Polymerisat mit einem Überschuß au 0,1 η NaOH versetzt und im geschlossenen Gefäß unter gelegentlichem Umschütteln 16-24 Stunden bei Raumtemperatur belassen. Anschließend wird die nicht verbrauchte Lauge mit 0,1 η HCl gegen Phenolphthalein zurücktitriert, bis die Lösung 30 Sekunden farblos bleibt 1 ml verbrauchte 0,1 η NaOH entspricht 0,1 mÄquiv/g.

Gegenstand der Erfindung ist weiter ein Verfahren zur Herstellung von Copolymerisaten gemäß Anspruch ι ο 1, dadurch gekennzeichnet, daß man — bezogen auf Gesamtmonomere —

A 0,1 bis 50 Gew.-%, vorzugsweise 2 bis 25 Gew.-% «^-monoolefinisch ungesättigte Dicarbonsäureanhydride mit 4 bis 9 Kohlenstoffatomen,

B 35 bis 90 Gew.-%, vorzugsweise 50 bis 85 Gew.-% Di- und/oder Poly-(Meth)Acrylate von Di- und/oder Polyolen und

C 5 bis 60 Gew.-%, vorzugsweise 10 bis 50 Gew.-% mindestens eines hydrophilen Monomeren

— die Summe der Prozentgehalte A bis C beträgt 100 — nach der Methode der Fällungspolymerisation oder der Perlpolymerisation in Lösungsmitteln oder Lösungsmittelgemischen, die gegen Anhydridgruppen inert sind, bei Temperaturen von 20 bis 200° C in Gegenwart Radikale bildender Verbindungen polymerisiert

Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung der erfindungsgemäß erhaltenen Copolymerisate zur Fixierung von Substanzen, die mit den Anhydridgruppen der Copolymerisate reagieren könnea

Als «^-monoolefinisch ungesättigte Dicarbonsäureanhydride mit 4 bis 9 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise mit 4 bis 5 Kohlenstoffatomen seien namentlich genannt: Maleinsäure-, Itaconsäure- oder Citraconsäureanhydrid, insbesondere Maleinsäureanhydrid. Für die Copolymerisation können auch Mischungen dieser Anhydride eingesetzt werden.

Die erfindungsgemäß zu verwendenden Di- und/oder Polymethacrylate bzw. Di- und/oder Polyacrylate von Di- und/oder Polyolen leiten sich von Verbindungen mit mindestens 2 alkoholischen oder phenolischen, Vorzugsweise alkoholischen OH-Gruppen bzw. deren Umsetzungsprodukten mit Alkylenoxide!! mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 2 bis 4 Kohlenstoffatomen oder Gemischen dieser Alkylenoxide ab, wobei an 1 Mol der Hydroxylgruppen tragenden Verbindung 1 bis 10⁴, bevorzugt 1 bis 10 Alkylenoxidbausteine anpolymerisiert sind. Beispielhaft seien Alkylenoxide, Äthylenoxid, Propylenoxid, Butylenoxid, Trimethylenoxid, Tetramethylenoxid, vorzugsweise Äthylenoxid und Propylenoxid genannt

Die erfindungsgemäß einzusetzenden Di- und PoIy-(Meth)Acrylate von Di- und Polyolen werden nach bekannten Methoden, beispielsweise durch Umsetzung der Di- und/oder Polyole mit (Meth)Acrylsäurechlorid in Gegenwaret von in etwa äquimolaren Mengen,, bezogen auf Säurechlorid, an tert. Aminen wie Triäthylamin, bei Temperaturen unter 2O⁰C, in Anwesenheit von Benzol gewonnen (vergl. De-OS 19 07 666).

Als Di- bzw. Polyole mit mindestens 2 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 2 bis 12 Kohlenstoffatomen kommen z. B. in Frage: Äthylenglykol, Propandiol-1,2, Propandiol-1,3, Butandiole insbesondere Butandiol-1,4, Hexandiole, Dekandiole, Glyzerin, Trimethylolpropan,

50 Pentaerythrit, Sorbit, Sucrose und deren Umsetzungsprodukte mit Alkylenoxiden, wie vorstehend angegeben. Es können auch Gemisch aus Di- und Polyolen eingesetzt werden.

Vorzugsweise werden Diacrylatc bzw. Dimethacrylate von Diolr.n mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen und/oder Umsetzungsprodukten von einem Mol dieser Diode mit 1 — IG Molen Alkylenoxid mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen bzw. Trimethylolpropantrimethacrylat verwendet

Besonders vorteilhaft sind die Dimethacrylate von Äthylenglykol, DÜthylenglykol, Triathyienglykol, Tetraäthylenglykol oder höheren Polyalkylglykolen mit Molgewichten bis 500 oder deren Gemische.

Die dritte Gruppe der Copolymerisationskomponenten besteht aus einfach ungesättigten, hydrophilen Monomeren. Als solche können alle polymerisierbaren, einfach ungesättigten Verbindungen, welche keine gegen Anhydridgruppen reaktiven funktioneilen Gruppen besitzen und hydrophile Polymere bilden, verwendet werden.

Die hydrophilen Monomeren besitzen vorzugsweise mindestens eine Carboxyl-, Aminocarbonyl-, Sulfo- oder Sulfamoylgruppe, wobei die Aminogruppen des Aminocarbonyl- oder SuJ/amoylrestes ggf. durch Alkylgruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder durch Alkoxymethyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen im Alkoxyrest substituiert sein können.

