JPS62236483A - 固定化酵素及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は固定化酵素とその製造法に係り、特に数種類の
酵素を同一系内に固定化した固定化酵素と、その製造法
に関する。

〔従来の技術〕

酵素反応は、その基質特異性や常温常圧での高い反応性
のため、様々な有用物質の生産或いは有害物質の除去な
どに利用されている。特に、近年。

酵素の固定化技術が進歩したことにより、酵素を有効に
再利用し、かつ、酵素反応を連続して行うことが一部の
酵素についてではあるが可能となり、酵素の工業的利用
は増々盛んになっている。

酵素を固定化する方法としては、１）担体結合法、２）
架橋法、３）包括法などがある。

この内１）は水不溶性の担体に結合させる方法であり、
固定化酵素の製造法の中では最も古くから行われており
、報告例が最も多い、その結合様式によって、さらに、
物理的吸着法、イオン結合法、および共有結合法の三つ
の方法に分けられる。

物理的吸着法は、共有結合法などに比べると、酵素の活
性中心の破壊あるいは高次構造の変化が少ないと考えら
れるので、酵素に適した担体が見いだされれば優れた方
法である。しかし、一般に酵素と担体との相互作用が弱
いため、酵素が脱離しやすいという欠点がある。イオン
結合法は、共有結合法に比べて操作が簡単であり、処理
も緩和なため、比較的活性の高い固定化酵素が得られる
場合が多い。しかし、共有結合に比べると担体と酵素と
の結合力が弱いため、緩衝液の種類あるいはｐＨの影響
をうけやすく、反応をイオン強度の高い状態で行うと、
酵素が担体から脱離することがある。共有結合法は、物
理的吸着法やイオン結合法に比べて１反応条件の設定が
むずかしく、反応操作が複雑であり、比較的激しい処理
をするために、活性の高い固定化酵素を得られないこと
があり、場合によっては基質特異性などの酵素的性質に
変化をきたすという欠点がある。しかし、酵素が担体と
強く結合しているため、高濃度の基質溶液あるいは塩類
溶液などによって簡単に脱離しないという特長がある。

２）の架橋法は２個またはそれ以上の官能基をもつ試薬
を用いて、酵素と酵素を架橋することによって固定化す
る方法である。この方法は１）の共有結合法の場合と同
様に、比較的激しい条件下で反応を行うため、得られた
固定化酵素の活性は比較的低い場合が多い。

３）の包括法には、高分子ゲルの細かい格子の中に酵素
を取込む格子型と、半透性の高分子の皮膜によって酵素
を被覆するマイクロカプセル型がある。これらの方法は
、１）の担体結合法や２）の架橋法と異なり、原理的に
は酵素自体とは結合反応を起こしていない、したがって
、多くの酵素の固定化に応用できる可能性がある。しか
し、化学的な重合反応を起こさせるよう場合には、酵素
が失活しやすい。

このように、従来公知の酵素固定化方法は一長一短があ
り、必ずしも満足し得るものではなかった。

かかる現状に鑑み、本発明者らは上記の如き問題のない
、酵素活性が高く、操作が簡便な固定化法を確立すべく
種々研究を重ねた結果、数種類の酵素を高い活性を保持
したまま同一系内に容易に固定化できる、担体結合法を
用いた新規な固定化法を見出し、本発明を完成した。

尚、この種の酵素固定化方法に関するものには、例えば
、特公昭５６−３９８７９号、特開昭５４−４１３８３
号各公報記載の方法がある。

〔発明が解決しようとする問題点〕

上記従来技術は、酵素活性、操作性、固定化量、担体か
らの酵素の脱離などの点について、一長一短があり、必
ずしも満足できる固定化方法ではなかった。

本研究の目的は、高い酵素活性を有し、操作が簡便で汎
用性の高い固定化法を提供することにある。

〔問題点を解決するための手段〕

上記目的は、酵素を担体結合法の物理的吸着法とイオン
結合法を組み合わせることにより、達成される。物理的
吸着法は水不溶性担体に酵素を物理的に吸着させて固定
化する方法であって、本発明においては、疎水基を含有
する水不溶性担体に酵素を疎水的相互作用により吸着さ
せている。イオン結合法は、イオン交換基を含有する水
不溶性担体に、酵素のもつアミノ酸残基を利用して、酵
素を結合させるものである。この二種類の担体を混合し
、これに酵素溶液を接触させることにより、酵素の固定
化を行なう、その際酵素溶液のｐＨ。

