CN113652459A - 一种鳕鱼皮胶原蛋白肽及其提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种鳕鱼皮胶原蛋白肽及其提取方法，其氨基酸序列为(Gly‑X‑Y)n。本发明从鱼皮中提取的胶原蛋白肽，胃蛋白酶是提取率最高的胶原解聚酶，提取率达47.04％±1.36％，具有蛋白质含量高、灰分少、重金属含量低、分子量小于120k道尔顿，白色粉末、无异味、完全溶于水等特性。
Description
技术领域
本发明涉及一种鳕鱼皮胶原蛋白肽及其提取方法，特别是，本发明涉及采用胃蛋白酶提取的鳕鱼皮胶原蛋白肽及其提取方法。
背景技术
随着我国对胶原蛋白深入研究，胶原蛋白的天然聚合物性质和性质对人类的贡献，胶原蛋白在食品、化妆品、医学等方面的应用和需求越来越广。胶原蛋白是一种生物聚合物，主要存在于动物结缔组织中。胶原蛋白也是一种功能蛋白，广泛分布于哺乳动物中，含量最高。与许多牲畜胶原蛋白相比，由于氨基酸组成的不同，水产品加工废料中所含的胶原蛋白(如皮肤，骨骼和鳞屑中的丰富胶原蛋白)具有许多优点，例如低过敏和非排异等。胶原蛋白由于其良好的生物活性而被用于许多领域，包括食品工业，制药工业，化妆品工业，生物材料等。然而，随着全球范围内诸如口蹄疫和疯牛病之类的牲畜疾病的爆发，源自哺乳动物的胶原蛋白的安全性变得越来越严重。因此，水产品已成为理想的胶原蛋白来源。水生资源的综合利用以及如何降低鱼类加工成本已成为新型开发胶原蛋白资源的驱动力。胶原蛋白是胶原完全水解的产物。胶原蛋白的三螺旋结构被完全分离和破坏，并且是不可逆的。目前来看，胶原蛋白的提取方法有热水提取、酸法提取、碱法提取、酶法提取和盐法提取等。每种提取方法各有利弊。
现有技术中，热水法提取就是经过预处理后的原料用相应温度的热水浸泡提取。该方法方便快速、操作简单、提取率高。但由于提取过程中作用温度比较高，胶原蛋白大多数变性为分子量较低的明胶，成纤维能力等生物活性丧失。酸法提取胶原蛋白是低浓度的酸使胶原蛋白分子间的氢键断裂，引起胶原纤维胀解，从而被提取出来。常用的酸包括醋酸、柠檬酸、盐酸和乳酸等，采用酸法提取得到胶原蛋白，通常管这种胶原叫做酸溶胶原(ASC)。酸法提取得到的胶原蛋白，纯度较高，但色氨酸全部失活，且提取率低。碱法提取多用于工业制取明胶，强碱溶液使得胶原纤维吸水膨胀、松散、张开，蛋白分子间的结合力减弱，更易于胶原蛋白的溶出。有关碱法提取胶原蛋白的研究，多见于从皮革废弃边角料中提取胶原蛋白，皮革的脱铬处理是提取的关键。碱法即将含胶原蛋白的原料如鱼皮鱼鳞等，浸泡在NaOH或 Ca(OH)2中，提取率非常低。碱水解会引起肽键水解，如果水解过度，会变成明胶。明胶中含有D型氨基酸和DL型氨基酸消旋混合物，发生消旋现象，最终提取溶液中会含有D型L型氨基酸。其中有些外消旋氨基酸有毒，甚至可能致癌。碱法提取生产过程可使三螺旋结构被严重破坏，造成蛋白变性，还产生有毒物质，无生物利用价值，因此很少人使用碱法进行完整提取，对碱法提取胶原蛋白研究较少。酶法提取主要运用酶可以切割下来共价键，导致胶原蛋白末端肽链无法连接。使得肽链展开，但主体仍为三螺旋结构。酶法提取胶原具有效率高、易于控制、纯度高等优点，一般情况下，常见的蛋白酶主要有微生物蛋白酶、动物蛋白酶及植物蛋白酶。
因此，胶原蛋白在提取时，一定要注意温度的控制等因素，否则会影响到胶原蛋白的结构等，在需要大量的且质量较好的胶原蛋白时，可以将酸提取法和酶提取法结合、这不仅提高鱼皮胶原蛋白的提取率，也可以得到质量更好的胶原蛋白。