Beispielhaft seien Acrylsäure, Methacrylsäure, Maleinsäurehalbester mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen im Alkoholrest, N-Vinyllactame, wie N-Vinylpyrrolidon, Methacrylamid, N-substituierte (Methacrylamide wie N-Methyl- und N-Methoxymethyl-(meth)acrylamid und N-Acryloyl-dimethyltaurin genannt

Sie werden je nach der gewünschten Hydrophilie und Quellbarkeit der Copolymeren und der Länge der Polyalkylenoxidkette (n) des mehrwertigen (Meth)-acrylesters in Mengen von 5 bis 60 Gew.-% der Monomerenmischung zugesetzt

Außer der Hydrophilie beeinflußt der Zusatz dieser Monomeren üben-aschenderweise auch die Struktur der Polymeren, was bei der Herstellung von Perlpolymerisaten von ganz besonderem Vorteil ist, da hier die Auswahl der zur Monomerenmischung zufügbaren Verdünnungsmittel durch die Bedingungen der Unlöslichkeit in Paraffinkohlenwasserstoffen und der Inertheit gegen Anhydridgruppen stark eingeschränkt wird.

Aufgrund der Variationsbreite in der Zusammensetzung der Monomerenmischung können innerhalb eines sehr weiten Bereiches Hydrophilie, Vernetzungsdichte, Quellbarkeit und Anhydridgruppengehalt der erfindungsgemäßen Copolymerisate dem jeweiligen Verwendungszweck optimal angepaßt werden.

Falls gewünscht, können neben den erfindungsgemäß zu verwendenden Di- und/oder Poly-(Meth)Acrylaten auch üblicherweise verwendete Vernetzungsmittel mit mindestens 2 nichtkonjugierten Doppelbindungen, etwa Divinyladipat, Methylenbisacrylamid, Triacrylformal oder Triallylcyanurat in Mengen von etwa 0,01 bis 30 Gew.-% der Monomerenmischung zugesetzt werden.

Die Polymerisation kann z. B. in einem organischen Lösungsmittel als Fällungspolymerisation durchgeführt werden, wobei die Polymeren bereits kurz nach dem Einsetzen der Polymerisation auszufallen beginnen. An sich sind alle gegen Anhydridgruppen inerten Lösungsmittel geeignet. Besonders günstige Lösungsmittel sind aliphatische, cycloaliphatische und aromatische Kohlenwasserstoffe, sowie halogensubstituierte Kohlenwasserstoffe, Alkylaromaten und Carbonsäureester.

Beispielhaft seien genannt: Heptan, Octan, Isooctan, Benzinfraktionen mit Siedepunkten von etwa 60 bis 200⁰C, Cyclohexan, Benzol, Toluol, Xylole, Chlorbenzol, Diochlorbenzole, Äthylacetat, Butylacx.tat.

Die Lösungsmittel sollen vorzugsweise einen Siedepunkt von mindestens 6O⁰C besitzen und im Vakuum gut aus dem Fällungspolymerisat entfernbar sein. Für 1 Teil der Monomerenmischung verwendet map etwa 2 bis 50, vorzugsweise 5 bis 20 Gew.-Teüe, des Lösungsmittels. Die Eigenschaften der Copolymerisate, besonderes das Schattgewicht und die spezifische Oberfläche werden durch Art und Menge des Lösungsmittels wesentlich beeinfluBt

In vielen Fällen ist es vorteilhaft, Gemische der obengenannten Lösungsmittel zu verwenden, oder die Polymerisation in einem Lösungsmittel für das Polymere zu beginnen und im Verlauf der Polymerisation kontinuierlich ein Fillungsmittel für das Polymere zuzugeben. Das Fallungsmittel kann aich zu bestimmten Zeitpunkten' in einer oder mehreren Portionen zugegeben werden. Außerdem kann die Monomerenmischung zusammen mit einem geeigenten Initiator als Lösung oder ohne Lösungsmittel in eine vorgelegte Lösungsmittelmenge eingespeist werden, so daß während der Polymerisation eine gleichmäßige, geringe Monomerkonzentration aufrecht erhalten wird. Durch Verwendung von(Meth)-Acrylmonomeren unterschiedlicher Hydrophilie und Variation der Polymerisationsbedingungen lassen sich innerhalb eines sehr weiten Bereiches Produkte mit dem jeweiligen Verwendungszweck angepaßter Quellbarkeit, Dichte und spezifischer Oberfläche bei guter mechanischer Stabilität herstellen.

Die erfindungsgemäßen Copolymerisate werden vorzugsweise durch Suspensionspolymerisation hergestellt

Die Suspensionspolymerisation wird zweckmäßig in organischem Medium durchgeführt Als zusammenhängende Phase eignen sich besonders Paraffinkohlenwasserstoffe wie Hexan, Heptan, Octan und höhere Homologe, Cycloaliphaten wie Cyclohexan, sowie Paraffingemische wie Benzinfraktionen oder Paraffinöl. Die Monomeren und der Initiator werden in einem mit Paraffinen nicht mischbaren, gegen Anhydridgruppen inerten Lösungsmittel wie Acetonitril, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid oder Hexanethylphosphorsäuretriamid gelöst und meistens unter Zusatz von Dispergatoren in der zusammenhängenden Phase verteilt Dar Volumenverhältnis, zusammenhängende Phase : Monomerphase beträgt 1 :1 bis 10 :1, vorzugsweise 2 :1 bis 5 :1.

