CN112516166A - 一种鹿血浆蛋白肽粉冷冻干燥粉化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及药物加工技术领域，具体地说，涉及一种鹿血浆蛋白肽粉冷冻干燥粉化方法。包括制备新鲜鹿血浆、制备鹿血浆蛋白肽溶液以及对鹿血浆蛋白肽溶液进行冷冻干燥处理等步骤，制得鹿血浆蛋白肽粉。本发明设计可以在保证血浆原料活性的前提下，提高血浆蛋白质裂解的效果，提高血浆蛋白肽的产量，且可以提高产品的抗氧化性，进而延长成品的保存期限，同时可以在保持蛋白活性的前提下，快速完成血浆蛋白肽的冷冻操作，提高冷冻干燥的效果，降低加工过程中血浆蛋白肽的失活率，减少营养流失，从而有效保留了其鹿血发挥壮阳作用的有效成分，最大限度发挥鹿血壮阳的医用保健价值。
Description
技术领域
本发明涉及药物加工技术领域，具体地说，涉及一种鹿血浆蛋白肽粉冷冻干燥粉化方法。
背景技术
鹿血为鹿科动物梅花鹿和马鹿的血液，具有很高的营养价值，亦是一种名贵中药，具有壮阳的药用价值。动物类中药的有效成分以蛋白多肽为主，活性蛋白多肽是其发挥药用价值的主要成分。但是，鹿血浆蛋白肽在加工过程中，很多因素都会影响血浆原料中蛋白肽的含量及活性，从而导致成品药物中的血浆蛋白肽含量降低，导致成品药物的质量低下，进而限制了鹿血壮阳的药用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鹿血浆蛋白肽粉冷冻干燥粉化方法，以解决上述背景技术中提出的问题，包括如下步骤：
S1、制备新鲜鹿血浆；
S2、制备鹿血浆蛋白肽溶液；
S3、对鹿血浆蛋白肽溶液进行冷冻干燥处理。
作为本技术方案的进一步改进，所述S1中，制备新鲜鹿血浆的方法包括如下步骤：
S1.1、取检疫合格的鹿动脉血液，加入体积为血液体积8％`10％的4％柠檬酸钠抗凝剂，充分混合；
S1.2、将充分混合的液体分置于离心管中，在4℃下设定离心转速2000rpm、离心时间12min，使溶液分为三层；
S1.3、吸取上述离心后的上层液体置于新的离心管中，在4℃下设定离心转速4200rpm、离心时间15min，使溶液分为两层；
S1.4、吸取上述离心后的上层液体，得到新鲜度鹿血浆，将其保存于4℃的冰箱中。
作为本技术方案的进一步改进，所述S1.2中，离心后的溶液分为上中下三层，其中上层为富含血小板的血浆层，中层为富含白细胞的外周血单核细胞层，下层为红细胞层。
作为本技术方案的进一步改进，所述S1.3中，离心后的溶液分为上下两层，其中上层清液为血浆层，底部沉淀为血小板。
作为本技术方案的进一步改进，所述S2中，制备鹿血浆蛋白肽溶液的方法包括如下步骤：
S2.1、将分离所得的新鲜鹿血浆置于反应罐A中，调节温度至36～38℃，加入HCl调节pH值至1.2～1.5，按酶/底物为2.5％～3％的重量比加入以壳聚糖为载体的固定化胃蛋白酶，恒温酶解3h；
S2.2、加入NaOH调节pH值至7.0～7.3，在4℃条件下设定离心转速8200rpm、离心时间15min，弃沉淀物，取上清液转入反应罐B；
S2.3、反应罐B的温度设置为55～60℃，加入NaOH调节pH值至8.2～8.5，按酶/底物为2％～2.3％的重量比加入以壳聚糖为载体的固定化碱性蛋白酶，恒温酶解2h；
S2.4、加入NaOH调节pH值至7.0～7.3，在4℃条件下，设定离心转速8200rpm、冷冻离心15min，取上清液得到鹿血浆蛋白肽溶液。
作为本技术方案的进一步改进，所述S2.2中，加入的以壳聚糖为载体的固定化胃蛋白酶选取分子量为35000的消化酶。
作为本技术方案的进一步改进，所述S2.5中，加入以壳聚糖为载体的固定化碱性蛋白酶的含量为8500U/g。
