CN110615827A - 一种X-Pro结构特异型ACE抑制肽及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种X‑Pro结构特异型ACE抑制肽及其制备方法，所述制备方法包括采用胰凝乳蛋白酶和脯氨酸特异内切酶复合酶酶解牡蛎蛋白，采用Sephadex G25凝胶过滤层析、SuperdexTM 30 Increase 10/300 GL凝胶过滤层析、反相高效液相色谱对牡蛎蛋白水解产物进行分离纯化，得到纯度较高的组分，经鉴定ACE抑制肽的氨基酸序列为Ser‑Ala‑Pro、Ala‑Met‑Pro、Thr‑Ser‑Gly‑Pro和Ser‑Asp‑Pro，这四种肽未曾报道过，为制备治疗高血压的药物提供了新途径。

Description

一种X-Pro结构特异型ACE抑制肽及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物肽的制备技术领域，特别是涉及一种X-Pro结构特异型ACE抑制肽及其制备方法。
背景技术
高血压是最常见的心血管疾病之一，它能造成大脑、心血管、肾脏的损害，是引起脑卒中、心力衰竭和冠心病等的重要因素，严重威胁着人类的健康。因此，治疗和预防高血压对提高人类的健康水准，延长寿命有着重要的意义。血管紧张素转换酶(ACE)在人体内通过肾素-血管紧张素系统和激肽释放酶-激肽系统调节人体血压，ACE可以将血管紧张素I转换为血管紧张素II，使周围小动脉、血管平滑肌收缩，同时刺激醛固酮分泌，促进人体肾脏对Na+、K+的重吸收，引起钠储量和血容量的增加，使血压升高；还可以使舒缓激肽失活，引起血压升高。综上所述，ACE一方面产生使血压上升的血管紧缩素II，另一方面，使具有血管舒张作用的舒缓激肽失活，这都造成了血压的上升。所以，如果抑制了ACE的活性，就可以起到降压的作用。
目前，化学合成了很多的ACE抑制剂，比如卡托普利、赖诺普利，虽然已经广泛应用于临床，降压效果显著，但是存在很多的副作用。食源性ACE抑制肽不仅没有毒副作用，本身还具有其他一些生理活性。目前主要是通过中性、碱性、胃蛋白酶、胰蛋白酶这一些比较常见的特异性较低的蛋白酶酶解蛋白资源，存在很大的随机性和盲目性，不利于研究ACE抑制肽的构效关系，定向特异性酶解蛋白质的研究鲜有涉及。
发明内容
本发明的目的是研究ACE抑制肽的结构特点和构效关系，提供特异性蛋白酶定向酶解牡蛎蛋白质，获得具有特定羧基末端的高活性的ACE抑制肽，以解决上述现有技术存在的问题。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供了一种X-Pro结构特异型ACE抑制肽，所述X-Pro结构特异型ACE抑制肽的氨基酸序列为Ser-Ala-Pro、Ala-Met-Pro、Thr-Ser-Gly-Pro和Ser-Asp-Pro。
本发明还提供所述X-Pro结构特异型ACE抑制肽的制备方法，包括以下步骤：
步骤(1)：将全牡蛎肉进行预处理，制备牡蛎蛋白；
步骤(2)：第一步酶解：用胰凝乳蛋白酶酶解牡蛎蛋白，得到酶解物Ⅰ；
步骤(3)：第二步酶解：用脯氨酸特异内切酶酶解酶解物Ⅰ，得到富含Pro、Tyr、Phe和Trp羧基末端的牡蛎ACE抑制肽混合物；
步骤(4)：通过Sephadex G25凝胶过滤层析、SuperdexTM 30Increase10/300GL凝胶过滤层析、反相高效液相色谱对步骤(3)得到的混合物进行分离纯化，得到所述X-Pro结构特异型ACE抑制肽。
进一步的，步骤(1)中将全牡蛎肉进行预处理的过程包括：将全牡蛎肉匀浆，加适量水，使固形物浓度为3wt％。
进一步的，步骤(2)中胰凝乳蛋白酶的加入量为固形物的0.2wt％-2.wt0％。
进一步的，步骤(2)中酶解条件为在37℃，pH 8.0条件下酶解1-6h。