Zur Stabilisierung der Suspension können beispielsweise Glycerin-mono- und dioleate, sowie Gemische dieser Verbindungen, Soibitan-mono- und trioleate bzw. -stearate, Polyftthylenglykolmonoäther mit Stearyl- bzw. Laurylalkohol oder Nonylphenol, Polyäthylenglykolmonoester mit Ölsäure, Stearinsäure und anderen Fettsäuren mit mehr als 10 C-Atomen, sowie das Na-SaIz des Sulfoberasteinsäuredioctylesters verwendet werden. Diese Stoffe werden in Mengen von vorzugsweise 0,1 bis 10%, bezogen auf die Monomerenmischung, eingesetzt und im allgemeinen in der Kohlenwasserstoffphase gelöst Die Partikelgröße der Suspensionspolymerisate kann außer durch Vergrößerung der Rührgeschwindigkeit durch Zugabe von 0,01 bis 2%, bezogen auf Monomere, einer weiteren oberflächenaktiven Substanz, z. B. eines Alkylsulfonates verringert werden.

Die Polymerisation wird durch radikalische Initiato

ren ausgelöst Geeignete Initiatoren sind z. B. Azoverbindungen oder Perverbindungen. Die zur Polymerisationsauslösung gebräuchlichste Azoverbindung ist das AzoisobuttersäurenitriL Als Perverbindungen kommen Hauptsächlich Diacylperoxide, wie Dibenzoylperoxid, oder Percarbonate, wie Diisopropyl- und Dicyclohexylpercarbonat in Frage, es können jedoch auch Dialkylperoxide, Hydroperoxide und in organischen Lösungsmitteln wirksame Redoxsysteme zur Initiierung verwen- det werden.

Die Initiatoren werden in Mengen von 0,01 bis 10%, vorzugsweise 0,1 bis 3%, bezogen auf die Gewichtsmenge der Monomermischung zugesetzt Die Polymerisation wird bei Temperaturen von etwa 20 bis 20O⁰C, vorzugsweise 50 bis 100⁰C in Abhängigkeit von der Zerfallsgeschwindigkeit der Initiatoren und meistens unterhalb des Siedepunktes der Lösungsmittel und bei Perlpolymerisationen unterhalb der Mischungstemperatur der beiden Phasen durchgeführt Außerdem ist es in der Regel vorteilhaft, in inerter Atmosphäre unter Abwesenheit von Sauerstoff zu polymerisieren.

Die durch Fällungspolymerisation erhaltenen Copolymerisate sind farblose bis schwach gelb gefärbte, pulvrige Substanzen mit Schüttvolumina von 1,5 bis 30 ml/g, vorzugsweise 2 bis 20 ml/g und spezifischen Oberflächen von 0,1 bis 500m²/g, bevorzugt 1 bis 400 mVg. Der nach Verseifung der Anhydridgruppen titrimetrisch bestimmte Gehalt an Carboxylgruppen liegt bei 0,01 bis 14 mÄquiv/g, vorzugsweise bei 0,02 bis

11 mÄquiv/g.

Die Suspensionspolymerisate sind weiße oder schwach gefärbte Perlen, die in einigen Fällen unregelmäßig geformt sein können und einen Durchmesser von 0,03 bis 3 mm, vorzugsweise 0,05 bis 0,5 mm und Schüttvolumina von etwa 1,4 bis 8 ml/g, vorzugsweise 1,4 bis 5 ml/g, besitzen. Ihr nach der Hydrolyse der Anhydridgruppen bestimmter Carboxylgruppengehalt beträgt 0,01 bis 14 mÄquiv/g, vorzugsweise 0,02 bis 11 mÄquiv/g.

Die erfindungsgemäßen Copolymerisate enthalten die copolymerisierten Einheiten im wesentlichen statistisch verteilt Aufgrund ihrer hohen Vernetzungsdichte sind die Copolymerisate in allen Lösungsmitteln unlöslich. Molekulargewichte sind daher nicht bestimm bar.

Die Copolymerisate können in Wasser auf das 1,1- bis 3fache ihres Schüttvolumens quellen. Sie eignen sich vorzüglich als Trägerharze zur Fixierung von Substanzen, die mit den Anhydridgruppen der Copolymerisate reagieren können. Außerdem besitzen sie eine ausgezeichnete mechanische Stabilität und damit praktisch keinen Abrieb.

Die oben beschriebenen Trägerharze binden alle Substanzen, die eine funktionell Gruppe tragen, die befähigt ist mit der Anhydridgruppe des Polymeren zu reagieren. Bei den Proteinen und Peptiden sind dies vor allem die endständigen Aminogruppen des Lysins und die freien Aminogruppen der Peptidkettenenden. Man geht hierbei so vor, daß man zu einer gerührten

bo wäßrigen Lösung des Proteins bei einer Temperatur zwischen 0 und 30° C die benötigte Polymerenmenge zugibt Das Gewichtsverhältnis von Protein zu Trägerharz kann in weiten Grenzen variiert und dem späteren Verwendungszweck angepaßt werden. Gute Ausbeuten erhält man bei einem Verhältnis von 1 Gew.-Teil Protein zu 4 bis 10 Gew.-Teilen polymerem Träger. Die optimalen Verhältnisse sind jedoch sowohl von der Zusammensetzung und der Struktur des Polymeren als

auch von der Art des Proteins abhängig.

Bei zahlreichen Enzymen ist es auch zweckmäßig, Stabilisatoren zuzusetzen. Als solche kommen Polyäthylenglykole oder nichtionische Netzmittel zur Abschwächung von Denaturierung an Oberflächen in Frage, sowie die bekannten SH-Reagentien oder Metallionen bei speziellen Enzymen. Das pH wird zweckmäßig mit einem pH-Staten auf dem für die betreffende Bindung optimalen pH-Wert gehalten. Dieser pH-Wert liegt in einem Bereich von 2 bis 9, vorzugsweise 5 bis 7. Beim Einsatz von Penicillinacylase hat es sich als zweckmäßig erwiesen, zwischen pH 5,7 und pH 6,8 zu arbeiten. Dabei müssen zur Konstanthaltung des pH-Wertes anorganische Basen (z. B. Alkalilaugen) oder organische Basen (z. B. tert organ. Amine) zugesetzt werden. Der Fortschritt der Reaktion ist am Verbrauch der zur pH-Konstanthaltung nötigen Menge an Base ersichtlich. Bei Raumtemperatur werden bis zur Beendigung der Reaktion etwa 16 Stunden bei 4° C bis zu 40 Stunden benötigt Das Harz wird hierauf abgesaugt und zur Ablösung eines kleinen Anteils an ionogen gebundenem Protein mit Puffern bzw. Salzen im Konzentrationsbereich von 0,2 bis 1 M gewaschen.

