JP2006500957A - セファレキシンの製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)室温で少なくとも10%水溶液を形成し、かつビニル基を有する親水性のラジカル重合性モノマー 5〜40質量%
(b)ポリマー類似反応においてリガンドの求核基と共有結合することができ、かつビニル基及び付加的な官能基を有するラジカル重合性モノマー 30〜50質量%
(c)2つ又はそれ以上のエチレン系不飽和重合性基を有する架橋性のラジカル重合性モノマー 20〜60質量%
[但し、a)、b)及びc)の総計は100質量%になる]
が含まれており、かつ希釈剤として、メタノール及び水からなる混合物が1:1.0〜1:4.0の比で使用され、その際に、炭素原子5〜7個を有する脂肪族炭化水素からなる有機溶剤からなる連続相中にモノマー相が小滴に分配されており、その際に、モノマー相と連続相との比は1:2.0〜1:4.0であり、かつこの形で、重合開始剤及び保護コロイドの存在で、ラジカル重合される[但し、モノマーと希釈剤との比が1:1.7〜1:2.4である]ことによって製造可能である、
求核基を有するリガンドに対して結合活性であり、かつビーズ状である架橋した親水性の担持ポリマー材料を、ペニシリンアミダーゼで被覆し、かつこの被覆された担体を
(i)7−アミノデスアセトキシセファロスポラニン酸及び
(ii)D−フェニルグリシンアミド
と1:2〜2:1、好ましくは1.5:1〜1:1.5の比で、特に好ましくはほぼ等モル比で、すなわち1.2:1〜1:1.2の比で含有する水溶液と接触させることによって、予想不可能でありかつ技術的に単純である方法で、特に成功する。
モノマー
モノマー混合物の親水性を保証するために、これは、主に親水性のモノマーからなっていなければならない。親水性のモノマーは、室温で少なくとも10%水溶液を形成し、かつ好ましくはイオン性基又は酸又は塩基の添加によりイオン化可能な基を有しないモノマーであると理解される。
希釈剤
モノマー相は、メタノール及び水からなる混合物が1:1.0〜1:4.0の比でなければならない希釈剤中に、溶解されているモノマーa)〜c)からなる。メタノール及び水の特に好都合な混合比は、1:1.2〜1:2.5であり、特に1:1.3〜1:1.7である。
モノマーと希釈剤との比
特に重要であるのは、モノマーと希釈剤との比である。これは、1:1.7〜1:2.4の範囲内、特に好ましくは1.9〜2.1の範囲内でなければならない。
連続相
連続相として、炭素原子4〜7個を有する脂肪族炭化水素である有機溶剤が適している。好ましくはn−ヘプタンであり、かつ特に好ましくはシクロヘキサンである。
モノマー相/連続相の比
モノマー相と有機溶剤により形成される連続相との比は、1:2.0〜1:4.0、好ましくは1:2.8〜1:3.3でなければならない。
別の処理条件
別の成分として、懸濁させたモノマー相は、本来公知の方法で、重合開始剤、好ましくは硫黄不含の開始剤であり、特に好ましくは4,4′−アゾビス−(4−吉草酸)、並びに保護コロイド(乳化剤)、例えばn−ブチルメタクリレート95部及び2−トリメチルアンモニウムエチルメタクリレート−塩化物5部からなり、30,000〜80,000の範囲内の分子量(質量平均)を有する混合ポリマーを含有する。
本発明により使用可能な担持材料の被覆
実施例において、担持材料は、pH 7.5でリン酸カリウム緩衝液中で被覆される。しかしながら当業者には、満足すべき被覆が保証される極めて多数の別の方法が与えられることは明白である。
セファレキシンの合成
出発物質(i)7−アミノデスアセトキシセファロスポラニン酸及び(ii)D−フェニルグリシンアミドは、10〜500mM、好ましくは50〜300mM、特に好ましくは150〜250mMの濃度で使用される。
本発明の有利な効果
