JPS6239997B2 - - Google Patents
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- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
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- Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
- Y10S530/815—Carrier is a synthetic polymer
- Y10S530/816—Attached to the carrier via a bridging agent
Landscapes
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Description
本発明は安定化された担体結合ペニシリンアシ
ラーゼの製造法に関する。蛋白質と相応する基質
の間の生物特有の交換作用による方法では、蛋白
質は固体担体に結合した材料の形で有利に使用さ
れる。それにより、蛋白質は処理された基質溶液
の簡単な濾過により単離できる。担体結合蛋白質
は、親和性クロマトグラフイの際にかつ殊に酵素
工程(その際、担体によつて結合された蛋白質が
酵素である)の実施の際に重要である。 水溶液中の遊離蛋白質に対して担体結合蛋白質
は、たいていPH価変動、高い温度又は自動酸化に
よる不活性化に対する高い安定性により優れてい
る。それにもかかわらず、生物特有の作用、例え
ば酵素の場合に酵素活性は、それぞれの使用段階
で担体結合蛋白質の数回の再使用の際にいくらか
低下する。蛋白質をメルカプタンで処理する
(Dissertation Jan Carlsson、Uppsala 1974年第
8頁Abstract参照)場合に、蛋白質の活性損失
を停止するか又は後退させることもできることは
公知である。メルカプタンの作用は、メルカプタ
ンが、自動酸化によりチオール基から生じたジス
ルフイド橋を蛋白質分子内で分解することに基づ
く。この自動酸化は可逆的活性損失の原因とみな
される。 しかしながら、基質溶液の結合蛋白質の活性の
維持のためにメルカプタンを添加することは、多
くの場合、それにより基質溶液が汚染され、かつ
付加的に経費のかかる精製段階が必要とされるの
で望ましくない。2つの使用の間の担体結合蛋白
質の別個の再活性化も、付加的な作業経費のため
に満足できる解決ではない。その上、たいていの
メルカプタンは毒性で、悪臭がある。 本発明の課題は、水溶液中での緩慢な活性損失
に対する高められた安定性を有する担体結合ペニ
シリンアシラーゼを、ペニシリンアシラーゼと非
水溶性担体物質との反応により製造することであ
る。この課題は、本発明により、メルカプト基不
含担体と結合したペニシリンアシラーゼに、硫化
水素又は少なくとも1個のメルカプト基及び少な
くとももう1個のメルカプト−、ヒドロキシ−又
は1級もしくは2級アミノ基を有する分子重量
5000以下、特に2000以下の化合物を作用させるこ
とにより解決される。 当業会では、メルカプタンの安定化作用がジス
ルフイド橋とのその反応によるという見解が主張
されているので、メルカプタンが担体材料に結合
し、そのために、ジスルフイド橋の近くに達する
ことができない場合でもメルカプタンが有効であ
ることは予期できなかつた。それにもかかわら
ず、結合したメルカプト基により意外にも著しい
安定性に達する。次の表で、担体結合ペニシリン
−アシラーゼの例でメルカプト基を含有するか又
は含有しない担体での数回再使用の際の活性損失
を対照させる。メルカプト基は、この場合、エポ
キシド基を有する酵素担体にジチオエリスリツト
を結合することにより導入される。この担体材料
はまずペニシリン−アシラーゼと、次に場合によ