Die gebundene Substanz wird entweder durch Elementaranalyse oder bei Enzymen oder Inhibitoren durch die enzymatische Aktivität bzw. die Hemmung der enzymatischen Aktivität bestimmt Die Ausbeuten an gebundener Substanz sind von der Art der Substanz und der Zusammensetzung des Polymeren abhängig. So wurden z. B. Aminosäuren und niedermolekulare Peptide praktisch vollständig angekoppelt; aber auch bei den Proteinen liegen die Ausbeuten an gebundener enzymatischer Aktivität bei 20 bis über 90% der eingesetzten Aktivität

Nach dem Stand der Technik (DE-OS 19 35 711 und 20 08 990) wird die Ankoppelung der Proteine in Pufferlösungen in Konzentrationen von 0,05 M bis 0,2 M vorgenommen. Arbeitet man ohne Puffer, so steigt der Anteil des ionogen gebundenen Proteins (DE-OS 19 35711). Überraschenderweise zeigte sich, daß bei den erfindungsgemäßen Harzen die Kopplung in möglichst ionenfreiem Medium maximale Ausbeuten an covalent gebundenem Enzym ergibt Das pH kann bei dieser Arbeitsweise durch einen pH-Staten sehr genau auf dem optimalen Wert konstant gehalten werden.

Die Anwendung von Enzymharzen ist technisch von besonderer Bedeutung, da mit ihrer Hilfe technisch wertvolle Produkte hergestellt werden können. Die vorherige Bindung der biologsichen Katalysatoren nach dem vorliegenden Verfahren gestattet durch ganz einfache Separationsprozesse ihre vollständige Abtrennung aus der Reaktionsmischung und ermöglicht die, aus wirtschaftlichen Gründen entscheidende, vielfache Wiederverwendung. Darüberhinaus wird in den meisten Fällen die Stabilität der empfindlichen und teuren Proteine entscheidend verbessert

Im folgenden werden einige Beispiele der Anwendung von trägergebundenen Substanzen angegeben, die nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt werden können.

Die Gruppe der Proteasen, wie Trypsin, Chymotrypsin, Papain, Elastase kann z.B. zur Herstellung von Proteinhydrolysaten für mikrobiologische Prozesse verwendet werden. Außerdem können die Enzyme auch zur Entfernung von antigenen Proteinen aus pharmazeutischen Wirkstoffen dienen.

Acylasen werden technisch zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure aus Penicillinen oder zur Trennung von Racematen acylierter Aminosäuren verwendet. Trägergebundene Amylase kann zum hydrolytischen Abbau von Stärke verwendet werden. Spezielle Hydrolasen, wie Asparaginase oder Urease

können in gebundener Form im extrakorporalen Kreislauf therapeutisch eingesetzt werden.

Diese und zahlreiche andere Anwendungsmöglichkeiten sind in der Literatur beschrieben worden. Siehe dazu z. B. die Zsuammenfassungen in Chem. Eng. News v. 15.

ίο 2. 1971, Seite 86 und Rev. Pure a. Appl. Chem. 21, 83 (1971).

Ein weiteres großes Anwendungsgebiet von an Trägern fixierten Substanzen ist die Affinitätschromatographie. So kann man mit gebundenen Antigenen oder auch Haptenen Antikörper und umgekehrt mit fixierten Antikörpern (y-Giobuiine) Antigene isolieren. Ebenso lassen sich Enzyme mit Hilfe gebundener Inhibitoren oder Substratanalogen spezifisch anreichern. Bekannt ist z. B. die Gewinnung von Trypsin und Chymotrypsin durch gebundene pflanzliche oder tierische Inhibitoren Andere Beispiele sind die Gewinnung von Peptidasen an speziellen, gebundenen Peptiden oder die Isolierung von Plasmin mit an einem Träger gebundenem Lysin Zusammenfassende Arbeiten über dieses Anwendungs gebiet sind von G. Feinstein in Nturwissenschaften 58 389, (1971) und F. Fried in Chromatographie Reviews 14 121,(1971) erschienen.

Die Siedepunkte in den Beispielen wurden bei Normaldruck bestimmt

Beispiel la)

70 g Tetraäthylenglykoldimethacrylat 20 g Methacrylsäure, 10 g Maleinsäureanhydrid und 1 g Azoiso- buttersäurenitril werden in 1 1 Benzol gelöst und zunächst 4 Stunden bei 60° C polymerisiert Dann gibt man 1 g Azoisobuttersäurenitril und 200 ml Benzin (Kp 100 bis 140° C) zu und polymerisiert 2 Stunden bei 70° C und 2 Stunden bei 80° C

Das pulvrige Polymere wird gründlich mit Petroläther (Kp 30 bis 50° C) gewaschen und im Vakuum getrocknet

Ausbeute: 96 g Schüttvolumen: 8,8 mi/g Quellvolumen in Wasser: 12,4 ml/g Spez. Oberfläche: 8,6 m²/g

Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen = 3,85 mÄquiv/g

Beispiel Ib)

6 g des nach Beispiel la) hergestellten Trägerharzes werden in einer Lösung von 610 U Penicillinacylase in 150 ml Wasser suspendiert Durch Zugabe von 1 N-NaOH mit einem pH-Staten wird der pH-Wert auf 63 gehalten und die 20 Stunden bei 25° C gerührt

Dann saugt man aber eine Glasfritte G 3 ab und wäscht mit je 300 ml 0,05 M-Phospkatpuffer pH 7 A der 1 M-Natriumchlorid enthält, und mit demselben Puffer ohne Natriumchlorid. Durch weiteres Waschen kann keine Aktivität mehr eluiert werden. Oberstand und

es Waschlösungen werden vereinigt und ihre enzymatische Aktivität bestimmt In einer aliquoten Menge wird die enzymatische Aktivität des feuchten Harzes gemessen.

