KR20100072171A - 이. 콜라이 ｂｌ 21 ｃｃｍ 7394에서 발현된 아크로모박터 종 ｃｃｍ 4824 유래의 고정화된 재조합 페니실린 아실라아제 촉매의 제조방법 및 베타-락탐 항생제의 합성을 위한 이의 용도 - Google Patents

이. 콜라이 ｂｌ 21 ｃｃｍ 7394에서 발현된 아크로모박터 종 ｃｃｍ 4824 유래의 고정화된 재조합 페니실린 아실라아제 촉매의 제조방법 및 베타-락탐 항생제의 합성을 위한 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 재조합 플라스미드 pKX1P1를 갖는 재조합 균주 이. 콜라이(E. coli) BL21 CCM 7394에서 발현된 아크로모박터 종(Achromobacter sp) CCM 4824 유래의 페니실린 아실라아제(PA)의 분리 및 항생제의 산업적 합성에 유용한 바이오촉매(biocatalyst)로의 PA의 가공을 개시한다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 바이오촉매로서 재조합 이. 콜라이(E. coli) BL21 CCM 7394로부터 유래된 PA에 의해 촉매화되는, 활성화된 아실 공여자(아목시실린 및 세파드록실을 위하여는 D-p-히드록시페닐글라이신 메틸 에스테르 또는 아마이드; 암피실린 및 세팔렉신을 위하여는 D-페닐글라이신 메틸 에스테르 또는 아마이드) 및 친핵체(6-APA 또는 7-ADCA)로 구성된 반응 혼합물에서 반-합성 β-락탐 항생제의 합성을 개시한다.

Description

이. 콜라이 ＢＬ 21 ＣＣＭ 7394에서 발현된 아크로모박터 종 ＣＣＭ 4824 유래의 고정화된 재조합 페니실린 아실라아제 촉매의 제조방법 및 베타-락탐 항생제의 합성을 위한 이의 용도{PROCESS FOR THE PREPARATION OF IMMOBILIZED RECOMBINANT PENICILLIN ACYLASE CATALYST FROM ACHROMOBACTER SP. CCM 4824 EXPRESSED IN E. COLI BL 21 CCM 7394 AND ITS USE FOR THE SYNTHESIS OF BETA-LACTAM ANTIBIOTICS}
본 발명은 재조합 플라스미드 pKX1P1를 갖는 재조합 균주 이. 콜라이(E. coli) BL21 CCM 7394에서 발현된 아크로모박터 종(Achromobacter sp) CCM 4824 유래의 페니실린 아실라아제(PA)의 분리 및 항생제의 산업적 합성에 유용한 바이오촉매(biocatalyst)로의 PA의 가공에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 바이오촉매로서 재조합 이. 콜라이(E. coli) BL21 CCM 7394로부터 유래된 PA에 의해 촉매화되는, 활성화된 아실 공여자(아목시실린 및 세파드록실을 위하여는 D-p-히드록시페닐글라이신 메틸 에스테르 또는 아마이드; 암피실린 및 세팔렉신을 위하여는 D-페닐글라이신 메틸 에스테르 또는 아마이드) 및 친핵체(6-APA 또는 7-ADCA)로 구성된 반응 혼합물로부터 반-합성 β-락탐 항생제의 합성에 관한 것이다.
수십년 동안, 페니실린 G 아실라아제(E.C.3.5.1.11)가 상업적으로 개발되어 페니실린 G 및 그의 6원환(six member) 변이체인 데아세톡시세팔로스포린 G의 아실기를 가수분해함으로써, β-락탐 항생제의 핵심 구조 단위인 6-아미노페니실란산(6-APA) 및 7-아미노데아세톡시세팔로스포란산(7-ADCA)를 각각 생성하여 왔다.
에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) ATCC 11105 유래의 페니실린 아실라아제의 합성 특성은 단지 중간정도이며, 이는 기질의 생성물로의 불완전한 전환을 야기한다. 유사한 페니실린 아실라아제가 클루이베라 크리오크레센스(Kluyvera cryocrescens) 및 프로비덴시아 렛트게리(Providencia rettgeri)로부터 보고된 바 있으나, 이들 효소들의 합성 능력은 잘 밝혀져 있지 않다. 최근 수년 동안, 변형된 속도론적(kinetic) 성질을 갖는 많은 변이주, 특히 개선된 S/H 비율(본 명세서에서 활성화된 아실 공여자의 가수분해에 대한 항생제의 합성 비율을 S/H로 약칭한다)을 갖는 변이체들이 위치특이적 돌연변이(site directed mutagenesis)에 의해 구축되어 왔다. 그러나, 이들 이. 콜라이(E.coli) PA 변이체들은 원하는 결과를 제공하지 못하였다. 페니실린 아실라아제를 생성하는 것으로 밝혀진 미생물, 예를 들어 아세토박터(Acetobacter), 에어로모나스(Aeromonas), 알카리젠스(Alcaligenes), 아파노클라디움(Aphanocladium), 알카리젠스 피칼리스(Alcaligenes faecalis), 산토모나스 종(Xanthomonas sp.), 프로비덴시아 렛트게리(Providencia rettgeri), 산토모나스 시트리(Xanthomonas citrii), 바실루스 메가테리움(Bacillus megaterium), 이.콜라이(E. coli,), 이중 이.콜라이(E. coli) PA가 가장 통상적으로 사용된다.
이.콜라이(E. coli)에 근거한 발현 시스템의 대부분의 경우에 있어서, 프레프로단백질(preproprotein)은 세포질 공간으로 이송되며, 여기에서 후-전사적(post-translational) 변형을 거쳐 완전히 기능적인 효소가 된다. 이는, 너무 많은 에너지의 소모 없이 각각의 효소가 상대적으로 높은 특이적인 순도를 가지며 세포로부터 유리될 수 있도록 하기 위하여, 세포 파괴의 선택적인 방법의 사용 가능성을 제공한다. 세포의 파괴는 고압 균질화 혹은 비드밀(Beadmill) 중에서의 붕괴(disintegration)와 같은 전통적인 기계적 방법에 의해 수행될 수 있으며, 이중 균질화가 산업적 수준에서 더 자주 사용된다. 선택적으로, 유기 용매가 세포를 파괴하고 또한 생성물을 추출하기 위하여 사용될 수도 있다.
세포 용해(cell lysis) 및 효소의 순도를 증진시키기 위하여 용매들의 조합을 사용하는 보고가 있다. De Leon 등은 2003년 논문에서 재조합 이.콜라이(E. coli)로부터 페니실린 G 아실라아제를 추출하기 위한 다양한 유기 용매의 사용을 보고하였다(A. De Leon, B. Garcia, A. P. Barba de la Rosa, F Villasenor, A.Estada, R.Lopez- Revilla, Process Biochemistry,39:301-305,2003). 그러나, 화학적 용해 방법은 미생물 및 유기 용매에 대한 효소 감수성에 따라 맞춤 개발(custom developed)되어야만 한다.
페니실린 아실라아제는 β-락탐 항생제의 열역학적으로 조절된 합성 뿐만 아니라 속도론적으로 조절된 합성에서 사용될 수 있다. 페니실린 아실라아제는 각각의 β-락탐 핵과 활성화된 아실 공여자의 직접적인 축합에 의해 β-락탐 항생제의 속도론적으로 조절된 합성에 사용된다. 이러한 효소적 방법은 전통적인 화학적 합성과 경쟁적인 것으로 보여지지만, 실제로 중요한 어려움에 직면하고 있으며, 이는 항생제의 전체 수율, 즉 형성되는 항생제 뿐만 아니라 활성화된 아실 공여자의 가수분해를 결정한다(MA.Wegman, U. Heinemann, A.Stloz, F.Van Rantwijk and R.A.Sheldon, Organic Process Res Dev. 4:318-322,2000). β-락탐 항생제의 효소적 합성은 아실 공여자로부터, 혹은 에스테르로부터, 혹은 아마이드 유도체로부터 직접 작용할 수 있다(Kashe V. Enzyme Microbial Technology, 18: 4-16,1986).
첫 번째 경우 즉 열역학적으로 조절된 합성에 있어서, 주요 사안은 반응 평형상태를 생성물 쪽으로 옮기는 것이다. 현재 이는 성공적일 수 없더라도, 이는 이상이고 바람직한 해결책일 것이다.
두 번째 경우 즉 속도론적으로 조절된 합성에 있어서, 항생제의 D-아실 측쇄의 에스테르 형태 혹은 아마이드 형태의 아실 공여자의 활성화된 전구체가 β-락탐 핵과 반응하여, 항생제 뿐만 아니라 알코올 또는 암모늄 및 미반응된 반응물 및 부생성물을 방출한다. 통상, 속도론적으로 조절된 방법에 있어서, 반응을 합성 쪽으로 몰아가기 위하여 아실 공여자가 몰과량(molar excess)으로 사용되며, 이는 상기 방법을 매력적이지 못하게 한다(Luciana R. B. Goncalves, Ruy Sousa, Jr. Roberto, Fernandez-Lafuente, Jose M.Guisan, Raquel L. C. Giordano, Roberto C. Giordano, Biotechnology and Bioengineering 8:6,622-631, 2002).
속도론적으로 조절된 효소적 방법의 주요 사안은 수율, 규모성(scalability), 아실 공여자의 과량 사용으로 인한 공정 경제성이었다. 많은 연구가 이를 개선하는 것을 목적으로 하고 있으며, 이는 공정 최적화, 공-용매의 첨가 또는 기질의 고농도 사용 또는 고정화에 의한 바이오촉매 활성의 개선을 포함한다.
효소 고정화는 효소의 안정성 및 선택성에 있어서 매우 중요한 역할을 하며, 따라서 효소적 방법의 미래를 결정한다. 효소적 방법은 대체로 잘 확립된 화학적 방법과 경쟁하여, 상기 공정 경제성이 매력적이지 못하면 결국 거부되게 된다. 대체적으로, 산업적 효소 고정화는 수년 이래로 꽤 성공적이었으며, 이중 페니실린 G 아실라아제는 제약산업에서 사용되는 성공적인 효소중 하나이다.
통상 공유(covalent) 형태의 고정화를 위하여, 표적 효소는 충분히 정제될 필요가 있으며, 따라서 시간이 증가함에 따라 생산 비용을 증가시킨다. 또한, 특정 성질의 담체 물질이 특정 단백질에 대한 적합성을 예측하기 위하여 연구될 필요가 있으며, 이는 이러한 담체들이 단백질의 2차, 3차 또는 4차 구조를 바꾸는 경향이 있어 이들의 특이적인 사용에 방해가 되기 때문이다.
이는 또한 비-공유적 고정화의 가능성에 대한 연구로 연결된다. 탑재화(entrapment) 및 캡슐화(encapsulation)가 비-공유 고정화의 가장 바람직한 방법이었다.
탑재화는 덜 정제된 형태의 단백질을 필요로 하므로 특히 유리하며, 심지어는 전체 세포가 다양한 담체에 적절히 탑재되어 왔다. 효소 추출물 중의 단백질은, 단백질을 거대 분자 형태를 형성하도록 유도하고 수성 용액 중에서 불용성이게 하는 염, 유기 또는 비-이온성 중합체을 가함으로써 응집(aggregation)될 수 있으며, 이들은 적절한 시약으로 가교화시켜 가교화된 효소 응집체(aggregates)를 제공할 수 있다(A.M.van der Weilen, M.Ottens and A.J.J. Straathof et al, Straathof, A. J. J.Panke, S. and Schmid, A. Current Opin Biotechnol, 13:548-556, 2002 and Cao, L, Van Langen, L. M. Van Rantwijk F et al, Enzyme Microbial Technology, 11: 665-670, 2001). 상기 보고 및 경제적인 관점에 근거하여, 본 발명자들은 아크로모박터 종(Achromobacter sp) CCM 4824 유래의 재조합 PA의 고정화 방법으로서 탑재화를 선택하였다.
고정화를 위한 본 발명에 따른 탑재화 방법은 전체 세포 또는 정제된 단백질을 사용하여, 이는 발현되는 활성의 수율 또는 효소 정제 비용을 절충한다. 본 발명에서 사용되는 효소는, 고체 암모늄 설페이트와 같은 침전제를 서서히 가함으로써 얻어지는 포화 용액 중에서 단백질을 침전시킴으로써 부분적으로 정제된다(Protein Purification and Process Engineering Edited by Roger G Harrison, Marcel Dekker Inc. Publication,141-183,1993).
효소 고정화의 목적은 높은 촉매 활성, 높은 기계적 및 조작 안정성, 재활용 가능성, 효소가 합성 반응에서 사용될 경우 높은 S/H 비율, 및 제조비용을 포함한다.
상기한 방법과 달리, 생성물 수율을 증진시키기 위한 보다 근본적인 접근방법은 개선된 속도론적 특성을 갖는 새로운 바이오촉매의 사용이며, 이는 속도론적으로 조절된 반응이 효소의 속도론적 파라미터에 의해 크게 영향을 받는 것으로 확실히 밝혀졌기 때문이다.
따라서, 현재의 연구 경향은 화학/제약 산업에서 유용한 새로운 다수의 새로운 바이오촉매/ 효소 변이체의 개발로 이어진다. 이러한 새로운 효소(바이오촉매)는, 자연으로부터 생산 미생물의 전통적인 분리, 주위의 유전자 풀(pool)로부터의 재조합 DNA 기술에 의해서 얻어질 수 있으며, 혹은 개선된 합성 능력을 갖는 새로운 군(family)의 페니실린 아실라아제를 야기하는 효소의 방향적 진화(directed evolution)의 방법에 의해 얻어질 수 있다.
따라서, 우수한 합성 능력을 갖는 페니실린 아실라아제의 적용가능성은 β-락탐 합성을 위한 효소적 방법의 개발을 위하여 핵심적인 요소이다. 중요한 속도론적 파라미터 중 하나는 활성화된 아실 공여자의 가수분해에 대한 항생제 합성의 비율(본 명세서에서 S/H로 약칭됨)이다. 상기 비율은 바이오촉매의 핵심적인 성능 파라미터이다.