り湿つた担体材料1gあたりジチオエリスリツト
50もしくは500mgと反応させたエポキシ基含有網
状アクリルアミド重合体であつた。6−アミノ−
ペニシラン酸に対するこの製品の活性は、基質溶
液(0.01M燐酸塩緩衝液、PH7.5)200ml中それぞ
れ基質5%と製品1〜2gとの繰返えし反応で、
37℃で1.0N NaOHを用いた自動滴定により確認
した。始めて使用する際の当初活性はそれぞれ
100%とみなした。
ラーゼの製造法に関する。蛋白質と相応する基質
の間の生物特有の交換作用による方法では、蛋白
質は固体担体に結合した材料の形で有利に使用さ
れる。それにより、蛋白質は処理された基質溶液
の簡単な濾過により単離できる。担体結合蛋白質
は、親和性クロマトグラフイの際にかつ殊に酵素
工程(その際、担体によつて結合された蛋白質が
酵素である)の実施の際に重要である。 水溶液中の遊離蛋白質に対して担体結合蛋白質
は、たいていPH価変動、高い温度又は自動酸化に
よる不活性化に対する高い安定性により優れてい
る。それにもかかわらず、生物特有の作用、例え
ば酵素の場合に酵素活性は、それぞれの使用段階
で担体結合蛋白質の数回の再使用の際にいくらか
低下する。蛋白質をメルカプタンで処理する
(Dissertation Jan Carlsson、Uppsala 1974年第
8頁Abstract参照)場合に、蛋白質の活性損失
を停止するか又は後退させることもできることは
公知である。メルカプタンの作用は、メルカプタ
ンが、自動酸化によりチオール基から生じたジス
ルフイド橋を蛋白質分子内で分解することに基づ
く。この自動酸化は可逆的活性損失の原因とみな
される。 しかしながら、基質溶液の結合蛋白質の活性の
維持のためにメルカプタンを添加することは、多
くの場合、それにより基質溶液が汚染され、かつ
付加的に経費のかかる精製段階が必要とされるの
で望ましくない。2つの使用の間の担体結合蛋白
質の別個の再活性化も、付加的な作業経費のため
に満足できる解決ではない。その上、たいていの
メルカプタンは毒性で、悪臭がある。 本発明の課題は、水溶液中での緩慢な活性損失
に対する高められた安定性を有する担体結合ペニ
シリンアシラーゼを、ペニシリンアシラーゼと非
水溶性担体物質との反応により製造することであ
る。この課題は、本発明により、メルカプト基不
含担体と結合したペニシリンアシラーゼに、硫化
水素又は少なくとも1個のメルカプト基及び少な
くとももう1個のメルカプト−、ヒドロキシ−又
は1級もしくは2級アミノ基を有する分子重量
5000以下、特に2000以下の化合物を作用させるこ
とにより解決される。 当業会では、メルカプタンの安定化作用がジス
ルフイド橋とのその反応によるという見解が主張
されているので、メルカプタンが担体材料に結合
し、そのために、ジスルフイド橋の近くに達する
ことができない場合でもメルカプタンが有効であ
ることは予期できなかつた。それにもかかわら
ず、結合したメルカプト基により意外にも著しい
安定性に達する。次の表で、担体結合ペニシリン
−アシラーゼの例でメルカプト基を含有するか又
は含有しない担体での数回再使用の際の活性損失
を対照させる。メルカプト基は、この場合、エポ
キシド基を有する酵素担体にジチオエリスリツト
を結合することにより導入される。この担体材料
はまずペニシリン−アシラーゼと、次に場合によ
り湿つた担体材料1gあたりジチオエリスリツト
50もしくは500mgと反応させたエポキシ基含有網
状アクリルアミド重合体であつた。6−アミノ−
ペニシラン酸に対するこの製品の活性は、基質溶
液(0.01M燐酸塩緩衝液、PH7.5)200ml中それぞ
れ基質5%と製品1〜2gとの繰返えし反応で、
37℃で1.0N NaOHを用いた自動滴定により確認
した。始めて使用する際の当初活性はそれぞれ
100%とみなした。
【表】
本発明により達した安定性は、硫化水素又は少
なくとも1個のメルカプト基及び少なくとももう