进一步的，步骤(3)中脯氨酸特异内切酶的加入量为50-1000U/g。
进一步的，步骤(3)中酶解条件为将酶解物Ⅰ的pH调至4.0，加入脯氨酸特异内切酶，在50℃下酶解1-6h，沸水浴加热10min灭酶活，8000rpm离心5-20min，得到具有较高活性的富含Pro、Tyr、Phe和Trp羧基末端的牡蛎ACE抑制肽混合物。
进一步的，步骤(4)所述的Sephadex G25凝胶过滤层析过程为：
用Sephadex G25填料制备1.6×60cm的凝胶过滤层析柱，以0.2mL/min流速用去离子水洗脱，检测280nm波长的吸收值，多次上样，收集峰尖冻干，并检测各个峰的ACE抑制活性，收集活性最高的两个组分，命名为G1和G4，进行下一步纯化。
进一步的，步骤(4)所述的SuperdexTM 30Increase 10/300GL凝胶过滤层析过程为：
(1)选取Sephadex G25凝胶过滤层析得到的活性最高的组分G1和G4，用SuperdexTM 30Increase 10/300GL预装柱(分离范围：100-7000Da)在AKTA系统上进一步纯化，以0.3mL/min流速用10mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.4，含150mmol/L NaCl)洗脱，检测280nm波长的吸收值，多次上样，收集峰尖冻干，并检测ACE抑制活性，收集活性最高的两个组份，命名为G1E1和G4E4。
进一步的，步骤(4)所述反相高效液相色谱的过程为：
(1)选取SuperdexTM 30Increase 10/300GL凝胶过滤层析过程得到的活性最高的组分G1E1和G4E4，用Agilent Zorbax SB-Aq C18在高效液相色谱系统上进一步纯化，流动相是乙腈：水(含0.1％TFA)＝5:95，以0.5mL/min流速和25℃柱温洗脱；检测波长215nm，多次上样，收集峰尖冻干，并检测ACE抑制活性，收集活性最高的两个组份，命名为G1E1C1和G4E4C1，对G1E1C1和G4E4C1进行二次分离，仅收集峰尖冻干，得到所述X-Pro结构特异型ACE抑制肽。
本发明还提供ACE抑制活性的检测方法，包括以下步骤：
取一定浓度的样品20μL，加入10μL ACE溶液(0.1U/mL)，37℃下保温10min，之后加入10μL浓度为5mmol/L的HHL溶液开始反应，于37°C反应60min，最后加入100μL浓度为1.0mol/L的HCl终止反应。同时用20μL HEPES缓冲液(50mmol/mL，含300mmol/mL NaCl，pH8.3)替代酶解液来制备反应液，作为空白对照组。反应液经过0.22μm滤膜过滤后用ZorbaxSB-Aq C18分析柱(4.6×150mm，5μm)在228nm处检测马尿酸的峰面积，以乙腈/超纯水(体积比为1：1，其中水含0.1％三氟乙酸)作为流动相，流速0.3mL/min，柱温25℃，进样量20μL。IC50值定义为使马尿酸峰面积减少50％的抑制剂浓度。
ACE抑制率(％)＝(1-样品的马尿酸峰面积/空白的马尿酸峰面积)×100％
本发明ACE抑制活性的检测原理为：底物类似物马尿酰-组氨酰-亮氨酸，简称HHL，可以被ACE分解成马尿酸和二肽，利用HPLC检测马尿酸的峰面积可以反映ACE的活性大小，当ACE被抑制时，马尿酸峰面积会减少，当减少一半时所需的ACE抑制肽浓度即为某个样品的IC50活性。