Sheldon 등의 연구(Sheldon, Van Rantwijk, Van Langen, Wegman, CAO and Janssen Synthesis of β-lactam antibiotics, Edited by AlIe Bruggmk, Kluwer Academic publication: 126-129,2003)는 이. 콜라이(E. coli) 유래 PA의 상이한 조제물들(preparations) 사이에서 합성 활성 뿐만 아니라 가수분해 활성에 있어서 상당한 변화가 존재한다는 것을 밝혔다.
Figure pct00001
상기 예들 중, 폴리-XDA-GA-PA(l,4-디(아미노 메틸) 벤젠 (p-크실렌 디아민, 글루타르알데히드 활성화에 의함) 유래의 마이크로비드)가 β-락탐 합성을 위한 효율적인 촉매인 것이 입증되었다. 암피실린 합성의 경우, 상기 효소 조제물을 사용한 S/H 비율은 85% 전환에서 2.0 이었으며, 이는 자유 효소와 맞먹는 것이며 아셈블라아제 보다 우수하다(80%전환에서 S/H 1.22). 아목시실린 합성의 경우, 상기 동일한 효소는 75 % 전환까지 4.5의 S/H 비율로 잘 수행되었으며, 이는 자유 페니실린 아실라아제에 비해 약간 더 높은 것이다.
아크로모박터 종(Achromobacter sp.) CCM 4824 (원래는 코마모나스 테스토스테로니(Comamonas testosteroni) CCM 4824; Plhackova 등(K. Plhackova et al. Applied Microbial Technology, 32: 507-516, 2001), Skrob et al., Enzyme Microbial Technology 32: 738-744, 2003) 유래의 페니실린 아실라아제(PA; E.C. 3.5.1.11, 페니실린 아미도히드롤라아제)는, 다른 출처로부터의 PA에 비교할 때, 암피실린, 아목시실린, 세팔렉신 및 세파드록실의 효소적 합성에 관하여 더욱 우수한 특성을 나타낸다.
Kyslik 등은 추가의 연구에 관한 체코 특허 출원 PV 2007-82에서, 아크로모박터(Achromobacter) CCM 4824 유래의 상기 페니실린 아실라아제를, 플라스미드 벡터 상에서 재조합 균주 이. 콜라이(E. coli) BL21(pKXlPl) CCM7394에서 클로닝하고 발현시켰다. 상기 유전자의 클로닝 및 발현 방법과 이의 발효 조건은 인도 PCT 출원 제PCT/IN07/00193호 뿐만 아니라 체코 특허 출원 PV - 2007-82에 개시되어 있다. 본 발명은 β-락탐 항생제의 산업적 합성에 있어서 상기한 바와 같은 페니실린 아실라아제의 적용을 포함한다.
따라서, 본 발명은 이. 콜라이(E. coli) BL21(pKXlPl)로부터 페니실린 아실라아제의 추출 및 이어서 개선된 수율로 최종 생성물을 얻기 위한, 새로운 바이오촉매인 페니실린 아실라아제를 사용하여 β-락탐 항생제의 합성을 포함한다.
발명의 목적
본 발명의 주요한 목적은, 바이오촉매로서, 재조합 플라스미드 pKXlPl(CCM 7394)를 갖는 재조합 균주 이. 콜라이(E. coli) BL21에서 발현되는 아크로모박터 종(Achromobacter sp.) CCM 4824 유래의 페니실린 아실라아제(PA)를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 세포 용해 방법, 효소 분리, 효소 안정화에 의한 바이오촉매의 제조 및 β-락탐 항생제의 효율적인 합성을 위한 파라미터의 설계(designing)를 포함한다.
본 발명의 또다른 목적은 고정화된 효소를 사용하여 β-락탐 항생제의 산업적 합성방법을 제공한다.
발명의 요약
본 발명은 아크로모박터 종(Achromobacter sp.) CCM 4824 유래의 페니실린 아실라아제(PA)를 재조합 플라스미드 pKXlPl을 갖는 재조합 균주 이. 콜라이(E. coli) BL21 CCM7394로부터 분리하는 것을 개시하며, 또한 PA를 항생제의 산업적 합성에 유용한 바이오촉매(biocatalyst)로 가공하는 것을 개시한다.
따라서, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) BL21 CCM 7394에서 발현된 아크로모박터 종(Achromobacter sp) CCM 4824 유래의 페니실린 아실라아제 바이오촉매를 사용한 β-락탐 항생제의 합성방법은 다음 단계를 포함한다;
a. 용매 및 세포 투과를 위한 화학 세정제 또는 금속 킬레이트화제를 사용하여, 페니실린 아실라아제를 화학적으로 추출하는 단계;
b. 상기 수용성 효소를 분별 침전 및 크로마토그래피에 의해 정제하는 단계;
c. 상기 효소를 15:1 내지 20:1 비율의 아크릴아마이드 및 N,N'-메틸렌비스아크릴아마이드를 사용하여, -2 내지 2 ℃의 온도에서 고정화(immobilizing)하는 단계;
d. 상기 고정화된 효소를 글루타르알데히드로 가교시켜 안정화하여 100 내지 300 마이크론, 바람직하게는 150 내지 250 마이크론 범위의 입자 크기를 갖는 거친 입자(coarse particles)를 얻는 단계 및
e. 상기 고정화된 페니실린 아실라아제 효소를 사용하여, 친핵체(nucleophile)를 활성화된 아실 공여자(acyl donor)로 효소적으로 아실화시켜 고수율 및 고순도로 β-락탐 항생제를 얻는 단계.
상기 추출에서 사용되는 용매는 톨루엔, 에틸아세테이트, 클로로포름, 및 부틸아세테이트로부터 선택되며, 상기 화학 세정제 또는 금속 킬레이트화제는 EDTA, 세트리미드(cetrimide), 우레아 및 소듐 라우릴 설페이트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 상기 추출 과정은 클로로포름 1 내지 3%w/v 및 소듐 라우릴 설페이트 0.1 내지 0.2%w/v의 효율적인 조합을 사용한다.
상기 추출은 15 내지 35 ℃, 바람직하게는 28 내지 30 ℃의 온도에서, 6 내지 12 시간 동안, pH를 5.5 내지 9.0, 바람직하게는 6.5 내지 7.5의 범위로 유지시킴으로써 수행되어 수용성 효소를 얻는다.
상기 효소의 정제는 암모늄 설페이트를 사용한 처리에 의해 혹은 이온-교환 크로마토그래피를 사용하여 수행될 수 있다.
상기 효소 고정화는 암모늄 설페이트를 포화의 30 내지 70%에 해당하는 양으로 사용하여 전-처리된 응집된(aggregated) 형태의 효소를 포함한다. 상기 응집체(aggregates)는 15:1 내지 20:1 비율의 아크릴아마이드 및 메틸렌 비스-아크릴아마이드를 사용하여 달성된다. 상기 효소 고정화 과정은 인산나트륨 또는 인산칼륨 완충액 중에서, 글루타르알데히드를 2mM 내지 8mM, 바람직하게는 4mM 내지 6mM의 농도로 사용하여 가교화시킴으로써 수행된다.
상기 효소의 고정화는 0.3 내지 0.5%(w/v) 범위의 농도로 글루타르알데히드를 사용한 2차 가교화 단계를 추가로 포함한다.
β-락탐 항생제 제조를 위한 효소적 아실화 방법은, 5.2 내지 7.2 범위의 pH에서, 상기 고정화된 페니실린 아실라아제 효소와 함께 친핵체 및 활성화된 아실 공여자를 포함하는 혼합물을 반응시키는 것을 포함한다. 상기 반응 혼합물의 pH는 산, 바람직하게는 진한 염산을 가함으로써 조절된다.
상기 아실 공여자는 D-p-히드록시페닐글라이신 메틸 에스테르 또는 아마이드 또는 D-페닐글라이신 메틸 에스테르 또는 아마이드로부터 선택되고, 상기 친핵체는 6-아미노페니실란산(6-Aminopenicillianic acid) 또는 7-아미노 데아세톡시세팔로스포란산(7-Amino Deacetoxycephalosporanic acid)으로부터 선택된다.
상기 항생제의 합성은 상기 반응 혼합물의 pH를 낮춤으로써 상기 반응 혼합물로부터 일부의 β-락탐 항생제를 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
β-락탐 항생제인 아목시실린은, 1.2 내지 4.5, 더욱 바람직하게는 1.5 내지 1.8 범위의 몰비로, 6-아미노 페니실란산을 D-히드록시 페닐 글라이신 메틸 에스테르로 아실화시켜 합성된다.
β-락탐 항생제인 암피실린은, 1.2 내지 4.5, 더욱 바람직하게는 1.3 내지 1.7 범위의 몰비로, 6-아미노 페니실란산을 D-페닐 글라이신 메틸 에스테르로 아실화시켜 제조된다.
β-락탐 항생제인 세팔렉신은, 1.2 내지 4.5, 더욱 바람직하게는 1.5 내지 1.7 범위의 몰비로, 7-아미노 데아세톡시 세팔로스포란산을 D-페닐 글라이신 메틸 에스테르로 아실화시켜 제조된다.
본 발명은 또한 유가식(fed-batch mode)으로 아크로모박터(Achromobacter) sp CCM 4824 유래의 PA를 포함하는 유전적으로 변형된 이. 콜라이(E. coli) BL21 CCM 7394의 배양을 개시하며, 또한 본 발명은 세포 용해(cell lysis), 효소 분리, 효소 안정화에 의한 바이오촉매의 제조, 및 바이오촉매로서 아크로모박터 종(Achromobacter sp) CCM 4824 로부터 분리된 바이오촉매로서 고정화된 재조합 페니실린 아실라아제를 사용하여 아목시실린, 암피실린, 세파드록실 및 세팔렉신의 효율적인 합성을 위한 파라미터의 설계(designing)를 포함한다.
상기 페니실린 아실라아제의 고정화 방법은 또한, 고정화된 효소의 합성 능력을 증진시키고 또한 바이오촉매의 안정성을 확보하기 위하여 장기간 동안 증가된 활성을 유지하도록 적합하게 설계되었다.
도 la.(IA/VI)는 FERMASE NA™ 15O을 사용하여 6-APA(친핵체) 및 HPGMeHCl(아실 공여자)로부터 아목시실린 3수화물(AMOX) 합성의 전환 경과를 나타낸다(실시예 8).
도 lb.(IB/VI)는 FERMASE PA™ 15OO을 사용하여 6-APA(친핵체) 및 HPGMeHCl(아실 공여자)로부터 아목시실린 3수화물(AMOX) 합성의 전환 경과를 나타낸다(실시예 8).
도 2a.(IIA/VI)는 FERMASE NA™ 150을 사용하여 6-APA 및 HPGMeHCl로부터 AMOX 합성의 전환 경과 및 AMOX 정제를 나타낸다(실시예 9).
도 2b.(IIB/VI)는 FERMASE NA 150을 사용하여 6-APA 및 HPGMeHCl로부터 AMOX의 pH-조절된 합성의 전환 경과를 나타낸다. 아실 공여자/친핵제 비율 1.49(실시예 10).
도 3.(III/VI)는 FERMASE NA™ 150을 사용하여 6-APA 및 HPGMeHCl로부터 AMOX 합성에 있어서 전환의 시간 경과 및 AMOX 정제를 나타낸다(실시예 11).
도 4.(IV/VI)는 FERMASE NA™ 150을 사용하여 6-APA 및 HPGMeHCl로부터 AMOX의 합성에 있어서 전환의 시간 경과를 나타낸다 - 연기된(postponed) 아실 공여자 첨가에 따른 뱃치 반응(batch reaction)(실시예 13).
도 5a.(VA/VI)는 FERMASE NA 150을 사용하여 6-APA 및 PGMeHCl로부터 암피실린 3수화물(AMP)의 합성에 있어서 전환의 경과를 나타낸다. 아실 공여자/친핵체 비율 1.5(실시예 19).
도 5b.(VB/VI)는 FERMASE NA 150을 사용하여 6-APA 및 PGMeHCl로부터 AMP의 합성에 있어서 전환의 경과를 나타낸다. 아실 공여자/친핵체 비율 1.35 - pH 5.9, 20℃에서의 뱃치 반응(실시예 20).
도 6a.(VIA/VI)는 FERMASE NA 150을 사용하여 7-ADCA 및 PGMeHCl로부터 세팔렉신 1수화물(CEX)의 합성에 있어서 전환의 경과를 나타낸다. 아실 공여자/친핵체 비율 1.5 - pH 6.3, 25℃에서의 뱃치 반응(실시예 21).
도 6b.(VIB/VI)는 FERMASE NA 150을 사용하여 7-ADCA 및 PGMeHCl로부터 CEX의 합성에 있어서 전환의 경과를 나타낸다. 아실 공여자/친핵체 비율 1.34 - pH 6.3, 25℃에서의 뱃치 반응(실시예 22).
본 발명은 상업적으로 중요한 반-합성 β-락탐의 제조를 위한 효소적 방법의 분야에 관한 것이다. 상기 항생제는 가장 많이 사용되는 의약품들 중 하나이며, 이중 반-합성 페니실린 및 세팔로스포린(예를 들어, 암피실리, 아목시실린, 세팔렉신, 세파졸린, 세파드록실) 및 기타 항생제들은 전세계 매출의 60% 이상을 기여한다.
본 발명은 유전적으로 변형된 이. 콜라이(E. coli) BL21 CCM 7394 세포에서 발현되는 아크로모박터 종(Achromobacter sp.) CCM 4824 유래의 재조합 페니실린 아실라아제의 분리를 제공하며, 또한 본 발명은 주로 세포 용해(cell lysis), 효소 분리, 효소 안정화에 의한 바이오촉매의 제조, 및 이. 콜라이(E. coli) CCM 7394로부터 분리된 바이오촉매로서 고정화된 재조합 페니실린 아실라아제를 사용하여 아목시실린, 암피실린, 및 세팔렉신이 효율적인 합성을 위한 파라미터의 설계(designing)를 포함한다. 상기 재조합 균주 CCM 7394의 배양방법은 체코 특허 PV-2007-82에 기술되어 있다.