1個のメルカプト−、ヒドロキシ−又は1級又は
2級アミノ基を有する化合物の担体材料の結合活
性基への結合に基づく。上記化合物のメルカプト
−、ヒドロキシ−又はアミノ基は結合すべきペニ
シリンアシラーゼの相応する基と同様に、担体材
料の結合活性基と反応する。化合物が分子量5000
以下を有するので、化合物はその僅かな分子の大
きさにより、更に、蛋白質分子のために立体障害
の理由から使えない担体材料の結合活性基とも反
応できる。この結合活性基は、水とよりも硫化水
素もしくはメルカプト−、ヒドロキシ−及びアミ
ノ基とより容易に反応し、その結果、結合活性基
と蛋白質との反応も、次のメルカプト−及び場合
によりヒドロキシ−又はアミノ基を含有する化合
物との反応も水相中で行なうことが可能である。
それにもかかわらず本発明による基は水によつて
徐々に分解されるので、本発明方法の第1及び第
2の反応工程の間に不必要な長い時間が存在しな
い。 結合した分子ごとに少なくとも1個のメルカプ
ト基は遊離型で保持されかつ他のメルカプト−、
ヒドロキシ−又はアミノ基が担体の結合活性基と
反応する場合に、所望の安定化作用が実現する。
担体が不溶性固体マトリツクスからなり、かつ相
当する低い分子活動性を有するので、メルカプト
基含有化合物は、大部分はその官能基でのみ、担
体に結合する。この基がヒドロキシル−又はアミ
ノ基である場合は、それぞれの場合に、1個のメ
ルカプト基が保持される。1個のメルカプト基及
び1個又は数個のアミノ−又はヒドロキシ基を有
する化合物を使用する際には、メルカプト基が担
体の結合活性基と反応して、アミノ−又はヒドロ
キシ基だけがそのまま残つている。この場合に、
結合分子は、安定化には寄与しない。しかしなが
ら、分子の1部分はメルカプト基とではなく、ア
ミノ−又はヒドロキシ基と反応するので、統計的
平均では、十分な安定化作用をするメルカプト基
が残つている。 メルカプト基含有化合物の量は、一般に、担体
−酵素−生成物の湿つた重量に対して少なくとも
0.3重量%の遊離SH基が結合するように定める。
硫化水素及び2個以上のメルカプト基との化合物
は、硫黄に結合した水素原子2個(又は2個以
上)を含有し、担体へのその結合の後にいずれの
場合にも1個の遊離メルカプト基が残つている。
2個以上のSH−基を有する化合物が殊に有利で
ある。次のものがこれに属する:ジチオエチレン
グリコール、ジチオプロピレングリコール又はジ
チオブチレングリコール、1・12−ジメルカプト
ドデカン、並びにエチレングリコール、ドデカン
ジオール、ネオペンチルグリコール又は2・2′−
ビス−(4−ヒドロキシ−シクロヘキシル)−プロ
パンのジ−メルカプト酢酸エステル、トリメチロ
ールプロパン−トリ−メルカプトプロヒオネー
ト、ペンタエリスリツト−テトラ−メルカプトア
セテート、−テトラ−メルカプトプロピオネー
ト、−テトラ−メルカプトカプロン酸エステル又
は−テトラ−メルカプトウンデカン酸エステル並
びに他の官能基を有する化合物、例えばジチオエ
リスリツト。それぞれ1個のアミノ−及び1個の
メルカプト基を有する化合物として、メルカプト
エチルアミン及びシステインが挙げられる。1個
のメルカプト基及び1個又は数個のヒドロキシル
基だけを有する化合物は、重要性が低い。それと
いうのも、メルカプト基は一般にヒドロキシル基
よりも容易に、担体の結合活性基と反応するから
である。この化合物の例はモノチオエチレングリ
コール及びモノチオプロピレングリコールであ
る。 蛋白質に対する結合活性基を有する非水溶性担
体材料の多くは公知である。この種の担体及びそ
の活性基に関する概要は、O.ツアボルスキイ
(O.Zaborsky)のイモビライズド・エンツイムス
(Immobilized Enzymes;Cleveland 1973年)に
記載されている。ここでは、アクリルアミド、無
水マレイン酸、メタクリル酸、スチロール又はポ
リペプチドを主体とする合成網状重合体が重要な