发明内容
本发明还提供一种鳕鱼皮胶原蛋白肽的提取方法，包括以下步骤：
将鱼皮用含7.5％氯化钠的0.02mol/L氢氧化钠于20℃浸泡18h后，蒸馏水洗涤数次，置于10％正丁醇溶液磁力搅拌一小时，间隔一小时，重复多次；
将预处理后的鱼皮按料液比1∶20加入0.5mol/L乙酸中，并加入鱼皮质量2％的胃蛋白酶，磁力搅拌提取24h，离心取上清；
加入一定质量的氯化钠至上清液氯化钠溶液最终浓度为0.9mol/L，静置过夜后于4℃，6000r/min离心20min，弃上清；
脱色去味，按照干皮5％的量称量活性炭和氯化钙，将其全部倒入过滤液进行充分混合，将混合液至于60度的水中进行恒温，十分钟内搅拌二次后静止沉淀20分钟，带有上清液吸出时进行过滤；
加入10倍体积的0.1mol/L的乙酸中溶解沉淀，并在10倍体积的0.1mol/L乙酸溶液中透析12h，每4h换一次透析液，蒸馏水透析至中性，得到酶溶性胶原蛋白提取液；
冷冻干燥得到酶溶性胶原蛋白(PSC)。
本发明进一步提供一种鳕鱼皮胶原蛋白肽粉的制备方法，按照本发明所述的方法提取得到的胶原蛋白，将酶解液置于平皿中于-70℃冷冻4h，或-20℃冷冻24h。
如本发明从鱼皮中提取的胶原蛋白肽，胃蛋白酶是提取率最高的胶原解聚酶，提取率达47.04％±1.36％，具有蛋白质含量高、灰分少、重金属含量低、分子量小于120k道尔顿，白色粉末、无异味、完全溶于水等特性。1、形态：粉末状、无结块，小颗粒，水溶性和流动性非常好；2、分子量：≤130kDa(道尔顿)；3、色泽：白色或微黄；4、气味：无鱼腥味；5、杂质：无肉眼可见外来杂质；6、溶解度：易溶于水；7、蛋白质含量：≥95％。
附图说明
图1示出羟脯胺酸质量浓度与吸光值关系的标准曲线图。
图2示出不同酶提取鳕鱼鱼皮胶原蛋白的结果。
图3示出提取鳕鱼鱼皮胶原蛋白SDS-PAGE图谱。
图4示出不同处理方法提取的鳕鱼皮胶原蛋白的扫描电子显微镜照片。
图5示出鳕鱼鱼皮胶原蛋白图片。
具体实施方法
下面，将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行详细的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。图1示出羟脯胺酸质量浓度与吸光值关系的标准曲线图。图2 示出不同酶提取鳕鱼鱼皮胶原蛋白的结果。图3示出提取鳕鱼鱼皮胶原蛋白SDS-PAGE图谱。图4示出不同处理方法提取的鳕鱼皮胶原蛋白的扫描电子显微镜照片。图5示出鳕鱼鱼皮胶原蛋白图片。
在本发明中，采用鳕鱼干皮(吉林省延吉市鑫平水产)；复合催化活性酶(酶活力3000U/g)；胃蛋白酶(酶活力3000U/g)；碱性蛋白酶(酶活力20000U/g)；中性蛋白酶(酶活力10000U/g)；SDS-PAGE试剂盒。其它试剂均为分析纯，来自北京索莱宝科技有限公司。
胶原蛋白可细分为：大分子胶原蛋白和小分子胶原蛋白肽，平常我们食用猪蹄的胶质，里面含有胶原蛋白，但是它是大分子蛋白质，其分子量在30万道尔顿以上，并不能被人体直接吸收并且吸收率很低；而通过酸碱、酶切等技术把分子量控制在6000道尔顿以内的胶原蛋白，称之为胶原蛋白肽，肽是介于氨基酸和大分子蛋白质之间的物质，两个或以上的氨基酸脱水缩合形成若干个肽键从而组成一个肽，多个肽进行多级折叠就组成一个蛋白质分子。肽是精准的蛋白质片段，其分子只有纳米般大小，胃肠、血管及肌肤等极易吸收，其吸收率要远远高于大分子蛋白质。本发明提供的一种鳕鱼皮胶原蛋白肽，其氨基酸序列为(Gly-X-Y)n，其中，n为1000左右。所述的鳕鱼皮胶原蛋白肽，分子量小于120k道尔顿。