본 발명에 따라, β-락탐 항생제가 활성화된 아실-공여자(아목시실린 및 세파드록실에 대해서는 D-p-히드록시페닐글라이신 메틸 에스테르 또는 아마이드; 암피실린 및 세팔렉신에 대해서는 D-페닐글라이신 메틸 에스테르 또는 아마이드)와 친핵체(6-APA 또는 7-ADCA)로 이루어진 반응 혼합물로부터 합성되며, 이는 아크로모박터 종(Achromobacter sp.) CCM 4824 유래의 재조합 페니실린 아실라아제에 의해 촉매화된다.
일 구현예에서, 본 발명은, 고압 균질기; 에틸 아세테이트, 톨루엔, 부틸 아세테이트 및 클로로포름과 같은 다양한 용매를 사용한 온화한 화학적 추출과 같은 다양한 방법을 사용하여, 아크로모박터 종(Achromobacter sp.) CCM 4824 유래의 페니실린 아실라아제를 함유하는 이. 콜라이(E. coli) BL21 CCM 7394 세포의 세포 용해 방법을 제공한다. 상이한 용매들을 사용한 용해(lysis)의 정도는 반응 매질로부터 샘플을 주기적으로 꺼내어 측정된다. 용매로 인한 용해(lysis)의 정도는 상등액 샘플 중 AH PenG을 분석하고, 세포 현탁액의 초기 활성과 비교함으로써 측정된다(% 세포 용해). 상기 재조합 균주 CCM 7394의 배양 방법은 체코 특허 PV-2007-82에 기술되어 있다.
시험 결과에 따르면, 클로로포름이 60%의 수율로 가장 적합한 용매인 것으로 입증되었으며, 따라서 추가의 시험은 높은 SAH PenG 로 효소 수율을 최적화하기 위하여 수행되었다. 그 결과를 표 1에 나타낸다.
상기 과정에 따라서, 다양한 농도의 클로로포름을 가하여 화학적 용해를 개시시켰으며, 이어서 효소의 추출을 수행하였다. 2%v/v의 클로로포름 농도에서, 관찰된 세포 용해는, 다른 농도와 비교할 때, 80%이다. 상기 결과를 표 2에 나타낸다.
또한, 세포 용해의 정도를 개선하기 위하여, EDTA(에틸렌디아민 테트라아세트산), 세트리미드(cetrimide), 우레아 및 소듐 라우릴 설페이트로부터 선택된 화학 세정제 및 금속 킬레이트화제와 같은 다른 첨가제를 상기 클로로포름에 가하였으며, 첨가제로서 소듐 라우릴 설페이트의 사용이 용해의 정도를 증진시키는 것으로 관찰되었다. 상기 결과를 표 3에 나타낸다. 상기 반응은 15 내지 35 ℃의 온도 범위에서 편리하게 수행될 수 있다.
또한, 상기 용해된 바이오매스(biomass)는 파괴된 세포로부터 단백질을 분리하기 위하여 12 시간 동안 5 ℃에서 저장된다. 상기 현탁액의 온도를 28 내지 30 ℃로 올리고, 증류수로 희석하고; 또한 2M 아세트산을 사용하여 pH를 5.0으로 조절한다. 현탁액으로부터 산성 단백질의 응고(coagulation)는 폴리에틸렌 이민을 4O ℃에서 1 시간 동안 가함으로써 수행된다. 상기 응고된(flocculated) 물질은 원심분리에 의해 용액으로부터 분리된다. 4N 수산화나트륨을 사용하여, 맑은 상등액의 pH를 7.5로 조절하고, 얻어진 용액을 수용성 효소(SE)로서 지칭한다.
상기 SE 용액의 일부를 5 ℃에서 교반하고, pH를 7.5로 조절한다. 여기에, 고체 암모늄 설페이트를 리터당 390 그램(60% (w/v)의 포화에 해당하는 양)을 20분에 걸쳐 서서히 가하였다. 동일한 온도에서 60분 동안 추가로 교반하였다. 포화된 용액을 12 시간 동안 냉각시키고, 침전된 효소를 5 ℃에서 분리한다. 상기 침전물은 그램당 700 유닛(units)의 AH PenG를 가지며, mg 단백질 당 2 유닛의 특이적 활성을 갖는다.
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 리터당 283.6 그램의 고체 암모늄 설페이트를 미리 냉각시킨 SE(0-1 ℃)에 30분에 걸쳐 가함으로써 효소 페이스트(paste)의 제조방법을 기술한다. 침전을 2시간 동안 진행시키고 원심분리하여 효소 페이스트를 얻었다. 효소의 수율은 74%이었다. 상기에서 얻어진 효소 페이스트를 폴리아크릴아마이드 겔로 고정화하는데 사용하거나 또는 하기한 바와 같이 PA의 정제를 위해 사용하였다.
다른 구현예에서, 본 발명은 이온-교환 크로마토그래피 방법을 사용한 페니실린 아실라아제의 정제 단계를 제공한다. 관능성(functional) 카르복실 기를 갖는 CATEX 상에서의 크로마토그래피, 약 양이온-교환기를 적용하여, 효소 페이스트로부터 정제된 PA를 제조하였으며, 이는 세파비드(Sepabeads) 및 DILBEADS ™와 같은 거대다공성(macroporous) 폴리아크릴레이트 수지 상에서의 고정화에 적합하다. 상기 PA는 이온-교환기에 선택적으로 결합하고, 더 낮은 등전점을 갖는 벌크(bulk) 단백질은 컬럼을 통과하였다. 결합된 PA는 염화칼륨의 구배를 사용하여 컬럼으로부터 회수하였다. 정제된 효소의 용액은 중량비 1 : 2.7로 존재하는 동일한 SAH penG의 두가지 동형체(isoforms)를 포함한다. 상기 정제 후 활성의 총 수율은 45% 이다.
고정화된 효소의 합성 활성을 증진시키고 또한 바이오촉매의 더욱 우수한 안정성을 확보하기 위하여 장기간 동안 증가된 활성을 유지시키기 위하여, 페니실린 아실라아제의 고정화 과정을 또한 적합하게 설계하였다. 상기 고정화 과정은 효소 탑재화(entrapment) 방법을 포함한다. 폴리아크릴아마이드계 중합체가 효소 탑재화를 위해 가장 일반적으로 사용되며, 이는 자유 효소에 대한 유사도에 때문이다. 달성되는 고정화 수율은 단백질 결합의 관점에서 거의 90%이며, 나타나는 활성의 관점에서 거의 60-70% 이다. 폴리아크릴아마이드의 사용에 있어서의 제한점은 중합체의 비-반응성의 성격, 물리적 안정성으로 인한 매트릭스로부터 효소의 유출이며, 또한 큰 기질 분자에 대하여 직면하게 되는 확산 문제(diffusion problem)이다. 최적화된 정도의 가교를 사용함으로써 이러한 제한점들이 극복되었다. 가교화제들 중, 글루타르알데히드는 이중-관능적(bi-functional) 가교제로서, 폴리아크릴아마이드계 겔 탑재화를 위하여 선택된 가교제이다(Protein Immobilisation- Fundamentals and Application, Edited by Richard Taylor, Marcel Dekker Inc Publication, 40:1991).
상기 최적화의 중요한 기준은, 어느 정도의 불활성는 피할 수 없을 지라도, 합성 효소 활성을 유지하는 것이며, 또한 중합체로부터 효소의 유출을 제한하기 위하여 중합된 겔에 기계적 강도를 부여하는 것이다. 상기 겔 탑재화된 효소는, 최종 생성물로서 바이오촉매의 안정성을 더욱 잘 확보하기 위하여 추가적으로 재-가교화시킨다.
침전물 중의 상당량의 비특이적 단백질이 글루타르알데히드와의 더욱 우수한 가교화를 돕도록, 상기 방법을 더욱 적합하게 개선시켰다. 이는 또한 중합 과정을 더욱 촉진시키는데 도움을 준다. 낮은 특이적 활성을 갖는 효소의 사용은 상기 제조방법을 경제적이게 하고 또한 생성물 및 활성의 관점에서 더욱 높은 수율을 갖도록 한다.
상기에서 얻어진 100 그램의 효소 페이스트를 인산나트륨 완충액으로 희석하여 균질화된 용액을 얻는다. 아크릴아마이드 단량체 용액(10 %w/v) 및 N',N'-메틸렌비스아크릴아마이드(0.5 %w/v)를 함유하는 모액으로부터 14.5 ml를 상기 교반된 효소 용액에 5 ℃에서 가하고, 추가로 5분 동안 계속 교반하였다. 상기 반응 혼합물에, 25% (w/v)의 글루타르알데히드 용액 5ml를 가하고, 정확히 8분 동안 교반하였다. 이후, 0.5% (v/v)의 TEMED 용액 및 새롭게 제조된 1.0 % (w/v)의 암모늄 퍼설페이트(ammonium persulfate) 용액을 상기 용액에 가하였다. 중합은 2분 이내에 개시된다.
중합을 완료시킬 목적으로 사용되는 암모늄 퍼설레이트 및 TEMED의 양을 연구하였으며, 그 결과를 표 6에 기술하였다. 완전한 중합을 달성하기 위하여 1:0.6 비율의 암모늄 퍼설레이트 및 TEMED가 가장 우수한 것으로 확인되었다.
두꺼운, 불투명한 중합 혼합물(polymerizing mass)이 얻어졌으며, 이를 미리-냉각시킨 용기(trays)에 붓고, 완전히 중합시킨 후, 30분 동안 인큐베이션하였다. 형성된 겔 응집체(aggregate)를 잘라, #30 메쉬(500 마이크론) 체를 통하여 체로 걸렀다. 얻어진 겔 응집체를 # 50 메취(300 마이크론)을 통하여 물을 사용하여 세척하여 더욱 미세한 입자, 미량의 미-반응된 단량체 및 기타 시약을 제거하였다. 1.2 M 염화나트륨을 사용하여 탑재된 효소의 추가의 세척을 수행하여 미량의 비-결합된 단백질을 제거한다. 가교화를 촉진시키기 위하여, 상기 응집체를 0.5% (v/v)의 글루타르알데히트 용액 중에서 25 ℃에서 30분 동안 교반한다, 재-가교화 후, 미량의 글루타르알데히드를 5 부피의 물로 세척하여 제거한다.
최종적으로, 상기 촉매를 진공 여과하여 과량의 물을 제거하고 500 ppm의 에틸파라벤을 함유하는 pH 7.8의 5OmM 인산나트륨 완충액 중에 보관한다. 최종 생성물의 % 건조 중량은 12-15%의 범위이며, 98%의 입자가 100-300 마이크론의 입자크기 분포를 갖는다.
중량으로서의 수율은 88 내지 92%의 범위이다. 활성으로 표시된 수율(AH PenG = 110 U/g ww; AH PenG = 750 U/g dw)은 고정화를 위해 취해진 활성에 대하여 47%에 해당한다.
상기 활성은 25mM 페니실린 G, pH 8.0의 5OmM 인산나트륨 완충액을 사용하여 37℃에서 알카리 적정에 의해 측정된다. 아목시실린 합성 활성(AS Amox =150U/g dw)은 40 mmoles의 6-APA 및 60 mmoles의 HPGMeHCl을 사용한 반응조건에서, pH 6.3 및 4O℃에서 측정된다. 상기 반응을 30분 동안 수행한 후, 활성 측정을 위한 HPLC 분석을 수행한다.
효소 탑재를 위한 가장 좋은 비율을 확인하기 위하여, 다양한 농도의 아크릴아마이드 및 N',N'-메틸렌 비스아크릴아마이드를 사용하여, 상기 과정을 반복하였다. 가장 좋은 아크릴아마이드 및 N',N'-메틸렌 비스아크릴아마이드의 농도 비는 19:1로 밝혀졌으며, 얻어지는 수율은 92%의 효소 활성을 갖는다. 상기 범위에 대한 시험 결과를 표 5에 나타낸다.
가교화를 위해 사용된 단백질 밀리그램당 1 내지 5 밀리몰로부터 선택된 다양한 농도의 글루타르알데히드를 사용하여 상기 시험을 추가로 계속하였다. 얻어진 결과는 글루타르알데히드의 농도가 증가하면 형성되는 바이오촉매의 강도(strength)가 증가하지만, 활성의 수율은 글루타르알데히드의 농도에 대하여 역으로(inversely) 관련되는 것으로 나타났다. 상기 결과를 표 6에 나타낸다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 25℃ 및 37℃에서 폴리아크릴아마이드 겔 응집체(FERMASE NA™ 150) 및 (FERMASE NA™ 1500)의 가수분해적 활성의 평가를 기술하며, 상기 촉매의 활성은 더 높은 온도에서 거의 두배인 것으로 관찰되었다.
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 FERMASE NA ™ 150 및 FERMASE NA™ 1500을 사용하여, 6-APA(친핵체) 및 HPGMeHCl(아실 공여자)로부터 아목시실린 3수화물의 합성에 관한 것이다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 아실-공여자는 과량으로 사용되어 반응의 역치(threshold)를 생성물 즉 항생제 쪽으로 이동시킨다. 반응물(아실 공여자, 친핵체) 모두가 반응의 초기에 한번에 뱃치-형태의 반응에 가해질 수 있거나(이는 아실 공여자의 낮은 용해도로 인하여 두꺼운 현탁액의 형성을 야기한다), 혹은 아실 공여자를 단계적으로 반응에 가하여 현탁액의 형성을 방지할 수 있다. 후자의 경우에 있어서, 덜-용해성의 생성물(항생제)이 형성될 때까지 반응용액이 맑고, 아실 공여자의 초기 가수분해 속도가 더 낮고, 상기 제조방법이 지속적으로 실시될 수 있다. 아실 공여자 추가의 양 방법이 조합될 수도 있다.
반응 과정에서 pH가 감소되는 경향이 있으므로, 반응 혼합물의 pH를 조절할 필요가 있다. 특정의 최종 pH 6.3이 6-APA의 아목시실린 3수화물로의 최대 전환을 달성하는데 필요하다. 상기 pH는 인산 또는 수산화나트륨 또는 암모니아를 사용하여 조절된다.
조절된 pH 조건에서 FERMASE PA ™ 1500을 사용하여 6-APA(친핵체) 및 HPGMeHCl(아실 공여자)로부터 아목시실린의 합성을 위한 유사한 시험을 수행하였다.