对于ACE抑制活性的测定方法，相较于用乙酸乙酯萃取马尿酸后测定吸光值的方法来说，HPLC结果更为准确、误差更小，而选择合适的柱子和方法将HHL与马尿酸完全分离开是关键。本发明在现有研究的基础上，减少HHL的用量，从而减少图谱中HHL的峰高，更好地凸显产物马尿酸的峰形，减少马尿酸的峰面积误差，并且整个体系用量减少一倍，从而降低了检测成本。由图1-9可以看出，经改进后的方法可以将HHL和马尿酸完全分离开，空白组中HHL的洗脱时间为5.454min，马尿酸洗脱时间为6.160min，样品中HHL的洗脱时间为5.469min，马尿酸洗脱时间为6.166min，用改进后的方法检测酶解产物的ACE抑制活性，ACE抑制活性的IC50值为0.128mg/mL。与现有文献相比，样品的ACE抑制活性高于大多数研究报道的活性。
本发明还采用肼解法分析了酶解产物羧基末端的氨基酸组成，包括以下步骤：
当蛋白质用无水肼处理时，只有羧基末端氨基酸以游离氨基酸的形式释放，通过测定肼解前后游离氨基酸含量的差异，就可以得到酶解产物的羧基末端氨基酸含量。
取10μL(约0.25μmol)样品放于褐色玻璃管内，在85℃真空干燥5-8h，在干燥箱中向玻璃管内加入0.3mL无水肼，立刻在煤气灯上封口(开始时管内无水肼产生烟雾)，100℃反应12h，中间晃动5-6次。反应完成后，取出冷却，打开玻璃封管，立刻放到置有浓硫酸的干燥器中抽干。向抽干后的肼解物中加入2mL水，充分溶解后，再加入0.5mL新鲜蒸馏的苯甲醛，置于30℃振荡反应1h(如果酰肼不能完全沉淀，则调整溶液的pH值并加入稀碱使其中性)。反应完成后，将反应液4800rpm离心20min，取上层清液，油状残渣用3mL水洗二次。水洗液与清液合并后立刻抽干，利用RP-HPLC分析游离氨基酸组成。对照组为没有经过肼解反应的酶解液原液，稀释至相同浓度，检测游离氨基酸的组成。
本发明还提供所述X-Pro结构特异型ACE抑制肽在制备抑制高血压药物中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
因ACE倾向与羧基端氨基酸残基为疏水性氨基酸的抑制肽反应，例如Pro和芳香族氨基酸Tyr、Phe和Trp，尤其是Pro。基于此构效关系，本发明选择了能够特异性酶切Tyr、Phe和Trp羧基末端的胰凝乳蛋白酶用于第一步酶解，能够特异性酶切Pro羧基末端的脯氨酸特异内切酶用于第二步酶解，如此复合酶解牡蛎蛋白，优化了酶解条件，得到了具有较高活性的富含Pro、Tyr、Phe和Trp羧基末端的牡蛎ACE抑制肽混合物，通过Sephadex G25凝胶过滤层析、SuperdexTM 30Increase 10/300GL凝胶过滤层析、反相高效液相色谱对牡蛎蛋白水解产物进行分离纯化，得到了具有特定氨基酸末端的多肽Ser-Ala-Pro、Ala-Met-Pro、Thr-Ser-Gly-Pro和Ser-Asp-Pro。
本发明用肼解法分析了酶解产物中羧基末端的氨基酸组成。Pro在酶解产物中所有羧基末端氨基酸中的比例达到50.85％。这表明，所选择的脯氨酸特异内切酶发挥着关键作用，它将牡蛎蛋白切成了大量具有脯氨酸羧基末端的肽链。
本发明通过一级和二级质谱，鉴定出四种肽的序列结构为Ser-Ala-Pro(SAP)、Ala-Met-Pro(AMP)、Thr-Ser-Gly-Pro(TSGP)和Ser-Asp-Pro(SDP)，均具有Pro末端，这四种新肽均未曾报道过。
附图说明
图1为Zorbax SB-Aq C18分析样品的ACE抑制活性；
图2为肼解法分析酶解产物中的羧基末端氨基酸组成；
图3为牡蛎蛋白水解物的Sephadex G25凝胶过滤层析图谱；
图4为G1的SuperdexTM 30Increase 10/300GL凝胶过滤层析图谱；
图5为G4的SuperdexTM 30Increase 10/300GL凝胶过滤层析图谱；
图6为G1E1的RP-HPLC分离纯化图谱；
图7为G4E4的RP-HPLC分离纯化图谱；
图8为G1E1C1和G4E4C1的RP-HPLC分离纯化图谱；