担体材料として挙げられる。天然担体としては、
炭化水素例えばアガロース、セルローズ、網状デ
キストラン又は澱粉が挙げられる。ガラス及び他
の無機物質も担体として使用される。活性担体は
結合活性基として、例えばニトロアリールフルオ
リドー、シリルクロリド−、カルボン酸無水物
−、カルボニル−、イミドカルボネート−、イソ
チオシアネート−、(ニトロ−)フエニルエステ
ル−、アシルアジド−、アリールジアゾニウム−
又はシアヌリルクロリド−基を含有する。担体材
料へこれらの基を導入する方法は、上記文献並び
にそこで引用した文献に詳しく述べてある。結合
活性基の数は、担体材料1g当り蛋白質少なくと
も10mg、特に100mg以上を結合するのに十分であ
るべきである。 安定化作用は、オキシラン−又はアミドカルボ
ネート基を結合活性基として有する担体の場合に
明らかに示される。オキシラン基は殊に反転懸濁
重合により製造したパール重合体の網状アクリル
アミド重合体の製造の際に、グリシジル基含有共
重合体、例えばグリシジル−アクリレート又は−
メタクリレートの共用により導入される。炭水化
物構造を有する担体、例えばセルローズ、アガロ
ース、デキストランに、グリシジル基は、例え
ば、エピクロルヒドリン又は1・4−ビス−
(2・3−エポキシプロピル)−ブタンとの反応に
より導入される。最後に挙げた担体とブロムシア
ンとの反応によりイミドカルボネート基が得られ
る。直径5〜5000μmを有するパール状担体物質
はその容易な取扱い性及びその流動性により特に
有利である。 結合すべき蛋白質の性質は、本発明生成物の意
図する使用目的に従う。親和性クロマトグラフイ
ーのために、生特異性相互作用で生じる基質混合
物の1成分になりうる蛋白質を担体に結合する。
該成分は担体結合蛋白質に一時的に保持される。
有利に、酵素は担体、例えばペニシリンアシラー
ゼ、リボヌクレアーゼ、アミラーゼ又はカタラー
ゼに結合する。本発明において、結合及び安定化
されたペニシリンアシラーゼは、それにより第1
の価値の高い酵素の経済的な再使用が工業的規模
で可能であるので、殊に工業的に重要である。 2、3の酵素は硫化水素又はメルカプタンに対
して敏感であり、これらは一般に本発明の方法に
は適さない。既に硫化水素又は遊離メルカプタン
により安定にされるか又は活性化される酵素は、
本発明方法により高い安定性の酵素生成物に変じ
ることができる。 例 1 (a) オキシランアクリル樹脂パール状球の製造温
度計、インペラ撹拌機、還流冷却器及びN2−
供給管を備えた丸フラスコ(6000ml)に、 n−ヘプタン 1740g 過クロルエチレン 1100g n−ブチルメタクリレート95%及び2−トリメ
チルアンモニウムエチルメタクリレート−塩化
物5%の組成の重合体 2g を供給する。窒素導入下に約55℃で ホルムアミド 791g メタクリルアミド 60g アリルグリシドエーテル 60g グリシジルメタクリレート 60g メチレン−ビス−メタクリルアミド 120g ベンゾイルペルオキシド 6g からなる混合物を添加し、撹拌により有機相中
で分配させる。重合はジメチルアニリン6gの
添加により促進させる。10時間の重合後に室温
まで冷却させ、パール状球を沈澱させ、上方の
液相を傾瀉する。パール状球はアセトン約2000
mlの添加により縮化させ、引濾過し、かつアセ
トンで2回後洗浄する。引続き、パール状球は
一夜、室温で真空下に乾燥させる。 収率:約90%細かい、薄い黄色のパール状球。 (b) ペニシリンアシラーゼの不動態化 ペニシリンアシラーゼ(E.coli比活性
12.1U/mg)1.2gを0.1M燐酸塩緩衝液(PH
8、0.02%NaN3)40ml中に溶解し、生成物
(1a)10gに添加する。23℃で、72時間放置さ
れ、引続き3回それぞれ1M NaCl水溶液1000
mlで洗浄しかつ燐酸塩緩衝液(PH7.5;0.02%