상기 반응은 6-APA의 % 전환과 동시에 아목시실린의 증가에 근거하여 종료된다. 효소는 반응 혼합물로부터 제거되며, 추가의 사용을 위하여 물로 완전히 세척된다.
유사한 방식으로, 다른 β-락탐 항생제들이 아크로모박터(Achromobacter) sp. CCM 4824로부터 얻어진 바이오 촉매로서 재조합 PA를 사용하여 합성된다. 암피실린의 합성을 위해서는 6-APA(친핵체) 및 PGMeHCl(아실 공여자)의 축합; 세파드록실의 합성을 위해서는 7-ADCA(친핵체) 및 HPGMeHCl 에스테르 또는 아마이드(아실 공여자)의 축합; 세팔렉신의 합성을 위해서는 7-ADCA(친핵체) 및 PGMeHCl 에스테르 또는 아마이드(아실 공여자)의 축합.
약어:
AH PenG PenG의 가수분해 활성
SAH PenG mg 단백질 당 나타난 활성
SE 실시예 5에 따라 제조된 수용성 효소
PA 페니실린 아실라아제
PGA 페니실린 G 아실라아제
rPAAs 아크로모박터(Achromobacter) sp. 유래의 재조합 PA
rPGAEc 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) 유래의 재조합 PGA
HPGMeHCl D-p-히드록시페닐글라이신 메틸 에스테르 염산염
PGMeHCl D-페닐글라이신 메틸 에스테르 염산염
HPG D-히드록시 페닐 글라이신
PG D-페닐 글라이신
AAD 활성화된 아실 공여자
Wn 초기 친핵체에 대한 % 전환
AMOX 아목시실린 3수화물
AMP 암피실린 3수화물
CEX 세팔렉신 1수화물
AH AAD 활성화된 아실 공여자의 가수분해 활성
AS Amox AMOX 합성의 활성
AS Amp AMP 합성의 활성
AS Cex CEX 합성의 활성
S/Hinit AS Amox, AS Amp, 또는 AS Cex / AH AAD의 비율
RM 반응 혼합물
cdw 세포 건조 중량
dw 건조 중량
ww 습한 중량(wet weight)
TEMED: N',N,'N,'N'-테트라메틸에틸렌디아민
세포 페이스트(cell paste): 아크로모박터 sp 유래의 PA를 갖는 E.coli BL 21 세포
FERMASE PA ™ 1500: 폴리아크릴아마이드 겔 탑재화된 rPGAEc
FERMASE NA ™ 150: 폴리아크릴아마이드 겔 탑재화된 rPGAAs
RPM 분당 회전수
U 활성도 유닛(U): 37 ℃에서, 정확히 pH 8당, 53mM 페니실린 G K 칼륨염에서, 50 mM 인산나트륨 완충액 환경에서, 0차 속도의 범위내에서, 1 마이크로몰의 6-APA의 형성을 촉매화하는 효소의 양으로 정의됨
바람직한 구현예를 포함하는 하기 실시예는 본 발명의 실시를 설명하기 위하여 제공되며, 나타낸 특정사항들은 예시의 수단 및 본 발명의 바람직한 구현예에 대한 설명적인 논의를 목적으로 제공된 것임이 이해되어야 한다.
실시예:
실시예 1
고압 균질기에 의한 세포 용해(Cell lysis)
아크로모박터 종(Achromobacter sp.) CCM 4824 유래의 PA 활성을 갖는 이. 콜라이(E.coli) BL 21 CCM 7394 세포를 원심분리에 의해 세포 배양액으로부터 세포 페이스트의 형태(샤플스 원심분리(Sharples centrifuge)) 혹은 세포 현탁액의 형태(알파-라발 연속 분리기(Alfa-Laval continuous separator))로 수확하였다. 수확된 균체를 0.02M 인산나트륨 중에 현탁하여 약 5 % (cdw/v) 현탁액을 얻었으며, 현탁액의 pH를 7.0으로 조절하고, 20%w/v 수산화나트륨을 사용하여 상기 값에서 유지시켰다. 8-13℃로 냉각시킨 세포 현탁액(2350 ml, 4.9% cdw/v, 86.5 U/ml의 AH PenG)을 파괴시켰다(균질기 Manton-Gaulin, 40-50 MPa의 압력, 3회 연속 사이클). 각각의 사이클 후에, 균질화물을 8-13℃로 냉각시키고, pH를 7.0으로 조절하였다. 세포 파편 및 바닥(ballast) 단백질의 분획을 다음으로 이루어진 열응고(thermocoagulation) 단계에 의해 제거하였다: 50% 아세트산으로 pH 5.0으로 조절, 응고 세디푸르(flocculant Sedipur) CL 930의 첨가(2-4g/L) 및 1시간 동안 4O℃에서 온도를 유지. 8-13℃로 상기 균질화물의 신속한 냉각 후에, 상기 균질화물을 700 ml H2O로 희석하고, pH를 8.0으로 조절하고(20% 수산화나트륨 용액), 상기 혼합물을 20분 동안 원심분리하였다(베크만 원심분리(Beckman centrifuge), 회전각(angle rotor), 4 X 350 ml, 10,000 rpm). 맑은 효소 용액(2580 ml, 8.7 mg 단백질/ml, 64.8 U/ml의 AH PenG)의 pH를 7.0으로 조절하고, 효소 용액을 -16℃에서 얼렸다. 상기 효소(SAH PenG = 8.4 U/mg 단백질)의 수율은 82% 이었다(파괴 전의 세포 현탁액의 활성도 100%).
실시예 2
A. 온화한 화학적 추출에 의한 효소 추출
본 발명의 다른 구현예에서, 세포 현탁액(1050 ml, 5% cdw/v, 10.2U/ml의 AH PenG)을 0.1M 인산나트륨 완충액(pH 7.5) 중에 2O℃에서 현탁시켰다. pH 탐침(probe), 온도 탐침 및 가변 교반기가 장착된 3-구 유리 반응기 중에서 온화한 화학적 용해(lysis)를 수행하였다. 묽은 수산화암모늄 용액을 사용하여 pH를 7.0으로 조절한 후, 온도를 28℃로 가져왔다. 상기 현탁된 균체에, 톨루엔, 에틸 아세테이트, 클로로포름, 부틸 아세테이트와 같은 용매 1% (v/v)를 가하여 세포 용해를 개시시켰다. 상기 반응을 일정한 온도에서 pH 변화에 대하여 모니터하였다. 샘플을 주기적으로 취하여 세포 용해의 정도를 평가하였다. 상기 반응을 2시간 동안 pH 7.0 및 28℃에서 지속시켰다. 상기 용매로 인한 용해의 정도를 샘플의 상등액 중 AH PenG를 분석하고 세포 현탁액의 초기 활성과 비교함으로써 측정하였다(% 세포 용해, 표 1).
시험 용매 % 세포 용해
1 톨루엔 7.4
2 에틸 아세테이트 25
3 클로로포름 60
4 부틸 아세테이트 33
상기 결과는 클로로포름이 60%의 수율로 가장 좋은 결과를 제공한다는 것을 나타내며, 따라서 이후의 시험은 높은 SAH PenG 로 효소 수율을 최적화하기 위하여 수행하였다.
B. 클로로포름을 사용한 온화한 화학적 추출에 의한 효소 추출
상기한 바와 동일한 과정에 따라, 다양한 농도의 클로로포름을 가하여 화학적 용해 및 이어지는 효소 추출을 개시시켰다.
실시예 클로로포름 농도 (%, v/v) % 세포 용해
A 1 62
B 2 80
C 2.5 74
D 3 45
상기 표 2에 나타낸 바와 같이 2% (v/v)의 농도로 사용된 클로로포름이 최대 용해 정도를 달성하는데 효과적이라는 것이 명백하였다. 더 높은 농도의 클로로포름의 경우에 있어서, 더 낮은 수율은 용매에 의한 효소의 변성에 기인한다.
C. 클로로포름 및 상이한 첨가제들의 혼합물에 의한 효소 추출
상기한 바와 동일한 과정에 따라, 다양한 농도의 화학 세정제 및 금속 킬레이트화제를 클로로포름과 함께 가하여 세포 용해 및 효소 수율을 증진시켰다. EDTA (에틸엔 디아민 테트라아세트산), 세트리미드(Cetrimide) 및 우레아와 같은 물질은 단독으로 혹은 조합하여 세포 용해를 돕는 것으로 알려져 있다. 소듐 라우릴 설페이트의 첨가는 용해의 정도를 증진시킨다. 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
실시예 클로로포름 농도 (%, v/v) 첨가제(0.2% w/v) % 세포 용해
A 2 EDTA 85
B 2 세트리미드 45
C 2 우레아 33
D 2 소듐 라우릴 설페이트 92
실시예 3
효소 농축물의 제조
실시예 1에서와 같이 제조한 350gm의 세포 페이스트를 최종 농도 5% (cdw/v)까지 20 - 25 ℃에서 증류수에 현탁시켰다. 상기 세포 현탁액의 pH를 7.0으로 조절하고, 얼음 냉각시킨 2% (v/v) 클로로포름 및 0.2% (w/v) 소듐 라우릴 설페이트를 가하여 용해를 개시시켰다. 샘플을 총 5시간 동안 주기적으로 취하였다. 파열된 세포로부터 단백질을 분리시키기 위하여, 추가의 가공 전에 용해된 균체를 5℃에서 12시간 동안 추가로 보관하였다. 상기 현탁액의 온도를 28-30℃로 올리고, 증류수로 2배 희석하였다. 2M 아세트산을 사용하여 pH를 5.0으로 조절하였다. 1% (w/v)의 폴리에틸렌 이민을 4O℃에서 1시간 동안 가함으로써 상기 현탁액으로부터 산성 단백질의 응고(coagulation)를 수행하였다. 응고된(flocculated) 물질을 7000rpm에서 원심분리하여 용액으로부터 분리하였다. 4N 수산화나트륨 용액을 사용하여 맑은 상등액의 pH를 7.5로 조절하고, 얻어진 용액을 가용성 효소(SE)로 지칭하였다. 세포 페이스트의 초기 활성에 대한 효소 수율은 90%이었다. 표 4는 제조 과정에 따른 PA 활성의 수율을 나타낸다. 상기 가용성 효소(SE)를 이후 촉매의 제조를 위하여 사용하였다.
추출시간 총 AH PenG(U) 활성도의 수율(%)
세포 페이스트 현탁액 5670 100
1 시간 4535 80
2 시간 5330 94
3 시간 5500 97
5 시간 6297 111
12 시간 6237 110
가용성 효소 5106 90
실시예 4
암모늄 설페이트 처리에 의한 효소 페이스트의 정제
방법 A
실시예 1에서와 같이 제조한 효소 용액(2580 ml, 8.7 mg 단백질/ml, 64,8U/ml의 AH PenG, pH 7.0)을 암모늄 설페이트를 사용한 침전에 의해 추가로 정제하였다. 고체 암모늄 설페이트(283.6 g/L)를 미리-냉각된 효소 용액(0-1℃)에, 30분에 걸쳐 냉각하면서 가하였다. 2시간 동안 침전을 진행시키고, 침전물을 원심분리에 의해 제거하였다. 상기 효소 페이스트를 폴리아크릴아마이드 겔로의 고정화를 위해 혹은 PA의 추가 정제를 위해 사용하였다. 효소의 수율은 74 %이었다(파괴 전의 세포 현탁액의 활성도 100%).
방법 B
실시예 3에서 제조된 SE 일부를 5℃에서 교반하고, pH를 7.5로 조절하였다. 60% (w/v)의 포화에 해당하는, 리터 당 390 grams의 고체 암모늄 설페이트를 20분에 걸쳐 서서히 가하였다.
5℃에서 60분 동안 추가로 교반하고, 상기 포화된 효소 용액을 12시간 동안 냉각시켰다. 7000 rpm으로 5℃에서 30분 동안 원심분리(레미 원심분리(Remi Centrifuge))에 의해 효소 침전물을 분리하였다. 상기 침전물은 그램 당 700 유닛의 AH PenG 및 mg 단백질 당 2 유닛의 특이적 활성을 함유하였다.
방법 C
이온-교환 크로마토그래피에 의한 PA의 정제:
관능성 카르복시기를 갖는 CATEX 상에서의 크로마토그래피, 약 양이온-이온교환기를 적용하여, 세파비드(Sepabeads) 및 DILBEADS™와 같은 거대다공성(macroporous) 폴리아크릴레이트 수지 상에서의 고정화에 적합한, 효소 페이스트로부터 정제된 PA를 제조하였다. 약 양이온-교환기로서, 0.02M 인산나트륨 완충액(pH 7.0)으로 평형화시킨 Fractogel COO- (Merck)를 사용하였다. (실시예 6에서 제조된) 페이스트를 0.1M 인산나트륨 완충액(pH 7.0, 400 ml) 중에 용해시키고, 샘플 및 완충액의 전도도가 동일해 지도록, 0.02M 인산나트륨 완충액(pH 7.0)에 대하여 완전히 투석하였다. 상기 용액을 원심분리하고, 펠렛을 제거하였다. 상등액 중의 AH PenG 은 259 U/ml 이었으며, SAH PenG 는16.8 U/mg 단백질이었다. 상기 용액을 상기 컬럼 상에 적용하고, PA를 상기 이온-교환기에 선택적으로 결합시키고, 더 낮은 등전점을 갖는 벌크(bulk) 단백질을 컬럼을 통하여 통과시켰다. 염화칼륨 구배(0.02 M 인산나트륨 완충액 중 0.0 - 0.14 M 염화칼륨, pH 7.0)을 사용하여 컬럼으로부터 결합된 PA를 회수하였다. 투석된 용액 0.4 l로부터 PA를 분리하기 위하여, 1 l의 충전용적(bedvolume)을 갖는 유리컬럼을 사용하였다. 정제된 효소 용액(1.25 l의 용적, 43.4 U/ml의 AH PenG)은 1 : 2.7의 중량비로 존재하는 동일한 SAH PenG (38.1 및 42.6 U/mg 단백질)의 두개의 동형체(isoforms)를 함유하였다. 상기 정제 단계 후의 활성의 총 수율은 45%이었다.