本発明による方法は、好都合なS/H−比(合成/加水分解)を有するセファレキシンの合成を可能にする。その際、このことが50〜500μm、特に120〜250μmの範囲内の粒度を有する担持材料の使用下で達成されることは有利である。それにより、より良好な応用技術的な性質、例えば固定床反応器中のより高い流速が達成される。より高い流速から、より良好な空時収量が生じる。バッチ法においても、より大きな担持粒子は利点を提供する、それというのも、これらはより迅速にろ別されることができるからである。これは、そしてまた空時収量、ひいては方法の経済性を高める。
大腸菌からのペニシリンアミダーゼ(=ペニシリンG−アシラーゼ)(EC 3.5.1.11)の結合能の測定
a)担持ポリマー材料へのペニシリンアミダーゼの共有結合
担持ポリマー材料1gを、無菌1Mリン酸カリウム−緩衝液、pH 7.5 5ml中のペニシリンアミダーゼ1530単位に添加し、23℃で48h恒温保持する。
b)結合能の測定
ペニシリンアミダーゼと結合した担持ポリマー材料(ポリマービーズ)250〜300mg湿量を、0.05%エチル−4−ヒドロキシベンゾエートを含有している0.05Mリン酸カリウム緩衝液、pH 7.5中の2%濃度のペニシリン−G−溶液20ml中へ、37℃で添加する。均一に撹拌しながら、遊離したフェニル酢酸の滴定を、0.5M NaOHで、7.8の一定のpH−値で10分間の期間に亘り行い、その際、NaOHの消費を記録する。
c)結合能の計算
測定曲線の線形領域(通常、1〜5minの範囲)が計算の基礎となっており、かつ10分間隔で外挿される。結合能は、担持ポリマー材料1g湿量当たりのペニシリンアミダーゼ単位として記載される(U/g湿量)。1単位は、毎分あたりの加水分解されたペニシリンG μmolに相当する(μmol/min);
0.5M NaOH 1 lは、その際、加水分解されたペニシリンG 500μmolに等価である(担持ポリマー材料の含水量は、ほぼ一定であり、故に無視されることができる。)。
大腸菌からのペニシリンアミダーゼ1530単位を、無菌1Mリン酸カリウム緩衝液、pH 7.5 6ml中に溶解させる。溶液を、Eupergit(R) C 1g(Roehm GmbH & Co. KG, ダルムシュタット、ドイツ連邦共和国)に添加し、得られた懸濁液を23℃で72時間恒温保持する。ポリマービーズを、焼結ガラスフィルター上に捕集し、0.1Mリン酸カリウム−緩衝液で洗浄する。その後のセファレキシン−合成及びS/H−値の測定は、例5もしくは6に従う。
WO 97/04086に従って、そこに開示されたタイプA酵素もしくはタイプB酵素の使用下にセファレキシン−合成を例6に記載されたように実施する。
Sepabeads(R) FP-EPもしくはSepabeads(R) FP-EP/G (Resindion S.R.I.、ミラノ、イタリア共和国)上に、比較例1に示されたように、大腸菌からのペニシリンアミダーゼを固定化する。その後のセファレキシン−合成及びS/H−値の測定は、例5もしくは6に従う。
EmphazeTMもしくは本発明により使用可能な材料が詰められたクロマトグラフィーカラムの流速の測定。
材料:Emphaze UltralinkTM Biosupport Medium、Lot#DC53515、Pierce、製造者の情報による平均粒度50〜80μm;
本発明により使用可能な材料、平均粒度208μm。
例1〜3において一致している試験条件:
温度計、水分離器、還流冷却器、窒素導入管を備えた2 l撹拌フラスコ中に、有機溶剤、n−ブチルメタクリレート95部及び保護コロイドとしての2−トリメチルアンモニウムエチルメタクリレート−塩化物5部からなる混合ポリマー3g及びドライアイス5gを装入する。撹拌しかつ窒素を導通しながら、50℃で、希釈剤としての1:1.5の比での水及びメタノール(例1)もしくはホルムアミド(例2及び3)、並びに