NaN3)0.05Mで2回洗浄する。 収量 湿つた生成物(フリツト上に吸引濾過
後)37g.酵素の活性:237U/湿つた生成
物g. (c) 活性測定 ペニシリン−G(カリウム塩)2g、燐酸塩
緩衝液(PH7.5;0.05M)90mlに溶解し、容積
をこの緩衝液で100mlにする。この基質溶液20
ml及び生成物(1b)250mg(湿つた重量)を滴
下状態(TTA3、Radiometer社コペンハーゲ
ン在)で37℃の恒温で撹拌する。加水分解によ
り遊離するフエニル酢酸を、PH7.8で1N−
NaOHを用いて自動ビユレツト(ABU12
Radiometer社コペンハーゲン在)で自動的に
滴定し、PHメーター及び滴定装置(11型
Radiometer社コペンハーゲン在)で制御す
る。同時に、NaOH−消費を記録装置(テイト
リグラフ(Titrigraph)SBR 2c Radiometer
社コペンハーゲン在)により記録する。活性は
変換カーブの直線の開始範囲からグラフで測定
する;1酵素単位(U)は、1分当りの分解し
た基質1μモルに相当する。 (d) 95%での繰返し使用の際の活性損失 5%の濃度の基質溶液の変換 生成物(1b)2.0g及び5%基質溶液(0.02
%のNaN3を含有する0.01M燐酸塩緩衝液中の5
%ペニシリン−G−K)20mlを、PH7.5及び37
℃で95〜98%の基質変換率になるまで撹拌す
る。装置及び変換カーブの記録は(1c)に記載
したものと同じである。次にパール状酵素をガ
ラスフリツト上で吸引濾過し、新たに基質溶液
20mlに投入する。この処置を20回連続して繰返
えす。 20回使用後の活性損失:57% 例 2 例(1b)による担体結合ペニシリンアシラー
ゼ2gに、ジチオグリコール(2%、NaOHを用
いてPH7.5に調節)の水溶液10mlを加える。該混
合物を37℃で18時間放置し、かつ水(10回それぞ
れ100ml)で洗浄し、かつ0.05M燐酸塩緩衝液
(PH7.5)で2回洗浄する。 収量:湿つた生成物 1.95g. 該生成物を、例(1a)と同様に試験する。20回繰
返えして使用した後の活性損失:42% 例 3 1・4−ジチオエリスリツト50mgをH2O1mlに
溶かし、かつNaOHの添加により、PH値を7.5に
調節する。該溶液を例(1b)による担体結合ペ
ニシリンアシラーゼ2gに加え、かつ該混合物を
48時間23℃で放置する。次に水で(5回)かつ緩
衝液で(2回)洗浄する。 収率:1.98g 例(1d)の記載と同様に実施した20回繰返えし
て使用した後の活性損失:35% 例 4 ジチオエリスリツト500mgを水5ml中に溶か
し、NaOH添加によりPH7.8に調節する。該溶液
を例(1b)による担体結合ペニシリンアシラー
ゼ2gに加え、かつ該混合物を23℃で48時間放置
させる。次に水で(5回)かつ緩衝液で(2回)
洗浄する。 例(1d)と同様に実施して20回繰返えして使用
した後の活性損失:11%.
なくとも1個のメルカプト基及び少なくとももう
1個のメルカプト−、ヒドロキシ−又は1級又は
2級アミノ基を有する化合物の担体材料の結合活
性基への結合に基づく。上記化合物のメルカプト
−、ヒドロキシ−又はアミノ基は結合すべきペニ
シリンアシラーゼの相応する基と同様に、担体材
料の結合活性基と反応する。化合物が分子量5000
以下を有するので、化合物はその僅かな分子の大
きさにより、更に、蛋白質分子のために立体障害
の理由から使えない担体材料の結合活性基とも反
応できる。この結合活性基は、水とよりも硫化水
素もしくはメルカプト−、ヒドロキシ−及びアミ
ノ基とより容易に反応し、その結果、結合活性基
と蛋白質との反応も、次のメルカプト−及び場合
によりヒドロキシ−又はアミノ基を含有する化合
物との反応も水相中で行なうことが可能である。
それにもかかわらず本発明による基は水によつて
徐々に分解されるので、本発明方法の第1及び第
2の反応工程の間に不必要な長い時間が存在しな