众所周知，胶原蛋白在提取时，一定要注意温度的控制等因素，否则会影响到胶原蛋白的结构等，在需要大量的且质量较好的胶原蛋白时，可以将酸提取法和酶提取法结合、这不仅提高鱼皮胶原蛋白的提取率，也可以得到质量更好的胶原蛋白。以胶原的热稳定性研究为基础，在临界热变性温度附近对胶原进行提取，采用生物酶对提取的胶原进行酶解，然后采用膜过滤的方法控制分子量的分布。通过温度控制实现胶原提取过程不变性，减少美拉德反应的发生，抑制有色物质的形成。反应条件温和，多肽分子量均一、范围可控，并能减少挥发性物质的产生，抑制腥味，是2019年为止最为先进的胶原蛋白肽制备工艺。
本发明所述的鳕鱼皮胶原蛋白肽可用于，从鱼皮中提取的胶原蛋白肽具有良好的生物活性，更容易被人体吸收利用。根据相关研究，鱼皮胶原蛋白肽具有许多生理功能：美容和护肤，防止皮肤老化；抗氧化；促进钙吸收，增加骨密度，改善骨缺损；增强人体免疫力；具有良好的生物相容性；具有一定的血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性等。
从鱼皮中提取的胶原蛋白肽具有良好的生物活性，更容易被人体吸收利用。根据相关研究，鱼皮胶原蛋白肽具有许多生理功能：美容和护肤，防止皮肤老化；抗氧化；促进钙吸收，增加骨密度，改善骨缺损；增强人体免疫力；具有良好的生物相容性；具有一定的血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性等。
胶原蛋白肽具有良好的保湿，锁水，美白功效。胶原蛋白广泛用于市场上的美容和护肤产品。胶原蛋白肽可以补充水分，减少游离脂肪酸含量，并提高皮肤愈合速度。使用碱性蛋白酶水解鳕鱼皮胶原蛋白，发现其分子量越小，胶原蛋白肽在体外的吸湿性和保湿性就越好。小分子量的胶原蛋白肽可以有效修复因衰老引起的皱纹，松弛等现象。事实证明，鳕鱼皮胶原蛋白肽是一种可以保护皮肤，修复皮肤结构和功能受损的物质。
人体内生理代谢以及来自外界环境的因素等原因会导致机体产生大量的自由基产物。自由基产物如果不被及时清理掉就会攻击机体的免疫系统，导致内脏器官受损、细胞发生癌变、功能障碍等。如今，一些疾病，例如动脉硬化，糖尿病和身体衰老，都是由氧化应激损伤和自由基代谢紊乱引起的。
研究表明，胶原蛋白肽可以增加小鼠血液和皮肤中的超氧化物歧化酶(SOD)的活性，提高清除过量自由基的能力。
钙是人体中较丰富的元素之一。骨骼和牙齿含有最多的钙，钙在人体的新陈代谢和神经系统的运作中起着至关重要的作用。随着衰老趋势变得越来越严重，患有骨质疏松症的人数急剧增加。在人类生长，发育和老年期间，钙的摄入量是维持和稳定人体骨质的重要且可调节的因素。胶原蛋白肽中所含的甘氨酸和脯氨酸可增强人体对钙的吸收。特殊的氨基酸之一，羟脯氨酸，是钙的载体，它可以将钙运输到人体的骨细胞，从而可以改善人体对钙的吸收和利用，改善骨质疏松症。
近几年以来，胃溃疡的发病率由于大量饮酒一直在增加。胃是主要吸收酒精的部位。胃粘膜会因高浓度酒精而造成严重损害，造成胃表面上皮细胞糜烂，溃疡和出血等症状。肝脏是人体重要的消化腺及新陈代谢器官。在人体新陈代谢过程中，会产生一些毒素和外来毒素，这些毒素和异物都在肝脏中被解毒。