20

25

Ergebnis:

Enzymatische Aktivitäten (NIPAB-Test; C. Kutzbach und B. Rauenbusch, ζ. physiol. Chemie 354 (1974) 43-53)

Ausgangslösung 610U

Überstand + Waschlösungen 112 U
Trägerharz nach der Umsetzung

d. s. 92% der Ausgangsaktivität 561 U

Die enzymatische Aktivität der Penicillinacylase wird colorimetisch oder titrimetrisch mit 0,002 M-6-Nitro-3-(N-phenylacetyl)-aminobenzoesäure (NIPAB) als Substrat bei pH 7,5 und 25° C gemessen. Der molare Extinktionskoeffizient der entstehenden 6-Nitro-3-aminobenzoesäure beträgt E(05r™=9ö90. i Einheit (U) entspricht dem Umsatz von 1 μΜοΙ Substrat pro Minute.

Beispiel Ic)

In einer Lösung von 40 ml Urease in 32 ml Wasser werden 400 mg des nach Beispiel la) hergestellten Trägerharzes suspendiert Bei ständigem Rühren bei Raumtemperatur wird der pH-Wert durch Zugabe von 1 N-Natronlauge auf pH 6,0 konstant gehalten. Nach 16 Stunden ist die Reaktion beendet, das Harz wird abgesaugt und wie in Beispiel Ib) mit Puffer gewaschen.

Ergebnis:

Enzymatische Aktivität

Ausgangslösung 168 U

Überstand+Waschlösung 64,5U Trägerharz nach der Umsetzung

d. s. 52% der Ausgangsaktivität 87 U

Die enzymatische Aktivität der Urease wird titrimetrisch mit 0,17 M-Harnstoff als Substrat bei 25°C und pH 6,1 bestimmt 1 Einheit (U) entspricht der Enzymmenge, die 1 μΜοΙ Harnstoff d. h. 2 μΜοΙ Salzsäure pro Minute verbraucht

Beispiel Id)

In einer Lösung von 100 mg Trypsin in 32 ml 0,02 M-Calciumchlorid werden 500 mg des nach Beispiel la) hergestellten Trägerharzes suspendiert Unter ständigem Rühren bei 4° C wird der pH-Wert durch Zugabe von 1 N-Natronlauge auf pH 6,3 konstant gehalten. Nach 16 Stunden wird das Harz abgesaugt und wie in Beispiel Ib) mit Puffer gewaschen.

Ergebnis:
Enzymatische Aktivität

Ausgangslösung 110 U

Überstand+Waschlösungen 15,6 U Trägerharz nach der Umsetzung

d. s. 58% der Ausgangsaktivität 64 U

Die enzymatische Aktivität wurde colorimetrisch nach Tuppy, Z. PhysioL Cehm. 329 (1962) 278, mit Benzol-arginin-p-nitroanilid (BAPNA) als Substrat gemessen. 1 Einheit (U) entspricht der Spaltung von 1 uMol Substrat pro Minute bei 25° C und pH 7,8.

Beispiel 2a)

Eine Lösung von 80 g Tetraäihylenglykoldimethacrylat, 10 g Methacrylsäure, 10 g Maleinsäureanhydrid und 1 ε Azoisobuttersäurenitril in 11 Benzol wird unter langsamem Rühren 4 Stunden bei 6O⁰C, 2 Stunden bei 7O⁰C und 1 Stunde bei 8O⁰C polymerisiert Das Polymere wird abfiltriert, dreimal in Benzol ausgerührt, mit Petroläther gewaschen und im Vakuum getrocknet.

Ausbeute: 70 g
Schüttvolumen: 7,0 ml/g
Quellvolumen in Wasser: 8,2 ml/g
Spez. Oberfläche: 53 mVg

Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen = 2,55 mÄquiv/g

35

40

Beispiel 2b)

1 g des nach Beispiel 2a) hergestellten Polymeren wird analog zu Beispie! Ib) mit Penicillinacylasc in 33 ml Wasser bei pH 6,3 umgesetzt.