图9为G1E1C1的ESI-MS和MS/MS图谱分析，其中a为G1E1C1的ESI-MS图谱；b.m/z274.5的ESI-MS/MS分析；c.m/z 318.6的ESI-MS/MS分析；d.m/z 362.6的ESI-MS/MS分析；
图10为G4E4C1的ESI-MS和MS/MS图谱分析，其中a.G4E4C1的ESI-MS图谱；b.m/z318.7的ESI-MS/MS分析。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1.制备ACE抑制肽
制备方法
将全牡蛎肉匀浆，加适量水，控制原料的固形物浓度为3％，加入占固形物0.2％-2.0％的胰凝乳蛋白酶，在37℃，pH 8.0条件下酶解1-6h，将pH调至4.0，后加入50-1000U/g的脯氨酸特异内切酶，在50℃下酶解1-6h，沸水浴加热10min灭酶活，8000rpm离心5-20min，得到了具有较高活性的富含Pro、Tyr、Phe和Trp羧基末端的牡蛎ACE抑制肽混合物。
2.分离纯化
(1)Sephadex G25凝胶过滤层析
用Sephadex G25填料制备1.6×60cm的凝胶过滤层析柱，以0.2mL/min流速用去离子水洗脱，检测280nm波长的吸收值，多次上样，收集峰尖冻干，并检测各个峰的ACE抑制活性。
用Sephadex G25凝胶过滤层析对酶解产物进行了粗分离，从图3看出，酶解产物被分离为7个峰，其中第1个峰和第4个峰的活性最好，命名为G1和G4，多次上样收集峰尖冻干，进行下一步纯化。
(2)GE SuperdexTM30 Increase 10/300GL凝胶过滤层析
选取上一步骤得到的活性最高的组分，用SuperdexTM 30Increase 10/300GL预装柱(分离范围：100-7000Da)在AKTA系统上进一步纯化，以0.3mL/min流速用10mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.4，含150mmol/L NaCl)洗脱，检测280nm波长的吸收值，多次上样，收集峰尖冻干，并检测ACE抑制活性。
第二步用GE SuperdexTM30 Increase 10/300GL凝胶过滤层析进行细分离，从图4看出，G1出现一个主峰，基线附近有多个小杂峰，收集主峰的峰尖冻干，命名为G1E1；从图5看出，G4出现4个峰，前三个峰含量较低而且不对称，因此收集第4个峰的峰尖冻干，命名为G4E4。
(3)RP-HPLC分离纯化
选取上一步骤得到的活性最高的组分，用Agilent Zorbax SB-Aq C18在高效液相色谱系统上进一步纯化，流动相是乙腈：水(含0.1％TFA)＝5:95，以0.5mL/min流速和25℃柱温洗脱；检测波长215nm，多次上样，收集峰尖冻干，并检测ACE抑制活性。
第三步利用反相HPLC纯化，从图6看出，G1E1分离的第一个峰活性最高，IC50为0.032mg/mL，命名为G1E1C1。从图7看出，G4E4也是第一个峰活性最高，IC50为0.047mg/mL，命名为G4E4C1。对G1E1C1和G4E4C1进行二次分离，仅收集峰尖冻干，用做下一步的结构鉴定。
所述ACE抑制活性的检测方法如下：
ACE抑制活性的检测原理为：底物类似物马尿酰-组氨酰-亮氨酸，简称HHL，可以被ACE分解成马尿酸和二肽，利用HPLC检测马尿酸的峰面积可以反映ACE的活性大小，当ACE被抑制时，马尿酸峰面积会减少，当减少一半时所需的ACE抑制肽浓度即为某个样品的IC50活性。