胶原蛋白天然存在于鱼皮和鱼鳞中，是一种天然食品成分。该产品是采用鱼皮、鱼鳞为原料经蛋白酶酶解制成的胶原蛋白类物质。其在我国也有一定的消费历史，可作为一般食品的生产经营。在我国，口服胶原蛋白作为新兴产业，其表现形式包括胶原蛋白胶囊、胶原蛋白软糖、胶原蛋白口服液等还将接受市场检验、赢得大众口碑后可迎来积极发展。
胶原蛋白含有19种氨基酸，在营养、抗氧化剂、抗炎和代谢方面起着重要的作用。胶原蛋白可以加快伤口愈合，减少伤口感染并保持湿润。胶原蛋白大都制成海绵或薄膜等形式参与皮肤烧伤或者皮肤大面积创伤的治疗，也可以与其他如抗菌剂、舒缓疼痛、起到促进伤口愈合的药物等相结合使用。胶原蛋白具有良好的生物相容性，方便降解、且不易与机体发生排异反应。它方便加工且穿透力强，这些特点使其成为一种良好的可植入机体的替代组织的材料。胶原蛋白也会被制成味道良好的软凝胶、软糖或胶囊用作营养补充剂。这些产物可以使药物或者营养更容易被吸收，并且还由易于大众接受。
实施例
1、复合催化活性酶法提取胶原蛋白
将处理好的鳕鱼皮与水1∶20(M/V)混合，加入1500U/g复合活性催化酶在65℃恒温水浴2h提取。脱色去味，按照干皮5％的量称量活性炭和氯化钙，将其全部倒入过滤液进行充分混合，将混合液至于60℃中进行恒温静止沉淀20分钟，将上清液吸出进行过滤。用800目的滤布进行正压过滤，使活性炭和杂质全部滤出。6000r/min离心20min 后取上清液，加入氯化钠至上清液浓度为0.9mol/L，静置过夜。离心 20min，弃去上清液，加入一定量的0.1mol/L乙酸溶解沉淀，然后用 0.1mol/L乙酸透析12h，每4h更换透析液，并透析至中性用蒸馏水。
2、胃蛋白酶法提取胶原蛋白
将预处理后的鱼皮粉碎后加入浓度为0.5mol/L醋酸溶液(1∶20 w/v)，酶用量为1500U/g胃蛋白酶并磁力搅拌6h。过滤后加入活性炭和氯化钙脱色去味。盐析、离心、透析和冻干过程与以上提取相同。
3、碱性蛋白酶法提取胶原蛋白
将处理好的鳕鱼皮与水1∶20(M/V)混合，调整pH为9，酶用量为 1500U/g在50℃下提取6h。盐析、离心、透析和冻干过程与以上提取相同。
4、中性蛋白酶法提取胶原蛋白
将处理好的鳕鱼皮与水1∶20(M/V)混合，调整pH为7，酶用量为 1500U/g在45℃下提取6h。盐析、离心、透析和冻干过程与以上提取相同。
将纯化处理后的胶原蛋白液置于大平皿中，高度不超过平皿壁的三分之二。于-70℃冰箱冷冻4h或-20℃冷冻24h。样品必须完全结冰，如有残留液体则易造成气化喷射。启动真空泵前，检查出水阀和充气阀，有机玻璃罩与橡胶圈是否清洁无污物，之后良好密封。放置样品进行冷冻干燥处理。真空度为55-60，温度-42℃，冷冻干燥24h后取出称重。结束后，打开机箱左侧的出水阀以排出水，然后清洁冷阱的内壁，最后用罩布盖住以防止灰尘。
本发明因羟脯氨酸为胶原蛋白特有氨基酸，按照GB/T 9695.23- 2008《肉与肉制品羟脯氨酸含量测定》的方法测定羟脯氨酸的含量。以L-羟脯氨酸标准溶液的质量浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，得曲线方程：绘制标准曲线，得曲线方程Y＝0.766X-0.019 式中，R2＝0.9982，Y为595nm处测定的吸光值值，X为蛋白质含量。图1示出羟脯胺酸质量浓度与吸光值关系的标准曲线。将冻干样品溶解，配置成质量浓度为10mg/mL的胶原蛋白溶解液，以体积比(3∶1) 与4×上样缓冲液混合，沸水浴3min，与蛋白Marker一起上样，在 210V的恒流下进行电泳，结束后转移电泳胶到快速染色液中处理中染色，脱色。凝胶成像仪观察成像。