Ergebnis:

Enzymatische Aktivitäten (NIPAB-Test)

Ausgangslösung 118 U

Überstand+Waschlösungen 21 U
Trägerharz nach der Umsetzung

d. s. 69% der Ausgangsaktivität 82 U

Beispiel 3a)

60 g Tetraäthylenglykoldimethacrylat, 30 g Methacrylsäure, 10 g Maleinsäureanhydrid und 1 g Azoisobuttersäurenitril werden in 300 ml Acetonitril gelöst Diese Lösung wird in 11 Benzin (Kp 100 bis 140⁰C), welches 5 g eines Gemisches von Glycerinmono- und -dioleat enthält, suspendiert und 22 Stunden bei 60° C polymerisiert

Die Polymerperlen werden abfiltriert dreimal in Benzol und anschließend zweimal in Petroläther (Kp 30 bis 50° C) suspendiert und im Vakuum getrocknet

Ausbeute: 94 g weiße Kugeln
Schüttvolumen: 4,4 ml/g
Quellvolumen in Wasser: 5,5 ml/g
Spez. Oberfläche: 6,6 mVg
Mittlerer Partikeldurchmesser: ~200μ
Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen =4,3 mÄquiv/g

45

Beispiel 3b)

1 g des nach Beispiel 3a) hergestellten Polymeren wird analog zu Beispiel Ib) mit Penicillinacylase in 33 ml Wasser bei pH 63 umgesetzt

Ergebnis:

Enzymatische Aktivität (NIPAB-Test)

Ausgangslösung 118 U

Überstand+Waschlösungen 43 U
Trägerharz nach der Umsetzung

d. s. 81 % der Ausgangsaktivität % U

55

60

65

Beispiel 4a)

Eine Lösung von 2100 g Tetraäthylenglykoldimethacrylat, 600 g Methacrylsäure, 300 g Maleinsäureanhydrid und 30 g Azoisobuttersäurenitril in 7,51 Acetonitril wird in 211 Benzin (Kp 100- 14O⁰C), in dem 150 g eines Gemisches von Glycerinmono- und -dioleat gelöst wurden, suspendiert und 1 Stunde bei 50° C und 20 Stunden bei 60° C polymerisiert

Das Perlpolymerisat wird abgesaugt, zweimal mit

Toluol und einmal mit Petroläther (Kp 30 bis 50° C) ausgerührt und bei 60° C getrocknet.

Ausbeute: 2,95 kg
Schüttvolumen: 4,7 ml/g
Quellvolumen in Wasser: 5,4 ml/g
Mittlerer Partikeldurchmesser: ca. 03 mm
Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen =4,0 mÄquiv/g
Spez. Oberfläche: 53 m²/g

Beispiel 4b)

1 g des nach Beispiel 4a) hergestellten Polymeren wird analog zu Beispiel Ib) mit Penicillinacylase in 33 ml Waser bei pH 63 umgesetzt

Ergebnis:

Enzymatische Aktivität (NIPAB-Test)

In der Ausgangslösung 107 U

Überstand und Waschlösungen 27 U
Trägerharz nach der Umsetzung

d. s. 63% der Ausgangsaktivität 67 U

Beispiel 4c)

20 g des nach Beispiel 4a) hergestellten Polymeren werden bei Raumtemperatur in 600 ml einer Lösung von 1,0 g unspezifischer Elastase aus Schweinepankreas unter Rühren eingetragen. Das pH wird hierbei auf 5,8 konstant gehalten. Nach einer Reaktionszeit von 16 Stunden wird das Harz abgesaugt und in der in Beispiel Ib) beschriebenen Weise aufgearbeitet

Ergebnis:

Enzymatische Aktivität (Casein-Test)

Ausgangslösung 2180E

Überstand+Waschlösungen 993 E
Trägerharz nach der Umsetzung

d. s. 56% der Ausgangsaktivität 1225 E

Die enzymatische Aktivität der unspezifischen Elastase wird titrimetrisch mit Casein als Substrat (Konzentration 11,9 mg/ml) bei pH 8,0 und 25° C bestimmt 1 Einheit (E) entspricht einem Verbrauch von 1 μΜο! Kalilauge pro Minute.

Beispiel 5a)

Eine Lösung von 80 g Tetraäthylenglykoldimethacrylat, 10 g Methacrylsäure, 10 g Maleinsäureanhydrid und 1 g Azoisobuttersäurenitril in 300 ml Acetonitril wird analog zu Beispiel 3a) polymerisiert

Ausbeute: 92 g weiße, eiförmige Prtikel
Schüttvolumen: 23 Kil/g
Quellvolumen in Wasser: 3,2 ml/g
Spez. Oberfläche: 1,7 mVg
Mittlerer Partikeldurchmesser: 125 μ
Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen —3,5 mÄquiv/g

Beispiel 5b)

1 g des nach Beispiel 5a) hergestellten Polymeren wird analog zu Beispiel Ib) mit Penicillinacylase in 33 ml Wasser bei pH 63 umgesetzt

Ergebnis:

Enzymatische Aktivität (NIPAB-Test)

Ausgangslösung 118 U

Überstand+Waschlösungen 34 U

Trägerharz nach der Umsetzung
d. s. 52% der Ausgangsaktivität

61 U

Beispiel 6a)

Eine Lösung von 50 g Äthylenglykoldimethacrylat, 40 g Methacrylsäure, 10 g Maleinsäureanhydrid und 1 g Azoisobuttersäurenitril in 300 ml Acetonitrl wird in 11 Benzin (Kp 100 bis 140⁰C), in welchem 5 g eines Gemisches von Glycerinmonooleat und -dioleat gelöst sind, suspendiert und 20 Stunden bei 6O⁰C polymerisiert Das Perolpolymerisat wird abfiltriert, dreimal in Benzol und zweimal in Petroläther (Kp 30 bis 50⁰C) suspendiert und im Vakuum bei 50⁰C getrocknet

Ausbeute: 87 g
Schutt voiumen: 4,8 mi/g
Quellvolumen in Wasser: 5,6 ml/g
Spez. Oberfläche: 13,2 mVg
Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen— 4,2 mÄquiv/g

Beispiel 6b)

Ig des nach Beispiel 6a) hergestellten Polymeren wird analog zu Beispiel Ib) mit Penicillinacylase in 33 ml Wasser bei pH 63 umgesetzt

Ergebnis:
_J0 Enzymatische Aktivität (NIPAB-Test)