取一定浓度的样品20μL，加入10μL ACE溶液(0.1U/mL)，37℃下保温10min，之后加入10μL浓度为5mmol/L的HHL溶液开始反应，于37°C反应60min，最后加入100μL浓度为1.0mol/L的HCl终止反应。同时用20μL HEPES缓冲液(50mmol/mL，含300mmol/mL NaCl，pH8.3)替代酶解液来制备反应液，作为空白对照组。反应液经过0.22μm滤膜过滤后用ZorbaxSB-Aq C18分析柱(4.6×150mm，5μm)在228nm处检测马尿酸的峰面积，以乙腈/超纯水(体积比为1：1，其中水含0.1％三氟乙酸)作为流动相，流速0.3mL/min，柱温25℃，进样量20μL。IC50值定义为使马尿酸峰面积减少50％的抑制剂浓度。
ACE抑制率(％)＝(1-样品的马尿酸峰面积/空白的马尿酸峰面积)×100％
图1为Zorbax SB-Aq C18分析样品的ACE抑制活性。对于ACE抑制活性的测定方法，相较于用乙酸乙酯萃取马尿酸后测定吸光值的方法来说，HPLC结果更为准确、误差更小，而选择合适的柱子和方法将HHL与马尿酸完全分离开是关键。本发明在现有研究的基础上，减少HHL的用量，从而减少图谱中HHL的峰高，更好地凸显产物马尿酸的峰形，减少马尿酸的峰面积误差，并且整个体系用量减少一倍，从而降低了检测成本。由图1-9可以看出，经改进后的方法可以将HHL和马尿酸完全分离开，空白组中HHL的洗脱时间为5.454min，马尿酸洗脱时间为6.160min，样品中HHL的洗脱时间为5.469min，马尿酸洗脱时间为6.166min，用改进后的方法检测酶解产物的ACE抑制活性，ACE抑制活性的IC50值为0.128mg/mL。与现有文献相比，样品的ACE抑制活性高于大多数研究报道的活性。
3.结构鉴定
纯化得到的牡蛎ACE抑制肽在电喷雾四极杆正交加速-飞行时间串联质谱仪上进行测序。所有测定均在正离子方式下进行。采用注射泵直接进样，流速为1μL/min。碰撞气体为氩气，雾化气为氮气。锥孔电压50V，源温80℃。对MS和MS/MS结果的分析软件为Masshunter Analysis和Skyline质谱分析软件。
通过电喷雾-四极杆-飞行时间质谱技术对G1E1C1和G4E4C1进行一级质谱和二级质谱鉴定，利用Skyline和Masshunter质谱分析软件对质谱结果进行分析，一级质谱图显示G1E1C1中存在三种肽，m/z为274.5、318.6和362.6(图9a)，三者均为[M+H]+离子峰，分子量分别为273.5Da、317.6Da和361.6Da。之后将三者进行二级质谱分析，m/z 116+是y1的特征片段，由C末端脯氨酸残基断裂形成，58++是带两个电荷的y1形成的碎片离子，通过脯氨酸残基的脱羧可以形成70+，88+可能是70+加H2O形成的。鉴定出G1E1C1中三个肽的序列是SAP，AMP和TSGP(图9b，c，d)。一级质谱图显示G4E4C1中主要存在一种成分，m/z为318.7(图10a)，也是[M+H]+离子峰，分子量为317.7Da。将318.7进行二级质谱分析，鉴定出肽序列是SDP(图10b)。这些特别的m/z如116+、58++、70+和88+都证明了C末端脯氨酸的存在，并且在每个二级质谱图中都存在，这与预期结果一致。通过查找文献、Biopep数据库和EROP-Moscow数据库，这四种ACE抑制肽以前未曾报道过。
本发明利用胰凝乳蛋白酶和脯氨酸特异内切酶复合酶解牡蛎蛋白，制备了具有较高活性的富含X-Pro结构的ACE抑制肽，得到四条新的ACE抑制肽SAP、AMP、TSGP和SDP，并且都含有Pro羧基末端。
4.肼解法分析酶解产物羧基末端的氨基酸组成
当蛋白质用无水肼处理时，只有羧基末端氨基酸以游离氨基酸的形式释放，通过测定肼解前后游离氨基酸含量的差异，就可以得到酶解产物的羧基末端氨基酸含量。
