CN115975881B - 硒挥发无色杆菌r39及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一株硒挥发无色杆菌R39及其应用。菌株R39为无色杆菌新种—硒挥发无色杆菌(Achromobacter seleniivolatilans)，菌株R39能够将单质硒、亚硒酸盐、硒代胱氨酸、硒甲基硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸等多种硒化合物高效转化为挥发态硒，并建立了生物反应器去除环境硒的方法，可用于含硒废水的处理以及硒污染水体和土壤的生物修复，应用前景广阔。

Description

硒挥发无色杆菌R39及其应用

技术领域

本发明涉及微生物学及硒污染环境修复技术领域，具体地说，涉及一株硒挥发无色杆菌R39及其应用。

背景技术

硒(Selenium)是人和动物必需的微量元素，参与合成谷胱甘肽过氧化物酶等多种含硒酶和含硒蛋白，具有提高免疫力、抗氧化、保护肝脏、肾脏和心血管等多种生物学功能。同时，硒的毒性和活性范围非常窄，过量摄入会导致中毒，包括脱甲、脱发、蹒跚病等。环境中硒含量过高不但影响微生物、藻类、鱼类等的生物多样性，还对当地居民和畜禽存在毒害风险。

煤炭和磷矿开采、冶金以及硒化合物生产加工等工业活动产生的含硒废水，释放到环境中会带来巨大的环境风险，需要处理后才能排放。目前硒污染废水的处理主要有化学絮凝和生物还原两类方法。化学絮凝是利用零价铁、铁盐等和硒氧化物化学共沉淀法去除硒酸盐和亚硒酸盐，但产生的大量含硒化学污泥废弃物需要进一步处理。许多环境微生物能够将硒氧化物还原为毒性较低的单质硒并沉淀去除，但微生物合成的单质硒往往以纳米颗粒(SeNPs)的形式悬浮在水中呈胶体状态，不容易沉淀。而且虽然SeNPs对人体和动物体的毒性大大降低，但对水生生物仍然有着较强的毒性。此外，与化学絮凝法相同，沉淀的SeNPs进入污泥后也成为新的硒污染物难以清除。因此利用化学絮凝和生物还原去除水体中硒的方式并不彻底。

目前发现了一些微生物能够通过甲基化过程将亚硒酸盐和硒酸盐转化为挥发态有机硒(二甲基硒(DMSe)和二甲基二硒(DMDSe)等)，从而将土壤和水体环境中污染的硒去除。例如，大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)(Moreno-Martin，Sanz-Landaluze et al.2021)，芽孢杆菌Bacillus sp.LHVE(Burra，Pradenas et al.2010)，假单胞菌Pseudomonas stutzeri NT-1(Kagami，Narita et al.2013)和Pseudomonastolaasii(Liu，Hedwig et al.2021)，以及寡养单胞菌(Stenotrophomonas bentonitica)(Ruiz-Fresneda，Eswayah et al.2020)等。利用硒挥发菌在生物反应器中将工业废水中的硒化合物快速转化为挥发态硒，产生的挥发硒通过尾气处理装置用硝酸溶液等吸收液吸收后可以再加工为高纯度亚硒酸或纳米硒产品，不仅实现了硒污染废水的处理，还有利于硒资源的回收利用(Otsuka and Yamashita 2020)。

发明内容

本发明的目的是提供一株安全性高、环境风险低的硒挥发无色杆菌(Achromobacter seleniivolatilans)R39及其在硒污染环境修复中的应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供从植物样品的根际土壤中分离纯化获得的一株硒挥发无色杆菌Achromobacter seleniivolatilans R39，该菌现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCC No.25435，保藏日期2022年7月29日。