胶原蛋白在130℃下用6mol/L盐酸水解4小时，脱酸后，用去离子水定容至5mL，并用自动氨基酸分析仪检测。取适量胶原蛋白样品在仪器上扫描，波长范围设置为4000～500cm-1，采集速率为2cm-1/s。
0.5mol/L乙酸溶液分别溶解适量的冻干样品以制备0.5mg/mL胶原蛋白溶液，以0.5mol/L乙酸溶液作空白对照。在190～400nm处以2 nm/s的速度对胶原蛋白溶液进行扫描，采集速率为0.5nm/s。
将冻干的样品固定在导电胶上，经真空喷金处理后，用扫描电子显微镜观察胶原蛋白的微观结构，对不同放大倍数下的胶原蛋白的形态特征进行观察。
所有试验均做3次平行。试验数据采用WPS Excel 2019和SPSS Statistics 19.0统计软件进行分析。采用GraphPad Prism软件作图。结果用“平均值±标准差”表示，P＜0.05为结果差异显著。
胶原蛋白提取率的测定
四种蛋白酶处理提取的鳕鱼鱼皮胶原蛋白提取率如图2所示。由图可以看出，胃蛋白酶是提取率最高的胶原解聚酶，提取率达47.04％±1.36％，而其他三种酶法提取率相差不多在24.94％-38.92％之间。总体来说酶法提取作用条件温和，操作方便且安全性高，经鉴定得到的胶原蛋白纯度较高，且不会造成很大的损伤，性质比较稳定。
实施例1
活性炭胃蛋白酶酶解法
(1)将鱼皮用含7.5％氯化钠的0.02mol/L氢氧化钠于20°浸泡18h 后，蒸馏水洗涤数次，置于10％正丁醇溶液磁力搅拌一小时，间隔一小时，重复五次。蒸馏水洗涤数次后沥干水分并在30℃恒温干燥箱中烘干备用。
(2)将预处理后的鱼皮按料液比1∶20加入0.5mol/L乙酸中，并加入鱼皮质量1500U/g的胃蛋白酶，40℃提取4小时，离心取上清。
(3)加入一定质量的氯化钠至上清液氯化钠溶液最终浓度为 0.9mol/L，静置过夜后于4℃，6000r/min离心20min，弃上清。
(4)脱色去味，按照干皮5％的量称量活性炭和氯化钙，将其全部倒入过滤液进行充分混合，将混合液至于60度的水中进行恒温，十分钟内搅拌后静止沉淀20分钟，带有上清液吸出时进行过滤。
(5)加入10倍体积的0.1mol/L的乙酸中溶解沉淀，并在10倍体积的0.1mol/L乙酸溶液中透析12h，每4h换一次透析液，蒸馏水透析至中性，得到酶溶性胶原蛋白提取液。
(6)冷冻干燥得到酶溶性胶原蛋白(PSC)。将酶解液置于平皿中于- 70℃冷冻4h，或-20℃冷冻24h。冷冻干燥机预冷至温度为-42℃。放入平皿，打开真空泵使真空度降到50至60，冷冻干燥24h。关闭真空泵，排气，拿出平皿并收集粉末。
(7)将干燥分进行粉碎，装袋，密封保存。
通过以上方法，制备得到的蛋白质含量为97％。
实施例2
除了改变以下步骤之外，其余按照实施例1相同的方法制备。将预处理后的鱼皮按料液比1∶20加入0.5mol/L乙酸中，并加入鱼皮质量 1500U/g的胃蛋白酶，35℃提取3小时，离心取上清。通过以上方法，制备得到的蛋白质含量为87.5％。
实施例3
除了改变以下步骤之外，其余按照实施例1相同的方法制备。将预处理后的鱼皮按料液比1∶20加入0.5mol/L乙酸中，并加入鱼皮质量 1500U/g的胃蛋白酶，35℃提取5小时，离心取上清。通过以上方法，制备得到的蛋白质含量为85.4％。
实施例4
除了改变以下步骤之外，其余按照实施例1相同的方法制备。将预处理后的鱼皮按料液比1∶20加入0.5mol/L乙酸中，并加入鱼皮质量 1500U/g的胃蛋白酶，45℃提取5小时，离心取上清。通过以上方法，制备得到的蛋白质含量为85.1％。
