CN1293201C - 一种提高化能自养硫杆菌平板检出率的方法 - Google Patents
一种提高化能自养硫杆菌平板检出率的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1293201C CN1293201C CNB2005100944273A CN200510094427A CN1293201C CN 1293201 C CN1293201 C CN 1293201C CN B2005100944273 A CNB2005100944273 A CN B2005100944273A CN 200510094427 A CN200510094427 A CN 200510094427A CN 1293201 C CN1293201 C CN 1293201C
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- thiobacillus
- liquid
- double
- flat slab
- thiooxidans
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种提高化能自养硫杆菌平板检出率的方法，是一项利用双层平板法培养化能自养硫杆菌的微生物分离技术。用2%的水琼脂作底层平板，上面涂布酵母Rhodotorula sp.R30菌液，再倒入分离硫杆菌的固体培养基作上层平板，涂布一定稀释度的含硫杆菌的悬液，于30℃下倒置培养。氧化硫硫杆菌Thiobacillus thiooxidans菌落在双层平板上检出的时间比单层平板提早9天，检出率提高3～4倍，氧化亚铁硫杆菌Thiobacillus ferrooxidans菌落在双层平板上检出的时间比单层平板提早5～7天，检出率提高2倍多。硫杆菌是严格的化能自养细菌，代时长，生长慢，在单层固体平板上形成菌落往往需要3～4周时间，且检出率较低，利用双层平板分离培养是一种快速有效的分离方法。
Description
一、技术领域
本发明涉及一种提高化能自养硫杆菌平板检出率的方法，是一项利用双层平板法培养化能自养硫杆菌的微生物分离技术，属于环境微生物技术领域。
二、技术背景
化能自养硫杆菌—氧化硫硫杆菌Thiobacillus thiooxidans和氧化亚铁硫杆菌Thiobacillus ferrooxidans，是2种广泛应用于生物湿法冶金、生物淋滤法去除污染介质(污泥、底泥等)中重金属、煤炭生物脱硫的主要细菌，也是导致酸性矿山废水形成的主要微生物。它们均属于中温、好氧、嗜酸，以CO2为唯一碳源的严格化能自养细菌，在培养基中生长比异养菌要缓慢得多。研究发现，在固体平板上，形成菌落时往往需要3～4周时间，且平板的检出率较低，成为严重影响对硫杆菌进行分离纯化及诱变筛选等工作的重要“瓶颈”。作者发明了一种双层平板法大幅度地提高了硫杆菌的检出率，并明显缩短了固体平板的培养时间。
三、发明内容
技术问题
发明一种用于提高化能自养硫杆菌的平板检出率及缩短培养时间的方法。
技术方案
本发明提供的氧化亚铁硫杆菌Thiobacillus ferrooxidans LX5菌株，氧化硫硫杆菌Thiobacillus thiooxidans TS6菌株和酵母菌Rhodotorula sp.R30菌株，是本实验室自己分离的菌株，现于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存。Thiobacillus ferrooxidans LX5和Thiobacillus thiooxidans TS6为严格化能自养菌。两菌株特征为：呈短杆状0.3～0.5×1.0～1.5μm，革兰氏阴性菌，最适温度30～35℃，最适pH2.0～3.0，好氧、嗜酸、专性化能自养菌。其中Thiobacillus ferrooxidans LX5既可以以亚铁为能源物质，也可利用还原性硫为能源物质。但Thiobacillus thiooxidans TS6只能利用还原性硫为能源物质，不能氧化亚铁。酵母菌Rhodotorula sp.R30菌株的单细胞呈卵圆形，直径4.5～5.5μm，芽殖。不产生子囊孢子。菌落呈粘质样，产生粉红色色素，形成荚膜。最适温度30℃，最适pH3.0～7.0。
提高自养化能硫杆菌平板检出率的双层平板法：
1、酵母菌Rhodotorula sp.R30(保藏号：CGMCC No.1147)的培养方法，配制PDA培养基，成分：马铃薯200g，蔗糖或葡萄糖20g，水1000mL，pH自然，121℃，30min灭菌。液体培养条件：从斜面上取酵母菌R30菌苔，接种于PDA液体培养基中，于28～30℃，180r/m摇床上培养2天。