イオン強度が酵素の固定化量に大きな影響を与える。一
般的に、イオン強度を増すことにより、疎水結合による
吸着力は強化されるものの、逆にイオン結合による吸着
力が弱められる。ｐＨは担体や酵素のイオン基の解離に
影響を与える。好適な固定化条件は、酵素の種類、酵素
反応の条件などにより異なり、特定されないが１例えば
、酵素が安定で、固定化に関与するイオン基が最大限解
離するようなｐ　Ｉ−Ｉで、疎水結合の吸着力の増加と
イオン結合の吸着力の減少を考えて全体として吸着力が
最大になるようなイオン強度という条件が好ましい。

第１の発明は、疎水基を含有する水不溶性担体とイオン
交換基を含有する水不溶性担体の混合担体の疎水基及び
イオン交換基に結合して固定化され、疎水基がアルキル
基、イオン交換基が陰イオン交換基であり、酵素が酸性
アミノ酸残基を含有することを特徴とする。

第２の発明は、疎水基を含有する水不溶性担体とイオン
交換基を含有する水不溶性担体を混合し、この混合担体
に酵素溶液を接触させることにより酵素の固定化を行な
うことを特徴とし、上記固定化は、カラムに充填された
上記混合担体の疎水基の部分及びイオン交換基の部分で
、疎水結合による物理的吸着及びイオン結合によるイオ
ン結合的吸着によって行なわれることを特徴とする６本
発明に適用される水不溶性担体としては、アガロース〔
例えばセファローズ（ファルマシア社製の商品名）、バ
イオゲルＡ（バイオランド社製の商品名）〕、架橋デキ
ストラン〔例えばセファデックス（ファルマシア社製の
商品名）〕、セルロース〔例えばセレツクス（バイオラ
ッド社製の商品名）、アビセル（旭化成社製の商品名）
〕の如き多糖類、ポリアクリルアミドゲル〔例えばバイ
オゲルＰ（バイオラッド社製の商品名）〕の如き合成高
分子、多孔質ガラス〔例えばアミノプロピル−ＣＰＧ　
（エレクトロ・ヌクレオニクス社製の商品名）〕の如き
無機物質などが挙げられる。

該担体を公知の方法〔例えばＡ　、　Ｈ、ＮｉＮ１５ｈ
ｉｋａ。

Ｐ　、Ｂａ１ｌｏｎ、　Ｊ　、５ｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ
　ｌ１ｉｏｃｈａ＋ｍ、、　１　、３３−４９　（１９
７６）参照〕により、エポキシ化した後。

アルキル基を導入したものを、疎水基を含有する水不溶
性担体として用いることができる。或いは、オクチル−
セファローズＣＬ−４Ｂ（ファルマシア社製の商品名）
、フェニル−セファローズＣＬ−４８（ファルマシア社
製の商品名）の如き、疎水基を含有する市販のハイドロ
フォービッククロマトグラフィー用の吸着剤を用いるこ
とができる。

また、該担体に公知の方法〔例えばＪ、Ａｍ。

Ｃｈｅａ＋、　Ｓａｃ、、　７８　、７５１　（１９５
６）参照〕により、ジエチルアミノエチル基を導入した
ものを、陰イオン交換基を含有する水不溶性担体として
用いることができる。或いは−ＤＥΔＥ−セファデック
ス（ファルマシア社製の商品名）の如き、ジエチルアミ
ノエチル基を含有する市販のイオン交換クロマトグラフ
ィー用の吸着剤を用いることができる。