实施例5
除了改变以下步骤之外，其余按照实施例1相同的方法制备。将预处理后的鱼皮按料液比1∶20加入0.5mol/L乙酸中，并加入鱼皮质量 1500U/g的胃蛋白酶，45℃提取3小时，离心取上清。通过以上方法，制备得到的蛋白质含量为89.1％。
实施例6
除了改变以下步骤之外，其余按照实施例1相同的方法制备。将预处理后的鱼皮按料液比1∶20加入0.5mol/L乙酸中，并加入鱼皮质量 1200U/g的胃蛋白酶，40℃提取5小时，离心取上清。通过以上方法，制备得到的蛋白质含量为75.5％。
实施例7
除了改变以下步骤之外，其余按照实施例1相同的方法制备。将预处理后的鱼皮按料液比1∶20加入0.5mol/L乙酸中，并加入鱼皮质量 1200U/g的胃蛋白酶，35℃提取4小时，离心取上清。通过以上方法，制备得到的蛋白质含量为79.3％。
实施例8
除了改变以下步骤之外，其余按照实施例1相同的方法制备。将预处理后的鱼皮按料液比1∶20加入0.5mol/L乙酸中，并加入鱼皮质量 1200U/g的胃蛋白酶，40℃提取3小时，离心取上清。通过以上方法，制备得到的蛋白质含量为85.2％。
实施例9
除了改变以下步骤之外，其余按照实施例1相同的方法制备。将预处理后的鱼皮按料液比1∶20加入0.5mol/L乙酸中，并加入鱼皮质量 1200U/g的胃蛋白酶，45℃提取4小时，离心取上清。通过以上方法，制备得到的蛋白质含量为87.5％。
实施例10
除了改变以下步骤之外，其余按照实施例1相同的方法制备。将预处理后的鱼皮按料液比1∶20加入0.5mol/L乙酸中，并加入鱼皮质量 1800U/g的胃蛋白酶，40℃提取3小时，离心取上清。通过以上方法，制备得到的蛋白质含量为79.2％。
实施例11
除了改变以下步骤之外，其余按照实施例1相同的方法制备。将预处理后的鱼皮按料液比1∶20加入0.5mol/L乙酸中，并加入鱼皮质量 1800U/g的胃蛋白酶，45℃提取4小时，离心取上清。通过以上方法，制备得到的蛋白质含量为85.0％。
实施例12
除了改变以下步骤之外，其余按照实施例1相同的方法制备。将预处理后的鱼皮按料液比1∶20加入0.5mol/L乙酸中，并加入鱼皮质量 1800U/g的胃蛋白酶，45℃提取4小时，离心取上清。通过以上方法，制备得到的蛋白质含量为89.8％。
实施例13
除了改变以下步骤之外，其余按照实施例1相同的方法制备。将预处理后的鱼皮按料液比1∶20加入0.5mol/L乙酸中，并加入鱼皮质量 1800U/g的胃蛋白酶，40℃提取5小时，离心取上清。通过以上方法，制备得到的蛋白质含量为85.7％。
在本发明中，图1示出羟脯胺酸质量浓度与吸光值关系的标准曲线图，因羟脯氨酸为胶原蛋白特有氨基酸，按照GB/T 9695.23-2008 《肉与肉制品羟脯氨酸含量测定》的方法测定羟脯氨酸的含量。以L- 羟脯氨酸标准溶液的质量浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，得曲线方程：绘制标准曲线，得曲线方程Y＝0.766X-0.019式中， R2＝0.9982，Y为595nm处测定的吸光值值，X为蛋白质含量。
胶原蛋白提取率计算公式为：