作为本技术方案的进一步改进，所述S3中，对鹿血浆蛋白肽溶液进行冷冻干燥处理的方法包括如下步骤：
S3.1、将新制得的鹿血浆蛋白肽溶液置于冷冻罐中预冷至-5～-8℃，溶液体积不超过罐体的75％；
S3.2、将预冷的鹿血浆蛋白肽敲碎，轻微搅拌混匀，设置温度-32～-35℃，冷冻2～2.5h；
S3.3、将温度调整为-40～-70℃，冷冻30min后，将冷冻罐抽真空至10～20Pa；
S3.4、设定抽真空-升温循环，即当罐压达到10～20Pa后停止抽真空，缓慢升温使罐压回升，罐压升至90～100Pa后再度抽真空至10～20Pa，随后循环进行抽真空-升温操作，并关注罐温度；
S3.5、当罐温升至55～58℃时，停止循环，再次抽真空至罐压10～13Pa，干燥3～5h；
S3.6、当含水量达到5～8％后，将冻干的鹿血浆蛋白肽进行低温粉碎，用60目筛进行过筛，得到冻干鹿血浆蛋白肽粉。
与现有技术相比，本发明的有益效果：该鹿血浆蛋白肽粉冷冻干燥粉化方法中，可以在保证血浆原料活性的前提下，通过合理合适配比多种蛋白酶，提高血浆蛋白质裂解的效果，提高血浆蛋白肽的产量，且可以提高产品的抗氧化性，进而延长成品的保存期限，同时通过预冷、敲碎再进一步冷冻的方法，并设置多次的真空-升温循环，可以在保持蛋白活性的前提下，快速完成血浆蛋白肽的冷冻操作，提高冷冻干燥的效果，降低加工过程中血浆蛋白肽的失活率，减少营养流失，提高药物成品的质量，从而有效保留了其鹿血发挥壮阳作用的有效成分，最大限度发挥鹿血壮阳的医用保健价值。
附图说明
图1为本发明的整体方法流程图；
图2为本发明中制备新鲜鹿血浆的方法流程图；
图3为本发明中制备鹿血浆蛋白肽溶液的方法流程图；
图4为本发明中对鹿血浆蛋白肽溶液进行冷冻干燥处理的方法流程图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
如图1-4所示，本实施例的目的在于，提供一种鹿血浆蛋白肽粉冷冻干燥粉化方法，包括如下步骤：
S1、制备新鲜鹿血浆；
S2、制备鹿血浆蛋白肽溶液；
S3、对鹿血浆蛋白肽溶液进行冷冻干燥处理。
本实施例中，S1中，制备新鲜鹿血浆的方法包括如下步骤：
S1.1、取检疫合格的鹿动脉血液，加入体积为血液体积8％`10％的4％柠檬酸钠抗凝剂，充分混合；
S1.2、将充分混合的液体分置于离心管中，在4℃下设定离心转速2000rpm、离心时间12min，使溶液分为三层；
S1.3、吸取上述离心后的上层液体置于新的离心管中，在4℃下设定离心转速4200rpm、离心时间15min，使溶液分为两层；
S1.4、吸取上述离心后的上层液体，得到新鲜度鹿血浆，将其保存于4℃的冰箱中。
其中，S1.1中，因钙是凝血反应中不可缺少的元素，而柠檬酸钠能与血液中的钙离子形成配位化合物，进而可以阻止血液凝结，便于对血液进行离心纯化，可以更好地保留细胞蛋白。
进一步地，S1.2中，离心后的溶液分为上中下三层，其中上层为富含血小板的血浆层，中层为富含白细胞的外周血单核细胞层，下层为红细胞层。
进一步地，S1.3中，离心后的溶液分为上下两层，其中上层清液为血浆层，底部沉淀为血小板。
本实施例中，S2中，制备鹿血浆蛋白肽溶液的方法包括如下步骤：
S2.1、将分离所得的新鲜鹿血浆置于反应罐A中，调节温度至36～38℃，加入HCl调节pH值至1.2～1.5，按酶/底物为2.5％～3％的重量比加入以壳聚糖为载体的固定化胃蛋白酶，恒温酶解3h；
S2.2、加入NaOH调节pH值至7.0～7.3，在4℃条件下设定离心转速8200rpm、离心时间15min，弃沉淀物，取上清液转入反应罐B；
S2.3、反应罐B的温度设置为55～60℃，加入NaOH调节pH值至8.2～8.5，按酶/底物为2％～2.3％的重量比加入以壳聚糖为载体的固定化碱性蛋白酶，恒温酶解2h；
S2.4、迅速冷却反应罐B中的血浆，加入NaOH调节pH值至7.0～7.3，在4℃条件下，设定离心转速8200rpm、冷冻离心15min，取上清液得到鹿血浆蛋白肽溶液。
其中，S2.2中，加入的以壳聚糖为载体的固定化胃蛋白酶选取分子量为35000的消化酶。
其中，S2.5中，加入以壳聚糖为载体的固定化碱性蛋白酶的含量为8500U/g。
具体地，以壳聚糖为载体的固定化胃蛋白酶在酸性条件下对蛋白进行水解，可以分解蛋白质中苯丙氨酸或酪氨酸与其他氨基酸形成的肽键，产物为蛋白胨及少量的多肽和氨基酸；以壳聚糖为载体的固定化碱性蛋白酶在碱性条件下具有较强的分解蛋白质的能力，可以将蛋白质分子肽链水解成多肽或氨基酸，较大程度地保留鹿血浆蛋白肽的营养。
本实施例中，S3中，对鹿血浆蛋白肽溶液进行冷冻干燥处理的方法包括如下步骤：
S3.1、将新制得的鹿血浆蛋白肽溶液置于冷冻罐中预冷至-5～-8℃，溶液体积不超过罐体的75％；
S3.2、将预冷的鹿血浆蛋白肽敲碎，轻微搅拌混匀，设置温度-32～-35℃，冷冻2～2.5h；
S3.3、将温度调整为-40～-70℃，冷冻30min后，将冷冻罐抽真空至10～20Pa；
S3.4、设定抽真空-升温循环，即当罐压达到10～20Pa后停止抽真空，缓慢升温使罐压回升，罐压升至90～100Pa后再度抽真空至10～20Pa，随后循环进行抽真空-升温操作，并关注罐温度；
S3.5、当罐温升至55～58℃时，停止循环，再次抽真空至罐压10～13Pa，干燥3～5h；
S3.6、当含水量达到5～8％后，将冻干的鹿血浆蛋白肽进行低温粉碎，用60目筛进行过筛，得到冻干鹿血浆蛋白肽粉。
实施例2
本实施例中对鹿血浆蛋白进行酶解的方法作出以下三组对比实验：
实验1
加入一定分子含量为35000的以壳聚糖为载体的固定化胃蛋白酶，加入HCl调节pH为1.3，恒温酶解3h后，再加入一定含量为8500U/g的以壳聚糖为载体的固定化碱性蛋白酶，加入NaOH调节pH至7.2，恒温酶解2h。
实验2
只加入一定分子含量为35000的以壳聚糖为载体的固定化胃蛋白酶，加入HCl调节pH为1.3，恒温酶解3h。
实验3
只加入一定含量为8500U/g的以壳聚糖为载体的固定化碱性蛋白酶，加入NaOH调节pH至7.2，恒温酶解2h。
将上述三组实验在多肽得率、DPPH清除性能、O2清除性能、总还原能力进行对比，具体如下表所示：
| 多肽得率 | DPPH清除性能 | O<sub>2</sub>清除性能 | 总还原能力 | |
| 实验1 | 14.12％ | 40.52％ | 44.35％ | 1.973％ |
| 实验2 | 7.72％ | 22.15％ | 19.83％ | 0.886％ |
| 实验3 | 13.99％ | 38.91％ | 43.69％ | 1.982％ |
由上表可以看出，本实施例的鹿血浆蛋白肽粉冷冻干燥粉化方法，通过选择并合理搭配多种蛋白水解酶，可以增强血液蛋白质的酶解效果，提高多肽得率，提高多肽粉成品中的多肽含量，同时提高成品的抗氧化能力，延长成品的保存期限，进而可以更好地保留成品中蛋白多肽的高含量和活性，提高成品的品质。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的仅为本发明的优选例，并不用来限制本发明，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (8)
1.一种鹿血浆蛋白肽粉冷冻干燥粉化方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1、制备新鲜鹿血浆；
S2、制备鹿血浆蛋白肽溶液；
S3、对鹿血浆蛋白肽溶液进行冷冻干燥处理。
2.根据权利要求1所述的鹿血浆蛋白肽粉冷冻干燥粉化方法，其特征在于：所述S1中，制备新鲜鹿血浆的方法包括如下步骤：
S1.1、取检疫合格的鹿动脉血液，加入体积为血液体积8％`10％的4％柠檬酸钠抗凝剂，充分混合；
S1.2、将充分混合的液体分置于离心管中，在4℃下设定离心转速2000rpm、离心时间12min，使溶液分为三层；
S1.3、吸取上述离心后的上层液体置于新的离心管中，在4℃下设定离心转速4200rpm、离心时间15min，使溶液分为两层；
S1.4、吸取上述离心后的上层液体，得到新鲜度鹿血浆，将其保存于4℃的冰箱中。
3.根据权利要求2所述的鹿血浆蛋白肽粉冷冻干燥粉化方法，其特征在于：所述S1.2中，离心后的溶液分为上中下三层，其中上层为富含血小板的血浆层，中层为富含白细胞的外周血单核细胞层，下层为红细胞层。
4.根据权利要求2所述的鹿血浆蛋白肽粉冷冻干燥粉化方法，其特征在于：所述S1.3中，离心后的溶液分为上下两层，其中上层清液为血浆层，底部沉淀为血小板。
5.根据权利要求1所述的鹿血浆蛋白肽粉冷冻干燥粉化方法，其特征在于：所述S2中，制备鹿血浆蛋白肽溶液的方法包括如下步骤：
S2.1、将分离所得的新鲜鹿血浆置于反应罐A中，调节温度至36～38℃，加入HCl调节pH值至1.2～1.5，按酶/底物为2.5％～3％的重量比加入以壳聚糖为载体的固定化胃蛋白酶，恒温酶解3h；
S2.2、加入NaOH调节pH值至7.0～7.3，在4℃条件下设定离心转速8200rpm、离心时间15min，弃沉淀物，取上清液转入反应罐B；
S2.3、反应罐B的温度设置为55～60℃，加入NaOH调节pH值至8.2～8.5，按酶/底物为2％～2.3％的重量比加入以壳聚糖为载体的固定化碱性蛋白酶，恒温酶解2h；
S2.4、加入NaOH调节pH值至7.0～7.3，在4℃条件下，设定离心转速8200rpm、冷冻离心15min，取上清液得到鹿血浆蛋白肽溶液。
6.根据权利要求5所述的鹿血浆蛋白肽粉冷冻干燥粉化方法，其特征在于：所述S2.2中，加入的以壳聚糖为载体的固定化胃蛋白酶选取分子量为35000的消化酶。
7.根据权利要求5所述的鹿血浆蛋白肽粉冷冻干燥粉化方法，其特征在于：所述S2.5中，加入以壳聚糖为载体的固定化碱性蛋白酶的含量为8500U/g。
8.根据权利要求1所述的鹿血浆蛋白肽粉冷冻干燥粉化方法，其特征在于：所述S3中，对鹿血浆蛋白肽溶液进行冷冻干燥处理的方法包括如下步骤：
S3.1、将新制得的鹿血浆蛋白肽溶液置于冷冻罐中预冷至-5～-8℃，溶液体积不超过罐体的75％；
S3.2、将预冷的鹿血浆蛋白肽敲碎，轻微搅拌混匀，设置温度-32～-35℃，冷冻2～2.5h；
S3.3、将温度调整为-40～-70℃，冷冻30min后，将冷冻罐抽真空至10～20Pa；
S3.4、设定抽真空-升温循环，即当罐压达到10～20Pa后停止抽真空，缓慢升温使罐压回升，罐压升至90～100Pa后再度抽真空至10～20Pa，随后循环进行抽真空-升温操作，并关注罐温度；
S3.5、当罐温升至55～58℃时，停止循环，再次抽真空至罐压10～13Pa，干燥3～5h；
S3.6、当含水量达到5～8％后，将冻干的鹿血浆蛋白肽进行低温粉碎，用60目筛进行过筛，得到冻干鹿血浆蛋白肽粉。
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