い。 結合した分子ごとに少なくとも1個のメルカプ
ト基は遊離型で保持されかつ他のメルカプト−、
ヒドロキシ−又はアミノ基が担体の結合活性基と
反応する場合に、所望の安定化作用が実現する。
担体が不溶性固体マトリツクスからなり、かつ相
当する低い分子活動性を有するので、メルカプト
基含有化合物は、大部分はその官能基でのみ、担
体に結合する。この基がヒドロキシル−又はアミ
ノ基である場合は、それぞれの場合に、1個のメ
ルカプト基が保持される。1個のメルカプト基及
び1個又は数個のアミノ−又はヒドロキシ基を有
する化合物を使用する際には、メルカプト基が担
体の結合活性基と反応して、アミノ−又はヒドロ
キシ基だけがそのまま残つている。この場合に、
結合分子は、安定化には寄与しない。しかしなが
ら、分子の1部分はメルカプト基とではなく、ア
ミノ−又はヒドロキシ基と反応するので、統計的
平均では、十分な安定化作用をするメルカプト基
が残つている。 メルカプト基含有化合物の量は、一般に、担体
−酵素−生成物の湿つた重量に対して少なくとも
0.3重量%の遊離SH基が結合するように定める。
硫化水素及び2個以上のメルカプト基との化合物
は、硫黄に結合した水素原子2個(又は2個以
上)を含有し、担体へのその結合の後にいずれの
場合にも1個の遊離メルカプト基が残つている。
2個以上のSH−基を有する化合物が殊に有利で
ある。次のものがこれに属する:ジチオエチレン
グリコール、ジチオプロピレングリコール又はジ
チオブチレングリコール、1・12−ジメルカプト
ドデカン、並びにエチレングリコール、ドデカン
ジオール、ネオペンチルグリコール又は2・2′−
ビス−(4−ヒドロキシ−シクロヘキシル)−プロ
パンのジ−メルカプト酢酸エステル、トリメチロ
ールプロパン−トリ−メルカプトプロヒオネー
ト、ペンタエリスリツト−テトラ−メルカプトア
セテート、−テトラ−メルカプトプロピオネー
ト、−テトラ−メルカプトカプロン酸エステル又
は−テトラ−メルカプトウンデカン酸エステル並
びに他の官能基を有する化合物、例えばジチオエ
リスリツト。それぞれ1個のアミノ−及び1個の
メルカプト基を有する化合物として、メルカプト
エチルアミン及びシステインが挙げられる。1個
のメルカプト基及び1個又は数個のヒドロキシル
基だけを有する化合物は、重要性が低い。それと
いうのも、メルカプト基は一般にヒドロキシル基
よりも容易に、担体の結合活性基と反応するから
である。この化合物の例はモノチオエチレングリ
コール及びモノチオプロピレングリコールであ
る。 蛋白質に対する結合活性基を有する非水溶性担
体材料の多くは公知である。この種の担体及びそ
の活性基に関する概要は、O.ツアボルスキイ
(O.Zaborsky)のイモビライズド・エンツイムス
(Immobilized Enzymes;Cleveland 1973年)に
記載されている。ここでは、アクリルアミド、無
水マレイン酸、メタクリル酸、スチロール又はポ
リペプチドを主体とする合成網状重合体が重要な
担体材料として挙げられる。天然担体としては、
炭化水素例えばアガロース、セルローズ、網状デ
キストラン又は澱粉が挙げられる。ガラス及び他
の無機物質も担体として使用される。活性担体は
結合活性基として、例えばニトロアリールフルオ
リドー、シリルクロリド−、カルボン酸無水物
−、カルボニル−、イミドカルボネート−、イソ
チオシアネート−、(ニトロ−)フエニルエステ
ル−、アシルアジド−、アリールジアゾニウム−
又はシアヌリルクロリド−基を含有する。担体材
料へこれらの基を導入する方法は、上記文献並び
にそこで引用した文献に詳しく述べてある。結合
活性基の数は、担体材料1g当り蛋白質少なくと
も10mg、特に100mg以上を結合するのに十分であ
るべきである。 安定化作用は、オキシラン−又はアミドカルボ
ネート基を結合活性基として有する担体の場合に
明らかに示される。オキシラン基は殊に反転懸濁
重合により製造したパール重合体の網状アクリル