第二方面，本发明提供含有所述硒挥发无色杆菌R39的菌剂。

第三方面，本发明提供一种生物合成挥发态硒(挥发态有机硒)的方法，所述方法包括：将无色杆菌属(Achromobacter)细菌硒接入含硒的培养基中进行培养。

培养基中的硒为无机硒和/或有机硒。

优选地，所述无色杆菌属细菌为硒挥发无色杆菌(Achromobacterseleniivolatilans)，更优选菌株R39。

进一步地，所述无机硒包括单质硒和/或亚硒酸盐(优选亚硒酸钠)。

所述有机硒可选自硒代胱氨酸、硒甲基硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸等中的至少一种。

进一步地，液体培养基中亚硒酸钠的浓度为8-8000mg/L(以Se计)。

进一步地，固体培养基中亚硒酸钠的浓度为8-6400mg/L(以Se计)。

本发明中，所述挥发态硒可选自二甲基硒、二甲基二硒中的至少一种。

第四方面，本发明提供无色杆菌属细菌在硒污染水体和土壤的生物修复中的应用。

优选地，所述无色杆菌属细菌为硒挥发无色杆菌(Achromobacterseleniivolatilans)，更优选菌株R39。

进一步地，将所述无色杆菌属细菌或其菌剂与硒污染水体和土壤接触，使其中的无机硒和/或有机硒转化为挥发态硒(挥发态有机硒)，以实现生物去除硒的目的。

进一步地，所述应用还包括回收(再利用)所述挥发态硒的步骤。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

无色杆菌属细菌广泛分布于土壤环境中，生物安全性高，且易于培养，本发明提供了利用无色杆菌属细菌转化亚硒酸盐等硒化合物产生挥发态硒的方法，并提供了一株无色杆菌新种——硒挥发无色杆菌(Achromobacter seleniivolatilans)R39菌株，菌株R39能够将单质硒(SeNPs)、亚硒酸盐(Se(IV))、硒代胱氨酸(SeCys2)、硒甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)和硒代蛋氨酸(SeMet)等多种硒化合物高效转化为挥发态硒，可用于含硒废水的处理以及硒污染水体和土壤的生物修复，应用前景广阔。

附图说明

图1为本发明菌株R39的16S rRNA基因进化树。

图2为本发明菌株R39的MLST多基因进化树。

图3为本发明较佳实施例中菌株R39对无机硒(Se(IV)和SeNPs)的挥发效率。

图4为本发明较佳实施例中菌株R39合成挥发硒的鉴定。

图5为本发明较佳实施例中在生物反应器中利用菌株R39去除Se(IV)并回收挥发硒。

图6为本发明较佳实施例中菌株R39对有机硒(SeCys2、MeSeCys和SeMet)的挥发效率。

图7为本发明较佳实施例中无色杆菌属模式菌株A.marplatensis LMG 26219^T和A.kerstersii LMG 3441^T对无机硒(Se(IV)和SeNPs)的挥发效率。

图8为本发明较佳实施例中菌株R39在含亚硒酸钠固体培养基上的生长情况。

图9为本发明较佳实施例中菌株R39在含亚硒酸钠液体培养基中的生长情况。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning：a Laboratory Manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1无色杆菌R39的分离鉴定

从富硒土壤采集植物样品，取其根际土壤5g加95mL无菌生理盐水，25℃、150rpm振荡提取30min，10倍梯度稀释后，取100μL涂布于添加100mM亚硒酸盐的LB平板，28℃培养2d，获得亚硒酸盐耐受菌株，并分离纯化出一株能够挥发亚硒酸盐的菌株R39。

用细菌DNA提取试剂盒(DL111-01，BMamp)提取R39菌株基因组DNA，以27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)为引物扩增16S rRNA基因。将PCR产物纯化后进行测序，测序结果用DNAMAN软件拼接，用BLAST程序与NCBI数据库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中细菌进行相似性比较。结果表明，R39属于无色杆菌属，菌株16S rRNA基因序列(SEQ ID NO：1)与Achromobacter marplatensisLMG 26219^T的一致性达到99.64％。利用Mega软件采用邻接法(neighbour-joiningmethod，Kimura 2-parameter model)绘制的R39菌株16S rRNA基因进化树见图1。

参考(Spilker,Vandamme et al.，2012)建立的无色杆菌属多位点序列分型(multilocus sequence typing，MLST)分析方法，分别扩增R39菌株rpoB(theβ-subunit ofRNA polymerase gene)，pyrG(the CTP synthetase gene)，fusA(the protein synthesiselongation factor gene)和leuS(the leucine tRNA synthetase gene)基因。从无色杆菌属pubMLST数据库(www.pubmlst.org/achromobacter)下载其它模式菌株的MLST多基因序列，用Mega软件采用邻接法(neighbour-joining method，Kimura 2-parameter model)建立进化树如图2所示。R39与Achromobacter pestifer LGM 3431^T(ST-136)和Achromobacter marplatensis LMG 26219^T(ST-208)亲缘关系最近。

使用PacBio Sequel platform和Illumina HiSeq/NovaSeq PE150平台对R39菌株进行全基因组测序后，用JSpeciesWS(https://jspecies.ribohost.com/jspeciesws/#analyse)计算其与无色杆菌属其它模式菌株的基因组平均核苷酸相似度(AverageNucleotide Identity，ANI)(表1)，用GGDC Calculator 3.0(http://ggdc.dsmz.de)计算DNA-DNA杂交值(digital DNA-DNA hybridization，dDDH)(表2)。结果表明，R39与其它无色杆菌模式菌株的ANI和dDDH值均低于种的阈值(ANI＜95％，dDDH＜70％)，说明R39为无色杆菌属的一个新种；且与A.marplatensis LMG 26219^T(ANI＝83.4％，dDDH＝28.6％)和A.kerstersii LMG 3441^T(ANI＝83.2％，dDDH＝28.3％)基因组相似性最高。此外，采用Sherlock标准微生物鉴定系统(version 6.0B；MIDI)测定R39及参比菌株(A.marplatensisLMG 26219^T和A.kerstersii LMG 3441^T)菌体脂肪酸组成特征(表3)。

表3 R39与参比菌株的脂肪酸特征比较

注：数值表示某种脂肪酸含量占总脂肪酸的比例；含量小于1％的微量脂肪酸(TR)数值未列出；＊^＊Summed feature 2包含C_16:1 iso I或C_14:0 3-OH或两者均有；summedfeature 3包含C_16:1 w6c或C_16:1 w7c或两者均有；summed feature 8包含C_18:1 w7c或C_18:1w6c或两者均有。

菌株R39的微生物学特征及生理生化特性：革兰氏阴性菌，在TSA培养基28℃培养2d，菌落直径1-2mm，半透明，表面湿润有光泽，边缘整齐；生长温度范围为4-37℃，生长pH范围为4-11，能够耐受5％的NaCl，兼性厌氧生长；能够还原硝酸盐，过氧化氢酶和氧化酶阳性，DNA酶阴性，不合成吲哚，不能水解淀粉和酪蛋白，不发酵D-葡萄糖，可以利用柠檬酸、癸酸、己二酸和苹果酸，能够产生酯酶(C4)、类脂酯酶(C8)、α-半乳糖苷酶，不合成碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、α/β-葡糖苷酶。

根据测序结果以及上述微生物学特征及生理生化特性，将菌株R39鉴定为无色杆菌属的一个新种，硒挥发无色杆菌(Achromobacter seleniivolatilans sp.nov.)，保藏编号CGMCC No.25435。

实施例2菌株R39对Se(IV)和SeNPs的挥发效率

挑取R39单菌落接种到LB试管(LB培养基：酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，pH7.0-7.2，121℃灭菌20min)，28℃、150rpm摇培12h进行活化，调节OD₆₀₀为0.8，作为种子液。在装有150mL LB培养基的500mL摇瓶中接种1.5mL R39种子液以及相应体积的亚硒酸钠或纳米硒母液(过滤灭菌)，使初始硒浓度分别为5mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L和80mg/L(以Se计)，置于28℃、150rpm振荡培养96h。通过培养96h后菌液总硒的减少量计算硒的挥发率：

硒挥发率(％)＝(菌液总硒_0h-菌液总硒₉₆h)/菌液总硒_0h×100％

原子荧光光谱仪(HG-AFS)硒含量检测结果表明，接种R39培养96h后，培养基中的硒大量减少，并且在培养过程中，Se(IV)和SeNPs摇瓶有浓烈的大蒜味气体产生，表明挥发硒的产生。在5～40mg/L添加量下，R39对Se(IV)和SeNPs两种无机硒的挥发率均达到90％及以上，其中，20mg/L添加量下达到最高，Se(IV)和SeNPs的挥发率分别为93.1％和93.9％；80mg/L添加量下，Se(IV)和SeNPs的挥发率为44.8％和46.4％(图3)。此外，利用GC-MS仪器检测在20mg/L添加量下R39产生的挥发硒种类(用顶空瓶培养后测定顶部气体)，结果见图4，R39将Se(IV)和SeNPs两种无机硒转化为二甲基硒(DMSe)和二甲基二硒(DMDSe)等挥发态硒。

实施例3在生物反应器中利用菌株R39去除Se(IV)并回收挥发硒

挑取R39单菌落接种到LB试管，28℃、150rpm摇培12h活化后，接种1％到60mL LB摇瓶，28℃、150rpm振荡培养10h制备摇瓶种子。在10L发酵罐中投料LB培养基6L，121℃灭菌20min，待温度降至28℃左右，接入60mL摇瓶种子(种子液OD₆₀₀为1.5)和12mL Se(IV)母液(10g/L，以Se计)。控制发酵温度28±0.5℃，搅拌转速150rpm，通气量180L/h，发酵24h。定时取样用原子荧光光谱仪(HG-AFS)测定发酵液的总硒含量。尾气管路连接缓冲瓶和洗气瓶，吸收瓶中装入浓硝酸吸收尾气中的挥发硒。

结果见图5，随着R39的生长，发酵液DO下降，pH上升，发酵液中的Se(IV)被迅速还原为挥发态从发酵液中去除，12h挥发率为31.9％，16h达到81.2％，24h达到94.5％，在含硒水中的去除率达到94.5％，此时菌液中硒残留量仅为5.5％，硒回收装置可以实现83.9％的硒的捕获回收，对挥发态硒的捕获率达到88.8％。

实施例4菌株R39对有机硒(SeCys2、MeSeCys2和SeMet)的挥发效率

实验目的：测定R39对三种硒氨基酸-硒代胱氨酸(SeCys2)、硒甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)和硒代蛋氨酸(SeMet)的挥发效率。

实验方法：挑取R39单菌落接种到LB试管，28℃、150rpm摇培12h活化，调节OD₆₀₀为0.8，作为种子液。在装有50mL LB培养基的150mL摇瓶中接种0.5mL R39种子液以及相应体积的SeCys2、MeSeCys和SeMet溶液(过滤灭菌)，使初始硒浓度为1mg/L(以Se计)，置于28℃、150rpm振荡培养72h。通过菌液硒含量的减少量计算硒的挥发率：

硒挥发率(％)＝(菌液总硒_0h-菌液总硒₇₂h)/菌液总硒_0h×100％

培养过程中三个硒处理均产生了浓烈的大蒜气味，硒含量测定结果表明，接种R39使培养基中的SeCys2、MeSeCys和SeMet大量被挥发。培养72h后，R39对MeSeCys的挥发效率最高(66.8％)，其次是SeCys2(53.1％)，SeMet的挥发率最低(38.6％)。挥发率随时间的变化表明，前24h硒挥发量快速增加，其中18～24h的挥发速率最大，24h后挥发量趋于稳定(图6)。

实施例5无色杆菌属A.kerstersii LMG 3441^T和A.marplatensis LMG 26219^T的硒挥发能力

选取与菌株R39基因组序列相似性最高的两个无色杆菌属模式菌株A.kerstersiiLMG 3441^T和A.marplatensis LMG 26219^T，测定其对亚硒酸盐和纳米硒的挥发能力与R39菌株的差异。结果表明，A.kerstersii LMG 3441^T和A.marplatensis LMG 26219^T也能够挥发亚硒酸盐和纳米硒，但两株菌的硒挥发效率显著低于R39，且A.kerstersii LMG 3441^T低于A.marplatensis LMG 26219^T。在初始20mg/L(以Se计)硒浓度下培养120h后，A.kerstersiiLMG 3441^T对亚硒酸盐和纳米硒的挥发率分别为27.1％和30.1％，仅为R39挥发效率的30％左右；A.marplatensis LMG 26219^T对亚硒酸盐和纳米硒的挥发率分别为70.8％和64.8％，为R39挥发效率的70％左右(图7)。

实施例6菌株R39对亚硒酸盐的耐受能力

1、菌株R39在固体平板上对亚硒酸盐的耐受能力

挑取R39单菌落接种到LB试管，28℃、150rpm摇培12h进行活化，调节OD₆₀₀为0.8，作为种子液。将LB固体培养基融化并冷却至60℃左右，加入无菌亚硒酸钠溶液(过滤灭菌)，轻轻振荡混匀后倒板，制备含0-6400mg/L亚硒酸钠(以Se计)的平板。将R39种子液用无菌生理盐水按照10倍梯度进行逐级稀释后，分别取2.5μL滴加到含硒平板上，无菌风吹干后置于28℃培养48h。菌株R39在含亚硒酸钠固体培养基上的生长情况见图8，结果显示R39能够耐受高达6400mg/L(以Se计)的亚硒酸盐。

2、菌株R39在液体培养基中对亚硒酸盐的耐受能力

挑取R39单菌落接种到LB试管，28℃、150rpm摇培12h进行活化，调节OD₆₀₀为0.8，作为种子液。按照1％接种量接种到LB液体培养基(添加无菌亚硒酸钠溶液至终浓度0-8000mg/L，以Se计)，置于28℃、150rpm振荡培养4d后观察菌体生长情况。结果见图9，菌株R39可以在含有8-8000mg/L亚硒酸钠(以Se计)的液体培养基中生长，能够耐受高达8000mg/L(以Se计)的亚硒酸钠。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (11)

1.硒挥发无色杆菌（Achromobacter seleniivolatilans）R39，其特征在于，保藏编号为CGMCC No. 25435。

2.含有权利要求1所述硒挥发无色杆菌R39的菌剂。

3.生物合成挥发态硒的方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求1所述硒挥发无色杆菌R39接入含硒的培养基中进行培养；

培养基中的硒为无机硒和/或有机硒。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述无机硒为单质硒和/或亚硒酸盐。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述亚硒酸盐为亚硒酸钠。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述有机硒选自硒代胱氨酸、硒甲基硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸中的至少一种。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，液体培养基中亚硒酸钠的浓度为8-8000mg/L，以Se计；

固体培养基中亚硒酸钠的浓度为8-6400 mg/L，以Se计。

8.根据权利要求3-7任一项所述的方法，其特征在于，所述挥发态硒选自二甲基硒、二甲基二硒。

9.权利要求1所述硒挥发无色杆菌R39在硒污染水体和土壤的生物修复中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，将所述硒挥发无色杆菌R39或其菌剂与硒污染水体和土壤接触，使其中的无机硒和/或有机硒转化为挥发态硒，以实现生物去除硒的目的。

11.根据权利要求9或10所述的应用，其特征在于，所述应用还包括回收所述挥发态硒的步骤。