本発明に適用される酵素は、アミノ酸残基即ち電荷を有
しているものであれば、特に制限されないが、例えば次
の如きものが好適に挙げられる。

酸化還元酵素： アラニンデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナー
ゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、イソクエン酸デヒド
ロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、グリセルアルデヒ
ドリン酸デヒドロゲナーゼ、グリコースデヒドロゲナー
ゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルタ
ミン酸シンターゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、シ
スチンレダクターゼ、セリンデヒドロゲナーゼ、乳酸デ
ヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ロイシン
デヒドロゲナーゼなど。

転移酵！１： アデニル酸キナーゼ、グリコーゲンシンターゼ、グリセ
リン酸キナーゼ、グリセロールキナーゼ、グルコキナー
ゼ、グルタミン酸キナーゼ、コリンキナーゼ、酢酸キナ
ーゼ、ヒスタミンメチルトランスフェラーゼ、ピルビン
酸キナーゼ、ヘキソキナーゼなど。

合成酵素： アスパラギンシンテターゼ、アセチル−ＣｏＡシンテタ
ーゼ、カルバモイルリン酸シンテターゼ。

グルタチオンシンテターゼ、グルタミンシンテターゼ、
ジヒドロ葉酸シンテターゼ、ビオチンカルボキシラーゼ
、ピルビン酸シンテターゼなど。

〔作用〕

本発明では、物理的吸着法とイオン結合法の組み合わせ
により酵素の固定化を行なうため、操作が簡便であり、
比較的酵素活性の高い固定化酵素が得られる。しかも、
物理的吸着法やイオン結合法だけの場合より強固に吸着
されているので、ｐ　Ｈやイオン強度の及ぼす影響が小
さくなり、より多くの酵素を固定化でき、また、担体か
らの酵素の脱離が少ない６担体や酵素を特に限定する必
要がないので、本固定化法は汎用性が高く、また数種類
の酵素を同時に同一系内に固定化することが可能となる
。

本発明の酵素固定化法によれば、固定化したい酵素の種
［（本来、本発明の酵素は物理的吸着法でも、イオン結
合的による吸着法でも固定化される酵素であるが、混在
する酵素によって、より物理的吸着に適するものとより
イオン結合による吸着に適するものがある）に応じて、
単に疎水基を含有する担体とイオン交換基を含有する担
体との混合割合を変えて仕込むのみで酵素はより結合力
が強い担体の方を選択して固着するため、酵素を効率よ
く強固に固定化可能である。

〔実施例〕

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが１
本発明はこれに限定されるものではない。

［実施例１］ 蒸留水で洗浄したセファローズ４Ｂ（ファルマシア社製
の商品名）（静置体積５０ｍＱ）に対して、蒸留水８　
ｍ　Ｑ　、ジオキサン３０ｍｆｌ、Ｉ　Ｎ　Ｎ　ａ　Ｏ
Ｈ水溶液１２ｍＱ及びエビブロモヒドリン４ｍＱを加え
、３０℃で４時間かくはんした。

反応終了後、ゲルを濾集し蒸留水（５００ｍＱ以上）で
充分に洗浄した。得られたエポキシ化セファローズ４Ｂ
は直ちに次の反応に用いた。エポキシ化セファローズ４
Ｂ（静置体積５０ｍＭ）を、６０％ジオキサン水溶液５
０ｍＡにけんだくシ。

０　、１　ｍｏ　Ｑ　　のｎ−オクチルアミンを加え、
室温で８時間かくはんした。さらに室温で２日間放置し
た後、ゲルを濾集し、４０％ジオキサン水溶液で洗浄し
た。洗液に２．４．６−ドリニトロベンゼンスルホン酸
の水溶液を少量加え、呈色反応が起こらなくなるまで洗
浄を続けた後、蒸留水で充分に洗浄した。得られたｎ−
オクチル化セファローズ４Ｂは、蒸留水にけんだくし・
４℃で保存した。