실시예 5
폴리아크릴아마이드 겔 응집체(aggregates)의 제조:- FERMASE NA™150
방법 A
실시예 3A로부터 얻어진 효소 페이스트를 0.3M 인산나트륨 완충액(pH 7.5)으로 희석하여 75ml의 PA 용액(250 U/ml의 AH PenG)을 얻었다. 상기 용액을 5℃에서 교반하면서 유지시켰다. 10% (w/v)의 아크릴아마이드 단량체 용액 및 0.5% (w/v)의 N',N'-메틸렌비스아크릴아마이드 용액의 14.5ml을 상기 효소 용액에 가하고, 5분 동안 교반하였다. 25% (v/v) 글루타르알데히드 5ml를 가하고, 정확히 8분 동안 교반하였다. 이후, 0.5% (v/v)의 TEMED 용액 및 1.0 % (w/v)의 새롭게 준비한 암모늄 퍼설페이트 용액을 상기 용액에 가하였다. 중합은 2분 이내에 개시되었다.
이 단계에서, 두껍고, 불투명한 중합 혼합물을 미리-냉각시킨 용기(tray)에 붓고, 완전히 중합시키고, 30분 동안 인큐베이션하였다. 형성된 겔 응집체를 잘라내어, #30 메쉬 (500 micron) 체를 통하여 걸렀다. 얻어진 겔 응집체를 # 50 메쉬 (300 micron)를 통하여 물로 세척하여 더 미세한 입자들, 미량의 미-반응 단량체 및 기타 시약들을 제거하였다.
5배의 부피로 준비한 1.2 M 염화나트륨을 사용하여 탑재된(entrapped) 효소의 추가 세척을 수행하여 미량의 비결합 단백질을 제거하였다.
가교를 촉진시키기 위하여, 상기 응집체를 0.5% (v/v)의 글루타르알데히드 용액 중에서 25℃에서 30 분 동안 교반하였다. 재-가교화 후, 미량의 글루타르알데히드를 5배 부피의 물로 세척하여 제거하였다.
최종적으로, 상기 촉매를 진공 여과하여 과량의 물을 제거하고, 500 ppm의 에틸파라벤을 함유하는 5OmM 인산나트륨 완충액 pH 7.8 중에서 보관하였다.
최종 조제물의 건조 중량은 12-15%의 범위이고, 100-300 마이크론 사이에 98% 입자를 갖는 입자크기분포를 가지고 있다.
중량 수율(mass yield)은 88 내지 92 %의 범위이었다. 발현된 활성의 수율(AH PenG = 110 U/g ww; AH PenG = 750 U/g dw)는 고정화를 위하여 취한 활성에 대하여 47%에 해당하였다.
활성은 37℃에서 25mM 페니실린 G 칼륨, 5OmM 인산나트륨 완충액 pH 8.0을 사용한 알카리 적정에 의해 측정하였다. 아목시실린 합성 활성(AS Amox =150U/g dw)은 pH 6.3 및 4O℃에서 40 mmol의 6-APA 및 60 mmol의 HPGMe.HCl을 사용한 반응 조건에서 측정하였다. 상기 반응은 30 분 동안 수행한 후, 이어서 활성 측정을 위하여 HPLC 분석을 수행하였다.
방법 B
실시예 5 방법 A에 기술된 바와 같은 과정을 수행하였으나, 다양한 농도의 아크릴아마이드 및 N,N'-메틸렌비스아크릴아마이드를 사용하였다(표 5). 문헌 보고는 2:1 내기 20:1 범위의 비율로 2개의 단량체의 사용을 제안한다. 상기 변화는 상이한 공극 크기의 겔 매트릭스를 야기하였으며, 이는 단백질 분자를 상이한 정도로 탑재(entap)하게 된다. 또한, 상이한 비율의 아크릴아마이드 및 N,N'-메틸렌비스아크릴아마이드는 공극 크기 및 얻어진 바이오촉매의 촉매활성에 영향을 미친다.
시험 번호 아크릴아마이드의 농도(% w/v) N,N'-메틸렌비스아크릴아마이드의 농도(% w/v) 아크릴아마이드와 N,N'-메틸렌비스아크릴아마이드의 비율 활성의
% 수율
1 10 0.55 18:1 4.2
2 9.5 0.5 19:1 54.4
3 9.5 0.5 18:1 6.0
4 9 0.47 19:1 54
5 8.6 0.57 15:1 36
6 8.5 0.45 19:1 92
7 8.0 0.4 20:1 59
8 8.0 0.5 16:1 24.7
9 7.5 0.45 16:1 29.3
10 7.5 0.55 15:1 50.3
11 7.6 0.4 19:1 70.1
상기 결과에 근거하여, 더욱 우수한 효소 활성을 위하여, 촉매 제조를 위해 사용되는 아크릴아마이드 및 N,N'-메틸렌비스아크릴아마이드의 농도는 각각 8.35% (w/v) 및 0.43% (w/v)이었으며, 이는 19 :1의 비율 (시험 번호 6)에 해당한다.
방법 C.
폴리아크릴아마이드 겔 응집체의 변형된 제조: Fermase NA™150
가교를 위하여 다양한 농도의 글루타르알데히드를 사용한 것을 제외하고는, 8.35% (w/v)의 아크릴아마이드 및 0.43 % (w/v)의 N',N'-메틸렌비스아크릴아마이드를 사용하여 실시예 5 방법 B에서 기술된 바와 같은 과정을 반복하였다. 선택된 농도는 단백질 밀리그램 당 1 내지 5 밀리몰로 변화시켰다. 글루타르알데히드의 최적 농도는 바이오촉매의 강도(strength)에 근거하여 선택하였다. 바이오촉매의 강도(strength)는 바이오촉매에 기계적 스트레스를 가함으로써 측정하였다. 이를 위하여, 물 중의 10 %의 바이오촉매 현탁액을 준비하고, 유리 비드(beads)(5 mm 직경)로 오비탈 교반기(orbital shaker) 중에서 25 ℃에서 70 RPM으로 12 시간 동안 교반하였다. 스트레스 처리 후에, 바이오촉매에 대한 잔류 효소 활성 및 중력 침강 시간(gravitational settling time)을 체크하였다. 그 결과를 표 6에 요약한다.
시험
번호		 글루타르알데히드의 농도(mM) PA 활성
U/d.w		 기계적 스트레스 후의 % 잔류 활성 스트레스 전의 침강 시간(Ts) 스트레스 후의 침강 시간(Ts)
1 1.0 885 60 24 65
2 1.5 880 63 24 40
3 2.5 840 86 21 28
4 3.0 650 97 21 23
5 3.5 425 80 22 29
6 4.0 400 76 22 35
7 4.5 260 70 22 36
8 5.0 245 55 23 40
상대적으로 더 작은 기계적 강도를 갖는 바이오촉매는 더 미세한 입자로 깨지는 경향이 있고, 이러한 더 미세한 입자의 부유성으로 인하여, 침강 시간이 증가한다. 따라서, 침강 시간을 기계적 안정성의 측정치로서 사용한다. 시험 번호 4가 이의 대응하는 것들에 비해 더 낮은 활성을 가졌음에도 불구하고, 그 안정성으로 인하여 추가의 시험을 위한 가장 좋은 조합으로서 선택하였다.
방법 D
중합을 위하여 0.75% - 1.0 % (w/v)의 암모늄 퍼설페이트(Ammonium persulfate) 및 0.5% (v/v) TEMED를 사용하는 것이 문헌(고정화된 시스템의 제조, Ichiro Chibata에 의해 편집, 78-92, 1978)에 의해 제안되었다. 중합을 종료하기 위하여 필요한 시간을 각각의 시험으로 체크하였다. 그 결과는 하기 표 7에서 논의된다.
시험 APS (% w/v) TEMED (% w/v) 중합시간 Ts(s)
9 0.75 0.5 50
10 0.75 0.6 45
11 1.0 0.5 45
12 1.0 0.6 35
실시예 6
폴리아크릴아마이드 겔 응집체(FERMASE NA™ 150)의 평가
이. 콜라이(E.coli) BL21 CCM 7394에서 발현된, 아크로모박터 종(Achromobacter sp.) CCM 4824의 재조합 PA(rPAAs)의 탑재화(entrapment)에 의하여 촉매를 제조하였다. 상기 폴리아크릴아마이드로의 겔 탑재화는 실시예 5에서 기술된 바와 같이 사용하였다.
방법 A
알칼리(alkalimetric) 분석(15 mM 페니실린 G 칼륨, 0.1M 인산나트륨, pH 8.0, 25 ℃에서)을 사용하여 촉매의 가수분해 활성을 측정하였다. 27.5 U/g ww의 AH PenG(13.5 % d.w., 204 U/g dw의 AH PenG)를 갖는 촉매를 합성 시험에서 사용하였다. 또한, 더 높은 온도에서의 알칼리 분석(15 mM 페니실린 G 칼륨, 0.1M 인산나트륨, pH 8.0, 37 ℃에서)을 사용하여 동일한 촉매의 가수분해 활성을 측정하였다: 촉매의 활성은 거의 2배이었다(AH PenG =58 U/g ww, AH PenG = 430 U/g dw).
방법 B
아목시실린 합성 활성 192 U/g dw의 AS Amox 을 다음 반응 조건으로 측정하였다: 300 mmol 6-APA, 700 mmol HPGMe.HCl, pH 6.3, 25 ℃.
아목시실린 합성과정의 반응물을 28℃에서 자동온도조절되는 컬럼 Luna 5μ C18, 150 x 2 mm (Phenomenex)을 사용하여 HPLC 방법으로 측정하였으며, 이동상은 7.5% 메탄올을 함유하는 0.05M 인산나트륨 완충액 pH 3.1이었고, 유속은 0.2 ml/min이었다. 피크를 215 nm에서 모니터하였다.
샘플의 제조: 반응 혼합물의 샘플을 0.05% 소듐 라우릴 설페이트를 함유하는 이동상으로 200 배 희석하고, 14000 rpm으로 10 분 동안 원심분리하여 주입(10 ㎕의 부피)하였다. HPG, 6-APA, HPGMe 및 AMOX의 HPLC 분석에서 체류시간(retention time)은 각각 2.3, 3.2, 5.5 및 7.6 분이었다. 아목시실린 합성의 유닛은 상기 반응 조건 하에서 1 분 당 형성된 아목시실린의 1 마이크로몰이다.
실시예 7.
폴리아크릴아마이드 겔 응집체(FERMASE PA™ 1500)의 제조.
이. 콜라이(E.coli) BL21 CCM 7394에서 발현된 아크로모박터 종(Achromobacter sp.) CCM 4824의 재조합 PA(FERMASE NA™ 150)의 합성 효율을 비교하기 위하여, 유사한 고정화된 조제물을 재조합 이. 콜라이(E.coli) PGA (rPGAEc)로 제조하였다. 촉매는 조성 및 효소 로딩(loading)을 변화시키면서 실시예 6에서와 유사한 방법에 따라 rPGAEc의 탑재화에 의하여 제조하였다. 촉매(15.7 % dw)의 가수분해 활성을 알칼리 분석(15 mM 페니실린 G 칼륨, 0.1M 인산나트륨, pH 8.0, 25℃에서)을 사용하여 측정하였다. 43.6 U/g ww의 AH PenG (278 U/g dw의 AH PenG)를 갖는 촉매를 아목시실린 합성에 사용하였다. 또한, 더 높은 온도에서의 알칼리 분석(15 mM 페니실린 G 칼륨, 0.1M 인산나트륨, pH 8.0, 37 ℃에서)을 사용하여 동일한 촉매의 가수분해 활성을 측정하였다: 촉매의 활성은 거의 2배이었다(AH PenG = 81 U/g ww 혹은 516 U/g dw). 아목시실린 합성 활성 54 U/g dw의 As Amox 를 다음 반응 조건으로 측정하였다: 실시예 6에 기술된 바와 같이 300 mmol 6-APA, 700 mmol HPGMcHCl, pH 6.3, 25 ℃.
실시예 8
FERMASE NA™ 150 및 FERMASE PA™ 1500을 사용하여 6-APA(친핵체) 및 HPGMeHCl(아실 공여자)로부터 아목시실린 3수화물(AMOX)의 합성 - 뱃치 반응(Batch reaction)
바닥에 체(125 μm, 나일론 직물) 및 교반기가 장착된 덮게가 씌워진 반응기를 9.4 ml의 탈염수(demineralised water)(25 ℃), 376 mg의 6-APA(92% 순도, 1.6 mmol의 친핵체)로 채우고, 40% 수산화나트륨을 사용하여 pH를 7.5로 조절하였다. 이후, 766 mg의 HPGMe.HCl(99% 순도, 3.48 mmol의 아실 공여자)를 가하고, 40% 수산화나트륨을 사용하여 pH를 6.3으로 조절하였다. 이후, HPGMe.HCl 결정의 현탁액이 형성되었다. 이어서, 0.6 g (ww) 양의 FERMASE NA™ 150을 상기 반응기로 이송하고, 교반을 시작하고(t=0 분), 온도를 25 ℃에서 유지시켰다. 약 60분 후에, 상기 현탁액의 점도가 약간 감소하였다(HPGMe.HCl 결정이 용해되고, AMOX의 결정이 형성되었다). pH가 6.3으로부터 6.4로 약간 증가되었고, 180번째 분에 20% 인산을 사용하여 pH를 6.3으로 다시 조절하였다.
200 분 후에, 상기 pH는 6.17이었으며, 96.9% Wn의 전환이 도달되었다. 270분 후에, 상기 pH가 5.85로 낮아졌고, 전환은 99.1% Wn이었다. AMOX 합성의 초기 비율(As Amox)은 85 U/g dw 촉매이었으며, HPG 형성의 비율은 27 U/g dw 촉매이었다. 상기 비율 S/Hinit 값은 3.15 이었다. 전환 과정을 도 l.a.(IA/VI)에 나타낸다.