アミド重合体の製造の際に、グリシジル基含有共
重合体、例えばグリシジル−アクリレート又は−
メタクリレートの共用により導入される。炭水化
物構造を有する担体、例えばセルローズ、アガロ
ース、デキストランに、グリシジル基は、例え
ば、エピクロルヒドリン又は1・4−ビス−
(2・3−エポキシプロピル)−ブタンとの反応に
より導入される。最後に挙げた担体とブロムシア
ンとの反応によりイミドカルボネート基が得られ
る。直径5〜5000μmを有するパール状担体物質
はその容易な取扱い性及びその流動性により特に
有利である。 結合すべき蛋白質の性質は、本発明生成物の意
図する使用目的に従う。親和性クロマトグラフイ
ーのために、生特異性相互作用で生じる基質混合
物の1成分になりうる蛋白質を担体に結合する。
該成分は担体結合蛋白質に一時的に保持される。
有利に、酵素は担体、例えばペニシリンアシラー
ゼ、リボヌクレアーゼ、アミラーゼ又はカタラー
ゼに結合する。本発明において、結合及び安定化
されたペニシリンアシラーゼは、それにより第1
の価値の高い酵素の経済的な再使用が工業的規模
で可能であるので、殊に工業的に重要である。 2、3の酵素は硫化水素又はメルカプタンに対
して敏感であり、これらは一般に本発明の方法に
は適さない。既に硫化水素又は遊離メルカプタン
により安定にされるか又は活性化される酵素は、
本発明方法により高い安定性の酵素生成物に変じ
ることができる。 例 1 (a) オキシランアクリル樹脂パール状球の製造温
度計、インペラ撹拌機、還流冷却器及びN2−
供給管を備えた丸フラスコ(6000ml)に、 n−ヘプタン 1740g 過クロルエチレン 1100g n−ブチルメタクリレート95%及び2−トリメ
チルアンモニウムエチルメタクリレート−塩化
物5%の組成の重合体 2g を供給する。窒素導入下に約55℃で ホルムアミド 791g メタクリルアミド 60g アリルグリシドエーテル 60g グリシジルメタクリレート 60g メチレン−ビス−メタクリルアミド 120g ベンゾイルペルオキシド 6g からなる混合物を添加し、撹拌により有機相中
で分配させる。重合はジメチルアニリン6gの
添加により促進させる。10時間の重合後に室温
まで冷却させ、パール状球を沈澱させ、上方の
液相を傾瀉する。パール状球はアセトン約2000
mlの添加により縮化させ、引濾過し、かつアセ
トンで2回後洗浄する。引続き、パール状球は
一夜、室温で真空下に乾燥させる。 収率:約90%細かい、薄い黄色のパール状球。 (b) ペニシリンアシラーゼの不動態化 ペニシリンアシラーゼ(E.coli比活性
12.1U/mg)1.2gを0.1M燐酸塩緩衝液(PH
8、0.02%NaN3)40ml中に溶解し、生成物
(1a)10gに添加する。23℃で、72時間放置さ
れ、引続き3回それぞれ1M NaCl水溶液1000
mlで洗浄しかつ燐酸塩緩衝液(PH7.5;0.02%
NaN3)0.05Mで2回洗浄する。 収量 湿つた生成物(フリツト上に吸引濾過
後)37g.酵素の活性:237U/湿つた生成
物g. (c) 活性測定 ペニシリン−G(カリウム塩)2g、燐酸塩
緩衝液(PH7.5;0.05M)90mlに溶解し、容積
をこの緩衝液で100mlにする。この基質溶液20
ml及び生成物(1b)250mg(湿つた重量)を滴
下状態(TTA3、Radiometer社コペンハーゲ
ン在)で37℃の恒温で撹拌する。加水分解によ
り遊離するフエニル酢酸を、PH7.8で1N−
NaOHを用いて自動ビユレツト(ABU12
Radiometer社コペンハーゲン在)で自動的に
滴定し、PHメーター及び滴定装置(11型
Radiometer社コペンハーゲン在)で制御す
る。同時に、NaOH−消費を記録装置(テイト
リグラフ(Titrigraph)SBR 2c Radiometer
社コペンハーゲン在)により記録する。活性は
変換カーブの直線の開始範囲からグラフで測定