Ausgangslösung 118 U

Überstand und Waschlösungen 29 U
Trägerharz nach der Umsetzung

d. s. 47% der Ausgangsaktivität 55 U

Beispiel 7a)

Eine Lösung von 50 g Trimethylolpropan-trimethacrylat, 30 g Methacrylsäure, 20 g Maleinsäureanhydrid und 1 g Azoisobuttersäurenitril in 300 ml Acetonitril wird analog zu Beispiel 6a) polymerisiert

Ausbeute: 86 g
Schüttvolumen: 2,0 ml/g
Quellvolumen in Wasser: 2,2 ml/g
Mittlerer Partikeldurchmesser: ~30 μ
Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen: 4,1 mÄquiv/g
Spez. Oberfläche: 173 mVg

Beispiel 7b)

1 g des nach Beispiel 7a) hergestellten Polymeren wird bei Raumtemperatur und ständigem Rühren zu einer Lösung von 100 mg Lysin in 32 ml Wasser gegeben. Der pH-Wert wird auf 63 konstant gehalten. Nach 16 Stunden wird das Harz abgesaugt, in 50 ml 1 M-Natriumchloridlösung suspendiert, abgesaugt und mit 100 ml Wasser nachgewaschen. Der Rückstand wird im Vakuum bei 100⁰C getrocknet und der Stickstoffgehalt nach Kjeldahl bestimmt

Ergebnis:

Trockengewicht: 860 mg

Stickstoffgehalt: 1,5% entsprechend einem Gehalt des Harzes Von 65 mg Lysin. Das sind 65% der eingesetzten Menge an Lysin.

13 14

Beispiel 8 Analog zu Beispiel 6a) wurden polymerisiert (Variation der Maleinsäureanhydrid-Menge):

Versuch Nr.	b	C	Emulgator = Gemisch aus Glycerin-mono- und dioleaten	d	e	f	g
a	70	65	Vs = Schüttvolumen	60	55	50	45
TGDM (g) 75	20	20	Vq = Quellvolumen in Wasser	20	20	20	20
MAS (g) 20	10	15		20	25	30	35
MSA (g) 5	1	1		1	1	1	1
AIBN (g) 1	250	250		250	250	250	250
Acetonitril (ml) 250	1000	1000		1000	1000	1000	1000
Benzin (ml) 1000	2,5	5	Säure = Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen	5	5	5	5
Emulgator (g) '5	93	86	Sp. O. = Spezifische Oberfläche	88	80	79	70
Ausbeute (g) 95	3,4	3,6		2,6	3,0	3,2	2,5
Vs (nil/g) 3,4	6,0	4,5		3,5	4,0	4,3	3,4
VQ (ml/g) 4,4	4,2	3,6		3,8	3,9	4,7	4,3
Säure (mÄq./g) 3,1	3,2	1,8	2,3	6,4	1,8	1,3
Sp. O. (m2/g) 5,1	TGDM = Tetraäthylenglykoldimethacrylat
	MAS = Methacrylsäure
MSA = Maleinsäureanhydrid
AIBN = Azoisobuttersäurenitril

"^Ie '. 35 Gemisches von Glycerinmono- und dioleaten enthält,

Eine Lösung von 70 g Tetraäthylenglykoldimethacry- suspendiert und unter Rühren zunächst 18 Stunden auf

lat, 20 g Acrylsäure, 10 g Maleinsäureanhydrid und Ig 50° C erwärmt Dann gibt man 1 g des Initiators nach

Azoisobuttersäurenitril im 11 Benzol wird unter und rührt weitere 8 Stunden bei 60° C. Die Polymerku- LuftiMisschluß und langsamem Rühren 4 Stunden auf geln werden mit Benzol und Petroläther gründlich

60⁰C, 2 Stunden auf 70° und 2 Stunden auf 80° C 4o gewaschen und im Vakuum getrocknet

erwärmt Das feinteilige Fällungspolymerisut wird Ausbeute-54 e klare Perlen

dreimal in Benzol und zweimal in Acetonitril suspen- ädKÄ^nAfc

dierUbgesaugtundunVakuumgetrocknet Quellvolumen in Wasser: 2,4 ml/g

Ausbeute :94 g . Mittlerer Partikeldurchmesser: ~ 03 mm Schüttvolumen: 6,8 ml/g ⁴³ Spez. Oberfläche: 0,8 mVg Quellvolumen in Wasser: 7,6 ml/g Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgrup- Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgrup- pen=3,3mÄquiv/g

pen -1,64 mÄquiv/g Gehalt an Stickstoff: 3,4% + = 27%

Spez. Oberfläche: 73 m²/g ₅₀ N-Vinylpyrrolidon. Beispiel 9b) Beispiel 10b)

1 g des nach Beispiel 9a) hergestellten Polymeren 1 g des nach Beispiel 10a) hergestellter. Polymeren

wird analog zu Beispiel Ib) mit Penicillinacylase in 32 ml wird analog zu Beispiel Ib) mit Penicillinacylase in 33 ml