如图3所示，胃蛋白酶提取的胶原蛋白结构孔隙最小且相对最均匀，结构保存完整。胶原蛋白的孔径大小、网络结构以及表面积是胶原蛋白应用于药物输送等生物医学材料的重要参数。而这种复杂多孔的网状结构和排列较不规则的纤维状表明胶原蛋白有很好的保湿吸水性。图3中，a-1，2，3：胃蛋白酶提取；b-1，2，3：复合催化活性酶提取； c-1，2，3：中性蛋白酶提取；d-1，2，3：碱性蛋白酶提取。
图4示出鳕鱼鱼皮胶原蛋白图片。从形态来看，胃蛋白酶提取的胶原蛋白较其他三种质地轻盈但有轻微的结块，是具有较为松散的海绵感的固态。
在加工胶原蛋白方面，与传统的喷雾干燥技术、微波干燥技术、超临界流体干燥技术相比，真空冷冻干燥技术可以最大程度地保留胶原蛋白中的有效成分，保持材料的原始结构，并且不会浓缩。干燥后的物质疏松多孔，呈海绵状，避免了极片真空开裂的问题等优点。冻干处理的胶原蛋白加水后极易溶液而复原且由于是在真空条件下，极大地缓解的胶原蛋白的氧化，是一种理想的胶原蛋白加工方式。
胃蛋白酶提取的胶原蛋白结构孔隙最小且相对最均匀，结构保存完整。胶原蛋白的孔径大小、网络结构以及表面积是胶原蛋白应用于药物输送等生物医学材料的重要参数。而这种复杂多孔的网状结构和排列较不规则的纤维状表明胶原蛋白有很好的保湿吸水性。
通过对四种酶提取胶原蛋白的比较分析结果可知，胃蛋白酶提取胶原蛋白的提取率最高，这是由于胃蛋白酶是一种动物蛋白酶且作用在酸性条件下，能够裂解端肽结构，因此提高了胶原蛋白在酸性条件下的溶解性。而其他三种蛋白酶酶作用的化学键广泛，因此提取率不及胃蛋白酶。由SDS-PAGE电泳可知胃蛋白酶存在d链，说明胃蛋白酶作用于胶原蛋白的非螺旋端肽，而不破坏胶原蛋白结构，仅促进胶原蛋白从皮中溶解，3种酶处理在谱图上不显示条带，可能是酶在处理过程中使大分子降解成小分子的组分造成的。四种酶提取的胶原蛋白甘氨酸，脯氨酸和羟脯氨酸的含量均较高，符合I型胶原蛋白氨基酸组成特征。这是因为胶原蛋白多肽链长且序列重复为Gly-X-Y氨基酸序列。羟脯氨酸作为胶原蛋白中的特征氨基酸，能够促进肽链间氢键的形成，进而维持胶原蛋白三螺旋结构的稳定性，保持胶原蛋白的热稳定性质。N-H基团伸缩振动产生酰胺A，酰胺A的存在说明了胶原蛋白的三螺旋结构，其吸收峰在3400～3440cm-1。当多肽中的·N-H基团伸缩与氢键相互作用时，会使吸收峰降低100cm-1左右。由图中看出 5种样品在3300cm-1附近有吸收峰，说明5种胶原蛋白均有氢键存在；分子中CH2基团的不对称伸缩振动产生的酰胺B。说明得到的胶原蛋白的三级结构均保留完好。酰胺I、酰胺II和酰胺III带反映出蛋白质肽链骨架结构的重要吸收峰，其与胶原蛋白的三螺旋结构密切相关，说明酶法提取的胶原蛋白完整保留了三螺旋结构。生色基团-COOH、 -CONH2和-C＝O有很强的紫外吸收特性且存在于胶原蛋白中。紫外吸收光谱实际上是蛋白质分子各种紫外生色基团加和的结果，是判断胶原蛋白类型的一个重要标志。四种酶提取得到的胶原蛋白在235nm左右吸收峰峰值较大。不同蛋白酶酶因其作用位点不同，因此对皮中胶原蛋白的提取有不同的影响。四种酶处理得到的胶原蛋白均呈现连续且紧密的孔状结构，水解程度具有一定差异，但都保留了较完整的纤维结构。几种蛋白酶提取的胶原蛋白显示网状结构分布不均匀，同时存在薄片状，孔径相对酸法大小不一且分布不均，可能是冻干前浓度不同所导致。但对比来看胃蛋白酶所提取的胶原蛋白结构最为完整，孔隙最为均匀。本发明的胃蛋白酶效果最佳，提取率为47.04％±1.36％；
在本发明中，根据SDS-PAGE电泳分析、紫外光谱分析、氨基酸分析结果，确定鳕皮中的胶原蛋白为I型胶原蛋白；