FERMASE PA™ 1500을 사용하여 동일한 시험을 (상기한 바와 같은) 반응기 중에서 수행하였으며, 9.4 ml의 탈염수(25 ℃), 376 mg의 6-APA(92% 순도, 1.6 mmol의 친핵체)로 채우고, 40% 수산화나트륨을 사용하여 pH를 7.5로 조절하였다. 이후, 766 mg의 HPGMeHCl(99% 순도, 3.52 mmol의 아실 공여자)를 가하고, 40% 수산화나트륨을 사용하여 pH를 6.3으로 조절하였다. 이어서, 0.6 g (습한 중량) 양의 FERMASE PA™ 1500을 상기 반응기로 이송하고, 교반을 시작하고(t=0 분), 온도를 25 ℃에서 유지시켰다. pH가 6.3으로부터 6.4로 약간 증가되었고, 160번째 분에 20% 인산을 사용하여 pH를 6.3으로 재조절하였다.
200 분 후에, 상기 pH는 6.2이었으며, 65.1% Wn의 전환이 도달되었다. 270분 후에, 상기 pH가 6.2로 낮아졌고, 전환은 75.6% Wn이었다. AMOX 합성의 초기 비율(As Amox)는 53.7 U/g dw 촉매이었으며, HPG 형성의 비율은 62.3 U/g dw 촉매이었다. 상기 비율 S/Hinit 값은 0.86 이었다. 전환 과정을 도 l.b.(IB/VI)에 나타낸다.
반응물의 최종 잔류 농도는 표 8에 나타낸다.
실시예 9
FERMASE NA™ 150을 사용하여 6-APA 및 HPGMeHCl로부터 AMOX의 합성 및 AMOX 정제
바닥에 체(125 ㎛, 나일론 직물) 및 교반기가 장착된 반응기(250 ml의 용적)를 94 ml의 탈염수(25 ℃), 3.028 g의 6-APA(92% 순도, 12.88 mmole의 친핵체)로 채우고, 40% 수산화나트륨을 사용하여 pH를 7.5로 조절하였다. 이후, 6.964 g의 HPGMeHCl(99% 순도, 32 mmole의 아실 공여자)를 가하고, 40% 수산화나트륨을 사용하여 pH를 6.3으로 조절하였다. 이어서, 6.0 g (ww) 양의 FERMASE NA™ 150을 상기 반응기 내로 이송하고, 교반을 시작하고(t=0 분), 온도를 25 ℃에서 유지시켰다. pH가 서서히 증가하기 시작하였고, 60번째, 80번째, 및 100번째 분에, H3PO4 인산(20%)을 사용하여 pH를 6.3으로 다시 조절하였다. 140분 후에, pH가 6.01이었으며, 96.8% Wn의 전환이 도달되었고, 반응을 종결시켰다. AS Amox 는 167.2 U/g dw 촉매였고, HPG 형성 비율은 55.9 U/g dw 촉매였다. 상기 비율 S/Hinit의 값은 2.99였다. 전환의 경과를 도 2.a.(IIA/VI)에 나타낸다. 반응물의 최종 잔류 농도는 표 8에 나타낸다.
반응 혼합물을 pH 1.8로 산성화하고, 온화한 진공하에서 여과하여 용액을 촉매로부터 분리하였다. 상기 촉매를 소량의 물로 세척하였다. 상기 용액을 진공하에서 셀룰로오스 여과 데스크(desk)를 통하여 여과하여 맑게 하고, 얼음-물 수조에서 냉각시켰다. 상기 맑은 용액의 pH를 4.2로 조절하고, 용액을 16시간 동안 냉장고에 넣고, 아목시실린 3수화물의 결정을 형성하도록 방치하였다. 상기 결정을 나일론 직물 필터(125 ㎛)를 통하여 여과하여 분리하고, 차가운 아세톤(-18 ℃)으로 신속하게 세척하고, 건조하였다. 5.0 g의 분리된 아목시실린 3수화물은 92.5 %의 수율을 나타내었다.
실시예 10
FERMASE NA 150를 사용하여 6-APA 및 HPGMeHCl로부터 AMOX의 pH-조절된 합성. 아실 공여자/친핵체 비율 1.49
실시예 8에서와 유사한 반응기를 82 ml의 탈염수(25 ℃), 5.64 g의 6-APA(92% 순도, 24.0 mmole의 친핵체)로 채우고, 40% 수산화나트륨을 사용하여 pH를 7.5로 조절하였다. 이후, 7.84 g의 HPGMeHCl(99% 순도, 35.66 mmole의 아실 공여자)를 가하고, 40% 수산화나트륨을 사용하여 pH를 6.3으로 조절하였다. 이어서, 18.0 g (ww) 양의 FERMASE NA™ 150을 상기 반응기 내로 이송하고, 교반을 시작하고(t=0 분), 온도를 25 ℃에서 유지시켰다. 반응의 30번째 및 80번째 분에, 인산(20%)을 사용하여 pH를 6.3의 값으로 다시 조절하였다.
240분 후에, pH가 5.65이었으며, 전환은 91.3 % Wn에 도달하였다. AS Amox (0-20 분)은 75.6 U/g dw 촉매였고, HPG 형성 비율은 17.8 U/g dw 촉매였다. 상기 비율 S/Hinit의 값은 4.25였다. 반응물의 최종 잔류 농도는 표 8에 나타낸다. 전환의 경과를 도 2.b.(IIB/VI)에 나타낸다.
실시예 11
FERMASE NA™ 150을 사용하여 6-APA 및 HPGMeHCl로부터 AMOX의 합성 및 AMOX 정제 - 유가식(Fed batch) 반응.
실시예 8에서와 같은 반응기를 188 ml의 탈염수(25 ℃), 6.92 g의 6-APA(92% 순도, 29.44 mmole의 친핵체)로 채우고, 40% 수산화나트륨을 사용하여 pH를 7.5로 조절하였다. 이후, 6.964 g (첫번째 양)의 HPGMeHCl(99% 순도, 31.68 mmole의 아실 공여자)를 가하고, 40% 수산화나트륨을 사용하여 pH를 6.3으로 조절하였다. 상기 용액은 맑았고, HPGMeHCl은 완전히 용해되었다. 이어서, 12.0 g (ww) 양의 FERMASE NA™ 150을 상기 반응기 내로 이송하고, 교반을 시작하고(t=0 분), 온도를 25 ℃에서 유지시켰다. 반응 20분 후에, 6.964 g (두번째 양)의 HPGMeHCl(31.68 mmole)를 가하고, 40% 수산화나트륨을 사용하여 pH를 6.3으로 조절하였다. 반응 40번째 분에, 세번째 양(6.964 g)의 HPGMeHCl(31.68 mmole)를 가하였다. 반응의 경과에 따라 pH가 감소하는 경향이 있어, 60번째, 80번째, 및 110번째 분에 40% 수산화나트륨을 사용하여 pH를 6.3의 값으로 다시 조절하였다.
140분 후에, pH가 5.67로 감소하였고, 전환은 98.7 % Wn에 도달하였다. AMOX 결정화는 반응 40번째 분에 시작되었다. AS Amox (0-20 분)은 123.0 U/g dw 촉매였고, HPG 형성 비율은 20.5 U/g dw 촉매였다. HPGMeHCl의 두번째 양을 가한 후에, 합성 비율은 190.0 U/g dw 촉매로 증가하였고, 3번째 양을 가한 후에는 143.0 U/g dw 이었다. 상기 비율 S/Hinit의 값은 6.0 (0 - 20 분)이었고, 아실 공여자를 두번째 및 세번째 가한 후에는 상기 값은 각각 2.28 및 0.96으로 낮아졌다. 전환의 시간경과를 도 3.(111/VI)에 나타낸다. 반응물의 최종 잔류 농도는 표 8에 나타낸다. 반응의 40번째 분에, AMOX의 침전이 시작되었고, 현탁액은 더욱 점성으로 되었다.
반응혼합물을 2배 희석하고, AMOX의 현탁액을 온화한 진공 및 교반하에서 제거하였다. 최종적으로, 상기 촉매를 소량의 물로 반복 세척하였다. 상기 용적들을 합하여(465 ml), 얼음-물 수조에서 냉각시키고, 10% HCl 염산을 사용하여 pH 1.8로 산성화하였다. AMOX 용액(497 ml)의 pH를 2.2로 다시 조절하였다. 상기 용액을 진공하에서 셀룰로오스 여과 데스크를 통하여 여과하여 맑게 하고, 필터를 물로 세척하였다. 맑은 용액(522 ml)의 pH를 4.2로 조절하고, 16 시간 동안 냉장고 안에서 AMOX 결정이 형성되도록 방치하였다. 상기 결정을 나일론 직물 필터(125 ㎛)를 통하여 여과하여 분리하고, 차가운 아세톤(-18 ℃)으로 신속하게 세척하고, 건조하였다. 10.5 g의 AMOX가 얻었졌으며, 이는 85 %의 몰 수율(molar yield)을 나타낸다. 모액 중의 아목시실린, 촉매, 및 아세톤의 잔류 농도는 각각 최종 생성물의 9.9, 3.1 및 0.6%에 해당한다.
실시예 12
FERMASE NA™ 150을 사용하여 6-APA 및 HPGMeHCl로부터 AMOX의 합성 및 AMOX 정제 - 유가식(Fed batch) 반응.
실시예 11에서와 유사한 반응기를 78 ml의 탈염수(25 ℃), 3.46 g의 6-APA(92% 순도, 14.72 mmole의 친핵체)로 채우고, 40% 수산화나트륨을 사용하여 pH를 7.5로 조절하였다. 이후, 3.482 g의 HPGMeHCl(99% 순도, 15.84 mmole의 아실 공여자)를 가하고, 40% 수산화나트륨을 사용하여 pH를 6.3으로 조절하였다. 상기 기질 용액은 맑았고, HPGMeHCl은 완전히 용해되었다. 이어서, 22.0 g (ww) 양의 FERMASE NA™ 150을 상기 반응기 내로 이송하고, 교반을 시작하고(t=0 분), 온도를 25 ℃에서 유지시켰다. 반응 20분 후에, 3.482 g (두번째 양)의 HPGMeHCl(15.84 mmole)를 가하고, 40% 수산화나트륨을 사용하여 pH를 6.3으로 조절하였다. 반응 40번째 분에, 세번째 양(1.738 g)의 HPGMeHCl(7.92 mmole)를 가하였다. 반응의 경과에 따라 pH가 감소하는 경향이 있어, 50번째 및 80번째 분에 40% 수산화나트륨을 사용하여 pH를 6.3의 값으로 다시 조절하였다. 반응물의 최종 잔류 농도는 표 8에 나타낸다. 70분 후에, pH가 5.67로 감소하였고, 전환은 98.1 % Wn에 도달하였다. AS Amox (0-20 분)은 71.3 U/g dw 촉매였고, HPG 형성 비율은 23.5 U/g dw 촉매였다. HPGMeHCl의 두번째 양을 가한 후에, 합성 비율은 121.2 U/g dw 촉매로 증가하였고, 3번째 양을 가한 후에는 37.2 U/g dw으로 감소하였다. 비율 S/Hinit의 값은 3.0 (0 - 20 분)이었고, 아실 공여자를 두번째 및 세번째 가한 후에는 상기 값은 각각 2.8 및 0.47로 낮아졌다. 반응 20분에, AMOX의 침전이 시작되었고, 현탁액은 더욱 점성으로 되었다.
생성물을 2배 희석하고, AMOX을 실시예 11과 유사한 방법으로 분리하였다. 5.1 g의 AMOX가 얻었졌으며, 이는 82.6 %의 수율을 나타낸다.
실시예 13
FERMASE NA™ 150을 사용하여 6-APA 및 HPGMeHCl로부터 AMOX의 합성 - 지연된 아실 공여자 첨가에 따른 뱃치 반응
실시예 9에서와 유사한 반응기를 94 ml의 탈염수(25 ℃), 3.46 g의 6-APA(92% 순도, 14.72 mmole의 친핵체)로 채우고, 40% NaOH를 사용하여 pH를 7.5로 조절하였다. 이후, 6.094 g의 HPGMeHCl(99% 순도, 27.72 mmole의 아실 공여자)를 가하고, 40% 수산화나트륨을 사용하여 pH를 6.3으로 조절하였다. 상기 혼합물은 HPGMe.HCl의 결정의 형성으로 인하여 탁하게(turbid) 되었다. 이어서, 6.0 g (ww) 양의 FERMASE NA™ 150을 상기 반응기 내로 이송하고, 교반을 시작하고(t=0 분), 온도를 25 ℃에서 유지시켰다. 반응 60분 후에, 1.567 g (두번째 양)의 HPGMe.HCl(99% 순도, 7.13 mmole)를 가하고, 40% 수산화나트륨을 사용하여 pH를 6.3으로 조절하였다. 반응의 경과에 따라 pH가 감소하는 경향이 있어, 90번째 분에 40% 수산화나트륨을 사용하여 pH를 6.3의 값으로 다시 조절하였다.
160분 후에, pH가 6.32이었고, 전환은 96.6 % w.r.n.에 도달하였다. AS Amox (0-20 분)은 124.8 U/g dw 촉매였고, HPG 형성 비율은 30.2 U/g dw이었다. HPGMeHCl의 두번째 양을 가한 후에, 합성 비율은 190.0 U/g dw 촉매로 증가하였다. 비율 S/Hinit의 값은 6.0 (0 - 20 분)이었고, 아실 공여자를 두번째 가한 후에는 상기 값은 2.28 이었다. 전환의 시간경과를 도 4(IV/VI)에 나타낸다. 반응물의 최종 잔류 농도는 표 8에 나타낸다. 생성물을 2배 희석하고, AMOX을 실시예 11과 유사한 방법으로 분리하였다. 5.2 g의 AMOX가 얻었졌으며, 이는 84.2 %의 수율을 나타낸다.