Wasser bei pH 6,3 umgesetzt 55 Wasser bei pH 6,3 umgesetzt Ergebnis: Ergebnis: Enzymatische Aktivität (NliPAB-Test) Enzymatisch* Aktivität (NIPAB-Test) Ausgangslosung 107 U Ausgangslösung 107 U Oberstand+Waschlösung 26 U 6o Oberstand+Waschlösungen 26 U Tragerharz nach der Umsetzung Trägerharz nach der Umsetzung

d.s.36%derAusgangsaktivität 38 U d. s. 77% der Ausgangsaktivität 82 U

Beispiel 10a) [

Eine Lösung von 50 g Tetraithylenglykoldimethacry- 65 Beispiel Ha)

lat, 40 g N-Vinylpyrrolidon, 10 g Maleinsäureanhydrid Eine Lösung von 70 g Tetraäthylenglykoldimethacry-

und 1 g Dicvclohexylpercjirbonat in 200 ml Acetonitril lat, 20 g Methacrylamid, 10 g Maleinsäureanhydrid, 1 g

wird in 11 Benzin (Kp 100 bis 140⁰C)₁ welches 5 g eines Azoisobuttersäurenitril und 200 ml Acetonitril werden

analog zu Beispiel 5a) in Benzin suspendiert und polymerisiert

FAusbeute:93g Schüttvohimen: 2,0 ml/g Quellvolumen in Wasser: 33 ml/g ^J

Sauregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen: 1,7 mAquiv/g Spez. Oberfläche: 7,2 mVg

Beispiel Hb)

g des nach Beispiel Ha) hergestellten Polymeren wird analog zu Beispiel Ib) mit Penicillinacylase in 32 ml Wasser bei pH 63 umgesetzt

Ergebnis:

Enzymatische Aktivität (NIPAB-Test) Ausgangslösung 107 U

Oberstand und Waschlosungen 42 U Trigerharz nach der Umsetzung

d. s. 31 % der Ausgangsaktivität 33 U

Beispiel 12b)

g des nach Beispiel 12a) hergestellten Polymeren wird analog zu Beispiel Ib) mit Penicillinacylase in 32 ml Wasser bei pH 63 umgesetzt

Ergebnis:

Enzymatische Aktivität (NIPAB-Test) Ausgangslösung 108 U

Oberstand+Waschlösungen 49 U Trigerharz nach der Umsetzung

d. s. 23% der Ausgangsaktivitit 25 U

Beispiel 12a)

Eine Lösung von 60 g Tetraäthylenglykoldimethacrylat, 30 g N-Methoxymethyl-acrylamid, 10 g Maleinsilu- reanhydrid und 1 g Azoisobutterslurenitril in 200 ml Acetonitril wird in 11 Benzin, in welchem 5 g eines Gemisches von Glycerin-mono- und dioleat gelöst werden suspendiert und 20 Stunden bei 60°C polymerisiert

Das Perlpolymerisat wird abfiltriert, dreimal in Essigester suspendiert und im Vakuum bei 50⁰C getrocknet

Ausbeute: 97 g Schattvolumen: 1,6 ml/g Quellvolumen in Wasser: 3,1 ml/g mittlerer TeUchendurchmesser: ~03 mm Spez. Oberfläche: 2,6 mVg

35 Beispiel 13a)

Setzt man im Ansatz von 12a) statt N-Methoxymethyl-acrylamid 30 g N-Methoxymethylmethacrylamid ein, so erhalt man folgendes Ergebnis:

Ausbeute: 94 g Schattvolumen: 2,4 ml/g Quellvolumen in Wasser: 3,9 ml/g Mittlerer Partikeidurchmesser: ~ 0,6 mm Spez. Oberfläche: 1,9 m²/g

Beispiel 13b)

g des nach Beispiel 13a) hergestellten Polymeren wird analog zu Beispiel Ib) mit Penicillinacylase in 32 ml Wasser bei pH 63 umgesetzt

Ergebnis:

Enzymatische Aktivität (NIPAB-Test Ausgangslösung 107 U

Überstand und Waschlösungen 60 U Trägerharz nach der Umsetzung

d. s. 22% der Ausgangsaktivität 24 U

Claims (6)

Patentansprüche:

1. Vernetzte Copolymerisate bestehend aus copolymerisierten Einheiten von

A 0,1 bis 30 Gew.-% ^^-monoolefinisch ungesättigten Dicarbonsäureanhydriden mit 4 bis 9 Kohlenstoffatomen,

B 35 bis 90 Gew.-% Di- und/oder PoIy-(Meth)Acryl&ten von Di- und/oder Polyolen und

C 5bis60Gew.-% mindestens eines nicht unter A und B genannten hydrophilen Monomeren,

wobei die Summe der Prozentgehalte A bis C 100 beträgt und wobei die vernetzten Copolymerisate Schüttvolumina von 1,4 bis 30,0 ml/g und spezifische Oberflächen von 0,1 bis 500 m²/g besitzen und nach der Verseifung der Anhydridgruppen 0,02 bis 11 Milliäquivalente Säure pro Gramm enthalten.

2. Verfahren zur Herstellung von Copolymerisaten gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man — bezogen auf Gesamtmonomere —

A 0,1 bis 50 Gew.-% «^-monoolefinisch ungesättigte Dicarbonsäureanhydride mit 4 bis 9 Kohlenstoffatomen,

B 35 bis 90 Gew.-% Di- und/oder PoIy-(Meth)Acrylate von Di- und/oder Polyolen und

C 5 bis 60 Gew.-% mindestens eines hydrophilen Monomeren

— die Summe der Prozentgehalte A bis C beträgt 100 — nach der Methode der Fällungspolymerisation oder der Perlpolymerisation in Lösungsmitteln oder Lösungsmittelgemischen, die gegen Anhydridgruppen inert sind, bei Temperaturen von 20 bis 200° C in Gegenwart Radikale bildender Verbindungen polymerisiert

3. Verwendung der Copolymerisate gemäß Anspruch 1 zur Fixierung von Substanzen, die mit den Anhydridgruppen der Copolymerisate reagieren können.

4. Verwendung der Copolymerisate gemäß Anspruch 1 zur Fixierung von Proteinen.

5. Verwendung der Copolymerisate gemäß Anspruch 1 zur Fixierung von Enzymen.

6. Verwendung der Copolymerisate gemäß Anspruch 1 zur Fixierung von Penicillinacylase.