取10μL(约0.25μmol)样品放于褐色玻璃管内，在85℃真空干燥5-8h，在干燥箱中向玻璃管内加入0.3mL无水肼，立刻在煤气灯上封口(开始时管内无水肼产生烟雾)，100℃反应12h，中间晃动5-6次。反应完成后，取出冷却，打开玻璃封管，立刻放到置有浓硫酸的干燥器中抽干。向抽干后的肼解物中加入2mL水，充分溶解后，再加入0.5mL新鲜蒸馏的苯甲醛，置于30℃振荡反应1h(如果酰肼不能完全沉淀，则调整溶液的pH值并加入稀碱使其中性)。反应完成后，将反应液4800rpm离心20min，取上层清液，油状残渣用3mL水洗二次。水洗液与清液合并后立刻抽干，利用RP-HPLC分析游离氨基酸组成。对照组为没有经过肼解反应的酶解液原液，稀释至相同浓度，检测游离氨基酸的组成。
图2表示了肼解前后酶解产物中游离氨基酸含量的差异，即酶解产物中羧基末端的氨基酸含量。从图中看出，几乎所有氨基酸含量都有不同程度的增加，这与理论相一致。Pro含量的增加最明显，从44.87g/kg增加到143.92g/kg。Pro在酶解产物中所有羧基末端氨基酸中的比例达到50.85％。这表明，所选择的脯氨酸特异内切酶酶发挥着关键作用，它将牡蛎蛋白切成大量具有脯氨酸羧基末端的肽链。
静脉注射动物实验
选择20只自发性高血压大白鼠为实验模型，大白鼠饲养一周后，将其分成2组，每一组10只，每日按大白鼠体重20mg/kg剂量(中剂量组)静脉注射产物Ser-Ala-Pro。
结果表明，1周后对照组大白鼠的血压持续升高，而治疗组自发性高血压大白鼠的血压明显下降，高血压大白鼠的平均收缩压从190mmHg下降到160mmHg说明产物Ser-Ala-Pro经静脉给药具有明显的降血压效果。
灌胃动物实验
选择20只自发性高血压大白鼠为实验模型，大白鼠饲养一周后，将其分成3组，每一组10只，每日按大白鼠体重20mg/kg剂量(中剂量治疗组)灌胃产物Ala-Met-Pro，另一组阳性药物卡普托力(Captopril)对照组，每日按大白鼠体重20mg/kg剂量灌胃。
4周后对照组大白鼠的血压持续升高，而治疗组自发性高血压大白鼠的血压明显下降，高血压大白鼠的平均收缩压从180mmHg下降到155mmHg说明产物Ala-Met-Pro经口服给药具有明显的降血压效果，并且与阳性药物降血压效果及趋势基本一致。
基于上文对本发明的充分理解，申请人相信，本领域技术人员应当容易理解，本发明所述的肽及通过通用方法所获得的其它相关衍生产品，都应当属于本发明保护所延及的范畴。上述通用方法举例但不限于与酸反应产生盐类，或者与金属/阳离子形成的盐类。所述的酸包括但不限于盐酸，硫酸，硝酸，磷酸等无机酸；蚁酸，乙酸，丙酸，甘氨胆酸，苹果酸，柠檬酸，酒石酸，琥珀酸等有机酸。所述的与金属/阳离子形成的盐类包括但不限于钠盐，钾盐，钙盐，铵盐，或者与氨基乙醇，三乙氨，二环乙氨等形成的胺类盐等。
另一方面，对本发明中所述及药物的理解，申请人相信，结合本领域现有技术，所述“药物”可以毫无疑义地理解为各种药物制剂，包括但不限于加入各种医药辅料所制得的散剂、颗粒剂、片剂、胶囊、栓剂、悬浮液、乳化液、喷剂、注射液或粉针剂等。根据不同剂型特点，在使用这些药物进行治疗时，可以通过各种相应的途径给药，典型但不限于可经口服给药、注射给药及粘膜给药。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种X-Pro结构特异型ACE抑制肽，其特征在于，所述X-Pro结构特异型ACE抑制肽的氨基酸序列为Ser-Ala-Pro、Ala-Met-Pro、Thr-Ser-Gly-Pro和Ser-Asp-Pro。
2.一种权利要求1所述X-Pro结构特异型ACE抑制肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(1)：将全牡蛎肉进行预处理，制备牡蛎蛋白；
步骤(2)：第一步酶解：用胰凝乳蛋白酶酶解牡蛎蛋白，得到酶解物Ⅰ；
步骤(3)：第二步酶解：用脯氨酸特异内切酶酶解酶解物Ⅰ，得到富含Pro、Tyr、Phe和Trp羧基末端的牡蛎ACE抑制肽混合物；