メタクリルアミド10g、
アリルグリシジルエーテル20g、
グリシジルメタクリレート20g及び
メチレン−ビス−メタクリルアミド50g
並びに4,4′−アゾビス−4−シアノ吉草酸2g(重合開始剤として)
からなっているモノマー相を有機相中へ分配し、引き続いて沸騰するまで65〜70℃で加熱する。バッチを、約6h恒温保持し、引き続いて室温に冷却する。生じたポリマービーズを、吸引ろ過し、洗浄し、流動層乾燥器中で乾燥させる。引き続いて、ペニシリンアミダーゼの結合能[U/g湿量]及び膨潤数[ml湿量/ml乾量]を測定する。
セファレキシンの合成
反応を、25℃及びpH 7.5で固定床反応器中で実施する。0.2M 7−ADCA及び0.2M D−フェニルグリシンアミドからなる混合物の水溶液10mlを、固定化されたペニシリンアミダーゼ0.5mlを有するカラムに通す。反応の間に、pH−値を、HClの添加により、接続された撹拌される貯蔵容器中で一定に保持する。特定の時間間隔で試料を取り出し、かつ例5に示されるように、HPLCを用いて分析する。
例4並びに比較例1〜3からの反応の生成物を、RP-8カラム(Merck KGaA、ダルムシュタット、ドイツ連邦共和国)の使用下にHPLCにより分析した。溶離剤として、無菌67mMリン酸カリウム緩衝液、pH 7.5を使用した。セファレキシンを、30%濃度(体積/体積)のメタノール−水溶液で溶出した。
5.3;4.7;3.6;4.6;4.3;5.2;4.7
となった7つの並行して実施される試験系列から構成される。
Claims (5)
- セファレキシンの製造方法において、
モノマー及び希釈剤からなるモノマー相の逆相粒状重合により製造可能であって、その際に、
モノマーとして、
(a)室温で少なくとも10%水溶液を形成し、かつビニル基を有する親水性のラジカル重合性モノマー 5〜40質量%、
(b)ポリマー類似反応においてリガンドの求核基と共有結合することができ、かつビニル基及び付加的な官能基を有するラジカル重合性モノマー 30〜50質量%、
(c)2つ又はそれ以上のエチレン系不飽和重合性基を有する架橋性のラジカル重合性モノマー 20〜60質量%
[但し、a)、b)及びc)の総計は100質量%になる]
が含まれており、かつ希釈剤として、メタノール及び水からなる混合物を1:1.0〜1:4.0の比で使用し、その際に、モノマー相が、炭素原子5〜7個を有する脂肪族炭化水素からなる有機溶剤からなる連続相中に小滴に分配されており、その際に、モノマー相と連続相との比が1:2.0〜1:4.0であり、かつこの形で、重合開始剤及び保護コロイドの存在で、ラジカル重合させる[但し、モノマーと希釈剤との比が1:1.7〜1:2.4である]ことによって製造可能である、
求核基を有するリガンドに対して結合活性であり、かつビーズ状である架橋した親水性の担持ポリマー材料を、
ペニシリンアミダーゼで被覆し、かつこれらの被覆された担体を、
(i)7−アミノデスアセトキシセファロスポラニン酸及び
(ii)D−フェニルグリシンアミド
を1:2〜2:1の比で含有する水溶液と接触させる
ことを特徴とする、セファレキシンの製造方法。 - モノマーとして、
a)アクリルアミド及び/又はメタクリルアミド
b)グリシジルメタクリレート及び/又はアリルグリシジルエーテル
c)N,N′−メチレン−ビス−アクリルアミド又はN,N′−メチレン−ビス−メタクリルアミドを使用する、請求項1記載の方法。 - 有機溶剤としてシクロヘキサンを使用する、請求項1又は2記載の方法。
- ペニシリンアミダーゼが大腸菌に由来する、請求項1から3までのいずれか1項記載の方法。
- セファレキシンを合成するための、請求項1から4までのいずれか1項記載の担持ポリマー材料の使用。
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