ＤＩ！＾ＥセファデックスＡ３０（ファルマシア社製の
商品名）を１００倍量以上の蒸留水中で２日間膨した後
（室温）、ブフナーろうとで吸引しながら蒸留水で繰り
返し洗浄後、１時間、脱気を行なった。得られたＤＥＡ
ＥセファデックスＡ５０は、蒸留水にけんだくし４℃で
保存した。

ｎ−オクチル化セファローズ４ＢとＤＥＡＥセブアデツ
クスＡ５０を１ｍＱずつカラムに充てんし、混合した。

５０　ｍ＋ｗｏＱ　／　Ｑ　トリエタノールアミン緩衝
液（ｐＨ７）で洗浄後、４℃で冷却し。

同緩衝液に溶解した酵素溶液を空間速度５ｖ＝１．５ｈ
−１で送り、その後−昼夜放置する。固定化反応終了後
、ゲルの１５倍量以上の５０ｍ＋ｓｏＱ／Ｑトリエタノ
ールアミン緩衝液（ｐ　１■７　）　で洗浄し、酵素が
担体から脱離して漏出してこないことを、洗浄液のタン
パク質を定量することにより（口ｒａｄｆｏｒｄ法）、
確認した。酵素はギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨと略す
）を使用した。その際の添加量と固定化量の関係、担体
からの酵素の脱離の有無を表１に示した。

［比較例１］ 実施例１と同様の方法でｍｌｌしたｎ−オクチル化セフ
ァローズ４８２ｍＡを用いて、Ｆ　Ｄ　Ｈを実施例１と
同様の手法で固定化した結果を第１表に示す。

第１表の本発明の実施例のものは、担体からの脱離が無
く、酵素が担体に強固に吸着した固定化酵素であること
がわかる。

［比較例２］ 実施例１と同様の方法で調製したＤＥＡＥ−セファデッ
クスＡ　５０２　ｍ　Ｑを用いて、Ｆ　Ｄ　Ｈを実施例
１と同様の手法で固定化した結果を第１表に示す。

［実施例２］ 実施例１と同様の手法を用いて作製した固定化ＦＤＩＩ
カラムに、１ｍｍｏＱ／ＱのＮＡＤ及び１００ｍ＋ｏｏ
　Ｑ　／　Ｑのギ酸ナトリウムを含む５０ｍｍｏ（ｉ／
αトリエタノールアミン緩衝液（ｐ　Ｉ（７”）　　を
、種種の流速（室温）で導通し、Ｎ　Ａ　Ｄ　ＩＩ再生
反応を行なった結果を第２表に示す。流出液中のＮＡＤ
Ｉ＋濃度は２６０ｎｍの吸光度（Ｅ　＝　１５　ａｌ／
　ｐｍｏｆ）、　）及び３４０ｎｍの吸光度（［＝６．
２ａ＋ｔ／　μｍｏ１２）、ＮＡＤ濃度は２６０ｎｍの
吸光度（Ｅ＝１８ｒｎ／μｍｏ＋２）を測定して求めた
。ＦＤＨの固定化量は２０．３５■タンパクＬ　ｍ　Ｑ
ゲルである。

第２表によれば基質（酵素の固定化に助力する物質）の
変換率は１００％に近く酵素の固定化に再利用するのに
好的である。

［実施例３コ 実施例１と同様の手法で作製したｎ−オクチル化セファ
ローズ４ＢとＤＥＡＥセファデックスＡ５０を混合して
充てんし、５０　ｍｍｏＱ　／　Ｑ　ｈリエタノールア
ミン緩衝液（ｐ　Ｈ７＞で洗浄を行なったカラムに、約
２５ＨのＦ　Ｄ　Ｈを溶解した乳酸デヒドロゲナーゼ（
ＬＤＨと略す）溶液（約４．３■タンパク質１ｍＱ）０
．８ｍＱ　　を、実施例１と同様の手法で固定化を行な
い、Ｆ　Ｄ　ＨとＬＳＨを同時に定量的に固定化するこ
とができた。