아목시실린 합성 - 결과 요약
실시예 RM
용적		 6-APA
(순도 92%)
초기		 HPGMeHCl/6-APA 몰비율
 촉매 최종반응시간 전환율 6-APA잔류 HPGMe잔류 HPG
잔류		 분리된 Amox 수율
번호 (ml) (g) 초기 합계 (g ww) 6-APA의 U1)/g (U1)/ml) (분) (%) (mM) (mM) (mM) (g) (%)
8 10 0.376 2.18 2.18 0.6 191 6.6 270 99.1 1.4 73 106 - -
8 10 0.376 2.18 2.18 0.6 191 6.6 270 75.6 39.0 97 144 - -
9 100 3.028 2.46 2.46 6.0 237 6.6 140 96.8 4.2 59 97 5.0 92.5
10 100 5.64 1.49 1.49 18.0 382 19.8 240 91.3 19.1 55 61 - -
11 200 6.92 1.08 3.23 12.0 207 6.6 140 98.7 1.9 130 136 10.5 85.0
12 100 3.46 1.08 2.69 22.0 760 24.2 70 98.1 2.8 76 108 5.1 82.6
13 100 3.46 1.88 2.37 6.0 207 6.6 160 96.6 5.0 85 102 5.2 84.2
1) AH PenG = 110 U/g ww; 750 U/g dw; pH 8, 37 ℃
실시예 14
FERMASE NA 150을 사용하여 6-APA 및 HPGMeHCl로부터 AMOX의 규모증대(Scale-up): 400 ml의 규모
400 ml의 작업용적(working volume)을 갖는 1000 ml의 덮게가 씌워진 원통형 유리 반응기로서 끝부분이 3개의 용기(ports)로 끼워진 반응기를 사용하여 효소 커플링을 수행하였다. 3개의 로브 패들(lobe paddle) 형 임펠러에 의해, 가변 속도 조절로 혼합을 수행하였다. 상기 반응은 300 +/-5 RPM의 고정된 교반에서 수행되었다.
80 mmoles에 해당하는 6.9 g의 6-APA 및 320 mmoles에 해당하는 27.84 g의 HPGMeHCl을 상기 반응기 중에서, 1:1 몰 암모니아를 사용하여 pH를 6.4 내지 7.4 사이로 조절하여 차례로 용해될 때까지, 교반하였다. 최종 pH를 6.3으로 조절하고 부피를 400 ml로 조절한 후, FERMASE NA™ 150을 가하여 합성 반응을 개시시켰다. 투입된 효소는 본 명세서의 다른 곳에서 언급한 바와 같이 β-락탐 핵의 그램 당 644 유닛의 AH PenG 의 로딩(loading)에 해당하였다.
효소 커플링은 28℃에서 수행하였고, 반응 전체적으로 pH를 모니터하였다. 일정한 간격으로 샘플을 취하여, HPLC로 분석하였다. AMOX의 동시적인(concomitant) 증가와 함께 6-APA의 % 전환에 근거하여 반응을 종료하였다. 반응혼합물로부터 효소를 제거하고, 모든 침전물이 효소로부터 세척될 때까지 50 ml의 물로 3회 세척하였다. 상기 효소는 추가의 사용을 위하여 5℃에서 보관하였다. 고정화된 효소의 제거 후에, 상기 용액의 pH를 2로 조절하고, 맑은 용액을 여과지를 통하여 여과한 다음, 상기 용액을 5℃로 냉각하고, pH를 6.3으로 조절하였다. 생겨난 침전물을 여과하고, 남아있는 모액을 pH 8 내지 9로 조절하였다. 두번째 침전물을 여과하였다. 양 침전물을 진공건조하였다. 6-APA의 AMOX로의 전환은 약 92%이었다. AMOX의 HPLC 분석결과, 98.50%의 순도를 나타냈다. AMOX의 몰 수율(molar yield)은 57.6 %이었다.
실시예 15
FERMASE NA™ 150을 사용하여 6-APA 및 HPGMeHCl로부터 AMOX 합성의 규모증대: 50 ml의 규모
50 ml의 작업용적(working volume)을 갖는 250 ml의 덮게가 씌워진 원통형 유리 반응기로서 끝부분이 3개의 용기(ports)로 끼워진 반응기를 사용하여 효소 커플링을 수행하였다. 3개의 로브 패들(lobe paddle) 형 임펠러에 의해, 가변 속도 조절로 혼합을 수행하였다. 상기 반응은 300 +/-5 RPM의 고정된 교반에서 수행되었다.
120 mmoles에 해당하는 1.296 g의 6-APA 및 320 mmoles에 해당하는 3.48 g의 HPGMeHCl을 상기 반응기 중에서, 1:1 M 암모니아를 사용하여 pH를 6.4 내지 7.4 사이로 조절하여 차례로 용해될 때까지, 교반하였다. 최종 pH를 6.3으로 조절하고 부피를 50 ml로 조절한 후, FERMASE NA™ 150을 가하여 합성 반응을 개시시켰다. 투입된 효소는 본 명세서의 다른 곳에서 언급한 바와 같이 β-락탐 핵의 그램 당 178 유닛의 AH PenG 의 로딩(loading)에 해당하였다.
효소 커플링은 28℃에서 수행하였고, 반응 전체적으로 pH를 모니터하였다. 일정한 간격으로 샘플을 취하여, HPLC로 분석하였다. AMOX의 동시적인(concomitant) 증가와 함께 6-APA의 % 전환에 근거하여 반응을 종료하였다. 반응혼합물로부터 효소를 제거하고, 모든 침전물이 효소로부터 세척될 때까지 20 ml의 물로 3회 완전히 세척하였다. 상기 효소는 추가의 사용을 위하여 5℃에서 보관하였다. 고정화된 효소의 제거 후에, 상기 용액을 5℃로 냉각하고, pH를 6.3으로 조절하였다. 생겨난 침전물을 여과하고, 남아있는 모액을 pH 8 내지 9로 조절하였다. 생겨난 침전물을 여과하였다. 양 침전물을 진공건조하였다. 6-APA의 AMOX로의 전환은 약 91.8%이었다. HPLC 분석결과, AMOX의 순도는 98.2%로 나타났다. 투입된 6-APA에 대한 AMOX의 몰 수율(molar yield)은 57 %이었다.
실시예 16
FERMASE NA™ 150을 사용하여 6-APA 및 HPGMeHCl로부터 AMOX 합성의 규모증대 및 AMOX 정제, 50 ml의 규모
50 ml의 작업용적(working volume)을 갖는 250 ml의 덮게가 씌워진 원통형 유리 반응기로서 끝부분이 3개의 용기(ports)로 끼워진 반응기를 사용하여 효소 커플링을 수행하였다. 3개의 로브 패들(lobe paddle) 형 임펠러에 의해, 가변 속도 조절로 혼합을 수행하였다. 상기 반응은 300 +/-5 RPM의 고정된 교반에서 수행되었다.
140 mmoles에 해당하는 1.51 g의 6-APA 및 320 mmoles에 해당하는 3.48 g의 HPGMeHCl을 상기 반응기 중에서, 1:1 M 암모니아를 사용하여 pH를 6.4 내지 7.4 사이로 조절하여 차례로 용해될 때까지, 교반하였다. 최종 pH를 6.3으로 조절하고 부피를 50 ml로 조절한 후, FERMASE NA™ 150을 가하여 합성 반응을 개시시켰다. 투입된 효소는 본 명세서의 다른 곳에서 언급한 바와 같이 β-락탐 핵의 그램 당 178 유닛의 AH PenG 의 로딩(loading)에 해당하였다.
효소 커플링은 28℃에서 수행하였고, 반응 전체적으로 pH를 모니터하였다. 일정한 간격으로 샘플을 취하여, HPLC로 분석하였다. AMOX의 동시적인(concomitant) 증가와 함께 6-APA의 % 전환에 근거하여 반응을 종료하였다. 반응혼합물로부터 효소를 제거하고, 모든 침전물이 효소로부터 세척될 때까지 20 ml의 물로 3회 세척하였다. 상기 효소는 추가의 사용을 위하여 5℃에서 보관하였다. 고정화된 효소의 제거 후에, 상기 용액을 5℃로 냉각하고, pH를 6.3으로 조절하였다. 생겨난 침전물을 여과하고, 남아있는 모액을 pH 8 내지 9로 조절하였다. 두번째로 생겨난 침전물을 또한 여과하였다. 양 침전물을 진공건조하였다. 6-APA의 AMOX로의 전환은 약 94%이었다. HPLC 분석결과, AMOX의 순도는 98.54%로 나타났다. AMOX의 몰 수율(molar yield)은 70%이었다.
실시예 17
FERMASE NA™ 150을 사용하여 6-APA 및 HPGMeHCl로부터 AMOX 합성의 규모증대 및 AMOX 정제: 100 ml의 규모
100 ml의 작업용적(working volume)을 갖는 250 ml의 덮게가 씌워진 원통형 유리 반응기로서 끝부분이 3개의 용기(ports)로 끼워진 반응기를 사용하여 효소 커플링을 수행하였다. 3개의 로브 패들(lobe paddle) 형 임펠러에 의해, 가변 속도 조절로 혼합을 수행하였다. 상기 반응은 300 +/-5 RPM의 고정된 교반에서 수행되었다. 100 mmoles에 해당하는 2.16 g의 6-APA 및 320 mmoles에 해당하는 6.96 g의 HPGMeHCl을 상기 반응기 중에서, 1:1 M 암모니아를 사용하여 pH를 6.4 내지 7.4 사이로 조절하여 차례로 용해될 때까지, 교반하였다. 최종 pH를 6.3으로 조절하고 부피를 100 ml로 조절한 후, FERMASE NA™ 150을 가하여 합성 반응을 개시시켰다. 투입된 효소는 본 명세서의 다른 곳에서 언급한 바와 같이 β-락탐 핵의 그램 당 178 유닛의 AH PenG 의 로딩(loading)에 해당하였다. 효소 커플링은 28℃에서 수행하였고, 반응 전체적으로 pH를 모니터하였다. 일정한 간격으로 샘플을 취하여, HPLC로 분석하였다. AMOX의 동시적인(concomitant) 증가와 함께 6-APA의 % 전환에 근거하여 반응을 종료하였다. 반응혼합물로부터 효소를 제거하고, 모든 침전물이 효소로부터 세척될 때까지 20 ml의 물로 3회 세척하였다. 상기 효소는 추가의 사용을 위하여 5℃에서 보관하였다. 고정화된 효소의 제거 후에, 상기 용액을 5℃로 냉각하고, pH를 6.3으로 조절하였다. 생겨난 침전물을 여과하고, 남아있는 모액을 pH 8 내지 9로 조절하였다. 생겨난 침전물을 여과하였다. 양 침전물을 진공건조하였다. 6-APA의 AMOX로의 전환은 약 95%이었다. HPLC 분석결과, AMOX의 순도는 98.48%로 나타났고, AMOX의 몰 수율(molar yield)은 74.9%이었다.
실시예 18.
FERMASE NA™ 150을 사용하여 6-APA 및 HPGMeHCl로부터 AMOX의 연속합성 및 AMOX 정제: 효소 재활용(recycling)
100 ml의 작업용적(working volume)을 갖는 250 ml의 덮게가 씌워진 원통형 유리 반응기로서 끝부분이 3개의 용기(ports)로 끼워진 반응기를 사용하여 반응을 수행하였다. 3개의 로브 패들(lobe paddle) 형 임펠러에 의해, 가변 속도 조절로 혼합을 수행하였다. 180 mmoles에 해당하는 3.88 g의 6-APA 및 320 mmoles에 해당하는 6.96 g의 HPGMeHCl을 상기 반응기 중에서, 40% 수산화나트륨을 사용하여 pH를 6.4 내지 7.4 사이로 조절하여 차례로 용해될 때까지 교반하였다. 최종 pH를 6.3으로 조절하고 부피를 100 ml로 조절한 후, 15 grams ww의 FERMASE NA™ 150 (AH PenG: 146 IU/g wet, 724 IU/건조 중량, AS Amox : 습한 그램당 45.7 유닛(Units per gram wet), 221 U/건조 중량(gram dryweight))을 가하여 합성 반응을 개시시켰다. 투입된 효소는 본 명세서의 다른 곳에서 언급한 바와 같이 β-락탐 핵의 그램 당 567 유닛의 AH PenG 의 로딩(loading)에 해당하였다.
효소 커플링은 28℃에서 수행하였고, 반응 전체적으로 pH를 모니터하였다. 일정한 간격으로 샘플을 취하여, HPLC로 분석하였다. AMOX의 동시적인(concomitant) 증가와 함께 6-APA의 % 전환에 근거하여 반응을 종료하였다. 반응혼합물로부터 효소를 제거하고, 모든 침전물이 효소로부터 세척될 때까지 50 ml의 물로 3회 세척하였다. 상기 효소는 추가의 사용을 위하여 5℃에서 보관하였다. 고정화된 효소의 제거 후에, 실시예 16에서 기술한 바와 같은 나중단계의(downstream) 과정에 따라 AMOX을 분리하였다. 효소는 다단계 사이클을 위해 재사용되었다(25 사이클의 데이터를 표 9에 나타낸다)
사이클 수 AMOX %HPLC %몰 %전환
번호 그램 순도(건조) 수율 (6-APA)
1 6.31 100.25 85 94.73
2 6.36 98.83 85.5 92.20
3 6.27 100.51 83.88 89.76
4 6.29 102.03 84.6 94.56
5 6.12 101.5 82.32 90.28
6 6.3 101.44 84.74 87.40
7 6.3 100.43 84.74 85.16
8 6.13 101.57 82.45 91.97
9 6.15 97.86 82.73 92.41
10 6.26 98.23 84.21 85.08
11 6.21 99.45 83.53 83.10
12 6.19 98.26 83.26 93.92
13 6 101.27 80.71 81.10
14 5.89 102.81 79.23 71.18
15 5.63 95.4 75.73 83.35
16 5.84 103.5 78.55 87.31
17 5.84 95.57 78.55 86.35
18 5.8 98.55 78 88.45
19 5.8 99.98 78 86.99
20 6.45 99.52 86.76 87.16
21 5.79 100.75 77.8 85.8
22 6.58 99.93 88.51 86.22
23 5.68 100.55 76.4 84.56
24 5.98 100 80.44 67.63
25 6.06 97.78 81.5 64.77
6-APA의 평균 전환은 85.66이었으며, 평균 몰 수율은 82.02이었다.