2、氧化硫硫杆菌Thiobacillus thiooxidans TS6(CGMCC NO.0759)的液体培养方法，培养基成分(g/L)：(NH4)2SO4 0.4，KH2PO4 3.0，CaCl2·2H2O 0.25，MgSO4·7H2O0.5，FeSO4·7H2O 0.01，硫粉4.0。用10N硫酸调pH为3.0，培养条件：T.thiooxidans TS6接种在液体培养基中，于28～30℃，180r/m摇床上培养5天，制备TS6菌液。
3、氧化硫硫杆菌Thiobacillus thiooxidans TS6的固体培养基成分：A液：(NH4)2SO42g、KCl 0.1g、K2HPO4 0.25g、MgSO4·7H2O 0.25g、Ca(NO3)2·4H2O 0.01g，溶于500mL蒸馏水中，用10N H2SO4调pH为3.0；B液：22.1g Na2S2O3·5H2O溶于300mL蒸馏水中；C液：30g琼脂粉溶于200mL蒸馏水，A、B和C液分开湿热灭菌后，冷却至60℃，备用。
4、氧化亚铁硫杆菌Thiobacillus ferrooxidans LX5(CGMCC NO.0727)的液体培养方法，培养基成分(g/L)：(NH4)2SO4 3.5；KCl 0.116，K2HPO40.058，Ca(NO3)4H2O0.0168，MgSO4·7H2O 0.583，FeSO4·7H2O 44.22。用10N硫酸调pH2.58，培养条件：T.ferrooxidans LX5接种在液体培养基中，于28～30℃，180r/m摇床上培养5天，制备LX5菌液。
5、氧化亚铁硫杆菌Thiobacillus ferrooxidans LX5的固体培养基成分：：A液：(NH4)2SO4 3.0；KCl 0.10，K2HPO4 0.05，Ca(NO3)4H2O 0.01，MgSO4·7H2O 0.5，溶于300mL蒸馏水中，用10N H2SO4调pH为2.79；B液：4g琼脂糖溶于500mL蒸馏水；C液：22.1g FeSO4·7H2O溶于200mL蒸馏水中(pH为2.59)。A液与B液分别湿热灭菌，C液过滤除菌。冷却至60℃，备用。
6、配制2％的水琼脂：称取2g琼脂溶于100mL蒸馏水中，121℃，30min灭菌。冷却至60℃，备用。
7、制备双层平板：在无菌平皿中倒入60℃的2％水琼脂作底层，待平板凝固后，用无菌吸管取0.1mL的酵母菌R30菌液于底层平板上并均匀涂布，放置1～2h。再分别将用于分离T.thiooxidans TS6或T.ferrooxidans LX5的固体培养基A、B、C液3者混合，迅速倒入混匀，作上层平板，凝固后备用。
8、分别取T.thiooxidans TS6和T.ferrooxidans LX5菌液作稀释，取0.1mL适当稀释的TS6或LX5菌悬液于双层平板上并均匀涂布，放置20～30min后，置30℃培养箱倒置培养。
9、培养11天，计数菌落，T.thiooxidans TS6菌落直径约0.5～1mm，呈淡黄色。T.ferrooxidans LX5菌落直径约1～1.5mm，呈黑褐色。
本发明的技术原理：
用于固体平板法进行硫杆菌分离培养的凝固剂琼脂粉在倒平板前，须经高温灭菌，而灭菌后琼脂粉中水溶性有机物含量大幅度升高，实验发现，灭菌前仅为96.8mgDOC.L-1(折合干琼脂重量的4.52％)，灭菌后达到320.9mg.L-1(折合干琼脂重量的15％)，提高3.3倍。高温灭菌使琼脂产生一定的水解作用，从而产生大量的水溶性有机物。硫杆菌是化能自养细菌，代时长，生长慢，一些低分子量水溶性有机物对它有很大的毒害作用。因此，由于水溶性有机物的存在使得在单层平板上生长的自养菌更趋缓慢。而在双层平板中，底层的异养微生物酵母菌R30，能消耗琼脂粉水解产生的水溶性有机物，减轻了培养基中水溶性有机物对硫杆菌生长的抑制，从而缩短了菌落出现的时间，并提高了菌落的检出率。
有益效果：
本发明用双层平板分离化能自养硫杆菌的方法，具有以下有益效果：
1、本发明使用的酵母菌R30，营养要求简单，易于扩大培养。
2、利用本发明的双层平板法分离化能自养的氧化硫硫杆菌T.thiooxidans TS6，
在双层平板上菌落的检出率比在单层平板上检出率提高3～4倍，检出时间由20天缩短至11天。
3、利用本发明的双层平板法分离化能自养的氧化亚铁硫杆菌T.ferrooxidansLX5，在双层平板上菌落的检出率是在单层平板上检出率的2倍多。检出时间由15天缩短至11天。
四、具体实施方式
实施例1：制革污泥生物淋滤液中氧化硫硫杆菌T.thiooxidans的检测。