［実施例４］ 以下に示す酵素活性測定法により、種々の濃度のギ酸、
ＮＡＤ、ピルビンｆｉ、ＮＡＤＨに対する反応初速度を
測定し、Ｋｍ　（ミカエリス定数）を求めた。その結果
を第３表に示す。

第３表によれば、得られた固定化酵素は酵素活性を保持
しており、固定化によっても酵素的性質に変化がないこ
とがわかる。

ＦＤＨについては次のようにして酵素活性を測定した。

光路長１ｃｘのＵＶセル中に、４００ｍｍｏ　Ｑ　／　
Ｑギ酸ナトリウム水溶液、４０ｍｍｏＱ／ＱＮＡＤ水溶
液＋　５０ｍ＋ｏｏＱ／　Ｑ　トリエタノール水溶液（
ｐＨ７）を適当量入れ、全体で３ｍＱになるようにする
。これにＦ　Ｄ　Ｈ溶液０．０１ｍＡ　　を加え、すば
やく混合した後、２５℃での３４０ｎｍの吸光度の時間
変化より、反応初速度を求めた。固定化Ｆ　Ｄ　Ｈの場
合は、前記酵素溶液のかわすに固定化ＦＤＨのけんだく
液（同量の５０ｍｍｏＱ／Ｑトリエタノールアミンｔｐ
Ｈ７にけんだ＜）０．０１ｍｆｆ　　を加え、かくはん
下、２５℃で３４０ｎｍの吸光度の時間変化を測定し１
反応の初速度を求めた。

Ｌ　Ｄ　ＨについてもＦＤＨと同様に２５℃での３４０
ｎｍの吸光度の時間変化を測定した。その際ギ酸ナトリ
ウム水溶液とＮＡＤ水溶液のかわりに、　５０　ｍｔｓ
ｏＱ　／　Ｑピルビン酸ナトリウム水溶液。

５ｍｍｏＱ／ＱＮＡＤＨ水溶液を使用する。ＬＤＨ溶液
は０．００１ｍ　Ｑ　添加する。固定化Ｌ　Ｄ　Ｈの場
合も固定化Ｆ　Ｄ　Ｈと同様にして、反応の初速度を求
めた。

固定化酵素は実施例１と同様の手法で調整したｎ−オク
チル化セファローズ４ＢとＤＥＡＥセファデックスＡ５
０の混合物２　ｍ　Ｑに、ＦＤＩ（とＬ　Ｄ　Ｈが各々
１５．９ＷＫ、１．５３■固定化した物である。

第　　１　　表 ＊１　担体１　ｍ　Ｑ当りの酵ｉｔ 固定化条件：　ｐＩＩ７，５Ｖ＝１　ｈ−１，室温第　
　２　　表 第　　３　　表 〔発明の効果〕

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、疎水基を含有する水不溶性担体とイオン交換基を含
   有する水不溶性担体の混合担体の疎水基及びイオン交換
   基に結合して固定化されたことを特徴とする固定化酵素
   。 ２、疎水基がアルキル基であることを特徴とする特許請
   求の範囲第１項記載の固定化酵素。 ３、イオン交換基が陰イオン交換基であることを特徴と
   する特許請求の範囲第１項または第２項記載の固定化酵
   素。 ４、酵素が酸性アミノ酸残基を含有することを特徴とす
   る特許請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載の固定化
   酵素。 ５、疎水基を含有する水不溶性担体とイオン交換基を含
   有する水不溶性担体を混合し、この混合担体に酵素溶液
   を接触させることにより酵素の固定化を行なうことを特
   徴とする固定化酵素の製造法。 ６、上記固定化は、カラムに充填された上記混合担体の
   疎水基の部分及びイオン交換基の部分で行なわれること
   を特徴とする特許請求の範囲第５項記載の固定化酵素の
   製造法。 ７、上記固定化は、疎水結合による物理的吸着及びイオ
   ン結合によるイオン結合的吸着によつて行なわれること
   を特徴とする特許請求の範囲第５項または第６項記載の
   固定化酵素の製造法。