步骤(4)：通过Sephadex G25凝胶过滤层析、SuperdexTM 30Increase10/300GL凝胶过滤层析、反相高效液相色谱对步骤(3)得到的混合物进行分离纯化，得到所述X-Pro结构特异型ACE抑制肽。
3.根据权利要求2所述的一种X-Pro结构特异型ACE抑制肽的制备方法，其特征在于，步骤(1)中将全牡蛎肉进行预处理的过程包括：将全牡蛎肉匀浆，加适量水，使固形物浓度为3wt％。
4.根据权利要求2所述的一种X-Pro结构特异型ACE抑制肽的制备方法，其特征在于，步骤(2)中胰凝乳蛋白酶的加入量为固形物的0.2wt％-2.0wt％。
5.根据权利要求2所述的一种X-Pro结构特异型ACE抑制肽的制备方法，其特征在于，步骤(2)中酶解条件为在37℃，pH 8.0条件下酶解1-6h。
6.根据权利要求2所述的一种X-Pro结构特异型ACE抑制肽的制备方法，其特征在于，步骤(3)中脯氨酸特异内切酶的加入量为50-1000U/g。
7.根据权利要求2所述的一种X-Pro结构特异型ACE抑制肽的制备方法，其特征在于，步骤(3)中酶解条件为将酶解物Ⅰ的pH调至4.0，加入脯氨酸特异内切酶，在50℃下酶解1-6h，沸水浴加热10min灭酶活，8000rpm离心5-20min，得到具有较高活性的富含Pro、Tyr、Phe和Trp羧基末端的牡蛎ACE抑制肽混合物。
8.根据权利要求2所述的一种X-Pro结构特异型ACE抑制肽的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述的Sephadex G25凝胶过滤层析过程为：
用Sephadex G25填料制备1.6×60cm的凝胶过滤层析柱，以0.2mL/min流速用去离子水洗脱，检测280nm波长的吸收值，多次上样，收集峰尖冻干，并检测各个峰的ACE抑制活性，收集活性最高的两个组分，命名为G1和G4，进行下一步纯化。
9.根据权利要求2所述的一种X-Pro结构特异型ACE抑制肽的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述的SuperdexTM 30Increase 10/300GL凝胶过滤层析过程为：
(1)选取Sephadex G25凝胶过滤层析得到的活性最高的组分G1和G4，用SuperdexTM30Increase 10/300GL预装柱(分离范围：100-7000Da)在AKTA系统上进一步纯化，以0.3mL/min流速用10mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.4，含150mmol/L NaCl)洗脱，检测280nm波长的吸收值，多次上样，收集峰尖冻干，并检测ACE抑制活性，收集活性最高的两个组份，命名为G1E1和G4E4。
10.根据权利要求2所述的一种X-Pro结构特异型ACE抑制肽的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述反相高效液相色谱的过程为：
(1)选取SuperdexTM 30Increase 10/300GL凝胶过滤层析过程得到的活性最高的组分G1E1和G4E4，用Agilent Zorbax SB-Aq C18在高效液相色谱系统上进一步纯化，流动相是乙腈：水(含0.1％TFA)＝5:95，以0.5mL/min流速和25℃柱温洗脱；检测波长215nm，多次上样，收集峰尖冻干，并检测ACE抑制活性，收集活性最高的两个组份，命名为G1E1C1和G4E4C1，对G1E1C1和G4E4C1进行二次分离，仅收集峰尖冻干，得到所述X-Pro结构特异型ACE抑制肽。
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