(1)采样：取南京农业大学江浦实习基地不同阶段的制革污泥生物淋滤液(pH＝4.8，3.2，2.1)。
(2)pH＝4.8，3.2，2.1的三种制革污泥生物淋滤液分别稀释至10-4，10-5。
(3)酵母菌Rhodotorula sp.R30用PDA液体培养基扩大培养，28～30℃，180r/m摇床培养2天。
(4)配制2％的水琼脂：称取2g琼脂溶于100mL蒸馏水中，121℃，30min灭菌。冷却至60℃，备用。
(5)制备T.thiooxidans的固体培养基成分：A液：(NH4)2SO42g、KCl 0.1g、K2HPO4 0.25g、MgSO4·7H2O 0.25g、Ca(NO3)2·4H2O 0.01g，溶于500mL蒸馏水中，用10N H2SO4调pH为3.0；B液：22.1g Na2S2O3·5H2O溶于300mL蒸馏水中；C液：30g琼脂粉溶于200mL蒸馏水，A、B和C液分开湿热灭菌后，冷却至60℃，备用。
(6)制备双层平板：在无菌平皿中倒入60℃的水琼脂作底层，待平板凝固后，用无菌吸管取0.1mL的酵母菌R30菌液于底层平板并均匀涂布，放置1～2h。再将用于分离T.thiooxidans的固体培养基A、B、C液(60℃)3者混合，迅速倒入混匀，作上层平板，凝固后备用。
(7)分离计数制革污泥生物淋滤液中的氧化硫硫杆菌T.thiooxidans：分别取0.1mL稀释至10-4，10-5的制革污泥生物淋滤液，于双层平板上均匀涂布，放置20～30min后，置30℃培养箱倒置培养，每个样品做三个重复。并做单层平板(无涂布有酵母菌R30菌液的水琼脂层)涂布分离对照。
(8)培养11，20天，分别计数T.thiooxidans在单、双层平板上的菌落数，结果见表1。
表1三种制革污泥生物淋滤液中T.thiooxidans在单、双层平板上的检出效果
| 样品 | 稀释度 | 双层平板 | 单层平板 | ||||
| 培养时间 | 菌落数 | 平均菌落数 | 培养时间 | 菌落数 | 平均菌落数 | ||
| pH 4.8pH 3.2pH 2.1 | 10-410-510-5 | 11天11天11天 | 163，185，176256，278，213352，337，361 | 175249350 | 20天20天20天 | 68，46，4787，60，53130，123，150 | 5467134 |
实施例2：从矿山废水中分离氧化亚铁硫杆菌Thiobacillus ferrooxidans
(1)采样：安徽马鞍山某矿山废水
(2)在100mL矿山废水中加入适量的T.ferrooxidans无机盐培养液，于30℃，180r/m摇床上富集培养7天，然后稀释至10-2，10-2，10-4。
(3)酵母菌Rhodotorula sp.R30用PDA液体培养基扩大培养，28～30℃，180r/m摇床培养2天。
(4)配制2％的水琼脂：同实例1
(5)制备T.ferrooxidans的固体培养基成分：A液：(NH4)2SO43.0；KCl 0.10，K2HPO4 0.05，Ca(NO3)4H2O 0.01，MgSO4·7H2O 0.5，溶于300mL蒸馏水中，用10N H2SO4调pH为2.79；B液：4g琼脂糖溶于500mL蒸馏水；C液：22.1g FeSO4·7H2O溶于200mL蒸馏水中(pH为2.59)。A液与B液分别湿热灭菌，C液过滤除菌。冷却至60℃，备用。
(6)制备双层平板：在无菌平皿中倒入60℃的水琼脂作底层，待平板凝固后，用无菌吸管取0.1mL的酵母菌R30菌液于底层平板并均匀涂布，放置12h。再将用于分离T.ferrooxidans的固体培养基A、B、C液(60℃)3者混合，迅速倒入混匀，作上层平板，凝固后备用。
(7)分离计数矿山废水中的氧化亚铁硫杆菌T.ferrooxidans：分别取0.1mL稀释至10-2，10-3，10-4的矿山废水，于双层平板上均匀涂布，放置20～30min后，置30℃培养箱倒置培养，每个样品做三个重复。并做单层平板(无涂布有R30菌液的水琼脂层)涂布分离对照。
(8)培养8，15天，分别计数T.ferrooxidans在单、双层平板上的菌落数，结果见表2。
表2矿山废水中T.ferrooxidans在单、双层平板上的检出效果
| 样品 | 稀释度 | 双层平板 | 单层平板 | ||||
| 培养时间 | 菌落数 | 平均菌落数 | 培养时间 | 菌落数 | 平均菌落数 | ||
| 矿山废水 | 10-4 | 8天 | 157，143，132 | 144 | 15天 | 48，69，58 | 58 |
Claims (5)