在本发明中，傅里叶红外光谱扫描显示，四种酶处理方法处理后，都出现了酰胺A、B、I、II和III特征吸收峰，说明都存在三螺旋结构；扫描电镜显示，胃蛋白酶处理得到的胶原蛋白结构保存最完整，孔隙分布最均匀。其他几种酶法处理的胶原蛋白的纤维网状结构有一定差异，结构保存不及胃蛋白酶提取的胶原蛋白完整。
本发明从鱼皮中提取的胶原蛋白肽，其含量在95％以上，具有蛋白质含量高、灰分少、重金属含量低、分子量小于120k道尔顿，白色粉末、无异味、完全溶于水等特性。1、形态：粉末状、无结块，小颗粒，水溶性和流动性非常好；2、分子量：≤130kDa(道尔顿)(提供分子量计算方法)；3、色泽：白色或微黄；4、气味：无鱼腥味；5、杂质：无肉眼可见外来杂质；6、溶解度：易溶于水；7、蛋白质含量：≥95％。本发明以鳕鱼皮为原料，采用酶解工艺，提取胶原蛋白并研究其特性，不仅能增加鳕鱼皮的附加值并使废弃物再利用，它还可以满足各个行业对胶原蛋白和活性胶原蛋白肽的需求。从而提高我国水产养殖业的可持续发展，还能够生产出人们所需的抗氧化肽，为抗氧化类产品、保健品的研发提供有效的参考数据。为功能性食品、药品以及护肤品的生产提供辅料，给人们带来重大的经济价值及良好的社会效益。解决了鳕鱼深加工副产物的增殖问题，减少了环境的污染，保持了人类和自然的可持续性发展。
Claims (2)
1.一种鳕鱼皮胶原蛋白肽的提取方法，其特征在于包括以下步骤：
将鱼皮用含7.5％氯化钠的0.02mol/L氢氧化钠于20℃浸泡18h后，蒸馏水洗涤数次，置于10％正丁醇溶液磁力搅拌一小时，间隔一小时，重复多次；
将预处理后的鱼皮按料液比1∶20加入0.5mol/L乙酸中，并加入鱼皮质量2％的胃蛋白酶，磁力搅拌提取24h，离心取上清；
加入一定质量的氯化钠至上清液氯化钠溶液最终浓度为0.9mol/L，静置过夜后于4℃，6000r/min离心20min，弃上清；
脱色去味，按照干皮5％的量称量活性炭和氯化钙，将其全部倒入过滤液进行充分混合，将混合液至于60度的水中进行恒温，十分钟内搅拌后静止沉淀20分钟，带有上清液吸出时进行过滤；
加入10倍体积的0.1mol/L的乙酸中溶解沉淀，并在10倍体积的0.1mol/L乙酸溶液中透析12h，每4h换一次透析液，蒸馏水透析至中性，得到酶溶性胶原蛋白提取液；
冷冻干燥得到酶溶性胶原蛋白(PSC)。
2.一种鳕鱼皮胶原蛋白肽粉的制备方法，其特征在于，其特征在于包括以下步骤：
将鱼皮用含7.5％氯化钠的0.02mol/L氢氧化钠于20℃浸泡18h后，蒸馏水洗涤数次，置于10％正丁醇溶液磁力搅拌一小时，间隔一小时，重复多次；
将预处理后的鱼皮按料液比1∶20加入0.5mol/L乙酸中，并加入鱼皮质量2％的胃蛋白酶，磁力搅拌提取24h，离心取上清；
加入一定质量的氯化钠至上清液氯化钠溶液最终浓度为0.9mol/L，静置过夜后于4℃，6000r/min离心20min，弃上清；
脱色去味，按照干皮5％的量称量活性炭和氯化钙，将其全部倒入过滤液进行充分混合，将混合液至于60度的水中进行恒温，十分钟内搅拌后静止沉淀20分钟，带有上清液吸出时进行过滤；
加入10倍体积的0.1mol/L的乙酸中溶解沉淀，并在10倍体积的0.1mol/L乙酸溶液中透析12h，每4h换一次透析液，蒸馏水透析至中性，得到酶溶性胶原蛋白提取液；
冷冻干燥得到酶溶性胶原蛋白(PSC)；
将酶解液置于平皿中于-70℃冷冻4h，或-20℃冷冻24h。
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