する;1酵素単位(U)は、1分当りの分解し
た基質1μモルに相当する。 (d) 95%での繰返し使用の際の活性損失 5%の濃度の基質溶液の変換 生成物(1b)2.0g及び5%基質溶液(0.02
%のNaN3を含有する0.01M燐酸塩緩衝液中の5
%ペニシリン−G−K)20mlを、PH7.5及び37
℃で95〜98%の基質変換率になるまで撹拌す
る。装置及び変換カーブの記録は(1c)に記載
したものと同じである。次にパール状酵素をガ
ラスフリツト上で吸引濾過し、新たに基質溶液
20mlに投入する。この処置を20回連続して繰返
えす。 20回使用後の活性損失:57% 例 2 例(1b)による担体結合ペニシリンアシラー
ゼ2gに、ジチオグリコール(2%、NaOHを用
いてPH7.5に調節)の水溶液10mlを加える。該混
合物を37℃で18時間放置し、かつ水(10回それぞ
れ100ml)で洗浄し、かつ0.05M燐酸塩緩衝液
(PH7.5)で2回洗浄する。 収量:湿つた生成物 1.95g. 該生成物を、例(1a)と同様に試験する。20回繰
返えして使用した後の活性損失:42% 例 3 1・4−ジチオエリスリツト50mgをH2O1mlに
溶かし、かつNaOHの添加により、PH値を7.5に
調節する。該溶液を例(1b)による担体結合ペ
ニシリンアシラーゼ2gに加え、かつ該混合物を
48時間23℃で放置する。次に水で(5回)かつ緩
衝液で(2回)洗浄する。 収率:1.98g 例(1d)の記載と同様に実施した20回繰返えし
て使用した後の活性損失:35% 例 4 ジチオエリスリツト500mgを水5ml中に溶か
し、NaOH添加によりPH7.8に調節する。該溶液
を例(1b)による担体結合ペニシリンアシラー
ゼ2gに加え、かつ該混合物を23℃で48時間放置
させる。次に水で(5回)かつ緩衝液で(2回)
洗浄する。 例(1d)と同様に実施して20回繰返えして使用
した後の活性損失:11%.
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 水溶液中のペニシリンアシラーゼとメルカプ
ト−、ヒドロキシ−、1級又は2級アミノ基に対
して結合活性基を有する非水溶性担体材料との反
応により安定化された担体結合ペニシリンアシラ
ーゼを製造する場合に、メルカプト基不含担体に
結合したペニシリンアシラーゼに硫化水素又は少
なくとも1個のメルカプト基及び少なくとももう
1個のメルカプト−、ヒドロキシ−又は1級又は
2級アミノ−基を有する分子量5000以下の化合物
を作用させることを特徴とする、安定化された担
体結合ペニシリンアシラーゼの製造法。 2 メルカプト−、ヒドロキシ−、1級又は2級
アミノ基に対して結合活性の基として、オキシラ
ン−又はイミドカルボネート基を有する担体材料
を使用する、特許請求の範囲第1項記載の方法。 3 ポリアクリルアミド又は炭水化物誘導体を主
体とする担体材料を使用する、特許請求の範囲第
2項記載の方法。 4 オキシラン基を有する網状ポリアクリルアミ
ドを主体とする直径5〜1000μmを有するパール
状担体材料をメルカプト−、ヒドロキシ−、1級
又は2級アミノ基に対する反応性基として使用す
る、特許請求の範囲第2項又は第3項記載の方
法。 5 シアンブロミド化された炭水化物、例えばセ
ルローズ、網状デキストラン又はアガロースを担
体材料として使用する、特許請求の範囲第2項又
は第3項記載の方法。 6 少なくとも1個のメルカプト基を有する化合
物として炭素原子数2〜8を有する脂肪族化合物
を使用する、特許請求の範囲第1項から第5項ま
でのいずれか1項記載の方法。 7 遊離メルカプト基少なくとも0.03重量%(最
終生成物の湿り重量に対して)を担体材料に付加
させる、特許請求の範囲第1項から第6項までの
いずれか1項記載の方法。
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