실시예 19
FERMASE NA 150을 사용하여 6-APA 및 PGMeHCl로부터 암피실린 3수화물(AMP)의 합성. 아실 공여자/친핵체 비율 1.5 - pH 5.9, 20℃에서 뱃치 반응.
바닥에 체((125 μm, 나일론 직물) 및 교반기가 장착된 덮게가 씌워진 반응기를 94 ml의 탈염수(25 ℃), 8.827 g의 6-APA(98% 순도, 40.0 mmol의 친핵체)로 채우고, 40% 수산화나트륨을 사용하여 pH를 7.5로 조절하였다. 이후, 12.473 g의 PGMeHCl(97% 순도, 60.0 mmol의 아실 공여자)를 가하고, 40% 수산화나트륨을 사용하여 pH를 5.9로 조절하였다. 이어서, 6 g w/w 양의 FERMASE NA™ 150을 상기 반응기로 이송하고, 교반을 시작하고(t=0 분), 온도를 20 ℃에서 유지시켰다. 약 70분 후에, AMP의 결정이 형성되었고, 상기 현탁액의 점도가 증가하였다. 반응 과정에서 5.9의 pH 값을 유지하였다.
360 분 후에, 94.9 % Wn의 전환이 도달되었다. AMOX 합성의 초기 비율(As Amp)는 351.1 U/g dw 촉매이었으며, PG 형성의 비율은 56.4 U/g dw 촉매이었다. 상기 비율 S/Hinit 값은 6.0 이었다. 반응물의 최종 잔류농도는 표 9에 나타낸다. 전환 과정을 도 5a(VA/VI)에 나타낸다. 암피실린 합성과정의 반응물을 28℃에서 자동온도조절되는 컬럼 Tessek 5μ C8, 250x4 mm (Tessek, 체코 공화국)을 사용하여 HPLC 방법으로 측정하였으며, 이동상은 리터당 0.5 ml의 트리에틸아민 및 40 % 메탄올을 함유하는 0.05M 인산나트륨 완충액 pH 6.0이었고, 유속은 0.5 ml/min이었다. 피크를 215 nm에서 모니터하였다. 샘플의 제조: 반응 혼합물을 0.05% 소듐 라우릴 설페이트를 함유하는 이동상으로 400 배 희석하고, 원심분리하여(14000 rpm, 10 분) 주입(10 ㎕의 부피)하였다. 6-APA, PG, AMP, 및 PGMeHCl의 체류시간(retention time)은 각각 5.9, 6.85, 8.6 및 15.3 이었다.
반응 혼합물을 30 ml의 물로 희석하고, 진공하에서 체(sieve) 상에서 AMP의 현탁액으로부터 촉매를 분리하였다. 원심분리에 의해 모액으로부터 결정을 분리하였다. 효소 촉매를 모액으로 3회 세척하고, 최종적으로 20ml의 물로 1회 세척하였다. 결정을 모액(세척 용액) 중에 현탁시키고, 20% 염산을 사용하여 pH 1.5로 산성화하여 용해시키고, 용액을 진공하에서 셀룰로오스 여과 데스크(desk)를 통하여 여과하여 맑게 하고, 얼음-물 수조에서 냉각시켰다. 용액의 pH를 4.2로 조절하고, 상기 현탁액을 16시간 동안 냉장고에 보관하였다. 이후, 원심분리에 의해 결정을 분리하고, 차가운 아세톤(-18 ℃)으로 세척하고, 건조하였다. 13.2 g의 분리된 AMP(순도 93 %)는 76%의 수율을 나타내었다.
실시예 20
FERMASE NA 150을 사용하여 6-APA 및 PGMeHCl로부터 AMP의 합성. 아실 공여자/친핵체 비율 1.35 - pH 5.9, 20℃에서 뱃치 반응.
실시예 19에서와 유사한 반응기를 90 ml의 탈염수(25 ℃), 8.827 g의 6-APA(98% 순도, 40 mmol의 친핵체)로 채우고, 40% NaOH를 사용하여 pH를 5.9로 조절하였다. 이후, 11.226 g의 PGMeHCl(97% 순도, 54 mmol의 아실 공여자)를 가하고, 40% 수산화나트륨을 사용하여 pH를 6.3으로 조절하였다. 이어서, 10 g w/w 양의 FERMASE NA™ 150을 상기 반응기로 이송하고, 교반을 시작하고(t=0 분), 온도를 20 ℃에서 유지시켰다. 약 50분 후에, AMP의 결정이 형성되었고, 상기 현탁액의 점도가 증가하였다. 반응 과정에서 5.9의 pH 값을 유지하였다.
360 분 후에, 94.6 % Wn의 전환이 도달되었다. AMP 합성의 초기 비율(As Amp)는 272.2 U/g dw 촉매이었으며, PG 형성의 비율은 25.8 U/g dw 촉매이었다. 상기 비율 S/Hinit 값은 10.55 이었다. 반응물의 최종 잔류농도는 표 9에 나타낸다. 전환 과정을 도.5.b.(VB/VI)에 나타낸다. 생성물은 실시예 19에서와 유사하게 분리하였다. 13.3 g의 분리된 AMP(순도 95.7 %)는 82.5%의 수율을 나타내었다.
표 9.
암피실린 합성 - 결과 요약
Figure pct00002
1) AH PenG = 110 U/g ww; 750 U/g dw; pH 8, 37 ℃
실시예 21
FERMASE NA 150을 사용하여 7-ADCA 및 PGMeHCl로부터 세팔렉신 1수화물(CEX)의 합성. 아실 공여자/친핵체 비율 1.5 - pH 6.3, 25℃에서 뱃치 반응.
실시예 19에서와 유사한 반응기를 91 ml의 탈염수(25 ℃), 5.18 g의 7-ADCA(재결정화됨, 99% 순도, 24.0 mmol의 친핵체)로 채우고, 40% 수산화나트륨을 사용하여 pH를 7.5로 조절하였다. 이후, 7.49 mg의 PGMeHCl(97% 순도, 36.0 mmol의 아실 공여자)를 가하고, 40% 수산화나트륨을 사용하여 pH를 6.3으로 조절하였다. 이어서, 9 g (ww) 양의 FERMASE NA™ 150을 상기 반응기로 이송하고, 교반을 시작하고(t=0 분), 온도를 25 ℃에서 유지시켰다. 약 50분 후에, CEX의 결정이 형성되었고, 상기 현탁액의 점도가 증가하였다. pH가 약간 감소하였고, 6.3의 값을 유지시켰다. 210 분 후에, 91.1% Wn의 전환이 도달되었다. CEX 합성의 초기 비율(As Cpx)는 139 U/g dw 촉매이었으며, PG 형성의 비율은 21.5 U/g dw 촉매이었다. 상기 비율 S/Hinit 값은 6.5 이었다. 반응물의 최종 잔류농도는 표 10에 나타낸다. 전환 과정을 도 6.a.(VIA/VI)에 나타낸다. 세팔렉신 합성과정의 반응물을 28℃에서 자동온도조절되는 컬럼 Tessek 5μ C8, 250x4 mm (Tessek, 체코 공화국)을 사용하여 HPLC 방법으로 측정하였으며, 이동상은 리터당 0.5 ml의 트리에틸아민 및 40 % 메탄올을 함유하는 0.05M 인산나트륨 완충액 pH 6.0이었고, 유속은 0.5 ml/min이었다. 피크를 215 nm에서 모니터하였다.
샘플의 제조: 반응 혼합물을 0.05% 소듐 라우릴 설페이트를 함유하는 이동상으로 200 배 희석하고, 원심분리하여(14000 rpm, 10 분) 주입(5 - 10 ㎕의 부피)하였다. 7-ADCA, PG, CEX, 및 PGMeHCl의 HPLC 분석에 있어서의 체류시간(retention time)은 각각 5.85, 6.85, 8.2, 및 15.3 이었다.
실시예 22
FERMASE NA 150을 사용하여 7-ADCA 및 PGMeHCl로부터 CEX의 합성. 아실 공여자/친핵체 비율 1.34 - pH 6.3, 25℃에서 뱃치 반응.
실시예 19에서와 유사한 반응기를 94 ml의 탈염수(25 ℃), 6.56 g의 7-ADCA(재결정화됨, 99% 순도, 30.3 mmol의 친핵체)로 채우고, 40% 수산화나트륨을 사용하여 pH를 7.5로 조절하였다. 이후, 8.41 g의 PGMeHCl(97% 순도, 40.5 mmol의 아실 공여자)를 가하고, 40% 수산화나트륨을 사용하여 pH를 6.3으로 조절하였다. 이어서, 6 g (ww) 양의 FERMASE NA™ 150을 상기 반응기로 이송하고, 교반을 시작하고(t=0 분), 온도를 25 ℃에서 유지시켰다. 약 70분 후에, CEX의 결정이 형성되었고, 상기 현탁액의 점도가 증가하였다. pH가 약간 감소하였고, 6.3의 값을 유지시켰다. 300 분 후에, 88.5 % Wn의 전환이 도달되었다. CEX 합성의 초기 비율(As Cpx)는 208 U/g dw 촉매였으며, PG 형성의 비율은 18.5 U/g dw 촉매이었다. 상기 비율 S/Hinit 값은 11.3 이었다. 반응물의 최종 잔류농도는 표 10에 나타낸다. 전환 과정을 도 6.b.(VI/VI)에 나타낸다.
세팔렉신 합성 - 결과 요약
실시예 RM
용적		 7-ADCA
초기		 PGMe/6-APA 몰비율 촉매 최종
반응
시간		 전환율 7-ADCA
잔류		 PGMe
잔류		 PG
잔류		 Cpx
최종
번호 ml gm 합계 gww 6-APA의 U1)/g U1)/ml 분 (%) mM mM mM mM
21 100 5.18 1.50 9.0 193 9.9 210 91.1 21.3 29 77 210
22 100 6.56 1.34 6.0 102 6.6 300 88.5 34.3 47 53 260
1) AH PenG = 110 U/g ww; 750 U/g dw; pH 8, 37 ℃

Claims (22)

  1. 하기 단계를 포함하는 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) BL21 CCM 7394에서 발현된 아크로모박터(Achromobacter) sp CCM 4824 유래의 페니실린 아실라아제 바이오촉매를 사용한 β-락탐 항생제의 합성방법:
    f. 용매 및 세포 투과를 위한 화학 세정제 또는 금속 킬레이트화제를 사용하여, 페니실린 아실라아제를 화학적으로 추출하는 단계;
    g. 상기 수용성 효소를 분별 침전 및 크로마토그래피에 의해 정제하는 단계;
    h. 상기 효소를 15:1 내지 20:1 비율의 아크릴아마이드 및 N,N'-메틸렌비스아크릴아마이드를 사용하여, -2 내지 2 ℃의 온도에서 고정화하는 단계;
    i. 상기 고정화된 효소를 글루타르알데히드로 가교시켜 안정화하여 100 내지 300 마이크론, 바람직하게는 150 내지 250 마이크론 범위의 입자 크기를 갖는 거친 입자를 얻는 단계 및
    j. 상기 고정화된 페니실린 아실라아제 효소를 사용하여, 친핵체(nucleophile)를 활성화된 아실 공여자(acyl donor)로 효소적으로 아실화시켜 고수율 및 고순도로 β-락탐 항생제를 얻는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 용매가 톨루엔, 에틸아세테이트, 클로로포름, 및 부틸아세테이트로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 화학 세정제 또는 금속 킬레이트화제가 EDTA, 세트리미드(cetrimide), 우레아 및 소듐 라우릴 설페이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 화학적 추출이 클로로포름 1 내지 3%w/v 및 소듐 라우릴 설페이트 0.1 내지 0.2%w/v의 조합을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 추출이 15 내지 35 ℃, 바람직하게는 28 내지 30 ℃의 온도에서 6 내지 12 시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 추출의 pH를 5.5 내지 9.0, 바람직하게는 6.5 내지 7.5의 범위로 유지시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 정제가 암모늄 설페이트 처리를 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 정제가 이온-교환 크로마토그래피를 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 효소 고정화가 효소를 응집된(aggregated) 형태로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 효소 단백질의 응집화(aggregation)가 암모늄 설페이트를 포화의 30 내지 70%에 해당하는 양으로 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 효소 고정화 과정이 인산나트륨 또는 인산칼륨 완충액 중에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 고정화가 글루타르알데히드를 사용한 가교화 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 글루타르알데히드가 2mM 내지 8mM, 바람직하게는 4mM 내지 6mM의 농도로 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 고정화가 0.3 내지 0.5%(w/v) 범위의 농도로 글루타르알데히드를 사용한 2차 가교화 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 친핵체가 6-아미노페니실란산(6-Aminopenicillianic acid) 또는 7-아미노 데아세톡시세팔로스포란산(7-Amino Deacetoxycephalosporanic acid)으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 아실 공여자가 D-p-히드록시페닐글라이신 메틸 에스테르 또는 아마이드 또는 D-페닐글라이신 메틸 에스테르 또는 아마이드로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 항생제의 합성이 5.2 내지 7.2 범위의 pH에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 항생제의 합성이 상기 반응 혼합물의 pH를 낮춤으로써 상기 반응 혼합물로부터 일부의 β-락탐 항생제를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 반응 혼합물의 pH가 산, 바람직하게는 진한 염산을 가함으로써 조절되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제1항에 있어서, 상기 β-락탐 항생제가, 1.2 내지 4.5, 더욱 바람직하게는 1.5 내지 1.8 범위의 몰비로, 6-아미노 페니실란산을 D-히드록시 페닐 글라이신 메틸 에스테르로 아실화시켜 합성된 아목시실린인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제1항에 있어서, 상기 β-락탐 항생제가, 1.2 내지 4.5, 더욱 바람직하게는 1.3 내지 1.7 범위의 몰비로, 6-아미노 페니실란산을 D-페닐 글라이신 메틸 에스테르로 아실화시켜 제조된 암피실린인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제1항에 있어서, 상기 β-락탐 항생제가, 1.2 내지 4.5, 더욱 바람직하게는 1.5 내지 1.7 범위의 몰비로, 7-아미노 데아세톡시 세팔로스포란산을 D-페닐 글라이신 메틸 에스테르로 아실화시켜 제조된 세팔렉신인 것을 특징으로 하는 방법.
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