1、一种提高化能自养菌硫杆菌平板检出率的方法，其特征在于：用2％的水琼脂作底层平板，上面涂布异养菌酵母Rhodotorula sp.R30菌液，上面再倒入分离自养菌硫杆菌的固体培养基制成双层平板，再在双层平板上涂布待分离的含化能自养菌硫杆菌的菌液。
2、根据权利要求1所述一种提高化能自养菌平板检出率的方法，其特征在于：用2％的水琼脂作底层平板，上面涂布异养菌酵母Rhodotorula sp.R30，Rhodotorulasp.R30的培养方法，其特征在于用PDA液体培养基扩大培养，于28～30℃和180r/m下摇床培养2天。
3、根据权利要求1所述一种提高化能自养菌平板检出率的方法，其特征在于：在无菌平皿中倒入2％的已溶化并冷却至60℃的水琼脂作底层平板，待平板凝固后，用无菌吸管取0.1mL的Rhodotorula sp.R30菌液于底层平板上并均匀涂布，放置1～2h。
4、根据权利要求1所述一种提高化能自养菌平板检出率的方法，其特征在于：权利要求1中所述的倒入分离自养菌硫杆菌的固体培养基是指氧化硫硫杆菌Thiobacillus thiooxidans的固体培养基和氧化亚铁硫杆菌Thiobacillus ferrooxidans的固体培养基，
(1)氧化硫硫杆菌Thiobacillus thiooxidans的固体培养基分三个部分，A液：(NH4)2SO4 2.0g、KCl 0.1g、K2HPO4 0.25g、MgSO4·7H2O 0.25g、Ca(NO3)2·4H2O 0.01g，溶于500mL蒸馏水中，用10N H2SO4调pH为3.0；B液：22.1g Na2S2O3·5H2O溶于300mL蒸馏水中；C液：30g琼脂粉溶于200mL蒸馏水，A、B和C液分开湿热灭菌，冷却至60℃，三者混合，迅速倒入混匀，作上层平板，凝固后成双层平板；
(2)氧化亚铁硫杆菌Thiobacillus ferrooxidans固体培养基成分：A液：(NH4)2SO4 3.0g；KCl 0.1g，K2HPO4 0.05g，Ca(NO3)4H2O 0.01g，MgSO4·7H2O 0.5g，溶于300mL蒸馏水中，用10N H2SO4调pH为2.79；B液：4g琼脂糖溶于500mL蒸馏水；C液：22.1g FeSO4·7H2O溶于pH＝2.59的200mL蒸馏水中，A液与B液分别湿热灭菌，冷却至60℃，C液过滤除菌，A、B、C液三者混合，迅速倒入混匀，作上层平板，凝固后成双层平板。
5、根据权利要求1所述一种提高化能自养菌平板检出率的方法，其特征在于：在双层平板上涂布待分离的含化能自养菌硫杆菌的菌液，其方法是分别取0.1mL适当浓度的含T.thiooxidans或T.ferrooxidans菌悬液于双层平板均匀涂布，放置20～30min后，置30℃培养箱，倒置培养，计算T.thiooxidans或T.ferrooxidans的菌落数。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB2005100944273A CN1293201C (zh) | 2005-09-19 | 2005-09-19 | 一种提高化能自养硫杆菌平板检出率的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB2005100944273A CN1293201C (zh) | 2005-09-19 | 2005-09-19 | 一种提高化能自养硫杆菌平板检出率的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1746315A CN1746315A (zh) | 2006-03-15 |
| CN1293201C true CN1293201C (zh) | 2007-01-03 |
Family
ID=36166027
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNB2005100944273A Active CN1293201C (zh) | 2005-09-19 | 2005-09-19 | 一种提高化能自养硫杆菌平板检出率的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1293201C (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102888440A (zh) * | 2012-09-28 | 2013-01-23 | 中国水产科学研究院东海水产研究所 | 一种快速测定水产品中副溶血性弧菌总量的方法 |
| CN103540519B (zh) * | 2013-09-25 | 2015-01-21 | 中南大学 | 一种双层平板及其制备方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1590530A (zh) * | 2004-05-31 | 2005-03-09 | 南京农业大学 | 一种耐酸性红酵母菌及其用于污泥中重金属的生物脱除的方法 |
-
2005
- 2005-09-19 CN CNB2005100944273A patent/CN1293201C/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1590530A (zh) * | 2004-05-31 | 2005-03-09 | 南京农业大学 | 一种耐酸性红酵母菌及其用于污泥中重金属的生物脱除的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1746315A (zh) | 2006-03-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Lee et al. | Microbial flocculation, a potentially low-cost harvesting technique for marine microalgae for the production of biodiesel | |
| CN110643548B (zh) | 一株降解苯胺的浅黄微杆菌及其应用 | |
| CN104673715B (zh) | 对镉具有固定效应并能促进植物生长的肠杆菌及其应用 | |
| CN100552019C (zh) | 一株脱氮副球菌及其培养方法与应用 | |
| CN102268386B (zh) | 氨氧化细菌及其分离方法与应用 | |
| CN114703095B (zh) | 一株成都假单胞菌及其在污废水净化领域的应用 | |
| CN113249254A (zh) | 一株硝基还原假单胞菌菌株及其应用 | |
| CN102250776B (zh) | 一株应用于污泥和畜禽粪污生物沥浸处理的耐酸性异养菌z3 | |
| CN104862260A (zh) | 一株具有好氧反硝化能力的节杆菌及其应用 | |
| CN110656071B (zh) | 一种高效降解dmf的惠氏副球菌及其应用 | |
| CN102268387B (zh) | 一种氨氧化细菌及其分离方法与应用 | |
| CN106906173A (zh) | 一种氧化硫硫杆菌及其在去除重金属中的应用 | |
| CN112723558B (zh) | 脱氮副球菌在用于制备降解垃圾渗滤液中氨态氮的微生物菌剂中的应用 | |
| Gu et al. | Degradation of inhibitory substances by heterotrophic microorganisms during bioleaching of heavy metals from anaerobically digested sewage sludge | |
| CN106520611B (zh) | 处理高盐难降解有机废水的高效复合生物菌剂及其应用 | |
| CN1293201C (zh) | 一种提高化能自养硫杆菌平板检出率的方法 | |
| CN115386520B (zh) | 一株嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株及其应用 | |
| CN109554309B (zh) | 一株丛毛单胞菌w2及其在脱氮中的应用 | |
| CN115491338B (zh) | 一种化工中间体降解菌株及其在废水处理中的应用 | |
| CN115094013B (zh) | 一株嗜根寡养单胞菌、菌剂及其在废水处理中的应用 | |
| CN105670965B (zh) | 一种具有铁还原能力的菌种及其应用 | |
| CN1314797C (zh) | 一种耐酸性红酵母菌及其用于污泥中重金属的生物脱除的方法 | |
| CN103540519B (zh) | 一种双层平板及其制备方法 | |
| CN115537352B (zh) | 一种降解氯霉素的解鸟氨酸拉乌尔菌、菌剂及其应用 | |
| CN116426443B (zh) | 具有群体感应行为的菌株及其在促进厌氧氨氧化脱氮上的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |